较重卤原子取代的斯夸苷基染料,其制备方法及其在光动力的治疗和工业应用中作为敏化剂用途

本发明涉及如下面分子式1的较重卤原子取代斯夸苷 (squaraine)基染料及其药学可接受的衍生物， 分子式1 其中X是较重卤原子，它们能被用于光动力的治疗和工业应用。本 发明还涉及一种较重卤原子取代斯夸苷基染料的制备方法及这种染 料在光动力的治疗和工业应用中作为敏化剂的用途。

本发明还涉及如分子式1的斯夸苷染料，其中X是溴或碘，或 其药学可接受的衍生物，它们可以在诊断和治疗人或动物的癌及其它 疾病的光动力应用中被用作光敏剂。

本发明还涉及其中X是重卤原子的如分子式1的斯夸苷染料或 其衍生物，它们可被用作水消毒的光动力工业应用中的光敏剂。

光动力治疗是用于癌症和多种疾病的诊断和治疗的最新方式。 大量证据提示光动力治疗代表一种用于许多癌症的方便有效的方 法。光动力治疗包括通过光和化学药品(光敏剂)的联合作用使活细 胞失活。在静脉注射后，光敏剂被肿瘤细胞选择性地保留。肿瘤组织 中比正常组织中有更多的敏化剂。当用特定波长的光或激光照射时， 敏化剂产生高反应性物种，这些高反应性物种改变生物组织而引起癌 细胞的选择性破坏。

唯一已经过广泛研究的敏化剂是光敏钠，一种血卟啉衍生物 (HpD)，也称为第一代光敏剂。光敏钠和其商业变体Photosan、发 光菌是首先被许可临床使用并首先获得管理批准的。可是，光敏钠的 缺点是它是一种组份对所采用的合成方法高度敏感的混合物产品。已 知会引起皮肤光敏性的不希望的副作用，因为它自身体缓释。在这些 情况下，用光敏钠治疗的病人需要长时间呆在黑暗中直到它从身体内 排泄完。光敏钠在光谱的红区仅有微弱的吸收(在630nm的摩尔吸 收系数为3000 M-1cm-1)，导致难于将光传送到某些肿瘤位置以及 大肿瘤光穿透的不完全。因此，利用光敏钠的光动力治疗仅显示在小 于10mm深度的表层的癌。可以参考Dougherty，T.J.Photochem. Photobiol.1987，45，879；Kessel，D.；Dougherry，T.J.Phorphyrin Photosensitization；Plenum Publishing Corp.；New York，1983；Brown， S.B.；Truscott，T.G.Chem.Ber，1993，29，955；Andreoni，A.；Cubeddu， R.Phorphyrins in Tumor Phototherapy；Plenum Publishing Corp.：New York，1984；Brasseur，N.；Hasarat，A.；Langlois，R.；Wagner，J.R.； Roussean，J.；van Lier J.E.Photochem.Photobiol.1987，45，581；Spikes， J.D.，Photochem.Photobiol.1986，43，691；Firey，P.A.；Ford，W.E.； Sounik，J.R.；Kenney，M.E，；Rodgers，M.A.J.J.Am.Chem.Soc.1988， 110，7626；Moan，J.Cancer Lett.1986，33，45；Tralau，C.J.；Young，A. R.；Walker，N.P.J.；Vernon，D.I.；MacRobert，A.J.；Brown，S.B.； Brown，S.G.Photochem.Photobiol.1989，49，305。

