一种蒽类荧光染料的合成和应用 |
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| 申请号 | CN201510155218.9 | 申请日 | 2015-04-03 | 公开(公告)号 | CN105315698B | 公开(公告)日 | 2017-07-28 |
| 申请人 | 北京大学; | 发明人 | 黄岩谊; 段海峰; 陈子天; 谢晓亮; | ||||
| 摘要 | 本 发明 提供了一类新的 荧光 染料结构及其合成方法，该类蒽结构 荧光染料 具有相似于荧光素类分子的高吸光系数、高量子产率等性能，同时有具有更加红移的激发和发射 波长 。本发明提供的合成方法简单经济，适于大量合成和对分子结构进行基团修饰。本发明列举了通过将该类分子进行磷 酸化 修饰，可以得到一类具有荧光可产生性质的 磷酸 酶底物分子，具有广泛的 生物 学应用前景。 | ||||||
| 权利要求 | 1.一种以蒽结构为母体的荧光染料，其特征在于：具有如下通式(1)所示结构 |
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| 说明书全文 | 一种蒽类荧光染料的合成和应用技术领域[0002] 随着现代生物技术的发展，荧光染料化合物作为一种分子功能探针在生命科学、化学生物学等各个领域得到了广泛的应用，成为人们研究分子诊断技术、免疫分析检测等方面的有利武器。在众多的荧光染料中，有一类染料具备一种性质，即染料本身在经过一定的化学基团修饰之后，该染料衍生物即改变了其自身原有的荧光性质，通常表现为荧光效率的大幅下降或消失，而在将该类衍生物作为底物参与到酶反应或者其他类型的反应之后，其修饰基团脱落，从而释放原有的母体颜料结构，重新恢复其荧光性质。我们称这类荧光染料具备荧光可产生性(Fluorogenic dye)，而衍生后的荧光分子为荧光可产生分子(Fluorogenic molecules)。因为其独特的性质，使得此类分子在很多领域得到应用，并继续期待着更多应用的出现。但是有一点必须指出，虽然现有的荧光染料化合物在整个光谱范围内分布在从紫外波段到近红外的广泛区域内，但是只有一小部分荧光染料可以用来进行荧光可产生性修饰，其中包括处在紫外区域的香豆素类(coumarin)，蓝色区域的氧杂蒽类(如荧光素fluorescein)，橙色区域的试卤灵类(resorufin)和红色区域的茚酮类。目前来看，即使在这些类荧光染料中，激发波长落在绿光区(如545nm)的染料结构却很少，而追求长激发波长和廉价激发光源的荧光染料一直受人们关注，因为除了经济因素，长波长可以减少生物组织的自发背景，并有更小的光损伤，更深的组织渗透性。 [0003] 为找到这一区域的合适的荧光可生荧光性染料，人们常用采用对荧光素或者罗丹明类染料进行化学修饰的手段，一方面因为这两类荧光染料具有出色的消光系数和量子产率，另外结构改造所涉及到的化学合成也相对方便，含有氧杂蒽结构的荧光素类染料尤其如此。另一方面，通常情况下基团修饰(比如甲基化或者卤代)可以使发射波长红移，如多氯代的荧光素发射波长可以红移70nm左右，但是也同时造成荧光量子产率严重下降。对罗丹明类的甲基化等修饰虽然不至于严重影响量子产率，但是多甲基化的氮原子是很难再通过酰化等手段合成为荧光可生分子的。 [0004] 另一种有效的改变发射波长的方法是通过将氧杂蒽类结构上的桥连氧原子置换为其它原子，已有研究表明含有硒、碳、硅、碲等元素作为桥连原子的染料母体结构可以显著红移荧光团的发射波长(Arden-Jacob etc Spectrochim.Acta，Part A 57，2271-2283；Kolmakov，K.etc Eur.J.Org.Chem.2010，3593-3610；Kolmakov，K.etc Photochem.Photobiol.Sci.11，522-532.)。据此方法，对于绿光区荧光染料的研究，Luke D.Lavis等做了很好的尝试(ACS Chem.Biol.2013，8，1303-1310)，他们用叔碳原子取代了荧光素中的桥连氧原子，证明该类染料拥有出色的光学性质。但是其合成涉及特种配体参与的过渡金属催化及不稳定中间体的生成，不利于规模性合成和衍生化。找到合适的合成途径和合成更多新的染料结构仍然是必要的。 