[0001] 本发明涉及医药技术领域，涉及到附子生物碱在肾病救治上的应用，具体地是涉及到附子生物碱在制备治疗急性肾损伤药物中的应用。

[0002] 附子为毛茛科植物乌头(Aconitum carmichaelii Debx)的子根加工品，归心、脾、肾经，可治疗亡阳虚脱，虚寒吐泻，肾阳虚衰，风寒湿痹等病症。临床中附子复方制剂如金匮肾气丸、附子理中丸、参附注射液可用于肾脏保护。其中，附子生物碱(Aconitum carmichaelii Alkaloids,ACA)是附子主要生物活性物质之一，具有强心、镇痛、抗炎、抗老年痴呆、组织再生，抗氧化等活性。

[0003] 孙燕等人在《附子双酯型二萜生物碱对代谢酶的影响及心肌毒性研究进展》中提到附子生物碱中的双酯型二萜生物碱(如:乌头碱、中乌头碱、次乌头碱)可帮助改善心肌毒性，证实了附子生物碱在疾病治疗上的效果。

[0004] 同样地，韦震鸣等人在《去甲乌药碱对2型心肾综合征大鼠心肾的保护作用》中提到附子生物碱中的去甲乌药碱在抗心肌纤维化中的作用。由此，可发现附子生物碱在疾病治疗上的潜力较大，根据附子生物碱的多种特性，可待发现的应用方向还潜藏于冰山之下。

[0005] 急性肾损伤(acute kidney injury,AKI)是指肾功能急剧下降，导致血清肌酐升高和/或尿量减少的临床综合征，与导致肾功能下降的各种病因和病理生理过程有关。AKI不仅使电解质稳态受损和物质代谢紊乱，进展为慢性肾病乃至终末期肾衰竭，还可诱导心血管事件发生及全身炎症反应，使患者面临长期发病和死亡的风险。由于缺乏合适的预防治疗手段，其发病率和死亡率逐年呈上升的趋势，已成为威胁人类健康的重要公共卫生问题。

[0006] 目前，临床上主要以降低去除危险因素(如感染、药物等)、补液及营养物维持内环境稳定、诊治并发症和透析等支持治疗来延缓病程进展，临床疗效有限、价格高昂。因此，寻找真正有效、安全低毒、多靶点、来源广泛的植物药具有重要的临床价值。而AKI属于中医学中的“水肿”、“关格”、“癃闭”等范畴，是脾肾亏虚为本，瘀水互结，浊毒内盛的表现，或可用附子生物碱来缓解AKI的症状。

[0007] 本发明提供了附子生物碱在制备治疗急性肾损伤药物中的应用。将附子生物碱应用在制备急性肾损伤药物中，制备得到的药物能有效降低血清中肌酐和尿素氮的水平，疗效优势明显、价格相对低廉，可改善当前急性肾损伤的临床治疗技术不足。

[0008] 为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：本申请的发明人提供了一种附子生物碱的新用途：附子生物碱在制备治疗急性肾损伤的药物中的应用。

[0009] 为进一步探究附子生物碱在肾脏类疾病中的治疗效果，本申请的发明人以最常用的哺乳动物模型小鼠模型对附子生物碱进行一系列研究。结果显示：给患急性肾损伤的小鼠喂食附子生物碱，可显著降低小鼠血清中肌酐和尿素氮的水平，有效缓解由急性肾损伤带来的肾功能急剧下降并发的临床综合征。此外，附子生物碱可显著改善患急性肾损伤小鼠的肾损伤症状和病理损伤。

[0010] 基于上述研究，本申请的发明人对附子生物碱改善急性肾损伤的机理进行了深入研究，通过对小鼠给食附子生物碱，发现附子生物碱可显著改善小鼠的肠道微生物多样性。同时，可改善小鼠的肠道菌群紊乱，并使之趋于正常。由此可知，附子生物碱是通过对肠道菌群产生作用，来升高小分子有机酸浓度发挥对肾脏的保护作用。

