一种可检测GSTs含量的近红外荧光探针及其合成方法和应用 |
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申请号 | CN202110155050.7 | 申请日 | 2021-02-04 | 公开(公告)号 | CN112939886B | 公开(公告)日 | 2022-05-31 |
申请人 | 山西大学; | 发明人 | 温莹; 龙志清; 阴彩霞; 霍方俊; | ||||
摘要 | 本 发明 提供了一种可检测GSTs含量的 近红外 荧光 探针及其合成方法和应用。所述探针的名称为4‑(2,4‑二硝基苯 氧 基)苄基3,7‑双(二乙 氨 基)‑10H‑苯恶嗪‑10‑ 羧酸 盐,或4‑(2,4‑二硝基苯氧基)苄基3,7‑双(二甲氨基)‑10H‑吩噻嗪‑10‑羧酸盐。本发明还提供了一种检测体内GSTs含量的方法,即将所述探针在 磷酸 缓冲溶液pH=7: 乙醇 /9:1(v/v)体系中,通过荧光分光光度计对GSTs的含量进行定量检测。该检测方法灵敏度高,方法简便。 | ||||||
权利要求 | 1.一种可检测GSTs含量的近红外荧光探针,其特征在于,结构式为L1或L2: |
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说明书全文 | 一种可检测GSTs含量的近红外荧光探针及其合成方法和应用技术领域背景技术[0002] 化疗药物相对于机体来说是一种有毒物质,肿瘤细胞通过过度表达GSTs来保护自身不受化疗药物的伤害。GSTs是一个多功能的二相代谢酶家族,主要通过活化GSH(还原性谷胱甘肽)中的巯基与亲电子基团偶联,使结合物的疏水性增加从而排出体外。同时它也是细胞抗损伤、抗癌变的重要解毒系统。近红外荧光探针(650‑900nm),由于其较高的信噪比、较强的穿透深度以及较高的成像分辨率,受到了研究者的重视。目前,常见的近红外荧光生色团包括:花菁类、罗丹明类、方酸类、卟啉类、BODIPY类、碱性染料(碱性蓝、亚甲基蓝) 类等。其中,碱性染料荧光生色团,是生物分析领域中一种常用的组织染料。其在近红外区的吸收峰强且尖锐,摩尔消光系数高。故碱性染料及其衍生物可以作为良好的构建探针的骨架。 [0004] 在本发明中,基于碱性染料荧光团合成了两个检测GSTs的近红外荧光探针,GSTs会活化GSH中的巯基,使之与探针发生反应,释放出发红色荧光的碱性染料荧光团。从而实现对 GSTs的检测。 发明内容[0005] 本发明的目的在于提供一种可检测GSTs含量的近红外荧光探针及其合成方法,以及该探针在检测GSTs中的应用。所述检测过程较为简便、灵敏较高、光稳定性较好,检出限较低。 [0006] 本发明提供的两个可检测GSTs含量的近红外荧光探针,化合物的名称为4‑(2,4‑二硝基苯氧基)苄基3,7‑双(二乙氨基)‑10H‑苯恶嗪‑10‑羧酸酯 (4‑(2,4‑dinitrophenoxy)benzyl 3,7‑bis(diethylamino)‑10H‑phenoxazine‑10‑carboxylate)和4‑(2,4‑二硝基苯氧基)苄基3,7‑双(二甲氨基)‑10H‑吩噻嗪‑10‑羧酸酯 (4‑(2,4‑dinitrophenoxy)benzyl 3,7‑bis(dim ethylamino)‑10H‑ phenothiazine ‑10‑carboxylate),分别命名为L1和L2。它们的结构式如下: [0007] [0008] 本发明提供的两个基于碱性染料的近红外荧光探针的合成方法,步骤如下: [0009] (1)将对羟基苯甲醇溶于二氯甲烷中,于冰水浴中搅拌5min,随后加入三乙胺,搅拌 30min后滴加溶二氯甲烷中的1‑氯‑2,4‑二硝基苯,搅拌反应过夜,TLC检测反应进程,用饱和氯化钠(3×50mL)和二氯甲烷(3×50mL)萃取洗涤,无水硫酸钠干燥有机相,用石油醚/乙酸乙酯=3:1过柱纯化得淡黄色粉末,即产物(4‑(2,4‑二硝基酚氧基)苯基)甲醇,上述所用原料对羟基苯甲醇:三乙胺:1‑氯‑2,4‑二硝基苯摩尔比为1:3:1。 [0010] (2.1)将(4‑(2,4‑二硝基酚氧基)苯基)甲醇,3,7‑双(二乙氨基)‑10H‑吩恶嗪‑10‑羰基氯,碳酸钠和4‑二甲氨基吡啶溶于二氯甲烷中,在氮气保护,冰浴条件下搅拌反应8h。