[0001] 本发明属于药物合成技术领域，涉及制备名贵中药材蟾酥中的活性成分包括但不限于脂蟾毒配基(resibufogenin)等蟾毒基内酯类化合物的方法。

[0002] 蟾酥是我国传统名贵中药材，属国家二级保护野生药材物种。传统医学认为其具有解毒止痛、开窍醒神的功效。现代药理研究表明，蟾酥具有增强心肌收缩力、抗心肌缺血、升压、降压、抗肿瘤、抑菌抗炎、麻醉止痛，致幻等多种药理作用。然而，由于蟾酥制作工艺复杂，其生产过程中伴有大量的残次品，生物利用较低，不同产地的蟾酥其活性成分含量亦差别较大，难以符合固定的标准。此外，日益稀缺的野生动物资源和较低的天然丰度也在很大程度上制约着蟾酥的药理研究和临床应用。

[0003] 活性研究表明，蟾蜍内脂类化合物与蟾酥的生物活性表现基本一致，《中国药典》2020版一部要求蟾酥制品的液相色谱需要含有蟾毒灵(bufalin)，华蟾酥毒基
(cinobufagin)，脂蟾毒配基(resibufogenin)，日蟾毒它灵(gamabufalin)和蟾毒它灵(bufotaline)五个蟾毒基内酯类化合物的特征峰，并规定蟾毒灵(bufalin)，华蟾酥毒基(cinobufagin)，脂蟾毒配基(resibufogenin)这三个蟾蜍内酯类化合物的总含量不得少于
7％。因此，要解决上述的问题，蟾酥中具有较强生理活性的化学组分进行人工合成就显得尤为重要。

[0004] 由于蟾酥独特多样的生理活性，其活性成分的人工合成一直是有机合成领域研究的重点(Nat.Prod.Rep.2017,34,361–410；Eur.J.Med.Chem.2020,189,112038)。从上世纪60年代开始，有机合成化学家F.Sondheimer,Petti,Tsai和Wiesner等人从洋地黄毒苷配基，14‑dehydrobufalin等强心苷高级天然产物出发实现到蟾酥中的蟾蜍内酯类天然产物，如蟾毒灵，酯蟾毒配基等蟾毒基内酯类化合物的转化；Yoshii,Wiesner,Welzel和Stache等课题组从简单甾体化合物出发实现了复杂蟾蜍内酯类化合物的全合成；Wiesner,Engel,Wicha和Watt等人实现了蟾毒基内酯类化合物衍生物如异位连接的吡喃酮，14‑去羟基等化合物的合成。在发明人开展蟾酥合成研究的同时，Inoue等人从简单甾体化合物雄烯二酮出发，利用C16‑17位双键环氧化再开环的方式成功实现蟾毒灵等五个复杂蟾毒基内酯类天然产物的全合成(Organic Letters,2020,22,8652–8657)；南京大学俞寿云、戈慧明、谭仁祥等人结合自身发展的雄烯二酮C14‑位羟基化反应的特点，在优化了Inoue合成路线部分反应的基础上，实现了五个相同蟾毒基内酯类天然产物的形式合成(ACS Catal.,2022,12,
9839–9845)。

[0005] 通过调研上述合成工作不难发现，半合成工作的起始底物基本都是同样珍贵的天然产物，并不具有规模化生产的意义。而从简单甾体出发的全合成路线，除少数外，大部分甾体本身也并不廉价，而且需要耗费大量步骤进行氧化态的调整，总收率较低，且部分反应条件不利于工业放大，无法满足蟾毒基内酯类化合物生理活性研究的物质需求。

[0006] 本发明的目的在于提供一种高效合成蟾毒基内酯类化合物及其衍生物的方法。

[0007] 本发明的第一方面，提供一种式I所示的蟾毒基内酯类化合物的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：

[0008]

