水溶性PnO2-PODIPY/PnO2-azaPODIPY荧光染料及其制备方法 |
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| 申请号 | CN201410656425.8 | 申请日 | 2014-11-18 | 公开(公告)号 | CN104356680A | 公开(公告)日 | 2015-02-18 |
| 申请人 | 沈阳化工大学; | 发明人 | 姜新东; 赵九丽; 肖林久; 习东梅; 于海峰; 于秀兰; 姚晓东; 周凡; | ||||
| 摘要 | 水 溶性PnO2-PODIPY/PnO2-azaPODIPY 荧光 染料及其制备方法，涉及一种染料及其制备方法，所述的 荧光染料 是以次甲基二吡咯/氮杂亚甲基二吡咯络合PnO2(Pn=P，As，Sb，Bi)发展的PnO2-PODIPY/PnO2-azaPODIPY为母核的新型一系列染料。其通式如式I/II所示。该荧光染料具有经典传统染料BODIPY/azaBODIPY 光谱 性能等优点。尽管中心 原子 Pn为六配位，但此染料在空气和水溶液中稳定，不分解。这类化合物突出的特色是优异的 水溶性 ，同时具有一定的细胞透膜性，可用于 生物 染色 。本 发明 的这类新型染料具有较新颖的 光谱特性 ，可以应用于荧光成像方面。 | ||||||
| 权利要求 | 1.水溶性PnO2-PODIPY/PnO2-azaPODIPY荧光染料，其特征在于，所述荧光染料通式如式I/II所示： |
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| 说明书全文 | 水溶性PnO2-PODIPY/PnO2-azaPODIPY荧光染料及其制备方法 技术领域背景技术[0003] 在众多染料中，氟硼二吡咯甲川(BF2-dipyrrolemethene，简称BODIPY)类荧光染料，具有荧光量子产率高、光稳定性好、吸收和发射波长位于可见光区，易于调控等诸多优点而被广泛研究，其分子易修饰。 [0004] 氮杂氟硼二吡咯甲川(BF2-azadipyrrolemethene，简称azaBODIPY)染料是近年来受到广泛关注的一类新型近红外荧光染料，该类染料具有吸收和发射波长长，光稳定性好、半峰宽窄、量子产率高、摩尔消光系数大等特点，在生物分析领域具有广阔的应用前景，已经成为近年来研究的热点。但有分子难修饰的不足。 [0005] 近年来，亚甲基二吡咯/氮杂亚甲基二吡咯络合BF2而生成的BODIPY/azaBODIPY得到了广泛的发展，Shen研究小组和Burgess研究小组做了系统的报道。而现报道的BODIPY/azaBODIPY由于其疏水性，限制其体内/体外应用。亚甲基二吡咯/氮杂亚甲基二吡咯作为配体，络合Si及过渡金属，也有一些报道。例如以Si为中心的SiR3-BODIPY的化合物，但稳定性很差；而以金属离子（例如Zn，Ni，Sn，Cu，Co，Fe等）为中心的M-BODIPY的金属错体，稳定也不好，量子产率很低。它们的实际应用基本不可能。但是，亚甲基二吡咯/氮杂亚甲基二吡咯作为配体，络合PnO2 (Pn = P, As, Sb, Bi）的染料从没有报道过及考察过。 [0006] 长波长荧光染料，降低生物体内物质的自吸收和自发荧光的干扰，提高检测的灵敏度和选择性、提高荧光成像（治疗）效率。长波长荧光染料普遍量子产率低，但增加分子刚性/冻结旋转可以有效提高荧光量子产率。因此，在母核刚性修饰寻求突破。在此，我们引入新的战略设计，从经典传统的BODIPY/azaBODIPY发展的新型染料PnO2-PODIPY/PnO2-azaPODIPY （PnO2-phosphorusdipyrrolemethene，简称PnO2-PODIPY; PnO2-azaphosphorusdipyrrolemethene，简称PnO2-azaPODIPY）。