除去溶剂并将粗产物进行硅胶柱色谱纯化,得到棕色固体4‑(2,4‑二硝基苯氧基)苄基3,7‑双(二乙氨基)‑10H‑苯恶嗪‑10‑羧酸酯 (命名为L1)。其中(4‑(2,4‑二硝基酚氧基)苯基)甲醇:3,7‑双(二乙氨基)‑10H‑吩恶嗪‑10‑羰基氯:碳酸钠:4‑二甲氨基吡啶的投料摩尔比为 1.2:1:3:1。 [0011] (2.2)将(4‑(2,4‑二硝基酚氧基)苯基)甲醇,3,7‑双(二甲氨基)‑10H‑吩噻嗪‑10‑羰基氯,碳酸钠4‑二甲氨基吡啶溶于二氯甲烷中,在氮气保护,冰浴条件下搅拌反应8h。除去溶剂并将粗产物进行硅胶柱色谱纯化,得到棕色固体4‑(2,4‑二硝基苯氧基)苄基3,7‑双(二甲氨基)‑10H‑ 吩噻嗪‑10‑羧酸酯 (命名为L2)。(4‑(2,4‑二硝基酚氧基)苯基)甲醇:3,7‑双(二甲氨基)‑10H‑ 吩噻嗪‑10‑羰基氯:碳酸钠:4‑二甲氨基吡啶的投料摩尔比为1.2: 1:3:1。 [0012] 所述基于碱性染料荧光团合成的近红外荧光探针L1、L2可用于对GSTs的检测。 [0013] 本发明提供的一种检测GSTs的方法,步骤为: [0014] (1)、配制pH=7磷酸缓冲溶液(10mM,10%无水乙醇)为反应体系,将L1,L2溶于 DMSO配制成2mM的制备液,配置20mM的谷胱甘肽(GSH)溶液和1mg/mL的GSTs溶液。 [0015] (2)、取900μL的反应体系溶液、1μL L1(L2)的DMSO溶液、50μL的GSH溶液, 50μL的GSTs溶液加到一个荧光比色皿中,37℃水浴下进行荧光扫描,随着时间的增加,676 nm(L1)686nm(L2)处荧光强度逐渐增强。 [0016] (3)、在5个2mL的EP管中,分别加入体系溶液944μL、943μL、942μL、941μL、 940μL;1μL L1的DMSO溶液;50μL的GSH溶液,不同量的GSTs溶液,使GSTs在体系中的浓度分别为6μg/mL、7μg/mL、8μg/mL、9μg/mL、10μg/mL、摇匀在37℃水浴中放置 3h后,在676nm处扫描各浓度的荧光强度。以GSTs浓度为横坐标,676nm荧光强度为纵坐标绘制图,得GSTs的工作曲线;线2 性回归方程为:y=6.507x+48.218,R=0.99445。x的单位为μg/mL。 [0017] (4)、在6个2mL的EP管中,先分别加入体系溶液950μL;1μL L2的DMSO溶液; 50μL的GSH溶液,不同量的GSTs溶液,使GSTs在体系中的浓度分别为50ng/mL、100 ng/mL、200ng/mL、300ng/mL、400ng/mL、500ng/mL,摇匀在37℃水浴中放置3h后,在 686nm处扫描各浓度的荧光强度。以GSTs浓度为横坐标,686nm荧光强度为纵坐标绘制图,得GSTs的工作曲线;线性2 回归方程为:y=0.08197x+11.1103,R=0.99145。x的单位为ng/mL。 [0018] 与现有技术相比,本发明具有如下优点和效果: [0019] 1、本发碱性染料近红外荧光衍生物合成简单,成本较低; [0020] 2、本发明检测手段简单,只需紫外分光光度计和荧光检测器即可; [0021] 3、本发明近红外荧光探针L1、L2能实现对GSTs的动态检测,选择性较高、灵敏度较好,检出限很低; [0023] 图1实施例1制备荧光探针L1氢谱图 [0024] 图2实施例1制备荧光探针L1碳谱图 [0025] 图3实施例1制备荧光探针L1的质谱图 [0026] 图4实施例1制备荧光探针L2氢谱图 [0027] 图5实施例1制备荧光探针L2碳谱图 [0028] 图6实施例1制备荧光探针L2的质谱图 [0029] 图7实施例2L1与GSH和GSTs的作用的荧光光谱图 [0030] 图8实施例2L2与GSH和GSTs的作用的荧光光谱图 [0031] 图9实施例3L1的GSTs工作曲线图 [0032] 图10实施例4L2的GSTs工作曲线图 [0033] 图11实施例5L1的选择性荧光柱状图 [0034] 图12实施例5L2的选择性荧光柱状图 [0035] 图13实施例6L1、L2在HepG‑2中的荧光成像图 [0036] 图14实施例7L1、L2在HepG‑2中分别加入EA和NEM的荧光成像图 具体实施方式[0037] 下面结合实施例和附图对本发明做进一步说明,但本发明不受下述实施例的限制。 [0038] 实施例1 [0039] L1、L2的合成和表征 [0040] (1)将对羟基苯甲醇(5mmol,620.6mg)溶于15mL二氯甲烷中,于冰水浴中搅拌5 min,随后加入三乙胺(15mmol,2mL),搅拌30min后滴加溶于10mL二氯甲烷的1‑氯‑2,4‑ 二硝基苯(5mmol,1005mg),搅拌反应过夜,TLC检测反应进程,用饱和NaCl (3×50mL)和二氯甲烷(3×50mL)萃取洗涤,无水硫酸钠干燥有机相,用石油醚 /乙酸乙酯=3:1过柱纯化得纯产物(4‑(2,4‑二硝基酚氧基)苯基)甲醇(3.87mmol,1121.2mg),产率77.3%。 [0041] (2)将(4‑(2,4‑二硝基酚氧基)苯基)甲醇(173.8mg,0.6mmol),3,7‑双(二乙氨基)‑10H‑ 吩恶嗪‑10‑羰基氯(194.1mg,0.5mmol),碳酸钠(Na2CO3,160mg,1.5mmol)和4‑二甲氨基吡啶(DMAP,61.1mg,0.5mmol)溶于20mL二氯甲烷中,在氮气保护,冰浴条件下搅拌反应8h。除去溶剂并将粗产物进行硅胶柱色谱纯化,得到棕色固体4‑(2,4‑二硝基苯氧基) 苄基3,7‑双(二乙氨基)‑10H‑苯恶嗪‑10‑羧酸酯 (L1,51.3mg,0.08mmol);产率16%。1H NMR (600MHz,DMSO)δ8.90(s,1H),8.43(d,J=9.2Hz,1H),7.55(d,J=8.1Hz,2H),7.30(dd,J= 12.9,8.8Hz,5H),7.18(d,J=9.2Hz,1H),6.40(d,J=8.8Hz,2H),6.33(s,2H),5.25(s,2H), 13 3.31 (d,J=6.8Hz,8H),1.06(t,J=6.7Hz,12H). C NMR(151MHz,DMSO)δ154.81,153.36, 153.01,150.78,146.09,141.47,139.46,134.34,130.33,129.67,125.21,121.94,120.38, 119.40, 116.37,106.26,98.68,66.59,43.83,12.36. [0042] (3)将(4‑(2,4‑二硝基酚氧基)苯基)甲醇(173.8mg,0.6mmol),3,7‑双(二甲氨基)‑10H‑ 吩噻嗪‑10‑羰基氯(174.5mg,0.5mmol),碳酸钠(Na2CO3,124.4mg,1.17mmol)和4‑二甲氨基吡啶(DMAP,61.1mg,0.5mmol)溶于20mL二氯甲烷中,在氮气保护,冰浴条件下搅拌反应8h。除去溶剂并将粗产物进行硅胶柱色谱纯化,得到棕色固体4‑(2,4‑二硝基苯氧基)苄基3,7‑双(二甲氨基)‑10H‑吩噻嗪‑10‑羧酸酯 (L2,90.15mg,0.15mmol),产率30%。 1H NMR(600MHz,DMSO)δ8.90(d,J=2.8Hz,1H),8.43(dd,J=9.3,2.8Hz,1H),7.48(d,J= 8.5Hz,2H),7.35(d,J=8.8Hz,2H),7.27(d,J=8.5Hz,2H),7.18(d,J=9.3Hz,1H),6.69(d, 13 J= 2.6Hz,2H),6.67(dd,J=8.9,2.7Hz,2H),5.21(s,2H),2.89(s,12H). C NMR(151MHz,DMSO) δ154.78,153.53,153.27,148.64,141.47,139.46,134.46,131.99,129.87,129.64, 127.47,127.01, 121.90,120.29,119.41,110.88,109.73,66.36,40.19. [0043] 实施例2 [0044] 配制pH=7的磷酸缓冲溶液(10mM,含无水乙醇10%)体系溶液,将L1(L2)溶于 DMSO配制成2mM的制备液,配置20mM的谷胱甘肽(GSH)溶液和1mg/mL的GSTs溶液;取900μL的反应体系溶液、1μL L1(L2)的DMSO溶液、50μL的GSH溶液,50μL 的GSTs溶液加到一个荧光比色皿中,37℃水浴下进行荧光扫描,随着时间的增加,676nm (L1)686nm(L2)处荧光强度逐渐增强。