[0009] 由雄烯二酮4‑AD经过生物酶氧化得到式III化合物；

[0010] 式III化合物通过化学半合成完成六元二烯内酯环的上载和转化得到蟾毒基内酯类关键中间体II；

[0011] 关键中间体II经过氧化态修饰获得式I所示的蟾毒基内酯类化合物，

[0012] 式中，R1、R2和R4各自独立地为‑H或‑OH；

[0013] R3为‑CH3或‑CHO；

[0014] R5和R6各自独立地为‑H、‑OH或酮基；

[0015] R7为‑H、‑OH或氧乙酰基。

[0016] 在另一优选例中，R1、R2、R4、R5、R6、R7都为H，R3为甲基。

[0017] 在另一优选例中，R1、R2、R4、R5、R6、R7都为H，R3为甲基时，式III所示的化合物具有式5所示的结构，所述制备方法包括：步骤3或步骤2～3或步骤1～2～3，

[0018]

[0019] 其中：：

[0020] 步骤1：化合物2经甾体C14‑α羟化酶生物催化氧化得到化合物3；

[0021] 步骤2：在氢化催化剂作用下，化合物3在有机溶剂中经催化加氢得到化合物4；所述的氢化催化剂为二氧化铂、钯碳、氢氧化钯、兰尼镍或铑/三氧化铝；所述的有机溶剂为吡啶、4‑甲基吡啶、四氢呋喃、甲醇或乙醇中的一种或两种以上的混合溶剂；

[0022] 步骤3：化合物4在有机溶剂中通过还原剂还原得到化合物5；所述还原剂为三仲丁基硼氢化锂、三仲丁基硼氢化钾或二异丁基氢化铝；所述有机溶剂为四氢呋喃，乙醚，1,4‑二氧六环，乙二醇二甲醚、苯或甲苯中的一种或两种以上的混合溶剂。

[0023] 在另一优选例中，步骤1中采用甾体C14‑α羟化酶进行生物催化，所述生物催化方法包括但不限于纯酶催化、粗酶液催化和整细胞转化。

[0024] 在另一优选例中，所述的C14‑α羟化酶为复合酶，包括以下两种酶：(a)来源于Cochliobolus lunatus的细胞色素P450酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示；和(b)来源于Cochliobolus lunatus的细胞色素P450还原酶CPR，其氨基酸序列如SEQ ID No:4所示。

[0025] 在另一优选例中，步骤2中的氢化催化剂为氢氧化钯、质量分数5％的钯碳或10％的钯碳，所述有机溶剂为吡啶或4‑甲基吡啶。

[0026] 在另一优选例中，步骤3中的还原剂为三仲丁基硼氢化钾或二异丁基氢化铝，反应温度为‑78～0℃，有机溶剂为四氢呋喃或甲苯。

[0027] 在另一优选例中，R1、R2、R4、R5、R6、R7都为H，R3为甲基，式III所示的化合物具有式5所示的结构，式II所示的化合物具有式10所示的结构，所述制备方法包括：步骤7或步骤6～7或步骤5～6～7或步骤4～5～6～7，

[0028]

[0029] 其中：

[0030] 步骤4：化合物5的有机溶液中加入水合肼和碱反应，粗品中再加入单质碘和碱反应得到化合物6；所述的有机溶剂为四氢呋喃、乙醇或甲醇的一种或两种以上的混合物；所述的碱为二异丙基乙基胺、三乙胺或4‑二甲基氨基吡啶；

[0031] 步骤5：化合物6和化合物7中加入过渡金属催化剂和碱反应得到化合物8；所述的过渡金属催化剂为[1,1'‑双(二苯基膦基)二茂铁]二氯化钯、四(三苯基膦)钯、醋酸钯或二氯双(三苯基膦)钯；所述碱为碳酸钾、磷酸钾、磷酸氢钾、叔丁醇钾或氢氧化钾等；反应溶剂为四氢呋喃、甲醇、水、N,N‑二甲基甲酰胺的一种或两种以上的混合溶剂；

[0032] 步骤6：化合物8的有机溶液中加入氢化均相催化剂，经催化加氢反应得到化合物9；所述氢化均相催化剂为三苯基膦氯化铑、六氟磷酸(三环已基膦)(1,5‑环辛二烯)(吡啶)合铱或(1,5‑环辛二烯)氯铑(I)二聚体；采用的有机溶剂为二氯甲烷，苯或甲苯；