[0011] 本申请的发明人以小鼠模型对附子生物碱进行一系列研究，表明附子生物碱可在制备急性肾损伤的药物中得到有效应用，提供了附子生物碱的一种新用途。

[0012] 上述附子生物碱的提取方法包括以下步骤：S1、以重量份计，附子加入8～12倍质量乙醇，回流提取1～3h，过滤后取滤渣备用；
S2、以重量份计，往S1得到的滤渣中加入5～10倍质量乙醇，回流提取1～2h，过滤、合并滤液，浓缩得到浓缩液；
S3、将S2的浓缩液的pH调至9～11，氯仿萃取2～4次，合并氯仿层，回收氯仿，再加水溶解，得到附子生物碱。

[0013] 生附子含有大量的双酯型生物碱，毒性极大，而传统的水浸泡、煮、漂洗等处理，使总生物碱损失超过80％。合适的制备手段可在一定程度上降低附子的毒性成分双酯型生物碱含有量，增加有效成分单酯型生物碱含有量，达到增效减毒的目的。

[0014] 本申请的发明人利用两次醇提将附子生物碱富集至乙醇中，保证生物碱活性，提高生物碱得率。同时，醇提可帮助去除附子中的糖类、蛋白质，简化后续的分离纯化过程。随后，用氯仿对两次醇提后的附子进行萃取，帮助分离附子中的脂溶性生物碱，去除脂溶性杂质，同时可达到回收乙醇的目的。经两次醇提后浓缩得到的滤液中的醇浓度较高，氯仿萃取，使得乙醇进入氯仿相，实现醇的回收利用。

[0015] 此外，有文献报道附子酯型生物碱在碱性条件下水解将失去C8位苯甲酰基及C14位乙酰基转化为酯型原碱(乌头原碱、新乌原碱、次乌头碱)。为了保证总生物碱的溶出量及其中的单酯型生物碱含有量，S3中水解时的pH值尤为重要。本申请的发明人在参考相关文献和预实验后，发现当pH值维持在9～11时，总生物碱的溶出量较大，且单酯型生物碱含有量得到保证。

[0016] 本发明提出的方法经由两次醇提及最终的氯仿萃取，大大提高了生物碱得率，可帮助得到高精度的附子生物碱。最重要地是，此类方法可去除附子中的双酯型生物碱，大大降低附子的毒性，更利于在临床上的推广应用。

[0017] 优选地，所述步骤S1和S2中，加入的乙醇溶液的pH为2～3。

[0018] 乙醇在生物碱提取中的作用除富集、去除杂质外，当其作为体系中的基础溶剂时，整个体系的pH可以很好地进行调节。文献报道显示，酸水有利于附子生物碱的提取，故本发明将乙醇的pH调至2～3，将整个提取体系维持在酸性条件下。

[0019] 优选地，所述步骤S1和S2中，加入的乙醇溶液的体积浓度为80～90％。

[0020] 乙醇浓度较低，不利于附子生物碱的溶出；而过高的乙醇浓度反之会抑制附子生物碱的溶出。本申请的发明人通过预实验发现，当乙醇溶液的体积浓度为80～90％时，可保持相当的生物碱得率。

[0021] 优选地，所述步骤S2中，浓缩方式为减压浓缩。

[0022] 浓缩可帮助附子生物碱的再一次富集，而减压浓缩是一种高效低温的方式，相较于其他的浓缩方式(如热浓缩)，可以避免高温损失生物碱的活性。

[0023] 优选地，所述步骤S3中调pH所用试剂为氨水、氢氧化钠、氢氧化钾中的一种或多种。

[0024] 由上述提取方法得到的可应用于制备治疗急性肾损伤药物的附子生物碱，为下列之一或其中两种以上的混合物：乌头碱、苯甲酰新乌头原碱、新乌宁碱、塔拉乌头胺、准噶尔乌头碱、附子宁碱、川乌碱甲、森布星A、16β‑羟基‑cardiopetaline、10‑羟基新乌头碱、苯甲酰乌头原碱、次乌头碱和苯甲酰‑8‑OCH3‑新乌头原碱。