为了克服第一代敏化剂的缺点，合成了在长波长区表现出强吸 收的第二代敏化剂。正在光动力治疗的不同临床阶段进行评价的第二 代敏化剂包括二氢卟吩类、porphycenes、苯并卟啉类、酞菁类、红紫 素类和氨基乙酰基丙酸介导的卟啉类。红紫素类具有良好的光学性质 和生物分布型，但是需要加溶剂和乳化剂如脂质体或脂蛋白用于其光 动力应用。二氢卟吩类在光谱的红区和红外区有强吸收并与光敏钠竞 争，但皮肤光敏性是它们的主要问题。已经发现酞菁和金属酞箐类在 600-700nm区有强吸收，但是磺化程度对光动力活性的细节是不清 楚的。可以参见美国专利第603267、5965598、5889181、586035和 5789586号；Kostenich，G.A.；Zuravkin，I.N.；Zhavrid，E.A.J. Photochem.Photobiol.B.Biol.1994，22，211；Leach，M，W.；Higgins，R. J.；Autry，S.A.；Boggan，J.E.；Lee，S.-J.H.；Smith，K.M.Photochem. Photobiol.，Bai，S.；Lin，C.；Guo，Z.Proc.SPIE 1993，1616，275；Vogel， E.；Kocher，M.Schmickler，H.；Lex，J.Angew.Chem.Int.Ed.Engl.1986， 25，197；Leunig，M.；Richert，C.；Gamarra，F.；Lumper，W.；Vogel，E.； Jochani D.；Goetz，A.E.Br.J.Cancer 1993，68，225；Boyle，R.W.； Legnoff，C.C.；Vanheir，J.E.Br.J.Cancer 1993，67，1177；Wohrl，D.； Shopova，M.；Muller，S.；Muleiv，A.D.；Mantereva，V.N.；Krastev，K.K. J.Photochem.Photobiol.B.Biol.1993，21，155；Morgan，A.R.；Garbo， G.M.；Keck，R.W.；Ericksen，L.D.；Selman，S.H.Photochem. Photobiol.1990，51，589。

仍期望开发这样的光敏剂，它在长波长区有强吸收，对正常组 织无毒，在生理pH时溶于缓冲液，能够在光动力治疗期间被漂白， 并显示出更高的治疗效果。

斯夸苷形成一类染料，在红至接近红外区具有尖锐并且强的吸 收带。这些染料的摩尔吸收系数通常在500,000M-1CM-1范围内。斯 夸苷在静电复印光感受器、太阳能电池和光学记录装置中有工业应 用。然而，由于这些染料非常低的系间窜越效率，它们作为光动力治 疗应用中的光敏剂的潜力还没有研究。可以参考美国专利第 6001523、5552253、5444463号；Law，K.-Y.Chem.Rev.1993，93，449； Piechowski，A.P；Bird，G.R；Morel，D.L；Stogryn，E.L.J.Phy.Chem. 1984，88，934。

因此，研究斯夸苷基染料以观察与先前技术有关的问题是否可 以被克服。本发明的一个目的是提供一种光敏剂，基于斯夸苷部分， 它适用于光动力治疗应用。我们的初步研究表明当与母体未取代斯夸 苷染料相比时，斯夸苷部分的卤化作用导致增大的水溶性和系间窜越 效率。这些卤化染料在近红外区(＞600nm)表现出强吸收和在微观 不均一性介质中显著的红移。三重激发态是包含在这些系统中的主要 过渡态，它与分子氧有效地相互作用以定量的收率产生生物学高反应 性的单线态氧，由此使它们成为光治疗应用中潜在的候选者。可以参 考Ramaiah，D.；Joy，A.；Chandrasekhar，N；Eldho，N.V.；Das，S.； George，M.V.Photochem.Photobiol.1997，65，783。

可是，这些卤化斯夸苷染料的收率在规定的条件下较低，并且 在膜模型和药物载体系统如聚合物中其单线态氧(胞毒剂)的产生效 率是未知的。而且，在文献中对斯夸苷基染料的生物学性质或光动力 治疗应用尚无报道。对于确定敏化剂在光动力治疗应用中的用途是重 要的生物学性质包括敏化剂在生理pH和照射条件下的稳定性、细胞 毒性、药理学方面、生殖毒性和它的体内光动力活性的效率等。

本发明试图克服上述限制。在本发明中通过修改加工条件，我 们得到了收率增加的较重卤原子改性的斯夸苷基染料。我们首次研究 了典型的斯夸苷基光敏剂的生物学性质。这些研究包括这些敏化剂在 生理pH条件下的稳定性、细胞毒性和在黑暗中和照射条件下的诱变 性。另外研究了这些敏化剂的光动力作用的体内和体外效率和机理。

