金钗石斛总生物碱及其提取方法和在制备治疗糖尿病药物中的应用 |
|||||||
| 申请号 | CN202310648573.4 | 申请日 | 2023-06-02 | 公开(公告)号 | CN116606330A | 公开(公告)日 | 2023-08-18 |
| 申请人 | 成都融济华泰医药科技有限公司; | 发明人 | 赵学勇; 隋美玲; 岑川; | ||||
| 摘要 | 本 发明 公开了一种金钗石斛总 生物 碱 及其提取方法和在制备 治疗 糖尿病药物中的应用，提取方法包括金钗石斛干燥茎依次经过 粉碎 、过筛以及称重，得到金钗石斛粉末；按照料液比1:8～1:12用酸性 乙醇 浸泡金钗石斛粉末，后进行回流提取；回流提取得到的液体进行浓缩，然后用 酸溶液 进行溶解，得到待纯化溶液；待纯化溶液依次经过阳离子交换 树脂 、大孔 吸附 树脂纯化以及 有机 溶剂 纯化；通过本发明公开的金钗石斛总生物碱提取方法所得金钗石斛总生物碱的纯度大于80％，收率为1.0％～1.4％，具有纯度和收率相对较高的特点。可应用于糖尿病的治疗中。 | ||||||
| 权利要求 | 1.一种金钗石斛总生物碱的提取方法，其特征在于，所述提取方法包括： |
||||||
| 说明书全文 | 金钗石斛总生物碱及其提取方法和在制备治疗糖尿病药物中的应用 技术领域[0001] 本发明涉及中药技术领域，具体涉及一种金钗石斛总生物碱及其提取方法和在制备治疗糖尿病药物中的应用。 背景技术[0002] 糖尿病(diabetes mellitus,DM)是因胰岛素绝对或相对分泌不足、靶组织细胞对胰岛素敏感性降低引起蛋白质、脂肪等代谢紊乱的一种疾病，其中高血糖为其主要标志。由于控制血糖能力不足，糖尿病患者长期处于高血糖水平，从而损伤微血管和大血管，造成严重的并发症，因此降低血糖水平对于糖尿病的治疗十分关键。如何预防和治疗糖尿病及其并发症已成为世界各国医务工作者面临的严峻挑战。中医专注于糖尿病的治疗已有数千年的历史，中医的“整体观”和“多靶点”方法在医治糖尿病等多诱因疾病方面具有独特的优势。 [0003] 金钗石斛为兰科植物金钗石斛的新鲜或干燥茎，具有益胃生津，滋阴清热的功效。现代药理研究表明，金钗石斛具有抗肿瘤、抗衰老、保护神经系统、抗白内障、降血糖、调节血脂、提高免疫力、抗炎、抗疲劳等活性。已有研究报道金钗石斛具有治疗糖尿病及其相关病变的功效，然而对于金钗石斛总生物碱在糖尿病中的应用研究较少。 [0004] 现有金钗石斛总生物碱的提取一般都是采用单一方式提取，在纯度和收率方面均较低。 发明内容[0005] 本发明所要解决的技术问题是现有提取金钗石斛总生物碱方法存在纯度和收率方便均较低的问题。本发明提供一种金钗石斛总生物碱的提取方法。 [0006] 本发明的技术方案为：一种金钗石斛总生物碱的提取方法，包括： [0007] 金钗石斛干燥茎依次经过粉碎、过筛以及称重，得到金钗石斛粉末； [0008] 按照料液比1:8～1:12用酸性乙醇浸泡金钗石斛粉末，后进行回流提取； [0009] 回流提取得到的液体进行浓缩，然后用酸溶液进行溶解，得到待纯化溶液； [0011] 作为一种可能的设计，所述酸性乙醇中乙醇含量为70wt％～80wt％，pH值为3～4。 [0012] 作为一种可能的设计，所述回流提取的温度为60℃～100℃，提取次数为2～4次，每次提取的时间为2～3小时。 [0014] 作为一种可能的设计，所述待纯化溶液在进行阳离子交换树纯化前，用碱液将其pH值调节至8～10。 [0016] 作为一种可能的设计，所述有机溶剂包括二氯甲烷和/或氯仿。 [0017] 作为一种可能的设计，所述阳离子交换树脂和大孔吸附树脂纯化过程中依次经过水洗、75％～80％乙醇溶液洗以及含有2％～3％氨水的75％～80％乙醇溶液洗； [0018] 或； [0019] 所述阳离子交换树脂和大孔吸附树脂纯化过程中依次经过水洗、20％～30％乙醇溶液洗以及70％～80％乙醇溶液洗。 [0020] 本发明的有益效果为： [0021] 1.通过本发明公开的金钗石斛总生物碱提取方法所得金钗石斛总生物碱的纯度大于80％，收率为1.0％～1.4％，具有纯度和收率相对较高的特点。 [0022] 2.金钗石斛总生物碱中生物碱的种类丰富，经HPLC‑MS/MS分析，金钗石斛总生物碱中主要生物碱有：石斛碱、红星碱B、石斛星碱、2‑羟基石斛碱、6‑羟基石斛碱、4‑羟基石斛碱、红星碱A、红星碱C、石斛酮碱、细茎石斛碱、石斛氨碱、石斛酯碱、石斛酮碱、6‑羟基石斛酮碱等。 [0024] 为了更清楚地说明本发明示例性实施方式的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。在附图中： [0025] 图1为实施例1中开始给药后每周各组大鼠体重变化图； [0026] 图2为实施例1中金钗石斛总生物碱对各组大鼠血糖水平的影响图； [0027] 图3为实施例1中金钗石斛总生物碱对各组大鼠血清胰岛素水平的影响图； [0028] 图4为实施例1中金钗石斛总生物碱对各组大鼠GLP‑1水平的影响图； [0029] 图5为实施例1中金钗石斛总生物碱对各组大鼠caspase3水平的影响图； [0030] 图6为实施例1中金钗石斛总生物碱各组大鼠胰岛素抵抗指数HOMA‑IR的影响图。 具体实施方式[0031] 为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下面结合实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明，本发明的示意性实施方式及其说明仅用于解释本发明，并不作为对本发明的限定。 [0032] 本发明发明人发现金钗石斛具有治疗糖尿病及其相关病变的功效，但是目前关于金钗石斛的提取物(如：生物碱)在糖尿病中的应用研究很少，并不知金钗石斛生物碱是否能够治疗糖尿病；并且现有技术关于金钗石斛生物碱的提取方式都比较单一，存在纯度交底和收率低的问题。 [0033] 针对上述问题，本发明提供一种金钗石斛总生物碱的提取方法，包括以下步骤： [0034] S1.金钗石斛干燥茎依次经过粉碎、过筛以及称重，得到金钗石斛粉末； [0035] S2.按照料液比1:8～1:12用酸性乙醇浸泡金钗石斛粉末，后进行回流提取； [0036] S3.回流提取得到的液体进行浓缩，然后用酸溶液进行溶解，得到待纯化溶液； [0037] S4.待纯化溶液依次经过阳离子交换树脂、大孔吸附树脂纯化以及有机溶剂纯化。 [0038] 在步骤S1中金钗石斛粉末的粒径为50目左右。 [0039] 所述“料液比”是指固相质量和液相体积之间的比例。在步骤S2中，料液比一般为1:8～1:12，优选1:10～1:12，更优选1:12。 [0040] 所述“酸性乙醇”是指用酸性溶液调节乙醇pH值所得的溶液，酸性溶液一般为盐酸或浓硫酸。在步骤S2中，酸性乙醇的pH值为3～4。 [0041] 在步骤S2中，浸泡时间不少于8～10h，最好是浸泡过夜。回流提取的温度一般为60℃～100℃，优选80℃～100℃，更优选95℃～100℃。回流提取的次数一般为3～4次，每次的时间不少于2h，一般为2～3h。 [0042] 在步骤S3中，浓缩主要是回收酸性乙醇且得到浸膏，便于后续的再次溶解。酸溶液主要为盐酸或硫酸。 [0043] 在步骤S4中，所述待纯化溶液在进行阳离子交换树纯化前，用碱液将其pH值调节至8～10。碱液一般为氢氧化钠饱和溶液或浓氨水。阳离子交换树脂一般为钠型阳离子交换树脂。大孔吸附树脂一般为AB‑8大孔树脂。阳离子交换树脂或大孔吸附树脂吸附完成后进行洗脱时，主要是梯度洗脱，具体如下： [0044] (1)用水洗脱8～10BV至molish反应为阴性；(2)80％乙醇溶液洗脱4～6个BV至molish反应为阴性；(3)含2％氨水的80％乙醇溶液洗脱10～12个BV至生物碱检识反应为阴性，浓缩洗脱液。 [0045] 或； [0046] 大孔吸附树脂或阳离子交换树脂吸附完成后进行洗脱时，主要是梯度洗脱，具体如下： [0047] (1)用水洗脱6～8BV至molish反应为阴性；(2)20％～30％乙醇溶液洗脱4～6个BV至molish反应为阴性；(3)70％～80％乙醇溶液洗脱10～12个BV至生物碱检识反应为阴性，浓缩洗脱液。 [0048] 在步骤S4中，有机溶剂包括但不限于二氯甲烷和/或氯仿。 [0049] 本发明提取得到的金钗石斛总生物碱的纯度大于80％，并且研究发现提取得到的金钗石斛总生物碱在治疗糖尿病方面有良好的效果。 [0050] 实施例1 [0051] 本实施例公开一种金钗石斛总生物碱的提取方法，包括以下步骤： [0052] S1.称取金钗石斛干燥茎5kg，粉碎、过筛； [0053] S2.按照料液比1:8加入PH＝3的75％乙醇浸泡药材过夜，回流提取2次。过滤，合并滤液，滤液经浓缩、干燥后得到金钗石斛提取物浸膏。 [0054] S3.用2％的盐酸溶解浸膏；过滤，饱和氢氧化钠溶液调节pH值为4，通过预处理好的钠型阳离子交换树脂纯化，重复上样3次，上样完毕后，以流速为2‑3BV/h按照以下步骤进行梯度洗脱：(1)水洗脱10BV；(2)80％乙醇溶液洗脱5个BV；(3)含2％氨水的80％乙醇溶液洗脱10个BV；浓缩(3)中的洗脱液，调节PH＝4，将调节好pH的上样液再通过预处理好的AB‑8大孔吸附树脂上进行进一步纯化，以流速为2‑3BV/h按照以下步骤进行梯度洗脱：(1)用水洗脱6BV；(2)30％乙醇溶液洗脱5个BV；(3)酸性乙醇溶液洗脱10个BV，浓缩(3)中的洗脱液，加浓氨水调节PH＝10，用等体积氯仿萃取8次，氯仿层浓缩即得金钗石斛总生物碱54g。 [0055] 酸性染料比色测定金钗石斛总生物碱含量 [0056] 1.标准曲线的制备：精密称取石斛碱对照品0.50mg，置50mL容量瓶中，少量三氯甲烷充分溶解后定容至刻度；用移液枪分别取50、150、200、300、400μL于1.5mL具塞玻璃试管中，分别加适量三氯甲烷补至500μL体积；加入pH＝4.5的缓冲溶液250μL和0.04％溴甲酚绿溶液100μL，剧烈振摇3min，静置30min，分层，取下层三氯甲烷液100μL于96孔板，加0.01mol/L NaOH‑无水乙醇溶液20μL，摇匀，取三氯甲烷溶液，同法操作，作为空白对照；于酶标仪620nm处测定吸光度。