[0033] 步骤7：化合物9的有机溶液中加入酸得到化合物10；所述的酸为对甲基苯磺酸、吡啶对甲苯磺酸盐(PPTS)、苯磺酸、樟脑磺酸、高氯酸、高碘酸、质量分数2％～98％硫酸或质量分数2～36.5％盐酸；采用的有机溶剂为1,4‑二氧六环、甲醇、四氢呋喃和水的一种或两种以上的混合溶剂。

[0034] 在另一优选例中，步骤4中所述的有机溶剂为乙醇或四氢呋喃的一种或两种的混合溶剂；所述的碱为二异丙基乙基胺或三乙胺。

[0035] 在另一优选例中，步骤5中所述的过渡金属催化剂为[1,1'‑双(二苯基膦基)二茂铁]二氯化钯或四三苯基膦钯；所述碱为磷酸钾或碳酸钾；所述溶剂为N,N‑二甲基甲酰胺或四氢呋喃。

[0036] 在另一优选例中，步骤6中所述氢化均相催化剂为六氟磷酸(三环已基膦)(1,5‑环辛二烯)(吡啶)合铱或三苯基膦氯化铑，所述有机溶剂为二氯甲烷或甲苯。

[0037] 在另一优选例中，步骤7中所述的酸为浓度为3M的稀盐酸。

[0038] 在另一优选例中，R1、R2、R4、R5、R6、R7都为H，R3为甲基，式I所示的化合物具有式1所示的结构，式II所示的化合物具有式10所示的结构，所述制备方法包括：步骤8，[0039]

[0040] 其中，

[0041] 步骤8：化合物10的有机溶液中加入卤化试剂和高氯酸水溶液反应，粗品不经纯化直接溶于吡啶中，在50～70℃之间加热反应0.5～2.0小时得到目标化合物1；

[0042] 上述有机溶剂为1,4‑二氧六环、四氢呋喃、乙醚、丙酮或水的一种或两种以上的混合溶剂；所述卤化试剂为N‑溴代琥珀酰亚胺(NBS)，N‑碘代琥珀酰亚胺(NIS)或N‑氯代琥珀酰亚胺(NCS)；所述高氯酸水溶液的质量分数为1％～70％。

[0043] 在另一优选例中，步骤8中所述的有机溶剂为1,4‑二氧六环与水或丙酮与水的混合溶剂，其体积比例为12:1～5:1；所述卤化试剂为N‑溴代琥珀酰亚胺(NBS)或N‑碘代琥珀酰亚胺(NIS)。

[0044] 本发明的第二方面，提供一种蟾毒基内酯类化合物中间体8，具有下式：

[0045]

[0046] 本发明的第三方面，提供一种蟾毒基内酯类化合物中间体9，具有下式：

[0047]

[0048] 本发明从廉价易得的雄烯二酮4‑AD出发，经过生物酶氧化得到14‑α‑羟基‑雄甾烷‑17‑酮化合物，随后在没有任何保护基的情况下，利用化学转化完成E环吡喃酮的上载，得到关键中间体，再由此出发实现蟾毒基内酯类化合物的合成。利用此方法合成脂蟾毒配基仅需八步操作，路线简短，操作简单，反应量级大，可用于大规模制备该类天然产物，具有工业化生产的应用前景

[0049] 应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。说明书中所揭示的各个特征，可以被任何提供相同、均等或相似目的的替代性特征取代。限于篇幅，在此不再一一累述。附图说明

[0050] 图1为HPLC谱图。

[0051] 本申请的发明人经过广泛而深入的研究，提供一种蟾酥中活性成分脂蟾毒配基的制备方法，以价廉易得的甾体化合物雄烯二酮(4‑AD)为原料，在不引入保护基的情况下，通过生物‑化学接力策略，最短历经八步转化即可合成天然蟾蜍内酯类化合物，部分中间体可以克级规模制备。本方法可以促进该类化合物在医药领域的广泛应用，缓解蟾酥中活性物质药理研究的物料稀缺压力。

[0052] 制备方法

[0053] 本发明提供了一种甾体母核3β羟基、AB环十氢萘环顺式构型、C14‑α构型羟基的甾体化合物III和3‑β‑羟基‑14,15‑烯‑17‑吡喃酮蟾毒基类内酯高级中间体II，所述两种前体具有以下结构式所示的结构，用于作为化学半合成蟾蜍内酯类化合物的中间体。