本发明的主要目的是提供有效的斯夸苷基染料和/或其药学可接 受的衍生物，它们能够在光动力治疗应用包括癌症的治疗中用作敏化 剂。

本发明的另一个目的是提供斯夸苷基染料和/或其药学衍生物， 由于它们在微观不均一性介质中的高荧光量子产率，它们能被用作诊 断癌的荧光传感器。

本发明的又一目的是提供斯夸苷基染料和/或其衍生物，它们能 够用于光动力工业应用如水的消毒等。

本发明的再一目的是通过在化学装置中连接或引入斯夸苷基染 料，能够实现使这种药物传递或靶向于确定的活细胞的生物学专一 性，由此有效的第三代光敏剂也能够开发出来。

在说明书附图中 图1表示在有光和无光情况下，如分子式1的斯夸苷染料的细胞杀伤 效率的曲线图。 图2表示在有光和无光情况下，通过双(3，5-二溴-2，4，6-三羟基苯基) 斯夸苷的突变种诱导的曲线图。 图3表示在有光和无光情况下，通过双(3，5-二碘-2，4，6-三羟基苯基) 斯夸苷的突变种诱导的曲线图。 图4表示在有光和无光情况下，通过双(3，5-二溴-2，4，6-三羟基苯基) 斯夸苷的微核诱导的曲线图。 图5表示在有光和无光情况下，通过双(3，5-二碘-2，4，6-三羟基苯基) 斯夸苷的微核诱导的曲线图。

因此，本发明涉及一种如分子式1的较重卤原子取代斯夸苷染 料和其药学可接受的衍生物，其中X是较重卤原子。 分子式1

在本发明的一个实施方案中，X选自溴或碘。

在本发明的另一实施方案中，如分子式1的化合物是双(3，5- 二溴-2，4，6-三羟基苯基)斯夸苷。

在本发明的另一实施方案中，如分子式1的化合物是双(3，5- 二碘-2，4，6-三羟基苯基)斯夸苷。

本发明还涉及如分子式1的较重卤原子取代的斯夸苷染料或其 药学可接受的衍生物的制备方法，其中X是较重卤原子， 分子式1 包括双(2，4，6三羟基苯基)斯夸苷与卤素溶液或卤盐在有机酸中， 在50-80℃的温度范围内，在搅拌下反应1-5小时，冷却上述反应 混合物，过滤并洗涤所得化合物，接着重结晶得到所需化合物。

在本发明的一个实施方案中，卤盐是一氯化卤。

在本发明的另一实施方案中，有机酸是冰醋酸。

在本发明的又一实施方案中，在过滤和洗涤步骤之前将水加入 反应混合物中。

在本发明的再一实施方案中，卤原子选自溴和碘。

本发明还涉及如分子式1的化合物在光动力治疗应用中作为光 敏剂的用途。

在本发明的另一个实施方案中，如分子式1的化合物用作肿瘤 的荧光检测剂并用在癌及其它有关疾病的光动力治疗中。

本发明还涉及如分子式1的化合物在水消毒中作为敏化剂的用 途。

本发明也涉及如分子式1的化合物在通过将其引入化学装置使 这种药物靶向于确定的活细胞来设计有效的第三代光敏剂中的用 途。

在如分子式1的化合物的制备中，双(2，4，6-三羟基苯基)斯夸 苷的芳环用较重卤原子如溴改性以得到双(3，5-二溴-2，4，6-三羟基苯 基)斯夸苷和用碘改性以得到双(3，5-二碘-2，4，6-三羟基苯基)斯夸 苷。

观察到具有斯夸苷部分的结构式为双(3，5-二溴-2，4，6-三羟基苯 基)斯夸苷和双(3，5-二碘-2，4，6-三羟基苯基)斯夸苷的化合物及其 药学衍生物在生理pH条件下具有良好的溶解性和表现出很好地进入 光动力窗的强吸收(＞600nm)。这些染料在黑暗中是非常稳定且无 毒的，并且当暴露于光时表现出良好的细胞杀伤效率。它们进行快速 的光漂白并且它们的光降解产物在有光和无光的情况下是无毒的。它 们不诱导显著的突变。由于上述斯夸苷基染料具有良好的光物理和生 物学性质，这些化合物非常适合作为光敏剂用于光动力治疗和工业应 用。

下面的实施例是说明性，因此，它们不应被认为是限制本发明 范围的。 实施例1

双(2，4，6-三羟基苯基)斯夸苷(Triebs，A；Jacob，K.Angew，Chem. Int.Ed.Engl.1965，4，694)通过在50-60℃搅拌溶液1-3h溶解在 冰醋酸中(1∶4.7×103)中。溶液冷却后，溴的醋酸溶液(1∶1.7×102) 在1-2h内被逐滴加入，反应混合物在50-60℃加热1-2h，然后 在冰箱中保存10-12h。将形成的沉淀物过滤并用75-100ml水洗 涤。然后，从水与异丙醇(3∶1)的混合物中重结晶得到75-85％的 双(3，5-二溴-2，4，6-三羟基苯基)斯夸苷。

