一种基于重组无序蛋白的无膜细胞器及其构建方法与应用 |
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| 申请号 | CN202410156909.X | 申请日 | 2024-02-04 | 公开(公告)号 | CN117946224A | 公开(公告)日 | 2024-04-30 |
| 申请人 | 江南大学; | 发明人 | 刘龙; 陈坚; 吕雪芹; 堵国成; 李江华; 刘延峰; 于文文; | ||||
| 摘要 | 本 发明 涉及 生物 工程 技术领域，具体涉及一种基于重组无序蛋白的无膜细胞器的构建及其在调控代谢合成中的应用。通过设计八肽基本元件，构建由肽段重复 串联 构成的重组无序蛋白，导入表达宿主中，得到生物分子凝聚体即无膜细胞器，在枯草芽孢杆菌胞内构建了具有良好流动性、 稳定性 与温敏性的无膜细胞器并对其进行验证，证明构建得到的重组无序蛋白具有高度的可编程性。利用 可视化 实验对无膜细胞器的功能进行测试，构建得到的无膜细胞器不仅可以允许小分子化合物的扩展渗透，而且可以招募特定的靶向蛋白，能够应用于调控目标化合物代谢。 | ||||||
| 权利要求 | 1.一种重组无序蛋白，其特征在于：所述重组无序蛋白含有重复串联的肽段N8，所述肽段N8由八个氨基酸组成，其中包括三个甘氨酸、一个脯氨酸、一个丝氨酸、一个天冬氨酸、一个精氨酸、一个酪氨酸或丙氨酸。 |
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| 说明书全文 | 一种基于重组无序蛋白的无膜细胞器及其构建方法与应用技术领域背景技术[0002] 如何实现微生物胞内代谢网络的空间水平调控是构建新一代高性能细胞工厂的关键前提。研究表明，将途径酶招募固定形成微反应区室，能够有效缩短生物分子的空间距离，提高中间代谢物的传输速率，进而增强催化过程的整体效率。生物分子凝聚体是一种新型的亚细胞结构，在调节细胞行为、信号传导等方面发挥着重要作用。生物分子凝聚体通常是固有无序蛋白或其他生物分子(核酸等)在多价相互作用的介导下，经液‑液相分离过程而形成。与膜包被细胞器或蛋白外壳微区室相比，生物分子凝聚体因其固有的液体特性，可以自由地与外部环境交换目标生物分子。因此，生物分子凝聚体可以作为无膜细胞器实现生物过程的空间维度调控。 [0003] 作为GRAS(Generally Regard as Safe)革兰氏阳性宿主，枯草芽孢杆菌(B.subtilis)已被广泛用于L‑天冬酰胺酶，透明质酸以及核黄素等高附加值化合物的生物合成。然而，目前尚未有在B.subtilis中构建应用人工无膜细胞器的报道。此外，使用天然固有无序蛋白(IDPs)会限制生物分子凝聚体的可编程性，且无法实现正交性。 发明内容[0004] 本发明所要解决的技术问题在于如何设计能够形成生物分子凝聚体的重组无序蛋白并验证其是否能够在B.subtilis中形成功能性的无膜细胞器。本发明提供了一种基于重组无序蛋白的无膜细胞器及其应用，首先从头设计了八肽基本元件并得到了重组无序蛋白，并在体外诱导相分离获得生物分子凝聚体，系统表征了温度、NaCl浓度、重组无序蛋白浓度和分子拥挤剂浓度对生物分子凝聚体的形成及流动性的影响；通过改变八肽基本单元的氨基酸组成与排序位置，设计构建了一系列重组无序蛋白以形成不同的生物分子凝聚体，以验证氨基酸组成与排序对凝聚体的流动性产生影响；利用上述重组无序蛋白在枯草芽孢杆菌胞内构建了具有良好流动性、稳定性与温敏性的无膜细胞器。 [0005] 本发明的第一个目的是提供一种重组无序蛋白，含有重复串联的肽段N8，所述肽段N8由八个氨基酸组成，其中包括三个甘氨酸、一个脯氨酸、一个丝氨酸、一个天冬氨酸、一个精氨酸、一个酪氨酸或丙氨酸。 [0006] 进一步地，肽段N8的氨基酸序列可选自以下任意一种： [0007] (1)RGYGSPDG(SEQ ID NO.1)； [0008] (2)RGGDSPYG(SEQ ID NO.2)； [0009] (3)RGSPYGDG(SEQ ID NO.3)； [0010] (4)GYPSDGRG(SEQ ID NO.4)； [0011] (5)DGRGSPYG(SEQ ID NO.5)； [0012] (6)RGAGSPDG(SEQ ID NO.6)。 [0013] 进一步地，重组无序蛋白的序列为MSKGP‑(N8)n‑GY，n为15‑30之间的任意整数。 [0014] 优选地，n为20。 [0015] 本发明的第二个目的是提供一种无膜细胞器，构建含有上述重组无序蛋白的表达载体并导入表达宿主中，表达形成无膜细胞器。 [0016] 进一步地，使用诱导型启动子或组成型启动子表达重组无序蛋白。 [0017] 优选地，重组无序蛋白由Pgrac启动子表达。 [0018] 进一步地，使用IPTG进行诱导表达。 [0019] 进一步地，IPTG浓度为0.05‑0.5mM，诱导温度为37‑42℃，诱导时间为6‑10小时。 [0020] 本发明的第三个目的是提供一种含有上述重组无序蛋白或上述无膜细胞器的宿主细胞。 [0021] 进一步地，宿主为枯草芽孢杆菌。 [0022] 优选地，宿主为枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis 168。 [0023] 本发明的第四个目的是提供一种利用上述无膜细胞器招募目标蛋白的方法。 [0024] 进一步地，无膜细胞器靶向目标蛋白。 [0025] 进一步地，在目的蛋白的N端或C端连接多肽标签或标签配体，在无膜细胞器的N端或C端连接标签配体或多肽标签，多肽标签和标签配体共价结合。 [0026] 进一步地，多肽标签为RIDD短肽或CCDIA短肽，标签配体为RIAD短肽或CCDIB短肽。 [0027] 进一步地，无膜细胞器与标签配体通过连接肽连接。 [0028] 进一步地，连接肽的序列如式(GGGGS)n所示，其中n为大于等于1的整数。 [0029] 本发明的第五个目的是提供上述无膜细胞器在空间水平上调控目标化合物代谢合成中的应用。 [0030] 本发明的上述技术方案相比现有技术具有以下优点： [0031] 本发明基于液‑液相分离形成机制与原理，首次在枯草芽孢杆菌中构建与应用了无膜细胞器。从头设计了八肽基本元件，重复肽段构建获得重组无序蛋白，并结合分子模拟理论计算与实验验证其能够形成具有液体特性的生物分子凝聚体，该凝聚体经荧光漂白后在210s内可恢复83％的荧光强度。对重组无序蛋白的氨基酸序列组成与排序进行理性设计以调控多价相互作用强度，进而获得了系列可形成具有不同流动性的生物分子凝聚体的重组无序蛋白，实现了生物分子凝聚体的可编程性。在B.subtilis胞内构建了无膜细胞器，并通过实验证明其具有良好的流动性、稳定性与温敏性，通过可视化实验进一步证明了B.subtilis胞内的生物分子凝聚体允许小分子化合物的扩展渗透，且能够招募特定靶向蛋白，实现了在芽孢杆菌内调节目标化合物的代谢通量。