[0025] 本申请的发明人对由上述制备方法制得的附子总生物碱液进行LC‑MS/MS检测，在其中发现了含量较高的乌头碱、苯甲酰新乌头原碱、新乌宁碱、塔拉乌头胺、准噶尔乌头碱、附子宁碱、川乌碱甲、森布星A、16β‑羟基‑cardiopetaline、10‑羟基新乌头碱、苯甲酰乌头原碱、次乌头碱和苯甲酰‑8‑OCH3‑新乌头原碱。并在用制得的附子总生物碱液对患急性肾损伤的小鼠模型进行观察实验时，观察到患急性肾损伤的小鼠在附子总生物碱液的帮助下，其肾损伤症状和病理损伤得到显著改善。

[0026] 附子生物碱加入药学可接受的辅料，制成下列之一的剂型：混悬液、胶囊剂、片剂、丸剂、滴丸剂、颗粒剂、散剂、注射剂和缓释剂。

[0027] 除此之外，还可将附子生物碱应用到防治急性肾损伤的中药组合物中。

[0028] 优选地，所述附子生物碱药用剂量为5.0～10.0mg/kg/天。

[0029] 本申请的发明人在附子生物碱对顺铂诱导的急性肾损伤的小鼠作用实验中，观察到附子生物碱的给药量在5.0～10.0mg/kg/天即可达到药用效果。增大附子生物碱的给药量，对小鼠的肾脏损失评分提升效果甚微。

[0030] 因此，本发明具有以下有益效果：(1)本发明提出将附子生物碱用于治疗急性肾损伤，并通过小鼠实验证实附子生物碱在急性肾损伤治疗中的效果，为后续治疗急性肾损伤提供了新思路；
(2)本发明采用顺铂诱导的AKI动物模型，以“肠‑肾”轴为切入点，从肠道菌群产生的短链脂肪酸差异物质调控；其中ACA显著降低AKI小鼠血清中肌酐和尿素氮的水平，同时减少肾脏组织炎症细胞浸润；还观察到ACA可改善AKI模型组肠道菌群变化，升高丁酸、己酸浓度发挥肾脏保护作用，阐明了附子生物碱防治急性肾损伤疗效及机制，为后续研究提供方向；
(3)本发明提出的附子生物碱的提取工艺，可帮助降低附子的毒性成分双酯型生物碱含有量，增加有效成分单酯型生物碱含有量。
附图说明

[0031] 图1为实施例1中附子生物碱的提取流程示意图；图2为实施例1中所得附子生物碱的成分鉴定结果图；
图3为实施例5中附子生物碱对顺铂诱导的AKI小鼠的肾脏治疗效果图；
图4为实施例6中附子生物碱对顺铂诱导的AKI小鼠的肠道治疗效果图；
图5为实施例6中差异微生物群落多样性分析结果图；
图6为实施例7中肠道菌群代谢物长链脂肪酸中乙酸含量结果图。

[0032] 下面结合具体实施例对本发明做进一步描述。本领域普通技术人员在基于这些说明的情况下将能够实现本发明。此外，下述说明中涉及到的本发明的实施例通常仅是本发明一部分的实施例，而不是全部的实施例。因此，基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。

[0033] 【实施例】实施例1：附子生物碱的制备1
S1、以重量份计，130g附子加入pH＝2的10倍量85％乙醇，回流提取2h，过滤后取滤渣备用；
S2、以重量份计，往S1中得到的滤渣中加入pH＝2的8倍量85％乙醇，回流提取1h，过滤、合并滤液，浓缩至100mL；
S3、将S2的100mL浓缩液的pH调至10，氯仿萃取3次，合并氯仿层，回收氯仿，得附子总生物碱浸膏。再加水溶解并定容至50mL，得含生药量为2.60g/mL附子总生物碱液。