[0054]

[0055] 式中，R1、R2和R4为‑‑H或‑OH；R3为‑CH3或‑CHO；R5和R6为‑OH或酮基；R7为‑OH或氧乙酰基。

[0056] 在另一优选例中，所述甾体化合物R1、R2、R4‑R7基团都为H，R3为甲基。

[0057] 本发明提供了一种生物催化大量获得蟾蜍内酯化合物化学合成中间体14α‑羟基‑雄甾烷‑17‑酮的方法，以雄烯二酮(4‑AD)为原料，采用C14‑α羟化酶生物催化完成C14‑α构型羟基化。

[0058] 所述生物催化方法，包括但不仅限于纯酶催化、粗酶液催化和整细胞转化。

[0059] 本发明提供了一种将甾体母核C14位羟基化成α构型羟基的细胞色素P450酶及相关P450还原酶(Cytochrome P450 reductase，CPR)，所述酶的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4所示。

[0060] 本发明对甾体母核C14位α羟基化酶及相关的氧化还原酶(CPR)的DNA序列进行毕赤酵母密码子偏爱序列优化，适合毕赤酵母高效表达，密码子优化后的DNA序列分别如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3所示。

[0061] 本发明中，获得的14α‑羟基‑雄甾烷‑17‑酮可以通过以下步骤化学合成式1所示的蟾毒基类内酯高级中间体：

[0062]

[0063] 本发明中，获得的蟾毒基类内酯高级中间体可以通过以下步骤化学合成式1所示的蟾毒基类内酯：

[0064]

[0065] 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring  Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。

[0066] 序列：

[0067]

[0068] SEQ ID NO:1

[0069]

[0070]

[0071] SEQ ID NO:2

[0072] Met Asp Pro Gln Thr Val Gly Leu Val Val Arg Ala Leu Gln Thr Thr Ala Ile Ala Ala Val Leu Leu Ala Val Trp Thr Tyr Val Pro Lys Leu Gln Leu Asn Ala Gln Leu Arg Lys Leu Pro Ser Leu Thr Pro Glu Gly Thr Thr Lys Ala Arg Asp Lys Phe Met Ala Ser Ala Arg Lys Leu Tyr Gln Asp Gly Tyr His Lys Phe Arg Asp Ser Ala Tyr Thr Leu Ile Asn Glu Asn Gly Asn Ala Asn Val Ile Val Pro Pro Gln Phe Leu Pro Glu Leu Arg Gln Leu Pro Asp Asp Val Leu Ser Phe Pro Glu Ala Leu Thr Glu Asp Leu Glu Ile Lys Tyr Thr His Leu Ser Ile Glu Asn Pro Thr Ala Ala Gly Leu Ile Lys Lys Lys Leu Thr Pro Ala Leu Pro Arg Leu Asn Pro Ser Ile Cys Gln Asp Val Asp Arg Ala Val Lys Thr Tyr Met Pro Pro Cys Asp Asp Trp Thr Glu Val Asn Ile Asn Glu Lys Leu Leu Arg Ile Val Ala Lys Val Ser Gly Thr Ile Phe Val Gly Pro Glu Leu Ala Ser Asp Ser Asp Tyr Leu Asp Ala Ala Cys Phe Tyr Thr Val Asp Leu Met Asn Ala Val Thr Ala Met Lys Lys Ile Arg Pro Trp Leu Lys Pro Phe Leu Ala Ser Arg Thr Pro Glu Ile Ile Ala Leu Arg Ala Arg Glu Lys His Thr Glu Arg Val Leu Ile Pro Ile Val Glu Gln Arg Ile Ala Ala Lys Ala Asn Asp Pro Asn Trp Gln Glu Pro Asp Asp Phe Leu Gln Trp Met Leu Asp Met Arg Glu Gly Thr Glu Ser Ile Gln Glu Leu Ala Lys Thr Gln Leu Ser Leu Ile Phe Ala Ala Ile His Thr Thr Thr Met Thr Val Thr Asn Thr Met Tyr Thr Leu Ala Ala Met Pro Glu Tyr Leu Glu Pro Leu Arg Glu Glu Ile Arg Asn Val Met Leu Asp Glu Gly Gly Val Ile Thr Ser Arg Ala Leu Gln Arg Met Glu Lys Leu Asp Ser Tyr Met Lys Glu Val Leu Arg Phe Thr Gly Pro Thr Met Thr Ser Phe Thr Arg Arg Ala Arg Lys Gly Ile Thr Leu Ser Asn Gly Gln Tyr Ile Pro Ala Gly Val Ile Ile Glu Val Pro Ser Ala Ala Ile Tyr Gln Asp Asn Ala Phe Tyr Pro Ser Ser Asp Ser Phe Asp Gly Phe Arg Ala Tyr Lys Ala Arg Ser Thr Gly Lys Ala Ala Asp Ile Ala Arg Asn Gln Phe Val Thr Ser Asn Glu Glu Asn Leu Thr Phe Gly Tyr Gly Arg His Ala Cys Pro Gly Arg Phe Phe Ala Ala Asn Glu Ile Lys Met Met Ile Thr Arg Leu Ile Leu Asp Tyr Asp Ile Lys Met Pro Asn Gly Glu Lys Glu Arg Tyr Pro Gln Ile Glu Ile Gly Lys Met Ser Ile Pro Asp Pro Thr Lys Thr Leu Ala Phe Lys Arg Val Val Val