附图说明 [0032] 为了使本发明的内容更容易被清楚的理解，下面根据本发明的具体实施例并结合附图，对本发明作进一步详细的说明，其中 [0033] 图1是本发明实施例1中利用分子动力学模拟计算FW1的聚合能力； [0034] 图2是本发明实施例2中生物分子凝聚体的体外形成； [0035] 图3是本发明实施例2中使用FRAP实验检测凝聚体的恢复性； [0036] 图4是本发明实施例3中蛋白与NaCl浓度对SDP1‑GFP相分离的影响； [0037] 图5是本发明实施例3中SDP1‑GFP蛋白在不同温度下的相分离行为； [0038] 图6是本发明实施例3中不同PEG添加浓度对SDP1‑GFP凝聚体性质的影响； [0039] 图7是本发明实施例4中改变氨基酸排序位置对凝聚体流动性的影响； [0040] 图8是本发明实施例4中改变氨基酸组成对凝聚体流动性的影响； [0041] 图9是本发明实施例5中B.subtilis胞内SDP1‑GFP凝聚体的形成； [0042] 图10是本发明实施例5中胞内SDP1‑GFP凝聚体的位置分布； [0043] 图11是本发明实施例5中利用尿素验证胞内凝聚体的特性； [0044] 图12是本发明实施例5中胞内人工凝聚体对宿主细胞的影响； [0045] 图13是本发明实施例5中温度及表达强度对SDP1‑GFP凝聚体形成的影响； [0046] 图14是本发明实施例6中共表达靶向蛋白与胞内人工凝聚体的共定位分析； [0047] 图15是本发明实施例6中时序诱导表达靶向蛋白与胞内人工凝聚体的共定位分析； [0048] 图16是本发明实施例6中利用DV代谢合成途径可视化验证小分子在凝聚体中的扩散能力，其中“+”代表该基因在重组菌株内表达，“‑”表示该基因未在菌株内表达，“O”则表示该基因被招募至胞内凝聚体。 具体实施方式[0049] 下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。 [0050] 实施例1：重组无序蛋白基本单元的设计 [0051] 设计八肽基本单元FW1，其序列为RGYGSPDG(SEQ ID NO.1所示)。利用分子动力学模拟计算FW1的聚集度与塌落度，从而验证FW1设计原理的可行性。结果如图1表明，FW1的聚集度为0.95，塌落度为0.21，证明其在理论上具有高度聚合能力。 [0052] 实施例2：生物分子凝聚体的体外验证 [0053] (1)将FW1单元重复20次构建SDP1(氨基酸序列：MSKGP‑(RGYGSPDG)20‑GY，SEQ ID NO.7所示)。人工合成以启动子PT7控制GFP(含His标签)表达以及PT7控制SDP1和GFP(含His标签)融合表达的片段(序列如SEQ ID NO.8所示)，分别连接至pET28a质粒上，构建得到质粒pET28a‑GFP和pET28a‑SDP1‑GFP。将质粒pET28a‑GFP以及pET28a‑SDP1‑GFP分别转化入大肠杆菌BL21(DE3)内，涂布于添加卡那霉素的LB固体培养基上，长出的单菌落分别为大肠杆菌EC0和EC1。 [0054] (2)挑选步骤(1)中平板上长出的单菌落EC0和EC1接种于50mL的TB培养基中，220rpm、37℃培养至OD600为0.6‑0.8后添加0.5mM的IPTG进行诱导，并将培养温度调至25℃培养20h。 [0055] (3)5000×g离心10min收集培养后的菌体，20mM的Tris‑HCl(pH 7.4)重复洗涤2次菌体后使用破碎裂解液(500mM NaCl、20mM Tris‑HCl、pH＝7.4)重悬菌体；之后，使用超声破碎菌液后以14000×g离心30min收集上清，并用 FPLC蛋白纯化系统(GE Healthcare)进行蛋白纯化。