[0001] 本发明涉及石油烃降解菌，尤其是涉及一株耐铬的石油烃降解菌(Paraburkholderia caribensis)Thp3‑45A及其应用。

[0002] 石油及其产品是人类最重要的能源和工业原料，素有“工业血液”和“人类文明社会的血液”之称，作为一种重要的能源，其应用范围还在继续扩展，消耗量也日趋增大，但在石油的开采、炼制、储运和使用过程中，由于工艺水平和处理技术的限制使得大量石油烃类物质的废水、废渣不可避免的排入土壤，引起大面积土壤植被被石油污染，破坏土壤生产力，抑制植物营养物质的吸收和转移，造成植物死亡，并由此进入食物链，危害人类健康(张学佳.石油类污染物对土壤生态环境的危害[J]:化工科技，2008.16(6))。

[0003] 铬(Cr)是一种广泛应用于工业生产的重金属元素，常被广泛应用于电镀、制革、染色、合金生产、木材保藏等行业(Deflora S,Bagnasco  M,Serra D,Zanacchi P.Genotoxicity Of Chromium Compounds‑A Review.Mutat Res,1990,238(2):99‑172.)。据中华人民共和国环境保护部公布的2015年中国环境统计年报显示，本年度工业废水中六
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价铬(Cr )及总铬的排放量分别为70.4吨和188.6吨。由于Cr在环境中长期存在、不易降解，且具有通过食物链的生物聚集和放大作用，人为活动产生未经处理的Cr不仅对环境造成严重的污染，还可能威胁公众健康(Garg SK,Tripathi M,Srinath T.Strategies for Chromium Bioremediation of Tannery Effluent.Rev Environ Contam T,2012,217:75‑
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140.)。具体来看，在自然环境中Cr的主要存在形式是Cr 和Cr 。Cr 的性质较稳定，毒性较
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小；Cr 由于具有强氧化性和腐蚀性，同时能够穿过生物膜进入细胞内部，因而，对人体有很强的毒性作用且能够造成人类遗传性基因缺陷(Pajor F,Póti P,Bárdos L.Accumulation of some heavy metals(Pd,Cd and Cr)in milk of grazing sheep in north‑east 
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Hungary.Food Sci Biotechnol,2012,2(1):389‑394.)。研究表明，Cr 的毒性是Cr 毒性
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的100倍，致突变性是Cr 的1000倍(ZHAO Ran#*,WANG Bi,CAI Qing Tao,LI Xiao Xia,LIU Min,HU Dong,GUO Dong Bei,WANG Juan,FAN Chun*.Bioremediation of Hexavalent Chromium Pollution by Sporosarcinasaromensis M52Isolated from Offshore Sediments in Xiamen,China.2016,Biomed Environ Sci,29(2):127‑136.)。目前，国际癌
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症研究机构(IARC)及美国政府工业卫生学家协会(ACGIH)均已经确定Cr 化合物具有致癌性。因此，研究其处理技术对生态环境保护和人类健康意义重大。

[0004] 有研究表明：受石油烃污染的土壤，如油田土壤、火力发电厂等，常伴随有严重的重金属类物质污染的现象(Fu,Xiaowen,Zhaojie Cui&Guolong Zang.2014.Migration,speciation and distribution of heavy metals in an oil‑polluted soil affected by crude oil extraction processes.Environmental Science:Processes&Impacts 16.1737‑44.)，而部分重金属污染物对微生物具有致死作用。因此，大部分高效石油烃降解微生物在上述情况下降解效率大大下降(Dong,Zhi‑Yong,Wen‑Hui Huang,Ding‑Feng Xing&Hong‑Feng Zhang.2013.Remediation of soil co‑contaminated with petroleum and  heavy  metals  by  the  integration  of  electrokinetics  and biostimulation.Journal of Hazardous Materials 260.399‑408.)。目前，分别针对含石
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油烃与Cr 污染物土壤治理的物理法、化学法、生物法及不同方法的组合应用已经较为普
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遍，但关于石油烃污染物‑Cr 复合污染的研究却鲜见报道。现有的技术路线普遍存在成本
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高、周期长、易造成二次污染等诸多弊病。因此，寻求石油烃污染物‑Cr 复合污染的治理方案，对环境污染问题具有极其重要的实际意义。

[0005] 本发明的第一目的在于提供一株耐铬的石油烃降解菌(Paraburkholderia caribensis)Thp3‑45A。

[0006] 本发明的第二目的在于提供一株耐铬的石油烃降解菌(Paraburkholderia 6+
caribensis)Thp3‑45A在处理原油及Cr 复合污染土壤治理中的应用。

[0007] 所述石油烃降解菌(Paraburkholderia caribensis)Thp3‑45A，筛选自澳门发电厂内一处石油烃污染区域(E113°55′,N22°20′)，土壤样品在无菌收集后，经低温运送至实验室进行下一阶段研究工作。