[0073] SEQ ID NO:3

[0074]

[0075]

[0076] SEQ ID NO:4

[0077] Met Ala Gln Leu Asp Thr Leu Asp Ile Ile Val Leu Ala Val Leu Leu Val Gly Thr Val Ala Tyr Phe Thr Lys Gly Thr Tyr Trp Ala Val Ser Ala Asp Pro Tyr Gly Ser Ser Leu Ala Thr Ala Asn Gly Ala Ala Lys Ala Gly Lys Ser Arg Asn Ile Ile Glu Lys Met Asp Glu Thr Asp Lys Asn Cys Val Val Phe Tyr Gly Ser Gln Thr Gly Thr Ala Glu Asp Tyr Ala Ser Arg Ile Ser Lys Glu Gly His Ser Arg Phe Gly Leu Lys Thr Met Val Ala Asp Leu Glu Glu Tyr Asp Tyr Asp Asn Leu Asp Ala Phe Pro Glu Asp Lys Leu Ala Val Phe Val Leu Ala Thr Tyr Gly Glu Gly Glu Pro Thr Asp Asn Ala Val Glu Phe Tyr Glu Phe Ile Gly Ser Glu Asp Ile Ser Phe Ser Gln Gly Gly Gly Ile Asp Asp Lys Pro Leu Ser Asn Leu Asn Tyr Val Thr Phe Gly Leu Gly Asn Asn Thr Tyr Glu His Tyr Asn Ser Met Val Arg Asn Val Asp Lys Tyr Leu Thr Arg Leu Gly Ala Lys Arg Leu Gly Ala Ala Gly Glu Gly Asp Asp Gly Ala Gly Thr Met Glu Glu Asp Phe Leu Ala Trp Lys Glu Pro Met Trp Ala Ala Val Ala Glu Lys Met Gly Leu Glu Glu Arg Glu Ala Met Tyr Glu Pro Val Phe Glu Val Thr Glu Lys Pro Glu Leu Ser Pro Glu Asp Asp Thr Val Tyr Leu Gly Glu Pro Asn Lys Asn His Leu Glu Gly Asn Gln Lys Gly Pro Phe Asn Ala Asn Asn Pro Phe Ile Ala Pro Ile Val Glu Ser Ala Glu Leu Phe Lys Asp Ser Asp Arg Asn Cys Leu His Met Glu Ile Ser Ile Ala Gly Ser Asn Leu Ser Tyr Thr Thr Gly Asp His Ile Ala Ile Trp Pro Thr Asn Ala Gly Lys Glu Val Asp Arg Leu Phe Lys Val Leu Gly Lys Glu Asp Lys Arg His Thr Val Ile Ser Val Arg Gly Leu Asp Pro Thr Ala Lys Val Pro Phe Pro Ser Pro Thr Thr Tyr Asp Ala Ala Leu Arg Tyr His Ile Glu Ile Asn Ala Ala Val Ser Arg Gln Leu Val Ser Val Val Ala Gln Phe Ala Pro Asn Glu Asp Ile Lys Ala Glu Ile Val Lys Leu Gly Gly Asp Lys Asp Tyr Phe Lys Glu Gln Val Thr Asp Arg Asn Leu Asn Leu Gly Gln Leu Leu Glu Ile Thr Gly Lys Gly Ala Thr Trp Asp Lys Ile Pro Phe Ser Phe Leu Phe Glu Thr Met Val Lys Ile Gln Pro Arg Tyr Tyr Ser Ile Ser Ser Ser Ser Leu Val Gln Lys Asp Lys Ile Ser Ile Thr Ala Val Val Glu Ser Ile Glu Lys Pro Gly Ala Pro Tyr Ala Leu Lys Gly Val Thr Thr Asn Tyr Leu Leu Ala Leu Lys Gln Lys Gln His Gly Asp Pro Asn Pro Asp Pro His Gly Leu Ser Tyr Ser Ile Thr Gly Pro Arg Asn Lys Tyr Asp Gly Ile His Val Pro Val His Val Arg His Ser Asn Phe Lys Leu Pro Ser Asp Pro Ser Lys Pro Ile Ile Met Val Gly Pro Gly Thr Gly Val Ala Pro Phe Arg Gly Phe Val Gln Glu Arg Ala Ala Gln Ala Lys Ala Gly Gln Asn Val Gly Lys Thr Val Leu Phe Phe Gly Cys Arg Lys Gln Ser Glu Asp Phe Met Tyr Ala Asp Glu Trp Lys Gln Tyr Gln Gln Asp Leu Gly Asp Lys Phe Glu Met His Thr Ala Phe Ser Arg Asp Gly Pro Gln Lys Val Tyr Val Gln His Lys Leu Glu Glu Asn Gly Glu Glu Val Asn Arg Leu Leu Glu Gln Lys Ala Tyr Phe Tyr Val Cys Gly Asp Ala Ala His Met Ala Arg Glu Val Asn Thr Leu Leu Gly Lys Ile Ile Ala Lys Tyr Arg Asn Val Ser Glu Thr Lys Gly Glu Glu Ile Val Lys Ala Met Arg Ala Ser Asn Gln Tyr Gln Glu Asp Val Trp Ser