这种染料是以亚甲基二吡咯/氮杂亚甲基二吡咯络合PnO2发展的PO2-BODIPY/PO2-azaBODIPY染料。我们预期的设计的新型PnO2-PODIPY/PnO2-azaPODIPY染料为进一步应用于生物学研究的发展提供新式染料，丰富染料家族的种类。作为新式的染料，在具备经典传统的BODIPY/azaBODIPY染料的光谱性能等优点之外，最大的特征是良好的水溶性。 发明内容[0007] 本发明的目的在于提供一种水溶性PnO2-PODIPY/PnO2-azaPODIPY荧光染料及其制备方法，该荧光染料具有如下特点：中心原子是以Pn (Pn = P, As, Sb, Bi）络合的六配位的荧光染料，具有很好的水溶性，同时本发明所述染料在生物应用方面具有良好的细胞透膜性。 [0008] 本发明的目的是通过以下技术方案实现的：本发明的第一方面，本发明针对现有存在的BODIPY/azaBODIPY染料的不足，在 其基础上改进，提供了一类结构简单，长波长，且具有良好的细胞透膜性的新型化合物PnO2-PODIPY/PnO2-azaPODIPY。其具有的下列结构通式I/II： 其中，R1-R7选自-H、-Ph、-Me、-Et、-OH、-OMe、-OEt、-N(Me)2、-N(Et)2等基团； R8选自R8-1、R8-2、R8-3、R8-4、R8-5、R8-6、R8-7和R8-8等基团。 [0009] R1-R7选自-Ph、-Me、-Ar、萘基、芘基等基团。 [0010] 虚线，代表不熔合苯环与熔合苯环两种分子结构。 [0011] 具有上述通式I/II的新型荧光染料可用于生物染色，细胞成像，实施例子中列举了将其中的一个染料应用于细胞成像，显示出此类化合物具有良好的稳定性，具有很好的水溶性，同时有一定的透膜性。本发明的这类荧光染料同时还具有新颖的光谱特性。 [0012] 本发明的另一方面是以Pn原子为中心六配位的全新的PnO2-PODIPY/PnO2-azaPODIPY荧光染料，突出特征是良好的水溶性。 [0013] 本发明的再一方面：提供一种新式制备本发明所述的荧光染料的方法，所述方法包括如下步骤：（1）在氩气保护下，相应的醛和相应的吡咯溶解在二氯甲烷中，加入一滴三氟乙酸，室温搅拌，过夜反应。用TLC检测反应结束后，加入DDQ，搅拌30分钟。反应液用冰淬灭。用二氯甲烷萃取，减压蒸馏，剩余物用硅胶柱提纯，展开剂为二氯甲烷/正己烷，得到亚甲基二吡咯III固体。 [0014] 其中，R1-R7选自-H、-Ph、-Me、-Et、-OH、-OMe、-OEt、-N(Me)2、-N(Et)2等基团；R8选自R8-1、R8-2、R8-3、R8-4、R8-5、R8-6、R8-7和R8-8等基团。 [0015] （2）在敞开的体系下，将步骤（1）得到固体III溶解在二氯甲烷中，然后加入三乙胺，反应半小时。最后，加入PnOCl3 ((Pn = P, As, Sb, Bi）)，反应3小时。混合物用冰淬灭。用二氯甲烷萃取，减压蒸馏，剩余物用硅胶柱提纯展开剂为二氯甲烷/正己烷，得到固体I。 [0016] (3)开放体系下，加入苯基取代的吡咯、冰醋酸(、醋酸酐，冰浴下加入亚硝酸钠，室温反应0.5 h，转移至80 °C反应0.5 h，反应结束。缓慢加入冰水淬灭反应，会有固体析出，过滤出固体。滤饼用二氯甲烷溶解，以二氯甲烷为淋洗剂，以氧化铝为固定相过柱，旋干溶剂，得到氮杂次甲基二吡咯IV固体。 [0017] R1-R7选自-Ph、-Me、-Ar、萘基、芘基等基团。 [0018] 虚线，代表不熔合苯环与熔合苯环两种分子结构。 [0019] (4)将得到固体IV，在开放体系下，加入二氯甲烷、三乙胺，继续搅拌30分钟。缓慢滴入加入PnOCl3 ((Pn = P, As, Sb, Bi）)，室温搅拌反应8小时。加入冰水淬灭反应，二氯甲烷分液萃取，有机层水洗，无水硫酸钠干燥，旋干，柱层析，展开剂为二氯甲烷/正己烷，得到有金属光泽的固体II。 [0020] 其中II结构中，R”选自-H、-OH、-OMe、-OEt、-N(Me)2和-N(Et)2；虚线，代表不熔合苯环与熔合苯环两种分子结构。 [0021] 本发明改进现有BODIPY/azaBODIPY荧光染料光谱上的不足，设计合成新型的PnO2络合的PnO2-PODIPY/PnO2-azaPODIPY荧光染料。该类荧光染料具有光稳定性好的特点，同时这类染料具有有优异的水溶性，具有细胞透膜性，可以应用于生物染料，细胞成像方面的研究。附图说明 [0022] 图1是本发明的新型荧光染料的结构通式I。 [0023] 图2是本发明的新型荧光染料的结构通式II。 [0024] 图3是本发明的新型荧光染料I-1的磷谱。 [0025] 图4是本发明的新型荧光染料III-1的吸收（λabs = 450 nm in CH2Cl2）。 [0026] 图5是本发明的新型荧光染料I-1的吸收光谱（a: λabs = 513 nm in CH2Cl2; b: λabs = 505 nm in H2O）与荧光光谱(c: λem = 520 nm in H2O）。主要对比PO2络合前后光谱行为的表现。 [0027] 图6是本发明的荧光染料III-1的CH2Cl2溶液中的颜色（左图）；本发明荧光染料I-1在纯水中溶解的颜色（右图）。 [0028] 图7是本发明的新型荧光染料IIa-1的磷谱。 [0029] 图8是本发明的新型荧光染料IVa-1的吸收（λabs = 597 nm in CH2Cl2）。 [0030] 图9是本发明的新型荧光染料IIa-1的吸收（a: λabs = 625 nm in H2O）与荧光光谱（b: λem = 675 nm in H2O）。主要对比PO2络合前后光谱行为的表现。 [0031] 图10是本发明的新型荧光染料IVa-1的CH2Cl2中的颜色（左图）；本发明荧光染料IIa-1在纯水中溶解的颜色（右图）。 [0032] 图11是本发明的新型荧光染料IIa-1的对活细胞Hep-2细胞染色的荧光显微照片。所用的仪器为共聚焦激光扫描显微镜。型号：ArrayScan® VTI HCS Reader。激光发光通道：590 nm。 具体实施方式[0033] 下面结合附图所示实施例，对本发明作进一步详述。 [0034] 除另有说明外，本文中使用的术语具有如下含义。 [0035] 其中，R1-R7选自-H、-Ph、-Me、-Et、-OH、-OMe、-OEt、-N(Me)2、-N(Et)2等基团，优先选为-Me；R8选自R8-1、R8-2、R8-3、R8-4、R8-5、R8-6、R8-7和R8-8等基团，R8优先选为对硝基苯基。 [0036] 在本发明通式II中，R1-R7选自-Ph、-Me、-Ar、萘基、芘基等基团；虚线，代表不熔合苯环（a）与熔合苯环(b)两种分子结构。R1-R7 优先选为-Ph; 优先采用不熔合苯环的分子结构。 [0037] 本发明提供一种新式制备本发明所述的荧光染料PnO2-PODIPY/PnO2-azaPODIPY的方法，即首先制备中间体III/IV，其次制备的中间体与PnOCl3 (Pn = P, As, Sb, Bi)络合，最后水解，得到本发明所述的化合物。具体实施方案如下所述。 [0038] （1）在氩气保护下，相应的醛和相应的吡咯溶解在二氯甲烷中，加入一滴三氟乙酸，室温搅拌，过夜反应。用TLC检测反应结束，DDQ加入，搅拌30分钟。反应液用冰淬灭。用二氯甲烷萃取，减压蒸馏，剩余物用硅胶柱提纯，展开剂为二氯甲烷/正己烷，得到固体III。 [0039] 反应时间2-15小时。相应的醛与相应的吡咯的投料摩尔比为1:2。 [0040] （2）在敞开体系下，将得到固体III溶解在二氯甲烷中，然后加入三乙胺，反应半小时。最后，加入PnOCl3 (Pn = P, As, Sb, Bi），室温下反应8小时。把冰水缓慢加入，进行水解反应。