发明内容： [0005] 本发明的目的是针对目前绿色激发波长下荧光可生性染料的种类和合成方法不足，提出一种蒽类荧光染料的合成方法，可以有效的提高收率，增加衍生化的易行性，降低大规模合成成本，提高荧光可生分子的光学性质，有力推动蒽类荧光素在分子标记方面的应用。 [0006] 在本发明的第一方面，提供了一种荧光素类似物一一碳桥取代的荧光素或者蒽类荧光素，具有长波长，荧光可生性衍生化简单易行，消光系数和量子产率堪比荧光素的染料分子，具有下列结构通式(1)： [0007] [0008] 本发明提供一种以蒽结构为母体的荧光染料，其特征在于：具有如通式(1)所示结构，其中R0可选自-H，磷酸基，取代的磷酸基；R1，R5可独立的选自-H、氟、氯、芳基、取代芳基、C1-C6烷基、取代的C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、取代的C1-C6烷氧基；R2-4，R6-8，R11-13可以独立的选自-H、氟、氯、溴、芳基、取代芳基、杂芳基、-CO2H、-CO2R、-SO3H、-SO3R、-CH2CO2H、-CH2CO2R、-CH2SO3H、-CH2SO3R、-CH2NH2、-CH2NHR、-NO2、C1-C6烷基、取代的C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、取代的C1-C6烷氧基、C1-C6烷氧基芳基、取代的C1-C6烷氧基芳基、苯基、取代苯基、联苯基、取代联苯基、苄基、取代苄基、苯甲酰基、取代苯甲酰基，其中R选自C1-C6烷基、取代的C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、取代的C1-C6烷氧基、C1-C6烷氧基芳基、取代的C1-C6烷氧基芳基、苯基、取代苯基、联苯基、取代联苯基、苄基、取代苄基、苯甲酰基、取代苯甲酰基；R9、R10可以独立的选自C1-C6烷基、取代的C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、取代的C1-C6烷氧基、C1-C6烷氧基芳基、取代的C1-C6烷氧基芳基、苄基、取代苄。 [0009] 本发明的上述目的是通过下面的技术方案实现的： [0011] (2)将上述二苯甲醇衍生物经过氧化反应转化为二苯甲酮衍生物。 [0012] (3)将上述二苯甲酮衍生物与金属试剂反应，得到二烷基取代的二苯甲烷衍生物。 [0013] (4)将上述二烷基二苯甲烷衍生物经过与金属试剂在低温下反应，生成芳基金属化合物。 [0014] (5)将上述芳基金属化合物与苯甲醛衍生物反应，生成加成产物即苯甲醇衍生物。 [0015] (6)将上述苯甲醇衍生物经过氧化生成苯甲酮衍生物. [0016] (7)将上述苯甲酮衍生物经过脱除酚羟基保护基团，得到双酚类化合物，通过脱水关环反应得到目标荧光物。 [0017] 根据本发明另一个优选的技术方案，R0为氢，R1为甲基，R2-8、R11-13为氢，R9、R10为甲基。 [0018] 根据本发明另一个优选的技术方案，R0为H2PO3-，R1为甲基，R2-8、R11-13为氢，R9、R10为甲基。 [0019] 根据本发明另一个优选的技术方案，R9或R10独立的选自甲基、乙基或丙基。 [0020] 根据本发明的优选的技术方案，合成方法中，步骤(1)中间羟基苯基金属试剂可以为格式试剂或锂试剂。 [0021] 根据本发明的优选的技术方案，合成方法中，步骤(4)中金属试剂为格式试剂或烷基锂试剂。 [0022] 根据本发明的优选的技术方案，合成方法中，步骤3中的金属试剂为烷基锌。 [0023] 根据本发明的优选的技术方案，合成方法中， [0024] 步骤7中脱水关环反应为，通过与甲磺酸等强酸加热反应生成目标荧光化合物。 [0025] 根据本发明的进一步优选的技术方案，R0为H2PO3-。其合成方法可以是将权利要求1所述荧光化合物溶于溶剂，加入三氯氧磷或者焦磷酰氯，反应一段时间后加入水进行水解，所得磷酸化产物经过HPLC分离提纯。 [0026] 根据本发明的优选的技术方案，合成方法中，所述溶剂为二氯甲烷，四氢呋喃，乙腈，DMF，磷酸三甲酯中的至少一种。 [0027] 根据本发明的优选的技术方案，合成方法中，将权利要求1所述荧光化合物溶于溶剂，在-10～10℃的反应温度条件下，加入三氯氧磷或者焦磷酰氯。 [0028] 本发明提供的荧光染料的激发光波长范围为510-590nm，优选530-580nm；发射光波长范围为550-650nm，优选550-650nm。 [0029] 在本类荧光化合物结构中，R1基团特征为氢、氟、氯、C1-C6烷基、取代烷基，烷氧基等非亲和核性官能团，一方面避免了在上下两部分芳环主体结构间形成闭合的螺环结构，从而避免了在蒽结构上形成两个酚羟基基团，使后续的对酚羟基进行荧光开启/关闭式修饰时只有一个酚羟基反应位点，更有利于衍生化修饰；另一方面，减小了荧光化合物本身的极性，从而增加了该类染料的细胞膜通透性，有利于活细胞成像、测序等方面的研究研究和应用。 [0030] 本发明提供一种新的蒽类荧光染料及其合成方法。该荧光染料具备510-590nm的激发波长范围，550-650nm的发射波长范围，填补了本领域的不足，可以有效的应用于活细胞成像、测序等技术领域，具有十分重要的应用价值。 [0031] 本发明提供了一类新的荧光染料结构及其合成方法，该类蒽结构荧光染料具有相似于荧光素类分子的高吸光系数、高量子产率等性能，同时有具有更加红移的激发和发射波长。本发明提供的合成方法简单经济，适于大量合成和对分子结构进行基团修饰。本发明列举了通过将该类分子进行磷酸化修饰，可以得到一类具有荧光可产生性质的磷酸酶底物分子，具有广泛的生物学应用前景。附图说明 [0032] 图1，荧光化合物1的激发和发射光谱 [0033] 图2，磷酸酶底物分子2经磷酸酶(CIP)水解前后荧光光谱比较具体实施方式： [0035] 产物分离鉴定的仪器和方法：薄层层析硅胶为GF254 60型(Merk公司生产)，采用254nm及360nm双波长紫外灯检测；柱层析硅胶为青岛海洋200-300目硅胶；核磁共振谱采用Varian VXR-500核磁共振仪测定；氢谱、碳谱以TMS为内标；反相色谱使用Agela Cheetah-2中压制备色谱仪，Agela AQ C-18制备柱分离。 [0036] 本发明具体实施方式中的具体实施例，仅仅是对于本发明的进一步说明，并不够成本发明的限制因素。 [0037] 实施例一： [0038] 蒽结构荧光素“北京橙”(Peking Orange)的合成： [0039] 所示通式(1)中，R1＝Me，R0＝H，R2-8，11-13＝H，合成路线如下所示 [0040] [0041] 试剂和反应条件：i)THF，-40℃；ii)DCM，PCC，硅藻土；iii)ZnMe2，TiCl4，DCM-40℃；iv)t-Buli，THF；邻甲基苯甲醛；v)DCM，PCC；vi)BBr3；MeSO3H [0042] 1.合成(2-溴-5-甲氧基苯基)-3-甲氧基苯甲醇1a [0043] [0044] 在装备有恒压滴液漏斗的250ml干燥圆底瓶中，将间甲氧基苯基氯化镁的80ml干燥四氢呋喃溶液冷至-40℃，在氩气保护下将3-甲氧基邻溴苯甲醛(10.8g)的20ml干燥四氢呋喃溶液通过恒压滴液漏斗逐滴加入反应瓶中，保持-40℃搅拌2-6小时，通过TLC监测反应，待原料3-甲氧基邻溴苯甲醛消失后停止反应，加入20ml饱和氯化铵水溶液淬灭反应。反应混合物经旋转蒸发仪除去绝大部分四氢呋喃后分两次加入100ml二氯甲烷，经分液后合并有机相，有机相经过饱和食盐水洗涤、Na2SO4干燥、旋转蒸发仪浓缩后用硅胶柱层析，展开剂石油醚/乙酸乙酯～10/1，收集Rf～0.3产物点，得15g无色液体，收率93％。 [0045] 1H NMR(CDCl3，500MHz)：δ7.39(d，J＝10Hz，1H，Ar-H)，7.23(t，J＝10Hz，1H，Ar-H)，7.13(d，J＝5Hz，1H，Ar-H)，6.96(m，1H，Ar-H)，6.81-6.79(m，1H，Ar-H)，6.96(m，1H，Ar-H)， 6.70(dd，J＝10Hz，5Hz，1H，Ar-H)，6.08(d，1H，CH)，3.77(s，3H)，3.75(s，3H).13C NMR(126MHz，CDCl3)δ159.70，159.29，143.76，143.48，133.41，129.51，119.33，115.12， 114.01，113.11，113.05，112.80，74.63，55.49，55.23.HRMS：Calcd for C15H15BrO3Na(M+Na)，345.0097.Found，m/z 345.0096. [0046] 2.