[0078] 实施例1化合物3β,14α‑双羟基‑5β‑雄甾烷‑17‑酮的化学合成方法[0079] 步骤1：生物合成部分

[0080] 构建酵母蛋白表达载体pPICZA‑Duet:以pPICZA为模板，以GACCTTCGTTTGTGCGGCGGCCGCGATCTAACATCCAAAGACGAAAG、TTAACACTAGTCATATGGGATCCATGGTGATGGTGATGATGACCCATGG为引物克隆出DNA片段Fragment‑1；以ATATGACTAGTGTTAACCTGCAGTGAGTTTTAGCCTTAGACATGAC、GCTATGGTGTGTGGGGGGTCTCACTTAATCTTCTGTAC为引物克隆出DNA片段Fragment‑2，用BamH I酶切pPICZA，最后用诺唯赞公司的重组酶重组构建质粒pPICZA‑Duet。

[0081] 构建表达甾体C14α‑羟化酶的毕赤酵母工程菌：合成密码子优化后的来源于Cochliobolus lunatus的细胞色素P450(SEQ ID  NO:1)和细胞色素P450还原酶(cytochrome P450 reductase,CPR)(SEQ ID NO:3)基因。先用BamHI和SpeI酶切酵母表达载体pPICZA‑Duet，构建重组载体pPICZA‑Duet‑CPR，再用KpnI和XhOI酶切重组载体pPICZA‑Duet‑CPR，构建酵母表达载体pPICZA‑Duet‑P450‑CPR，将酵母表达载体pPICZA‑Duet‑P450‑CPR按照常规电转方法导入毕赤酵母KM71H，获得表达相应酶的工程菌。