而后用二氯甲烷萃取，减压蒸馏，剩余物用硅胶柱提纯展开剂为二氯甲烷/正己烷，得到固体I。 [0041] 在一个优选的实施方案中，反应温度25度，室温即可。反应时间1-5小时。 [0042] 固体III与三乙胺的投料摩尔比为1:5；固体III与PnOCl3 (Pn = P, As, Sb, Bi）的投料摩尔比为1:10。缓慢加入冰水，进行水解反应，完成PnO2的络合，生成染料I。 [0043] (3)敞开体系下，加入苯基取代的吡咯、冰醋酸、醋酸酐，冰浴下加入亚硝酸钠，室温反应0.5 h，转移至80 °C反应0.5 h，反应结束。加入冰水淬灭反应，会有固体析出，过滤出固体。滤饼用二氯甲烷溶解，以二氯甲烷为淋洗剂，以氧化铝为固定相过柱，旋干溶剂，得到固体IV。 [0044] 吡咯与亚硝酸钠的投料摩尔比严格为2:1。 [0045] (4)将得到固体IV，开放体系下，加入二氯甲烷、三乙胺，继续搅拌50分钟。缓慢滴入PnOCl3 (Pn = P, As, Sb, Bi），室温搅拌反应3小时。加入冰水淬灭反应，二氯甲烷分液萃取，有机层水洗，无水硫酸钠干燥，旋干，柱层析，展开剂为二氯甲烷/正己烷，得到有金属光泽的固体II。 [0046] 固体IV与三乙胺的投料摩尔比为1:5；固体IV与PnOCl3 (Pn = P, As, Sb, Bi）的投料摩尔比为1:8。缓慢加入冰水，进行水解反应，完成PnO2的络合，生成固体II。 [0047] 对本发明采用上述方法合成的新型荧光染料的化合物，采用核磁共振图谱包括1H NMR和31P NMR，质谱来确定其结构。 [0048] 本发明所述的PnO2-PODIPY/PnO2-azaPODIPY荧光染料具有如下特点：所述的化合物最大优点是具有良好的水溶性，可用于生理环境下的细胞成像。 [0049] 所述的化合物II的荧光发射波长大于600 nm，可用于细胞成像，避免生物自身的荧光背景干扰。 [0050] 所述的化合物具有优异的光稳定性。 [0051] 所述的化合物毒副性小，原料易得，结构经典，简单，易于制备，易产业化，经两步反应即可得到目标化合物。 [0052] 本发明的这些特征和优点以及其他特征和优点在参考以下附图和本发明的具体实施方式之后将变得显而易见。 [0053] 鉴于此，本发明所述的荧光染料进行生物染色时，需要其他组分，如溶剂，pH调节剂。 [0054] 本发明化合物进行生物样品染色后，样品在荧光激活细胞分选仪器中进行分析，测定装置由激发的荧光染料产生的发射光。 [0055] 本发明上述的荧光染料可以直接配制成水溶液，能够稳定存在。 [0056] 实施例1制备荧光染料I-1 （1）中间体化合物III-1的合成。 [0057] 在氩气保护下，对硝基苯基醛（300 mg, 0.19 mmol）和2,4-二甲基吡咯（0.51 ml,0.49 mmol）溶解在二氯甲烷（20 ml）中，加入一滴三氟乙酸，室温搅拌，反应12 h。用TLC检测反应结束，DDQ（900 mg）加入，搅拌30分钟。反应液用冰淬灭。用二氯甲烷萃取，减压蒸馏，剩余物用硅胶柱提纯，展开剂为二氯甲烷/正己烷，得到黄色固体III-1（183.2 mg, 30 %）。 [0058] （2）PO2-PODIPY染料I-1的合成。 [0059] 在敞开体系下，将得到固体III-1（64.2 mg）溶解在二氯甲烷（20 ml）中，然后加入三乙胺（0.7 ml），反应10分钟。而后，加入三氯氧磷（1.2 ml），室温下反应1小时。把冰水缓慢加入，进行水解反应。而后用二氯甲烷 (50 ml)萃取，MgSO4进行干燥，而后减压蒸馏，剩余物用硅胶柱提纯展开剂为二氯甲烷/正己烷，得到粉红色固体I-1 （58.1 mg,76%）。