双(3，5-二溴-2，4，6-三羟基苯基)斯夸苷的生化性质：熔点314 -315℃，IR(KBr)νmax3413，1622，726和519cm-1；分子量：计 算的642.6874；测定的642.6879(HRMS)；UV[20％v/v甲醇-水] λmax610nm(ε47000M-1cm-1)；[甲醇]λmax612nm(ε210000M -1cm-1)；性状：深蓝色粉末。 实施例2

双(2，4，6-三羟基苯基)斯夸苷(Triebs，A；Jacob，K.Angew，Chem. Int.Ed.Engl.1965，4，694)通过在60℃-70℃搅拌溶液1-2h溶解 在冰醋酸(1∶4.7×103)中。冷却后，冰醋酸中的一氯化碘(1∶1.7× 102)在1-2h内被逐滴加入。将反应混合物在50-60℃加热1-2h， 把15ml的水加入其中，并在冰箱中保存10-12h。将形成的沉淀物 过滤，用水(75-100ml)洗涤，并从甲醇与异丙醇(3∶1)的混合 物中重结晶得到65-75％的双(3，5-二碘-2，4，6-三羟基苯基)斯夸苷。

双(3，5-二碘-2，4，6-三羟基苯基)斯夸苷的生化性质：熔点270 -271℃；IR(KBr)νmax3383，1603，726和568cm-1；分子量：计 算的834.6320；测定的834.8360(HRMS)；UV[20％v/v甲醇-水] λmax617nm(ε63000M-1cm-1)，[甲醇]λmax620nm(ε249000M -1cm-1)；性状：深蓝色粉末。 实施例3

由于三线激发态是双(3，5-二溴-2，4，6-三羟基苯基)斯夸苷和双 (3，5-二碘-2，4，6-三羟基苯基)斯夸苷从532nm激光闪烁光分解研究 得到的主要瞬时中间产物，所以，测定了由这些系统产生光敏单线态 氧的效率，因为单线态氧是在光动力治疗中II型反应的主要胞毒剂。 由于双(3，5-二溴-2，4，6-三羟基苯基)斯夸苷和双(3，5-二碘-2，4，6-三 羟基苯基)斯夸苷的单脱质子化形式有大的三线态收率并有长的寿命 (Ramaaiah.D.Joy，A；Chandrasekhar，N；Eldho，N.V；Das，S；George， M.V.Photochem.Photobiol.1997，65，783)，而且这些是所期望在生 理pH条件(约7.4)下的主要种类的形式。这些染料在光动力治疗 中用作敏化剂的一级特征，我们研究了在药物载体、膜模拟物和微观 不均一性介质存在下，它们的单线态氧产生效率。在聚乙烯吡咯烷酮 (PVP)存在下，使用双(3，5-二溴-2，4，6-三羟基苯基)斯夸苷和双(3，5- 二碘-2，4，6-三羟基苯基)斯夸苷所得的结果列于表1中。

表1列出了在存在和不存在聚乙烯吡咯烷酮的情况下双(3，5- 二溴-2，4，6-三羟基苯基)斯夸苷和双(3，5-二碘-2，4，6-三羟基苯基)斯 夸苷的单线态氧产生效率。

                   表1 化合物                                    PVP，mM    单线态氧量子产率 双(3，5-二溴-2，4，6-三羟基苯基)斯夸苷       0          0.13±0.005

                                         14         0.29±0.001 双(3，5-二碘-2，4，6-三羟基苯基)斯夸苷       0          0.47±0.017

                                         14         0.62±0.007

该结果显示在由双(3，5-二溴-2，4，6-三羟基苯基)斯夸苷和双(3，5- 二碘-2，4，6-三羟基苯基)斯夸苷两者敏化的情况中，在PVP存在下， 单线态氧的量子产率均显著增加。在双(3，5-二碘-2，4，6-三羟基苯基) 斯夸苷的情况中，单线态氧的产生效率在微观不均一性介质中比在甲 醇中多近15％。另外，这些研究指出较重卤原子取代斯夸苷染料能 作为光动力治疗应用中有效的光敏剂。 实施例4