[0034] 实施例2：附子生物碱的制备2S1、以重量份计，130g附子加入pH＝3的8倍量80％乙醇，回流提取3h，过滤后取滤渣备用；
S2、以重量份计，往S1中得到的滤渣中加入pH＝3的5倍量80％乙醇，回流提取
1.5h，过滤、合并滤液，浓缩至80mL；
S3、将S2的80mL浓缩液的pH调至11，氯仿萃取3次，合并氯仿层，回收氯仿，得附子总生物碱浸膏。再加水溶解并定容至30mL，得含生药量为2.58g/mL附子总生物碱液。

[0035] 实施例3：附子生物碱的制备3S1、以重量份计，130g附子加入pH＝2.8的12倍量90％乙醇，回流提取1h，过滤后取滤渣备用；
S2、以重量份计，往S1中得到的滤渣中加入pH＝2.8的10倍量90％乙醇，回流提取
2h，过滤、合并滤液，浓缩至80mL；
S3、将S2的80mL浓缩液的pH调至9，氯仿萃取4次，合并氯仿层，回收氯仿，得附子总生物碱浸膏。再加水溶解并定容至80mL，得含生药量为2.61g/mL附子总生物碱液。

[0036] 实施例4：附子生物碱成分鉴定取实施例1制备得到的附子总生物碱液，纯水稀释至2μg/mL，进行LC‑MS/MS检测。
液相条件：ACQUITY BEH C18色谱柱(2.1×100mm,1.7μm)，0.1％甲酸水(A)‑乙腈(B)梯度洗脱(0‑0.5min,5％ B；0.5‑12min,5‑20％ B；12‑15min,20‑30％；15‑18min,30‑60％；
18‑18.5min,60‑90％；18.5‑22min,95％ B)。质谱条件：正离子模式，SCAN模式扫描获得总离子流图，MRM模式提取化合物离子对。离子源温度，150℃；脱溶剂气温度，400℃；脱溶剂气流速，800L/Hr。化合物锥孔电压、碰撞能、离子对参数如表1所示：
表1：化合物锥孔电压、碰撞能、离子对参数
上述测试结果如图2所示，分析图2的图谱可知，提取附子总生物碱液可得到如表2所示的13种含量较高的生物碱，分别是乌头碱、苯甲酰新乌头原碱、新乌宁碱、塔拉乌头胺、准噶尔乌头碱、附子宁碱、川乌碱甲、森布星A、16β‑羟基‑cardiopetaline、10‑羟基新乌头碱、苯甲酰乌头原碱、次乌头碱、苯甲酰‑8‑OCH3‑新乌头原碱。

[0037] 表2：成分鉴定结果序号 物质 保留时间(min)
1 多根乌头碱 2.82
2 森布星A 3.79
3 16β‑羟基‑cardiopetaline 4.37
4 多根乌头碱 5.17
4 川乌碱甲 5.39
5 准噶尔乌头碱 6.06
6 附子宁碱 8.92
7 新乌宁碱 10.04
8 塔拉乌头胺 13.35
9 新乌宁碱 13.95
10 苯甲酰新乌头原碱 15.20
11 苯甲酰乌头原碱 16.31
12 苯甲酰‑8‑OCH3‑新乌头原碱 16.74
13 10‑羟基新乌头碱 17.3
14 次乌头碱 17.84
15 次乌头碱 17.84
实施例5：附子生物碱对CDDP诱导的AKI小鼠改善作用
1.实验方法
30只(20±2g)雄性C57BL/6SPF小鼠，随机分为5组(每组6只)：对照组、模型组(顺铂20mg/kg)、氨磷汀阳性对照组(AMF 200mg/kg)、ACA组(5mg/kg)和ACA组(10mg/kg)。除对照组外，所有小鼠均腹腔注射顺铂溶液4天以诱导AKI。同时阳性对照组及附子生物碱组按
0.1mL/10g给药量灌胃2次/天，连续给药4天。每日记录小鼠体重及其他异常情况，第4天收集粪便样本，储存于‑80℃冰箱保存。第5天小鼠称重后颈椎脱位处死，解剖取样。血浆室温静置0.5h，2000rpm离心取血清用于生化指标检测；小鼠肾脏称重备用，部分肾脏经生理盐水冲洗干净后立即放入4％多聚甲醛中固定，48h后用石蜡包埋、切片观察肾脏病理状况并记录肾脏损伤评分，其余肾脏组织称重后立即放入液氮速冻，然后放入‑80℃冰箱中长期保存。