[0082] 酵母工程菌阳性克隆的筛选及细胞转化条件的优化：挑5～10个酵母工程菌单克隆于5mL YPD液体培养基中(含100μg/mL的Zeocin)，30℃，260rpm，培养24小时。将0.5mL培养物接入5mL MGYH甘油培养基，30℃，260rpm，培养24h。室温，2500g离心10min，在超净台中更换至5mL MMH甲醇培养基(含甲醇0.5％)，加入底物4‑AD，30℃，260rpm，每24小时加0.5％甲醇，总共摇了3天，取200μL菌液用等体积乙酸乙酯萃取两次，氮吹，用200μL甲醇复溶，用Shimadzu 8040LCMS检测，C14‑α羟化酶的酵母工程菌能细胞催化4‑AD生产相应的产物14‑α‑羟基‑4‑雄烯‑3,17‑二酮。对C14‑α羟化酶酵母工程菌细胞转化4‑雄烯‑3,17‑二酮的条件进行优化：包括种子培养液转接量、底物4‑AD的浓度和转化时间的优化，确定最优转化条件为：8％转接量、1.5g/L4‑AD，转化72h，每发酵1L C14‑α羟化酶酵母工程菌，投入1.5g 4‑AD可获得不低于700mg C14‑α羟基化产物14‑α‑羟基‑4雄烯‑3,17‑二酮，结果如图1所示。

[0083] 1H NMR(600MHz,CDCl3)δ＝5.75(s,1H),2.51–2.44(m,2H),2.44–2.34(m,4H),2.08–2.02(m,1H),2.01–1.89(m,3H),1.87–1.82(m,1H),1.81–1.73(m,2H),1.68–1.63(m,
1H),1.63–1.58(m,1H),1.56–1.49(m,2H),1.47–1.37(m,2H),1.22(s,3H),1.05(s,3H)ppm。

[0084] 步骤2：合成化合物4

[0085] 化合物3(10.30g,34.06mmol)溶于4‑甲基吡啶(114mL)，加入10％ Pd/C(2.06g)。氢气氛围下反应，原料转化完全后，加入硅藻土抽滤。滤液加入1.2M稀盐酸水溶液洗涤，乙酸乙酯萃取。饱和氯化钠水溶液洗涤，无水硫酸钠干燥。浓缩后粗品经柱层析分离纯化得到化合物4白色固体(8.50g,82％yield)。

[0086] 1H NMR(600MHz,CDCl3):δ＝2.69(t,J＝13.8Hz,1H),2.46‑2.33(m,3H),2.21–2.09(m,2H),2.07–2.01(m,2H),1.98–1.81(m,6H),1.61–1.54(m,2H),1.50–1.33(m,5H),1.05(s,3H),1.01(s,3H)ppm。

[0087] 步骤3：合成化合物5

[0088] 氮气保护下将化合物4(10.00g,32.85mmol)溶于四氢呋喃(100mL)，‑78℃浴下加入三仲丁基硼氢化钾溶液(43mL,1.0M in THF,43.00mmol,1.3eq.)。冰水浴下反应，原料转化完全后滴加饱和氯化铵溶液淬灭反应。反应液加入二氯甲烷萃取，合并有机相后饱和碳酸氢钠水溶液洗涤，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥。浓缩后粗品经柱层析分离纯化得到化合物5白色固体(8.19g,81％yield)。

[0089] 1H NMR(600MHz,CDCl3):δ＝4.15–4.11(m,1H),2.45–2.32(m,2H),2.01–1.93(m,2H),1.93–1.86(m,2H),1.84–1.72(m,3H),1.64–1.46(m,8H),1.43–1.34(m,2H),1.30–1.23(m,2H),1.00(s,3H),0.99(s,3H)ppm。

[0090] 实施例2化合物14,15‑双键‑17‑吡喃酮蟾毒基类内酯的化学合成方法

[0091] 步骤4：合成化合物6

[0092] 氮气保护下将化合物5(3.17g,10.34mmol)溶于乙醇(206mL)，加入三乙胺(21g,29mL,20.0eq)和水合肼(13g,12.6mL,20.0eq)。加热至50℃反应过夜，原料转化完全。减压浓缩除去反应溶剂后，将粗品腙化合物溶于四氢呋喃(206mL)，加入三乙胺(21g,21mL,
20.0eq)。冰水浴下滴加碘(7.88g,3.0eq)的四氢呋喃溶液。反应结束后硫代硫酸钠饱和水溶液淬灭，乙酸乙酯萃取后饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥。浓缩后粗品直接投下一步。