荧光发射图见图7、图8。 [0045] 实施例3 [0046] 配制pH=7的磷酸缓冲溶液(10mM,含无水乙醇10%)体系溶液,将L1溶于DMSO 配制成2mM的制备液,配置20mM的谷胱甘肽(GSH)溶液和1mg/mL的GSTs溶液;在 5个2mL的EP管中,分别加入体系溶液944μL、943μL、942μL、941μL、940μL;1μL L1 的DMSO溶液;50μL的GSH溶液,不同量的GSTs溶液,使GSTs在体系中的浓度分别为 6μg/mL、7μg/mL、8μg/mL、9μg/mL、10μg/mL、摇匀在37℃水浴中放置3h后,在676nm 处扫描各浓度的荧光强度。以GSTs浓度为横坐标,676nm荧光强度为纵坐标绘制图,得GSTs 的工作曲线如图9;线性回归方程为:y= 2 6.507x+48.218,R=0.99445。x的单位为μg/mL; [0047] 实施例4 [0048] 配制pH=7的磷酸缓冲溶液(10mM,含无水乙醇10%)体系溶液,将L1,L2溶于DMSO 配制成2mM的制备液,配置20mM的谷胱甘肽(GSH)溶液和1mg/mL的GSTs溶液;在 6个2mL的EP管中,先分别加入体系溶液950μL;1μL L2的DMSO溶液;50μL的GSH 溶液,不同量的GSTs溶液,使GSTs在体系中的浓度分别为50ng/mL、100ng/mL、200ng/mL、 300ng/mL、400ng/mL、500ng/mL,摇匀在37℃水浴中放置3h后,在686nm处扫描各浓度的荧光强度。以GSTs浓度为横坐标,686nm荧光强度为纵坐标绘制图,得GSTs的工作曲线如图10;线性回归方程为:y= 2 0.08197x+11.1103,R=0.99145。x的单位为ng/mL。 [0049] 实施例5 [0050] 配制pH=7的磷酸缓冲溶液(10mM,含无水乙醇10%)体系溶液。将L1或L2溶于DMSO 配制成2mM的制备液,配置20mM的谷胱甘肽(GSH)溶液和1mg/mL的GSTs溶液;在 9个2mL的EP管中分别加入体系溶液,1μL L1或L2的DMSO溶液,然后分别加入空白、 GSH(1mM),Cys(1mM),Hcy(1mM),H2S(1mM),GSTs(50μg/mL),GSH(1mM)+ Lysozyme(50μg/mL),GSH(1mM)+human albumin(50μg/mL),GSH(1mM)+GSTs(50 μg/mL),摇匀在37℃水浴中放置3h后,倒入荧光杯中在荧光光度计上扫描得各分析物676nm (L1)、686nm(L2)荧光强度。绘制柱状图,如图11、图12所示,只有GSH(1mM)+GSTs (50μg/mL)的荧光强度明显增强,其他分析物的荧光强度基本无明显变化。 [0051] 实施例6 [0052] 配制pH=7.4、浓度为10mM的PBS缓冲溶液,配制2mM L1、L2的DMSO溶液;10 μL L1、L2的DMSO溶液加入到2mL的PBS溶液中,使得其浓度为10μM;将此溶液加入 HepG‑2细胞中,在37℃下,孵育30min后,于共聚焦成像,荧光成像仪下显示较强的红色荧光;如图13所示。 [0053] 实施例7 [0054] 配制pH=7.4、浓度为10mM的PBS缓冲溶液,配制2mM L1、L2的DMSO溶液;用2 mL的500μM EA(GSTs的抑制剂)的PBS溶液孵育HepG‑2 30min,再用2mL PBS冲洗两次,再将10μL L1、L2的DMSO溶液加入到2mL的PBS溶液中,使得其浓度为10μM;将该溶液加入HepG‑2细胞中,在37℃下,孵育30min后,于共聚焦成像,荧光成像仪下显示红色荧光减弱;见图14。 [0055] 用2mL的50μM NEM(GSH的抑制剂)的PBS溶液孵育HepG‑2 30min,再用2mL PBS 冲洗两次,再将10μL L1、L2的DMSO溶液加入到2mL的PBS溶液中,使得其浓度为10μM;将该溶液加入HepG‑2细胞中,在37℃下,孵育30min后,2mL PBS冲洗两次,加入2mL PBS溶液于共聚焦成像,荧光成像仪下显示红色荧光减弱;见图14。 |