使用洗脱液(500mM NaCl、20mM Tris‑HCl、500mM imidazole、pH＝7.4)进行梯度洗脱，收集目标蛋白峰；最后，在透析液(500mM NaCl、20mM Tris‑HCl、pH＝7.4、5％(v/v)甘油)中脱盐，获得纯化后的蛋白GFP以及SDP1‑GFP。蛋白浓度使用BCA试剂盒检测。 [0056] (4)使用无盐缓冲液(0mM NaCl、20mM Tris、pH＝7.4)将步骤(3)中纯化后的蛋白GFP以及SDP1‑GFP进行稀释以诱导相分离。依据需求，在该缓冲液中添加不同浓度的PEG2000模拟胞内环境。 [0057] (5)吸取2μL的蛋白溶液放置于载玻片上后，立即使用配备100×油浸物镜的Leica DMi8显微镜下观察生物分子凝聚体的胞外形成。使用FITC荧光滤光片观察含有GFP的融合蛋白。观察结果如图2中的A所示，SDP1‑GFP与SDP1在体外均能形成球状凝聚体，而单独的GFP蛋白则呈现弥散状。此外，延迟拍摄结果如图2中的B所示，两个单独的SDP1‑GFP凝聚体能够相溶成一个尺寸更大的凝聚体。 [0058] (6)使用Leica TCS SP8激光扫描共聚焦显微镜对SDP1‑GFP凝聚体进行荧光漂白恢复实验。将蛋白液滴于488nm处激发荧光蛋白；之后，圈选生物分子凝聚体中心约3μm左右大小的区域进行荧光漂白。荧光漂白后进行210s的荧光恢复，对SDP1‑GFP凝聚体进行FRAP实验以进一步验证其液体性质。实验结果如图3所示，经漂白后的凝聚体在210s内能够恢复～83％的荧光强度。上述结果证明，SDP1‑GFP在体外能够形成具有液体性质的生物分子凝聚体。 [0059] 实施例3：系统表征SDP1生物分子凝聚体的特性 [0060] (1)通过调整无盐缓冲液添加的比例，调整NaCl以及纯化后的SDP1‑GFP的浓度，考察SDP1‑GFP蛋白浓度与NaCl浓度对凝聚体形成的影响。实验结果如图4所示，SDP1‑GFP浓度越高，越容易形成凝聚体；NaCl浓度越高，越难形成凝聚体。当NaCl浓度为50mM时，约8μM的SDP1‑GFP即可形成凝聚体(pH＝7.4、25℃)。 [0061] (2)进一步通过改变温度，使用分光光度计检测，在吸光度600nm处检测蛋白浊度。实验结果如图5所示，低于20℃时，50μM的SDP1‑GFP蛋白不会发生相分离；随着温度继续上升，SDP1‑GFP蛋白发生相分离，溶液逐渐浑浊(pH＝7.4、150mM NaCl)。荧光显微镜同步观察表明，环境温度越高，SDP1‑GFP越趋向于形成尺寸更大的凝聚体。 [0062] (3)为了模拟SDP1‑GFP在胞内形成凝聚体的环境，将分子拥挤剂PEG添加至溶液中。结果如图6所示，使用同等条件的FRAP漂白凝聚体后，PEG的添加浓度越高，SDP1‑GFP形成的凝聚体其流动性越低。当添加5％的PEG时，SDP1‑GFP凝聚体可以在210s内恢复80％的荧光强度；而当PEG的添加浓度达到13％时，凝聚体在210s内仅能恢复57％的荧光强度(150mM NaCl、pH＝7.4、25℃)。综上所述，温度、分子拥挤剂与NaCl浓度能够显著影响SDP1‑GFP的相分离行为和凝聚体流动性。 [0063] 实施例4：氨基酸组成排序对生物分子凝聚体形成及性质的影响 [0064] (1)通过在保持FW1氨基酸组成元素不变的情况下，改变其排序位置，并获得了FW2(RGGDSPYG，SEQ ID NO.2)、FW3(RGSPYGDG，SEQ ID NO.3)、FW4(GYPSDGRG，SEQ ID NO.4)和FW5(DGRGSPYG，SEQ ID NO.5)四种八肽。