[0093] 步骤5：合成化合物8

[0094] 氮气保护下将烯基碘6、硼酸酯化合物7(2.76g,12.41mmol,1.2eq)、Pd(dppf)Cl2(0.750g,1.034mmol,10mol％)和磷酸钾(6.58g,31.02,3.0eq)溶于N,N‑二甲基甲酰胺(23mL)，加热至60℃。反应结束后加水稀释后，乙酸乙酯萃取，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥。浓缩后粗品经柱层析分离纯化得到化合物8白色固体(2.28g,57％yield)。

[0095] 1H NMR(600MHz,CDCl3):δ7.54–7.53(m,1H),7.46–7.42(m,1H),6.36–6.32(m,1H),5.89–5.86(m,1H),4.15–4.11(m,1H),2.45–2.39(m,1H),2.34–2.27(m,1H),2.20–2.14(m,
2H),2.11–2.04(m,2H),1.99–1.89(m,2H),1.79–1.73(m,1H),1.67–1.53(m,2H),1.52–1.46(m,4H),1.26–1.17(m,3H),1.05(s,3H),1.01(s,3H)ppm。

[0096] 步骤6：合成化合物9

[0097] 将化合物8(2.22g,5.77mmol)溶于二氯甲烷(190mL)，加入六氟磷酸(三环已基膦)(1,5‑环辛二烯)(吡啶)合铱(0.694g,0.865mml,15mol％)。抽换氢气，室温下反应。硅藻土抽滤，二氯甲烷洗涤滤饼。浓缩滤液后粗品经柱层析分离纯化得到化合物9白色固体(2.05g,92％yield)。

[0098] 1H NMR(600MHz,CDCl3):δ＝7.30–7.26(m,2H),6.31–6.27(m,1H),4.13(s,1H),3.13(t,J＝9.3Hz,1H),2.05–1.89(m,4H),1.83–1.68(m,5H),1.67–1.57(m,2H),1.53–1.40(m,5H),1.35(dd,J＝13.3,2.6Hz,2H),1.30–1.21(m,3H),0.98(s,3H),0.64(s,3H)ppm。

[0099] 步骤7：合成化合物10

[0100] 化合物9(600mg,1.55mmol)溶于二氧六环(155mL)，加入盐酸(3.0mL,3.0M，水溶液)，室温搅拌。原料转化完全后加水淬灭，乙酸乙酯萃取。饱和氯化钠洗涤，无水硫酸钠干燥。浓缩后粗品经柱层析分离纯化得到化合物10白色固体(418mg,73％yield)。

[0101] 1H NMR(600MHz,Chloroform‑d)δ＝7.32(dd,J＝9.6,2.5Hz,1H),7.30(s,1H),6.30(d,J＝9.4Hz,1H),5.25–5.22(m,1H),4.12–4.09(m,1H),2.73(t,J＝9.4Hz,1H),2.43–
2.36(m,2H),2.05(d,J＝7.7Hz,1H),2.00–1.91(m,2H),1.85–1.80(m,1H),1.79–1.73(m,
1H),1.70–1.64(m,1H),1.59–1.23(m,12H),0.97(s,3H),0.71(s,3H)ppm。

[0102] 实施例3目标化合物脂蟾毒配基的化学合成方法

[0103] 将化合物10(360mg,0.977mmol)溶于丙酮和水的混合溶液(98mL，丙酮/水＝9:1v/v)中，加入N‑溴代琥珀酰亚胺(127mg,1.08mmol,1.1eq.)和质量分数1％高氯酸水溶液(0.98mL)。室温搅拌1小时。缓慢滴加饱和碳酸氢钠水溶液和饱和硫代硫酸钠水溶液淬灭，乙酸乙酯萃取，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥。浓缩后粗品不经纯化，直接溶于吡啶(9.8mL)，在60℃下反应2小时。浓缩后粗品经柱层析分离纯化(石油醚/EtOAc＝2:1)得到化合物1白色固体(190mg,收率51％)。核磁氢谱与标准谱图对比，结果一致。

[0104] 在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。