通过使用质粒DNA(PM2 DNA)和研究在各种条件下的DNA 裂解，对斯夸苷体的外光动力活性的机理进行了详细的评估。DNA 裂解之后，调控超螺旋(形式I)转变到开环(形式II)和直线形式 (形式III)。通过化合物/剂的一种单股断裂的诱导使形式I转变为 形式II，以及通过如以前文献(Epe，B.；Hegler，J.J.Methods Enzymol. 1994，234，122)所述的DNA弛豫分析对这些形式的定量，表明了它 的DNA裂解效率。质粒DNA裂解是非常灵敏的技术，它可以被用 于测试敏化剂的各种性质以及通过使用清除剂和活化剂得到的DNA 损伤分布型，能用作对损伤有直接责任的物种的一种指纹图谱并且也 提供体外光动力活性机理的信息。

在冰上的磷酸盐缓冲液(5mM KH2PO4，50mM NaCl，pH7.4) 中的PM2 DNA(10,000bp，10μg/ml)被暴露于斯夸苷染料外加来自 距离33cm的1000W卤灯(Philips，PF811)的光线下。改性DNA 通过乙醇/乙酸钠沉淀和通过DNA弛豫分析定量单股断裂(SSB)。 将超氧物歧化酶(SOD)(20μg/m)、过氧化氢酶(315U/ml)加 入或用D2O取代缓冲液中的H2O(最终的同位素纯度大于96％)以 便对包含的活性物质有更好的了解。对典型的斯夸苷基染料双(3，5- 二溴-2，4，6-三羟基苯基)斯夸苷和双(3，5-二碘-2，4，6-三羟基苯基)斯 夸苷的这些研究结果列于表2中。

表2列出了在有和没有添加剂的情况下，通过双(3，5-二溴-2，4，6- 三羟基苯基)斯夸苷和双(3，5-二碘-2，4，6-三羟基苯基)斯夸苷使质 粒DNA裂解的效率。

表2所列的结果指出，超氧化物歧化酶和过氧化氢酶对双(3，5- 二溴-2，4，6-三羟基苯基)斯夸苷和双(3，5-二碘-2，4，6-三羟基苯基)斯 夸苷诱导的DNA裂解效率都没有显著影响。因此，在磷酸盐缓冲液 (pH7.4)中没有添加剂的情况下观察到的过氧化物和过氧化氢(单 股断裂(SSB)的可能数量定为100％。

                  表2 在下列条件下单股断裂的相对数量(％) 化合物

           pH7.0     pH7.8    D2O     SOD     过氧化氢酶

                             缓冲液 (20g/mL)    (315U/mL) 双(3，5-二溴- 127±12   105±4   526±28  109±5      115±5 2，4，6-三羟基 苯基)斯夸苷 双(3，5-二碘- 134±9    109±22  614±97  100±2       92±6 2，4，6-三羟基 苯基)斯夸苷

这些物种后来的芬顿(Fenton)反应不包括在DNA裂解中。在D2O 中双(3，5-二溴-2，4，6-三羟基苯基)斯夸苷和双(3，5-二碘-2，4，6-三羟 基苯基)斯夸苷诱导的DNA裂解近5和6倍的增强有力地表明，在 这些情况中体外的光动力活性是由单线态氧介导的。 实施例5

在有光和无光的情况中敏化剂的稳定性信息对于它的实际使用 是重要的。因此，通过利用分光光度法测定吸光度变化研究了在有光 和无光情况下，在乙醇和磷酸盐缓冲液中，在生理pH条件(pH7.4) 下，在25℃时这些染料的稳定性。典型的斯夸苷基染料双(3，5-二溴 -2，4，6-三羟基苯基)斯夸苷和双(3，5-二碘-2，4，6-三羟基苯基)斯夸苷 在黑暗中相对时间的吸光度变化结果列于表3中。

表3列出了双(3，5-二溴-2，4，6-三羟基苯基)斯夸苷和双(3，5- 二碘-2，4，6-三羟基苯基)斯夸苷在乙醇和缓冲液(pH7.4)中，在黑 暗中的稳定性。

                      表3 在黑暗                         吸光度 中的时  双(3，5-二溴-2，4，6-    双(3，5-二溴-2，4，6-  双(3，5-二碘-2，4，6- 间，min   三羟基苯基)斯夸苷         三羟基苯基)斯夸苷     三羟基苯基)斯夸苷