1H NMR (500 MHz, CDCl3) 8.46 (d, J = 7.5 Hz, 2H), 7.69 (d, J = 7.5 Hz, 31 2H), 6.25 (s, 2H),2.77 (s, 6H), 2.54 (s, 6H). P NMR (202 MHz, CDCl3) -0.5. ESI-MS: m/z = 383.1. 实施例2 制备荧光染料IIa-1 （1）中间体化合物IVa-1的合成 开放体系下，加入2,4-二苯基吡咯（43.8 mg, 0.2 mmol）、冰醋酸(1 ml)、醋酸酐（0.4 ml），冰浴下加入亚硝酸钠（6.9 mg, 0.1 mmol），室温反应0.5 h，转移至80 °C反应0.5 h，反应结束。加入冰水淬灭反应，会有固体析出，过滤出固体。滤饼用二氯甲烷溶解，以二氯甲烷为淋洗剂，以氧化铝为固定相过柱，旋干溶剂，得到蓝紫色固体IVa-1（35.9 mg, 80%）。 1 H NMR (400 MHz, CDCl3) 8.04-8.08 (m, 4H), 7.94-7.97 (m, 4H), 7.33-7.57 (m, 13 12H), 7.21 (s, 2H) (NH not observed). C NMR (CDCl3) 155.1, 149.6, 142.7, 133.7, 132.2, 130.1, 129.2, 129.1, 128.3, 128.0, 126.6, 114.9. （2）PO2-azaPODIPY染料IIa-1的合成。 [0060] 在敞开体系下，将得到固体IVa-1（20.3 mg）溶解在二氯甲烷（20 ml）中，然后加入三乙胺（0.5 ml），反应10分钟。而后，加入三氯氧磷（1 ml），室温下反应1小时。把冰水缓慢加入，进行水解反应。而后用二氯甲烷 (50 ml)萃取，MgSO4进行干燥，而后减压蒸馏，剩余物用硅胶柱提纯展开剂为二氯甲烷/正己烷，得到蓝色固体IIa-1（19.6 mg, 85%）。1 H NMR (500 MHz, CDCl3) 8.14-8.17 (m, 4H), 7.69 (d, J = 7.0 Hz, 4H), 7.63 (d, 31 J = 7.0 Hz, 6H), 7.48 (t, J = 7.0 Hz, 2H), 7.32-7.35 (m, 6H). P NMR (202 MHz, CDCl3) 0.3. ESI-MS: m/z =511.2. 共聚焦激光扫描显微镜下观察化合物IIa-1对活细胞Hep-2细胞的染色：将化合物 -5 IIa-1（浓度5.0×10 M，40 的PBS溶液)加入2 ml的Hep-2细胞用常规的DMEM培养 5 -1 液（10%胎牛血清，0.2%NaHCO3水溶液，青霉素100 U/mL）。调整细胞浓度为1×10mL ，置于无菌盖玻片的培养皿中，37℃ 5%CO2培养箱放置1 h，用没有血清的DMPE清洗3次，除去没有贴壁的细胞，获取贴壁的Hep-2细胞供实验用。荧光成像前，用PBS缓冲溶液冲洗。实施例2化合物对Hep-2细胞的激光共聚焦成像。由图可见，经化合物染色后，在37℃抚育30分钟的一组细胞呈现出强的荧光，细胞清晰可见。说明此种染料对Hep-2细胞有很好的成像作用。所用仪器共聚焦激光扫描显微镜，型号ArrayScan® VTI HCS Reader。激光发射通道561 nm。 [0061] 以上内容是结合具体的优化实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在本发明核心构思以次甲基二吡咯/氮杂亚甲基二吡咯等配体与PnO2 (Pn = P, As, Sb, Bi)络合的前提下，还可以做出若干简单演绎和替换，都应该视为属于本发明的保护范围。作为本发明所属技术领域的域的普通技术人员来说，在基于本发明荧光染料用于染色的相同作用机理的考虑下，还可以做出若干简单推理，得到本发明的化合物的其他应用用途，都应当视为属于本发明的保护范围。 |
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