合成(2-溴-5-甲氧基苯基)-3-甲氧基苯甲酮1b [0047] [0048] 取(2-溴-5-甲氧基苯基)-3-甲氧基苯甲醇1a(6.5g)溶于80ml二氯甲烷中，快速搅拌下再加入10g氯铬酸吡啶盐(PCC)，室温下反应2-5h，TLC监测该反应直至原料基本消失后停止，反应液经过硅藻土助滤短柱过滤，二氯甲烷淋洗后收集滤液，旋转蒸发仪浓缩后经硅胶柱柱层析，展开剂石油醚/乙酸乙酯～10/1，收集Rf～0.6产物点，浓缩后得微黄色固体6.1g，收率95％。 [0049] 1H NMR(CDCl3，500MHz)：δ7.50(d，J＝10Hz，1H，Ar-H)，7.45(m，1H，Ar-H)，7.35(d，J＝10Hz，1H，Ar-H)，7.31-7.29(m，1H，Ar-H)，7.16-7.14(m，1H，Ar-H)，6.91-6.88(m，1H，Ar-H)，6.87(d，J＝5Hz，1H，Ar-H)，3.85(s，3H)，3.79(s，3H).13C NMR(126MHz，CDCl3)δ195.40，159.92，158.74，141.48，137.29，133.93，129.61，123.52，120.47，117.36，114.18，113.76， 109.69，77.05，55.65，55.49.HRMS：Calcd for C15H14BrO3(M+H)，321.0121.Found，m/z 321.0120. [0050] 3.合成1-溴-4-甲氧基-2-(2-(3-甲氧基苯基异丙基))苯1c [0051] [0052] 在干燥的250ml圆底瓶中加入70ml二氯甲烷，冷至-40℃，加入TiCl4(9ml)，搅拌下慢慢滴加入二甲基锌溶液(1M的甲苯溶液80ml)，氩气保护下在-40℃条件下搅拌15分钟。取(2-溴-5-甲氧基苯基)-3-甲氧基苯甲酮1b(6.1g)溶于30ml二氯甲烷中，将此溶液滴加入上述溶液中，保持-40℃搅拌反应3小时，之后缓慢升温至0℃再继续反应5～10小时，TLC监测该反应直至原料基本消失后停止。将该棕色反应液搅拌下倒入碎冰中淬灭反应，混合物经二氯甲烷萃取，Na2SO4干燥，旋转蒸发仪浓缩后用硅胶柱层析，展开剂石油醚/乙酸乙酯～15/1，收集Rf～0.6产物点，浓缩得5.5g无色液体，收率87％。 [0053] 1H NMR(CDCl3，500MHz)：δ7.38(d，J＝10Hz，1H，Ar-H)，7.21(d，J＝5Hz，1H，Ar-H)，7.18-7.14(m，1H，Ar-H)，6.87-6.81(m，1H，Ar-H)，6.72-6.69(m，1H，Ar-H)，6.63(dd，J＝ 10Hz，5Hz，1H，Ar-H)，3.82(s，3H)，3.74(s，3H)，1.73(s，6H).13C NMR(126MHz，CDCl3)δ 159.51，158.70，151.23，148.67，135.90，133.52，128.94，119.03，115.78，113.10，111.93， 109.87，55.38，55.14，44.88，30.16，13.29.HRMS：Calcd for C17H20BrO2(M+H)， 335.0642.Found，m/z 335.0641. [0054] 4.合成(4-甲氧基-2-(2-(3-甲氧基苯基)异丙基)苯基)(2-甲苯基)甲醇1d [0055] [0056] 在干燥的100ml圆底瓶中加入化合物1c(3g)，再加入30ml无水四氢呋喃将其溶解，氩气保护下冷至-78℃，搅拌下滴加入叔丁基锂的正己烷溶液(9～10mmol)，滴加完毕后保持温度在-78℃～-60℃范围内反应1小时，再将邻甲基苯甲醛(11.5mmol)溶于10ml干燥四氢呋喃，用注射器缓慢加入至-78℃的化合物1c的反应液中，滴加完毕后令其缓慢自由升温反应2～6小时。加入10ml饱和氯化铵溶液淬灭反应。经旋转蒸发仪除去绝大部分四氢呋喃后再加入100ml二氯甲烷萃取三次，有机相经干燥，浓缩后得到粗品化合物1d，直接用于下一步反应。 [0057] 1H NMR(CDCl3，500MHz)：δ7.35(d，J＝10Hz，1H，Ar-H)，7.22(d，J＝5Hz，1H，Ar-H)，7.12-7.00(m，5H，Ar-H)，6.85-6.81(m，1H，Ar-H)，6.79-6.74(m，2H，Ar-H)，6.63(dd，J＝ 10Hz，5Hz，1H，Ar-H)，5.74(s，1H)3.86(s，3H)，3.69(s，3H)，2.01(s，3H)，1.71(s，3H)，1.51(s，6H).13C NMR(126MHz，CDCl3)δ159.70，158.72，152.42，148.54，140.92，136.84，133.41， 131.99，130.50，129.53，127.66，127.19，125.24，119.14，118.34，113.70，112.63，110.51， 110.34，69.11，55.24，55.09，43.46，33.20，30.64，19.58.HRMS：Calcd for C25H29O3(M+H)， 377.2038.Found，m/z 377.2042. [0058] 5.合成(4-羟基-2-(2-(3-羟基苯基)异丙基)苯基)(2-甲苯基)甲酮1e [0059] [0060] 将上一步化合物1d溶于40ml二氯甲烷中，快速搅拌下再加入4g氯铬酸吡啶盐(PCC)，室温下反应2-4h，TLC监测该反应直至原料基本消失后停止，反应液经过硅藻土助滤短柱过滤，二氯甲烷淋洗后收集滤液，旋转蒸发仪浓缩后经硅胶柱柱层析纯化，展开剂石油醚/乙酸乙酯～7/1，收集Rf～0.5产物点，浓缩后得微黄色固体2.9g。 [0061] 6.合成目标化合物1“北京橙”(Peking Orange) [0062] [0063] 取化合物1e(2.9g)溶于40ml干燥二氯甲烷，冰水浴冷却下滴加三溴化硼(2-5eq)，滴加完毕继续反应2～5小时。反应完毕后小心加入20ml冰水淬灭，混合物继续搅拌30分钟，用饱和NaHCO3水溶液调节PH至～7，加入150ml二氯甲烷萃取，有机相经水洗、饱和食盐水洗涤，无水Na2SO4干燥后，经旋转蒸发仪浓缩，再经过真空油泵减压抽干，得到微黄色油状物。向该油状物中加入5ml甲基磺酸，搅拌下加热至80～100℃，保持加热下反应1小时停止。将反应物搅拌下倾倒入碎冰中，析出的固体经过滤收集，再经过水洗，真空干燥，得到目标产物1粗品约2.2g。粗品经过硅胶柱层析分离提纯，得1.8g橙红色固体“北京橙”(Peking Orange)，收率72％。附图1即产品1的激发和发射光谱图。 [0064] 1H NMR(CDCl3，500MHz)：δ7.32-7.29(m，1H，Ar-H)，7.24-7.18(m，2H，Ar-H)，7.02(d，J＝5Hz，1H，Ar-H)，6.95(s，1H，Ar-H)，6.94(s，1H，Ar-H)，6.86(d，J＝10Hz，1H，Ar-H)，6.50(dd，J＝10Hz，5Hz，1H，Ar-H)，1.94(s，3H)，15.2(s，3H)，1.48(s，3H).13C NMR(126MHz，CDCl3)δ174.51，157.24，155.28，136.62，135.96，130.24，129.10，128.84，125.72，122.37， 120.66，118.89，114.02，46.98，40.15，32.50，31.93，19.52.HRMS：Calcd for C23H19O2(M-H)，327.1386.Found，m/z 327.1390. [0065] 在此基础上，获得其他取代基团的通式(1)的化合物属于化学领域的常规技术手段。 [0066] 实施例二： [0067] 合成蒽结构荧光可产生性磷酸酶底物分子2 [0068] [0069] 在干燥反应瓶中加入300mg化合物1，再加入15mL无水干燥二氯甲烷，搅拌。向此悬浊液中加入质子海绵，搅拌10分钟直至混合物溶解。冷却至-20～0℃，滴加入250uL三氯氧磷，保持低温反应0.5～2h。加入30mL磷酸钠缓冲液，继续搅拌1小时。将所得溶液分液，水相经过浓缩，并经C-18反相色谱柱分离提纯，分离条件：AQ C-18制备色谱柱(Agela 40g)，0-50％乙腈/TEAA缓冲液梯度洗脱，流速20ml/min。所得含有目标产物馏分经过浓缩，冷藏保存备用。MS(ESI)：Calcd for C23H20O5P(M-H)，407.1.Found，m/z 407.1。附图2是磷酸酶底物分子2经磷酸酶(CIP)水解前后荧光光谱比较 [0070] 本发明的实施例仅仅是对于本发明的进一步解释，不构成限制。在实施例1和实施例2的基础上，本领域技术人员很容易得到其他取代基的荧光分子。 |
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