           (乙醇)                    (缓冲液)              (缓冲液)

0           1.90                       1.84                   1.75    30           1.88                       1.72                   1.47    60           1.88                       1.65                   1.38    90           1.88                       1.61                   1.36

在黑暗中的结果显示染料双(3，5-二溴-2，4，6-三羟基苯基)斯夸 苷和双(3，5-二碘-2，4，6-三羟基苯基)斯夸苷在乙醇中非常稳定，但 超过90min，在pH7.4缓冲溶液中受到轻微的漂白。双(3，5-二溴-2，4，6- 三羟基苯基)斯夸苷和双(3，5-二碘-2，4，6-三羟基苯基)斯夸苷在pH 7.4缓冲溶液中，在照射条件下所得的结果列于表4中。

表4列出了双(3，5-二溴-2，4，6-三羟基苯基)斯夸苷和双(3，5- 二碘-2，4，6-三羟基苯基)斯夸苷在缓冲液(pH7.4)中，在照射条件 下的稳定性。

                            表4 在黑暗中的时                        吸光度 间，min    双(3，5-二溴-2，4，6-三羟    双(3，5-二碘-2，4，6-三羟基苯

               基苯基)斯夸苷                    基)斯夸苷    0                 1.8                               1.72    5                1.35                               0.87   10                1.30                               0.74   15                1.25                               0.65   20                1.17                               0.58   30                1.10                               0.47

在照射条件下(1000W卤灯(Philips，PF811)，距离33cm) 的结果显示，这些染料表现出显著的光漂白。与双(3，5-二溴-2，4，6- 三羟基苯基)斯夸苷(25％)比较，化合物双(3，5-二碘-2，4，6-三羟 基苯基)斯夸苷受到很迅速的光漂白(在照射5min内近50％)，在 两种情况中光漂白均随照射时间的增长而增加。尽管光漂白可能被认 为是在肿瘤光敏剂中不利的性质，但由于可以调节剂量到保持肿瘤中 的光敏剂在有效水平，它具有潜在的益处。另外，因为它们的快速光 漂白，光动力治疗后的病人不需要长时间呆在黑暗中，并且如果需 要，治疗可以短时间间隔频繁地重复。 实施例6

为了测定有光与无光时斯夸苷基敏化剂的细胞杀伤效率(细胞 毒性)，将AS52细胞暴露在各种浓度的敏化剂下，暴露于光是用1000 W卤灯，距离33cm，在无Ca2+和Mg2+的PBS(140mM NaCl，3mM KCl，8mM Na2HPO4，pH7.4)中在冰上(106细胞/ml)进行的。照明 10min相当于在400和800nm之间的225kJ/m2。细胞通过离心成团 并在PBSG中重悬浮三次。细胞在新制介质中以3×104细胞/ml在37 ℃重悬浮，且细胞数被重复计数60小时。由生长曲线的指数部分(在 24和60h之间)，在重悬浮时增殖的细胞数通过外推法计算。细胞 存活率定义为增殖与重悬浮细胞之比。用典型的斯夸苷基染料双(3，5- 二溴-2，4，6-三羟基苯基)斯夸苷和双(3，5-二碘-2，4，6-三羟基苯基)斯 夸苷得到的结果示于图1中。

该结果显示，在照明条件下，细胞存活率的百分数随双(3，5- 二溴-2，4，6-三羟基苯基)斯夸苷和双(3，5-二碘-2，4，6-三羟基苯基)斯 夸苷的浓度增加而降低，表明它们在这些条件下的高细胞杀伤效率。 同时，双(3，5-二溴-2，4，6-三羟基苯基)斯夸苷和双(3，5-二碘-2，4，6- 三羟基苯基)斯夸苷在黑暗中没有表现出显著的效果，由此表明了它 们在无光情况下的无毒性。这些结果清楚地证明了较重卤原子取代斯 夸苷染料的光动力治疗应用。 实施例7