之后，将上述4个八肽分别重复20次构建SDP2(氨基酸序列：MSKGP‑(RGGDSPYG)20‑GY，SEQ ID NO.9)、SDP3(氨基酸序列：MSKGP‑(RGSPYGDG)20‑GY，SEQ ID NO.10)、SDP4(氨基酸序列：MSKGP‑(GYPSDGRG)20‑GY，SEQ ID NO.11)、SDP5(氨基酸序列：MSKGP‑(DGRGSPYG)20‑GY，SEQ ID NO.12)，人工合成以启动子PT7分别控制SDP2和GFP(含His标签)融合表达、SDP3和GFP(含His标签)融合表达、SDP4和GFP(含His标签)融合表达、SDP5和GFP(含His标签)融合表达的片段，并连接至质粒pET28a上，构建得到质粒pET28a‑SDP2‑GFP、pET28a‑SDP3‑GFP、pET28a‑SDP4‑GFP、pET28a‑SDP5‑GFP。将上述质粒分别转化入大肠杆菌BL21(DE3)内，涂布于添加卡那霉素的LB固体培养基上，长出的单菌落分别为大肠杆菌EC2、EC3、EC4和EC5。 [0065] (2)按照实施例2中的方法得到纯化后的蛋白SDP2‑GFP、SDP3‑GFP、SDP4‑GFP、SDP5‑GFP进行荧光漂白恢复实验。实验结果如图7所示，当氨基酸的组成相同时，其排序位置的差异会改变其所形成凝聚体的流动性。相比于SDP1‑GFP，8μM的SDP2‑GFP与6μM的SDP3‑GFP即可形成凝聚体(150mM NaCl、pH＝7.4、25℃)。然而，SDP2‑GFP与SDP3‑GFP的凝聚体恢复性相比于SDP1‑GFP出现明显下降，SDP2‑GFP凝聚体经光漂白后在210s内仅可恢复57％的荧光强度。SDP4‑GFP与SDP5‑GFP的凝聚体则表现出更好的荧光恢复性，经光漂白后在210s内均可恢复超过90％的荧光强度。 [0066] (3)通过改变氨基酸的组成进一步调控凝聚体的性质。将Y替换成疏水性氨基酸丙氨酸(A)时，得到八肽FW6(RGAGSPDG，SEQ ID NO.6)；将Y替换成苏氨酸(T)后，得到八肽FW7(RGTGSPDG，SEQ ID NO.13)；在FW1的C端额外增加了芳香族氨基酸Y得到九肽FW12(RGYGSPDGY，SEQ ID NO.14)。将FW6、FW7和FW12分别重复20次构建SDP6(氨基酸序列：MSKGP‑(RGAGSPDG)20‑GY，SEQ ID NO.15)、SDP7(氨基酸序列：MSKGP‑(RGTGSPDG)20‑GY，SEQ ID NO.16)和SDP12(氨基酸序列：MSKGP‑(RGYGSPDGY)20‑GY，SEQ ID NO.17)。人工合成以启动子PT7分别控制SDP6和GFP(含His标签)融合表达、SDP7和GFP(含His标签)融合表达、SDP12和GFP(含His标签)融合表达的片段，分别连接至pET28a质粒上，构建得到质粒pET28a‑SDP6‑GFP、pET28a‑SDP7‑GFP、pET28a‑SDP12‑GFP，并分别转化入大肠杆菌BL21(DE3)内，涂布于添加卡那霉素的LB固体培养基上，长出的单菌落分别为大肠杆菌EC6、EC7和EC12。按照实施例2中的方法得到纯化后的蛋白SDP6‑GFP、SDP7‑GFP、SDP12‑GFP进行荧光漂白恢复实验。实验结果如图8‑A所示，SDP6‑GFP同样可以形成凝聚体。经光漂白后，SDP6‑GFP可在210s内恢复80％的荧光强度，说明疏水作用可以促进相分离的发生。如图8‑B所示，SDP7‑GFP凝聚体经光漂白后无法恢复荧光强度。