[0008] 在实验室环境中：取250mL锥形瓶，洗净后加注90mL去离子水并添加直径为0.5cm玻璃珠25颗，封口后置于高压灭菌锅内，121℃，20min高温高压灭菌。待体系冷却至室温后，在超净工作台中将10.0g前述土壤样品加入锥形瓶内，重新封口后，置于28℃恒温摇床内震荡约30min，使土壤孔隙中的微生物充分释放。该过程所产生的悬浊液即为梯度稀释的原‑4 ‑5 ‑6液。该原液以10倍比例进行等比稀释，以10 、10 、10 为稀释终浓度，均匀涂布于LB固体平板上并倒置于28℃恒温培养箱培养约48h。经反复分离纯化，最终得到单菌石油烃降解菌(Paraburkholderia caribensis)Thp3‑45A。提取石油烃降解菌(Paraburkholderia caribensis)Thp3‑45A的基因组DNA并以此为模板扩增16S rDNA片段，并在Ezbiocloud上选取高相似度序列，用MEGA 7.0计算出序列的系统进化距离，并构建系统发育树。系统发育树显示：石油烃降解菌(Paraburkholderia caribensis)Thp3‑45A，其16s rDNA序列与模式菌株ParaburkholderiacaribensisMWAP64(T)相似性为99.86％，且共同形成一枝，因此命名为石油烃降解菌(Paraburkholderia caribensis)Thp3‑45A。石油烃降解菌(Paraburkholderia caribensis)Thp3‑45A已于2018年11月28日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉武汉大学，邮编：430072，保藏中心保藏编号为CCTCC NO：M 
2018837。

[0009] 在LB固体平板上挑取石油烃降解菌(Paraburkholderia caribensis)Thp3‑45A的一个单菌落接种于LB液体培养基中，过夜培养，即为Thp3‑45A种子液。将10g原油与90mL无机盐液体培养基分别灭菌后混合，即配制100g/L的原油‑无机盐培养基，并在此培养基中加6+
入干燥后至恒重的重铬酸钾粉末，使该体系中的Cr 浓度为100mg/L。按1％的比例加入菌株
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种子液，并在28℃，150rpm条件下培养共计15d，每3日取样分析Cr 及石油烃含量。再以
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50mg/L Cr 为梯度，不断增加LB液体培养基中的Cr 浓度，后接入Thp3‑45A种子液，通过监测一定培养周期后培养基中的吸光度值是否变化并加以LB固体平板涂布验证，以确定石油
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烃降解菌(Paraburkholderia caribensis)Thp3‑45A最高可耐受Cr 浓度。

[0010] 经上述实验验证：石油烃降解菌(Paraburkholderia caribensis)Thp3‑45A在6+
pH7.0，温度28℃，含Cr 和原油分别为100mg/L、100g/L的无机盐液体培养基中，150rpm培养
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15d，对Cr 去除率达94.6％，同时可以完全降解反应体系中的原油。且石油烃降解菌
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(Paraburkholderia caribensis)Thp3‑45A最高可在含约300mg/L Cr 的LB液体培养基中生长。

[0011] 上述LB固体培养基组分为：胰蛋白胨10g，酵母浸粉5g，氯化钠10g，琼脂粉15g/L，去离子水1L，pH6.9～7.1。LB液体培养基组分为：胰蛋白胨10g，酵母浸粉5g，氯化钠10g，去离子水1L，pH6.9～7.1。无机盐液体培养基组分为：氯化钙2.0g，定容至100mL，制成1000×氯化钙溶液；七水合硫酸镁2.0g,定容至100mL，制成100×硫酸镁溶液；硫酸铵0.5g,硝酸钠0.5g,磷酸二氢钾1.0g,水合磷酸二氢钠1.0g,去离子水800mL，调pH至7.0～7.2，高压灭菌后，于无菌环境下按比例加入氯化钙溶液与硫酸镁溶液，并加无菌水补齐至1L。

[0012] 本发明的石油烃降解菌(Paraburkholderia caribensis)Thp3‑45A的分离及应用有效填补了该方面研究的空白，并为实际污染环境的治理工作提供了一套可行的实践方案，展现出巨大的实际应用前景。附图说明

[0013] 图1为本发明的石油烃降解菌(Paraburkholderia caribensis)Thp3‑45A的系统发育分析树。在图1中，标尺表示差异精度。

[0014] 图2为本发明的石油烃降解菌(Paraburkholderia caribensis)Thp3‑45A不同时间对六价铬及废机油的降解率。在图2中，A为100mg/L Cr(VI)，B为石油烃。具体实施方式：

[0015] 以下实施例将结合附图对本发明作进一步的说明。

[0016] 实施例1：石油烃降解菌(Paraburkholderia caribensis)Thp3‑45A形态特征[0017] 将单菌落划线接种至LB固体培养基中，将平板倒置于恒温培养箱内，28℃培养72h。该菌革兰氏染色呈阴性，专性需氧。菌落呈圆形，米白色半透明，表面光滑湿润，边缘规则，无晕环，中央凸起，直径1～1.5mm。