[0038] 2.实验结果实验结果如图3所示，其中A为体重变化曲线，B为小鼠血清中肌酐和尿素氮的水平，C为肾切片H&E染色的代表性图片，D为肾切片形态学评分。每个点用平均值±标准差(n*** ###
＝6)表示，与对照组相比， p＜0.001；与模型组相比， p＜0.001。

[0039] 由图3A可知ACA能显著抑制小鼠体重的减轻，尤其是ACA(10mg/kg)组。观察图3B可知，ACA显著降低AKI小鼠血清中肌酐(Cr)和尿素氮(BUN)的水平。而图3C表明ACA减少了肾脏组织炎性细胞浸润，改善了肾组织细胞排列。图3D表明ACA显著改善了肾损伤的组织病理学评分。综上所述，ACA可显著改善AKI小鼠的肾损伤症状和病理损伤。

[0040] 实施例6：附子生物碱可调节CDDP诱导的AKI小鼠肠道微生物群紊乱1.实验方法
(1)使用 DNA Isolation kit试剂盒，从“实施例5”冷冻固体粪便样本中
提取总DNA，经Nanodrop 2000检测所得基因组DNA的浓度和纯度，并在1％琼脂糖凝胶上进行DNA的完整性评估。

[0041] (2)将上步所得样本稀释至10ng/mL。以稀释后的DNA为模板，使用带接头(Barcode)的特异引物，根据不同细菌的16S rDNA设计特异引物，在V3+V4可变区进行PCR扩增。

[0042] (3)通过1.8％的琼脂糖凝胶电泳检测PCR反应产物，并使用ImageJ软件分析定量，1:1进行混样。使用GeneJET DNA纯化试剂盒进行PCR产物纯化。

[0043] (4)将PCR纯化产物进行定量和均一化，构建测序cDNA文库，随后用Illumina HiSeq2500系统对质检合格的文库进行高通量测序。

[0044] (5)使用双端测序reads融合工具FLASH对测序数据进行拼接、质量过滤。通过UCHIME算法与参考数据库比较，去除嵌合体序列并获得有效数据。

[0045] (6)使用Vsearch软件根据97％相似阈值归类OTU，并基于细菌分类学数据库对OTU进行分类学注释，得到其物种分类信息。

[0046] (7)使用mafft软件(V7.310)确定不同类群中优势种的差异。

[0047] 2.实验结果实验结果如图4和5所示，其中图4A为维恩图(Venn)，图4B为测物种曲线图
(Observed)，图4C为皮洛均匀度(plelou)曲线图，图4D为香农多样性曲线图(shannon)，图
4E为辛普森多样性曲线图(simpson)，图4F为主成分分析(PCA)，图4G为未加权UniFrac距离的主坐标分析(PCoA)，图4H为非度量多维尺度图(NMDS)。图5A为ACA作用后在门水平上对各组粪便菌群进行聚类分析的结果图，图5B为ACA作用后在属水平上对各组粪便菌群进行聚类分析的结果图。

[0048] (1)OTU聚类分析：如图4A所示，所有组中有565个OTU重叠，而对照组和模型组中有687个OTU重叠，对照组和ACA(5mg/kg)组中有736个OTU重叠。说明ACA干预后，可在一定程度上逆转顺铂诱导的小鼠肠道菌群多样性变化。