如图8‑C所示，SDP12‑GFP并未形成具有液体性质的凝聚体，而是形成了不规则无定形的固体蛋白簇。 [0067] 实施例5：枯草芽孢杆菌胞内无膜细胞器的构建与验证 [0068] (1)人工合成以IPTG诱导型启动子Pgrac控制SDP1与GFP融合表达的片段(SEQ ID NO.18所示)，连接至载体pHT01上，构建得到质粒pHT01‑Pgrac‑SDP1‑GFP，并转化入B.subtilis 168的感受态中，之后涂板于添加氯霉素的LB固体培养基平板上，37℃培养12h，得到菌株SC‑1。 [0069] (2)挑选步骤(1)中平板上长出的单菌落SC‑1接种于2mL的LB培养基中，220rpm、37℃培养至OD600为0.6‑0.8后添加0.5mM的IPTG于37℃诱导2h。吸取5μL的菌液放置于载玻片上后，立即使用配备100×油浸物镜的Leica DMi8显微镜下观察胞内生物分子凝聚体的形成情况。观察结果如图9所示，SDP1‑GFP与SDP1在体外均能形成球状凝聚体，SDP1‑GFP融合蛋白在胞内能够形成凝聚体。当诱导时间延长后，B.subtilis进入产孢阶段时，孢子会对SDP1‑GFP凝聚体进行空间挤压，从而导致凝聚体形变为圆弧状。 [0071] (4)取2mL诱导形成凝聚体的菌株离心去上清，并用PBS溶液反复洗涤3次；之后，使用含有0.5M和1M尿素的PBS溶液复溶菌体，25℃静置20min后进行荧光显微镜观察拍摄。结果如图11所示。当IPTG诱导2h后所形成的SDP1‑GFP凝聚体经0.5M或1M的尿素处理20min后，胞内荧光凝聚体被分解，无法观察到凝聚体结果。当诱导至13h时，SDP1‑GFP凝聚体仍可以被1M尿素破坏分解。由于低浓度的尿素可以破坏多价相互作用，因此液态的凝聚体结构很容易被破坏消失，而包涵体等聚合物的结构则需要在高浓度的尿素条件下才被破坏。上述结果证明，胞内SDP1‑GFP凝聚体并非包涵体。 [0072] (5)在诱导后的0h、2h、4h、6h、8h和10h分别检测B.subtilis 168与SC‑1菌株的OD600。并过ImageJ软件对细胞长度进行分析。分析结果如图12所示，B.subtilis 168相比，过表达SDP1‑GFP的重组菌株SC‑1其生长在诱导后4h内受到影响，生长速率略有下降，但培养后期OD600仍可达到5.19，与B.subtilis 168基本一致。与此同时，细胞的平均长度与宽度均没有显著变化，其中细胞长度为2.8μm，细胞宽度均为0.7μm，但胞内形成SDP1‑GFP凝聚体的细胞其长度<2.5μm的占比明显增加。 [0073] (6)将菌株SC‑1接种于2mL的LB培养基中，220rpm、37℃培养至OD600为0.6‑0.8后添加0.5mM的IPTG分别于30℃、37℃和42℃下2h后，吸取5μL的菌液放置于载玻片上后，立即使用配备100×油浸物镜的Leica DMi8显微镜下观察胞内生物分子凝聚体的形成情况，用ImageJ软件统计分析SDP1‑GFP凝聚体形成的情况，统计结果如图13所示，胞内的SDP1‑GFP的相分离行为同样受到培养温度的影响。当IPTG的诱导浓度达到0.5mM，培养温度为30℃时，菌株SC‑1胞内SDP1‑GFP凝聚体的形成率仅为2.26％。当培养温度为37℃或42℃时，即使诱导浓度减少至0.05mM，菌株SC‑1胞内SDP1‑GFP凝聚体的形成率仍分别高达90.5％与92.38％。上述结果证明，相比于SDP1‑GFP的表达强度，胞内凝聚体的形成对温度更具有敏感性与依赖性。 [0074] (7)将FW1基本单元重复次数设置为10次构建FW110(氨基酸序列：MSKGP‑(RGYGSPDG)10‑GY，SEQ ID NO.19所示)，将FW1基本单元重复次数设置为15次构建FW115(氨基酸序列：MSKGP‑(RGYGSPDG)15‑GY，SEQ ID NO.20所示)，将FW1基本单元重复次数设置为30次构建FW130(氨基酸序列：MSKGP‑(RGYGSPDG)30‑GY，SEQ ID NO.21所示)。人工合成以启动子Pgrac分别控制FW110与GFP融合表达、FW115与GFP融合表达、FW130与GFP融合表达的片段，分别连接至pHT01载体上，构建得到质粒pHT01‑FW110‑GFP、pHT01‑FW115‑GFP与pHT01‑FW130‑GFP，分别转化入B.subtilis 168的感受态内，之后涂板于添加氯霉素的LB固体培养基平板上，37℃培养12h，得到菌株SC‑110、SC‑115和SC‑130。 [0075] (8)挑选步骤(7)中平板上长出的单菌落SC‑110、SC‑115和SC‑130接种于2mL的LB培养基中，220rpm、37℃培养至OD600为0.6‑0.8后添加0.5mM的IPTG分别于30℃和42℃诱导2h。吸取5μL的菌液放置于载玻片上后，立即使用配备100×油浸物镜的Leica DMi8显微镜下观察胞内生物分子凝聚体的形成情况。菌株SC‑110在30℃和42℃时均无法形成凝聚体；SC‑115在30℃时无法形成凝聚体，在42℃时可以形成凝聚体(形成率97.14％)；SC‑130在30℃和42℃时均可以形成凝聚体(30℃时形成率98.47％，42℃时形成率96.91％)。上述结果表明，通过改变分子量的大小可以调控SDP1凝聚体的温度依赖阈值范围，进而控制胞内凝聚体的形成。这一结果同样证明了SDP1具有高度的可编程性。 [0076] 实施例6：枯草芽孢杆菌胞内无膜细胞器的功能测试 [0077] (1)人工合成以启动子Pgrac控制RIAD、SDP1与GFP融合表达的片段(SEQ ID NO.22所示)，连接至载体pHT01，构建得到质粒pHT01‑Pgrac‑RIAD‑SDP1‑GFP，人工合成以木糖诱导型启动子PxylA控制mKate(红色荧光蛋白)与RIDD融合表达的片段(SEQ ID NO.23所示)，连接至载体p43NMK，构建得到质粒p43NMK‑PxylA‑mKate‑RIDD。将上述构建的两个质粒同时转入B.subtilis 168的感受态内，之后涂板于添加氯霉素和卡那霉素的LB固体培养基平板上，37℃培养12h，构建得到菌株SC2。将质粒pHT01‑Pgrac‑SDP1‑GFP(构建过程见实施例5)与p43NMK‑PxylA‑mKate‑RIDD同时转化入B.subtilis 168的感受态内，之后涂板于添加氯霉素和卡那霉素的LB固体培养基平板上，37℃培养12h，构建得到菌株SC3。 [0078] (2)挑选步骤(1)中平板上长出的单菌落SC2与SC3接种于2mL的LB培养基中，220rpm、37℃培养至OD600为0.6‑0.8后添加0.5mM的IPTG与30g/L木糖于37℃诱导2h。吸取5μL的菌液放置于载玻片上后，立即使用配备100×油浸物镜的Leica DMi8显微镜下观察胞内生物分子凝聚体的形成情况以及红色荧光蛋白mKate的分布情况。观察结果如图14所示，选择红色荧光蛋白mKate作为靶向蛋白，当SDP1‑GFP凝聚体没有融合RIAD短肽时，mKate‑RIDD荧光均匀分布于胞质内；当表达RIAD‑SDP1‑GFP时，84％的mKate‑RIDD被招募至凝聚体内，表明蛋白等生物大分子能够被招募至SDP1凝聚体内。 [0079] (3)按照步骤(2)，同时诱导表达时，mKate‑RIDD可以在凝聚体形成之前与RIAD‑SDP1‑GFP互作结合，无法直接证明SDP1‑GFP凝聚体形成后具有招募共定位mKate的能力。为了避免这个现象的发生，当菌株SC2在经IPTG诱导在胞内形成凝聚体后，将培养基替换为仅含30g/L木糖的LB培养基。结果如图15‑A所示，当培养基中仅含有IPTG诱导剂时，菌株SC2胞内形成SDP1‑GFP凝聚体，mKate‑RIDD未被诱导表达。当培养基中的IPTG替换为30g/L木糖，mKate‑RIDD蛋白开始表达。此时，85％的mKate仍被招募定位至SDP1‑GFP凝聚体。将IPTG与木糖诱导顺序改变，即先诱导mKate‑RIDD的表达时，结果如图15‑B所示，当SDP1‑GFP后续形成凝聚体时，仍有88％的mKate被招募。上述结果证明，SDP1‑GFP凝聚体能够有效的招募靶向蛋白，且具有高度的兼容性与普适性。 [0080] (4)人工合成以启动子P21控制VioA与RIDD融合表达、VioB与RIDD融合表达、VioC与RIDD RIDD RIDDRIDD融合表达、VioE与RIDD融合表达的基因片段，P21‑VioA ‑VioB ‑VioE 的序列如RIDD RIDD RIDD RIDD SEQ ID NO.24所示，P21‑VioA ‑VioB ‑VioE ‑VioC 的序列如SEQ ID NO.25所示，以RIDD 不同的组合方式连接至pcrF11载体上，分别构建得到质粒pcrF11‑55(pcrF‑P21‑VioA ‑RIDD RIDD RIDD RIDD RIDD RIDD VioB ‑VioE )以及质粒pcrF11‑56(pcrF‑P21‑VioA ‑VioB ‑VioE ‑VioC )。将pcrF11‑55与质粒pHT01‑Pgrac‑RIAD‑SDP1‑GFP(构建过程见步骤(1)同时转化入B.subtilis 168的感受态内，之后涂板于添加氯霉素和卡那霉素的LB固体培养基平板上，37℃培养12h，构建得到菌株SC4。将pcrF11‑56与质粒pHT01‑Pgrac‑RIAD‑SDP1‑GFP同时转化入B.subtilis 168的感受态内，之后涂板于添加氯霉素和卡那霉素的LB固体培养基平板上，37℃培养12h，构建得到菌株SC5。 [0081] (5)将步骤(4)中的菌株SC4和SC5分别接种至2mL液体LB培养基中，37oC、220rpm培养8h；其次，将培养液以5％(v/v)的接种量接种至含有20mL液体LB培养基的250mL挡板摇瓶中，37℃、220rpm；待发酵5h后，添加终浓度为0.5mM的IPTG诱导相分离过程；最终至24h发酵结束取1.5mL菌液进行可视化检测。菌液的发酵颜色如图16所示，当胞内仅表达VioABE且不诱导凝聚体形成时，细胞呈现出浅棕色；当添加IPTG诱导SDP1凝聚体形成时，VioABE被招募至凝聚体内，增强PDV代谢合成效率，细胞颜色转变为墨绿色。当胞内表达VioABEC且诱导SDP1凝聚体形成时，细胞颜色也由粉色转变为紫色。上述结果说明，小分子L‑色氨酸能够扩散至胞内凝聚体并参与DV的代谢合成。此外，细胞颜色的显著变化证明人工凝聚体能够在空间水平上调控目标化合物的代谢合成。 [0082] 显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。 |
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