斯夸苷基敏化剂的诱变特性是在AS52细胞中测定的，该AS52 细胞携带有细菌的鸟嘌呤转磷酸核糖基酶(gpt)基因作为赋与对6 -硫代鸟嘌呤的敏感性的选择标记。AS52细胞在含有11μg/ml黄嘌 呤219μg/ml黄嘌呤、22μg/ml腺嘌呤、1.2μg/ml氨蝶呤和8.8μg/ml 霉酚酸的清洁介质中培养一星期，以消除自发gpt突变种。细胞(0.5 ×106)在回收介质(含1.2μg/ml胸腺嘧啶脱氧核苷、11.5μg/ml黄 嘌呤、3μg/ml腺嘌呤)中培养48h，然后，如上所述在有光和无光 的情况下，暴露于双(3，5-二溴-2，4，6-三羟基苯基)斯夸苷和双(3，5- 二碘-2，4，6-三羟基苯基)斯夸苷中，之后培养一星期(表达时间)。 在此时间内，保持细胞指数增长。2×105个细胞被稀释在10ml培养 介质中和被平铺在皮氏培养皿(94mm)中。2小时后，将6-硫代 鸟嘌呤加入到各平皿(终浓度2.5μg/ml)中以选择。将200个细胞 加入到5ml培养介质平铺在皮氏培养皿(60mm)中以确定克隆效 率。将平皿保温7至9天。用Nacl溶液(0.9％v/v)代替介质。细 胞群用甲醇(-20℃)固定15min并用吉姆萨(Giemsa)(10％在H2O中)染色15min。暴露于斯夸苷外加光线后接下来的抗6-硫代鸟嘌 呤细胞的定量和细胞毒性的确定(处理和未处理的细胞的平皿培养效 率之比)，根据文献(Tindall，K.R；Stankowski Jr.L.F.；Machanoff，R.； Hsie，A.W.Mutat Res.1986，160，121-131)进行。

所得结果示于图2和图3中，它们表明在有光和无光情况下双 (3，5-二溴-2，4，6-三羟基苯基)斯夸苷和双(3，5-二碘-2，4，6-三羟基苯 基)斯夸苷不诱导立即的突变。虽然在有光的情况发现有严重的细胞 毒性，但当与黑暗和控制值比较时，未发现自发突变频率的显著增 加。 实施例8

为进一步了解遗传效果，由双(3，5-二溴-2，4，6-三羟基苯基)斯 夸苷和双(3，5-二碘-2，4，6-三羟基苯基)斯夸苷诱导的微核也在AS52 细胞中定量。AS52细胞被如上所述地暴露于斯夸苷中及在全部介质 中重悬浮。在39℃培养24小时后，约1×105个细胞通过细胞旋转离 心法和用甲醇在-21℃处理1小时被固定在显微镜的载玻片上。在 PBS(无Ca2+和Mg2+)中用二苯并二酰亚胺(bisbenzimide)染色3min 后，用荧光显微镜检测了2000个细胞的微核存在。所得结果示于图 4和图5中，它们表明这些染料没有诱导大量的微核。

本发明的斯夸苷基染料具有用于光动力的治疗和工业应用中的 光敏剂的令人满意的性质。这些系统的主要优点包括：

1.以双(3，5-二溴-2，4，6-三羟基苯基)斯夸苷和双(3，5-二碘-2，4，6- 三羟基苯基)斯夸苷结构为代表的斯夸苷基敏化剂是纯的单一 物质。

2.它们的合成工艺是经济的。

3.它们在黑暗中十分稳定并且在膜模型和载体系统存在时其稳定 性增加。

4.它们在生理pH条件下的缓冲液中有非常好的溶解性，因此，药 物制剂能够通过本身的传统工艺来制备并避免使用添加剂和载 体。

5.它们具有良好的吸收性质(＞600nm)及很大的吸收系数，(约 100,000M-1cm-1)

6.它们具有好的长寿命的三线态收率并且在膜模型和载体系统中 以定量收率产生单线态氧。

7.它们在黑暗中无毒而且当暴露于光时显示出良好的细胞杀伤作 用，如所希望的理想的光敏剂一样。

8.它们受到快速的光漂白，因此，光动力治疗后的病人不需要长 时间呆在黑暗中，并且如果需要，治疗可以短时间间隔频繁地 重复。

9.在有光和无光情况下，它们的光降解副产物是无毒的。

10.这些染料的光动力活性在暴露于光下5min内是最大的，因此， 用于治疗需要非常短的照射时间间隔。

11.它们是非诱变的。

12.它们可以被有效地用于靶向于确定的细胞器的第三代光敏剂的 合成。