[0018] 实施例2：石油烃降解菌(Paraburkholderia caribensis)Thp3‑45A的筛选与系统发育学鉴定

[0019] (1)现场采集澳门发电厂石油烃污染区域(E113°55′,N22°20′)地表下5～20cm深度的土壤样品，初步剔除草根、石块等杂质后，低温寄送至实验室，以供进一步分析筛选目的菌株之用。

[0020] (2)在实验室环境中：取250mL锥形瓶，洗净后加注90mL去离子水并添加25颗0.5cm直径的玻璃珠，封口后，121℃，20min高压灭菌。待体系降至室温后，在超净工作台中将10.0g前述土壤样品加入锥形瓶中，重新封口后，置于28℃恒温摇床内震荡约30min。该过程‑4 ‑5 ‑6
所产生的悬浊液即为梯度稀释的原液。该原液以10倍等比稀释，以10 、10 、10 为稀释终浓度，均匀涂布于LB固体平板上，后将平板倒置于28℃恒温培养箱培养约48h。经反复分离纯化，最终得到纯净单菌石油烃降解菌(Paraburkholderia caribensis)Thp3‑45A。

[0021] (3)提取石油烃降解菌(Paraburkholderia caribensis)Thp3‑45A的基因组DNA并以此为模板扩增16SrDNA片段，并在EZBiocloud上选取高相似度序列，用MEGA7.0计算出序列的系统进化距离，并构建系统发育树。系统发育树显示：石油烃降解菌(Paraburkholderia caribensis)Thp3‑45A与模式菌株ParaburkholderiacaribensisMWAP6 4 (T) 相似性 为 99 .8 6％ ，且共 同形 成 一枝 ，因 此 可认 其 属于 为Paenarthrobactercaribensis菌属，命名为石油烃降解菌(Paraburkholderia caribensis)Thp3‑45A。

[0022] 实施例3：本发明的石油烃降解菌(Paraburkholderia caribensis)Thp3‑45A对6+
Cr 及石油烃的去除效果

[0023] (1)配制LB液体培养基，并在LB固体平板上挑取石油烃降解菌(Paraburkholderia caribensis)Thp3‑45A的一个单菌落接种于LB液体培养基中，过夜培养，即为Thp3‑45A种子液。

[0024] (2)将10g原油与90mL无机盐液体培养基分别灭菌后混合，即配制100g/L的原油‑6+
无机盐培养基，并加入干燥至恒重的重铬酸钾粉末，使该体系中的Cr 浓度为100mg/L(此数
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值经预实验确定)。于28℃，150rpm条件下培养共15d，每3d取样分析石油烃及Cr 含量。结果
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显示：石油烃降解菌(Paraburkholderia caribensis)Thp3‑45A对Cr 去除率达94.6％，同时可以完全降解反应体系中的原油。

[0025] 实施例4：本发明的石油烃降解菌(Paraburkholderia caribensis)Thp3‑45A对6+
Cr 的最高耐受浓度

[0026] (1)配制LB液体培养基，并在LB固体平板上挑取石油烃降解菌(Paraburkholderia caribensis)Thp3‑45A的一个单菌落接种于LB液体培养基中，过夜培养，即为Thp3‑45A种子液。

[0027] (2)以50mg/L Cr6+为梯度间隔配制含不同浓度Cr6+的LB液体培养基，接入Thp3‑45A种子液，通过监测一定培养周期后培养基中的吸光度值是否变化并加以LB固体平板涂
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布验证，以确定其最高可耐受Cr 浓度。

[0028] (3)该实验结果显示：石油烃降解菌(Paraburkholderia caribensis)Thp3‑45A最6+
高可在含约300mg/L Cr 的LB液体培养基中生长。

[0029] 上述LB固体培养基组分为：胰蛋白胨10g，酵母浸粉5g，氯化钠10g，琼脂粉15g/L，去离子水1L，pH6.9～7.1。LB液体培养基组分为：胰蛋白胨10g，酵母浸粉5g，氯化钠10g，去离子水1L，pH6.9～7.1。无机盐液体培养基组分为：氯化钙2.0g，定容至100mL，制成1000×氯化钙溶液；七水合硫酸镁2.0g,定容至100mL，制成100×硫酸镁溶液；硫酸铵0.5g,硝酸钠0.5g,磷酸二氢钾1.0g,水合磷酸二氢钠1.0g,去离子水800mL，调pH至7.0～7.2，高压灭菌后，于无菌环境下按比例加入氯化钙溶液与硫酸镁溶液，并加无菌水补齐至1L。

[0030] 本发明的石油烃降解菌(Paraburkholderia caribensis)Thp3‑45A的系统发育分析树参见图1，本发明的石油烃降解菌(Paraburkholderia caribensis)Thp3‑45A不同时间对六价铬及废机油的降解率参见图2。