[0049] (2)α‑多样性分析：模型组Shannon指数、Simpson指数、Obeserved otus指数，Pielou指数比对照组均显著升高(P＜0.05)，而在ACA(5mg/kg)给药组在一定程度上抑制了该上升趋势(图4B‑E)，表明ACA(5mg/kg)能显著改善CDDP诱导的AKI小鼠的肠菌群结构改变。观察表3中的多样性分析结果可知物种多样性、实际检测到的OTU数及系谱发育多样性均降低。

[0050] 表3：α‑多样性分析结果Alpha_diversity Control Model ACA_5
Chao1 685.54±34.58 831.96±320.21 829.19±109.67
Observed_otus 681.17±32.65 829.00±318.89 825.00±108.76
Shannon 6.73±0.30 7.63±0.50 7.33±0.43
Simpson 0.94±0.02 0.99±0.00 0.98±0.01
Pielou_e 0.68±0.03 0.80±0.01 ±0.04
(3)β多样性分析：如图4F‑H所示，主成分分析(PCA)、主坐标分析(PCoA)和非度量多维标度(NMDS)的结果表明，对照组和模型组之间的孤立簇没有重叠，ACA(5mg/kg)组倾向于对照组，表明ACA能够调节肠道菌群趋于正常。

[0051] (4)物种组成差异聚类分析：观察图5及与图5中数据相对应的表4的结果可知，模型组与对照组相比，在门水平上和属水平上均出现显著的变化，而ACA显著逆转了上述变化，表明ACA显著改善了AKI小鼠的菌群多样性。ACA在门和属水平可显著改善顺铂导致的多种菌群的变化。

[0052] 表4：在门(p_)和属(g_)水平上的聚类分析结果  Control Model ACA_5
p_Firmicutes 55.35 52.07 51.06
p_Bacteroidota 32.32 33.42 31.10
#
p_Proteobacteria 3.02 5.83 4.82
p_Desulfobacterota 2.86 1.80 3.80
#
p_Patescibactaria 1.61 0.89 3.12*
p_Deferribacterota 0.29 0.11 0.44
#
g_Ligilactobacillus 22.34 4.09 8.00*
#
g_Ruminococcaceae_unclassified 13.18 1.68 2.23
g_Muribaculum 4.20 2.50 3.49
g_Lachnospiraceae_NK4A136_group 3.03 5.64 3.56
#
g_Allobaculum 0.25 4.45 2.71*
g_Helicobacter 2.82 1.81 2.81
#
g_Lactobacillus 0.61 3.10 2.60
g_Candidatus_Saccharimonas 1.61 0.89 3.11*
#
g_Ruminococcus 0.21 4.83 0.66*
#
g_Bifidobacterium 0.46 1.38 0.26*
#
g_Escherichia‑Shigella 0.19 3.43 0.99*
#
p＜0.05vs.control，*p＜0.05vs.model.
实施例7：附子生物碱上调AKI小鼠体内肠道菌群代谢物长链脂肪酸中乙酸含量
1.实验方法
吸取50μL实施例3中小鼠血清，加入100μL甲醇(80％)，涡旋混匀，离心(4℃，
20000rcf)15min，取上清液20μL于1.5mL EP管中，再加入3‑NPH和EDC衍生试剂，水浴30min，用甲醇‑乙腈‑水混合液(体积比8:1:1)定容至500μL，涡旋混匀，取200μL至进样瓶，LC‑MS/MS检测分析获得长链脂肪酸(乙酸、丙酸、丁酸、丙酸、异戊酸及己酸)在各组中浓度。

[0053] 2.实验结果其结果如图6所示，观察图6可知，ACA(5mg/kg)可以调节CDDP诱导的AKI小鼠体内多种短链脂肪酸的浓度变化，尤其对于丁酸和己酸浓度的改善最为显著。