以石斛碱浓度为横坐标，吸光度为纵坐标作标准曲线得回归方 2 程，A＝21.781C+0.068(R＝0.998)，在1‑5μg/mL有良好的线性关系； [0057] 2.金钗石斛总生物碱样品的测定：称取供试品金钗石斛总生物碱0.50mg，置5mL容量瓶中，少量三氯甲烷完全溶解后定容至刻度；移液枪移取200μL于1.5mL具塞玻璃试管中，加三氯甲烷300μL，摇匀，作为供试品溶液，其余操作按1进行，结果为金钗石斛总生物碱含量为88.3％，纯化得总生物碱量(g)/所用金钗石斛药材粉末量(g)＝总生物碱收率，计算得到总生物碱收率为1.08％。 [0058] 金钗石斛总生物碱对糖尿病模型SD大鼠的干预作用的方法，包括： [0059] 模型建立、实验分组及给药 [0060] 180～220g雄性SD大鼠60只，随机分为6组；空白组、模型组、二甲双胍组(100mg/kg)、金钗石斛总生物碱低、中、高剂量组(20、40、80mg/kg)，每组10只。模型组和给药组采用高脂高糖饲料喂养大鼠6周后，一次腹腔注射链脲佐菌素(STZ)40mg/kg诱导糖尿病大鼠模型；空白组采用普通饲料喂养6周，腹腔注射等体积生理盐水。模型建立成功后药物治疗组分别给予对应剂量的药物灌胃给药4周，空白组和模型组采用1％吐温80灌胃给药4周。 [0061] 药效指标检测 [0062] 在建模和给药过程中密切关注大鼠各项生理指标，每周测量一次大鼠体重。采用血糖测定仪观察各组大鼠空腹血糖变化，采用ELISA法测定大鼠血清中胰岛素(FINS)含量，根据胰岛素抵抗指数HOMA‑IR＝空腹血糖水平×血清胰岛素水平/22.5，计算大鼠HOMA‑IR。ELISA测定胰高血糖素样肽(GLP‑1)和半胱天冬氨酸蛋白酶3(caspase3)的表达。 [0063] 血糖测定方法:于各组试验动物灌胃0周、2周和4周，每组小鼠尾静脉取血，血糖仪测定空腹血糖。 [0065] 血清胰高血糖素样肽(GLP‑1)、caspase3测定，采用ELISA试剂盒，各试剂在使用前平衡至室温，按说明书配好标准品、洗涤液等，按试剂盒说明书进行操作。 [0066] 统计学方法 [0067] 所有数据均以 表示，使用GraphPad Prism 7软件进行统计分析；使用非配对t‑test来评估两组之间的差异。使用one‑way ANOVA进行多组比较。P<0.05的值被认为具有统计学意义。 [0068] 结果见图1‑6。C为对照组，DM为模型组，P为阳性药组，L为金钗石斛总生物碱低剂量治疗组；M为金钗石斛总生物碱中剂量治疗组；H为金钗石斛总生物碱高剂量治疗组。 [0069] 图1为实施例1中开始给药后每周各组大鼠体重变化，由图1可知，跟模型组相比，阳性药组和金钗石斛总生物碱高剂量治疗组体重下降更加缓慢。 [0070] 图2为实施例1中金钗石斛总生物碱对各组大鼠血糖水平的影响，由图2可知，跟模型组相比，阳性药组和金钗石斛总生物碱高、中剂量治疗组的降糖效果明显，且阳性药组和金钗石斛总生物碱高、中剂量治疗组降糖效果相当。 [0071] 图3为实施例1中金钗石斛总生物碱对各组大鼠血清胰岛素水平的影响，由图3可知，跟模型组相比，阳性药组和金钗石斛总生物碱治疗组的胰岛素水平均较高，并且金钗石斛总生物碱高剂量治疗组胰岛素水平和正常组相当，说明金钗石斛总生物碱能够明显提高胰岛素水平，从而首先血糖的控制。 [0072] 图4为实施例1中金钗石斛总生物碱对各组大鼠GLP‑1水平的影响，由图4可知，跟模型组相比，阳性药组和金钗石斛总生物碱治疗组的GLP‑1水平具有明显的提高，但是跟正常组相比，差异还是较大，说明金钗石斛总生物碱能够在一定程度上促进GLP‑1的表达。 [0073] 图5为实施例1中金钗石斛总生物碱对各组大鼠caspase3水平的影响，由图5可知，跟模型组相比，阳性药组和金钗石斛总生物碱治疗组的caspase3水平具有明显的下降，但是跟正常组相比，差异还是较大，说明金钗石斛总生物碱能够在一定程度上抑制caspase3的表达。 [0074] 图6为实施例1中金钗石斛总生物碱各组大鼠胰岛素抵抗指数HOMA‑IR的影响，由图6可知，跟模型组相比，阳性药组和金钗石斛总生物碱治疗组的胰岛素抵抗指数HOMA‑IR具有明显的下降，特别是金钗石斛总生物碱高剂量治疗组和正常组无明显差异，说明金钗石斛总生物碱在一定剂量上降低胰岛素抵抗指数HOMA‑IR，从而达到治疗糖尿病。 [0075] 实施例2 [0076] 本实施例公开一种金钗石斛总生物碱的提取方法，包括以下步骤： [0077] S1.称取金钗石斛干燥茎25kg，粉碎、过筛；按照料液比1:10加入PH＝3的75％的乙醇浸泡药材过夜，回流提取2次。过滤，合并滤液，滤液经浓缩、干燥后得到金钗石斛提取物浸膏。 [0078] S2.用3％的盐酸溶解浸膏；过滤，饱和氢氧化钠溶液调节pH值为4，通过预处理好的钠型阳离子交换树脂纯化，上样完毕后，以流速为2～BV/h按照以下步骤进行梯度洗脱：(1)水洗脱9BV；(2)80％乙醇溶液洗脱5个BV；(3)含2％氨水的80％乙醇溶液洗脱12个BV；浓缩(3)中的洗脱液，调节PH＝4。 [0079] S3.将调节好pH的上样液再通过预处理好的AB‑8大孔吸附树脂上进行进一步纯化，以流速为2～3BV/h按照以下步骤进行梯度洗脱：(1)用水洗脱6BV；(2)30％乙醇溶液洗脱5个BV；(3)80％乙醇溶液洗脱10个BV，浓缩(3)中的洗脱液，加浓氨水调节PH＝10，用等体积氯仿萃取8次，氯仿层浓缩即得金钗石斛总生物碱337.5g。 [0080] 金钗石斛总生物碱含量为82.7％，总生物碱收率为1.35％。 [0081] 实施例3 [0082] 本实施例公开一种金钗石斛总生物碱的提取方法，包括以下步骤： [0083] S1.称取金钗石斛干燥茎10kg，粉碎、过筛；按照料液比1:10加入PH＝3的75％的乙醇浸泡药材过夜，回流提取2次。过滤，合并滤液，滤液经浓缩、干燥后得金钗石斛提取物浸膏。 [0084] S2.用2％的盐酸溶解浸膏；过滤，饱和氢氧化钠溶液调节pH值为4，通过预处理好的钠型阳离子交换树脂纯化，以流速为2‑3BV/h按照以下步骤进行梯度洗脱：(1)水洗脱10BV；(2)80％乙醇溶液洗脱4个BV；(3)含2％氨水的80％乙醇溶液洗脱12个BV；浓缩(3)中的洗脱液，调节PH＝4。 [0085] S3.将调节好pH的上样液再通过预处理好的AB‑8大孔吸附树脂上进行进一步纯化，以流速为2‑3BV/h按照以下步骤进行梯度洗脱：(1)用水洗脱6BV；(2)30％乙醇溶液洗脱5个BV；(3)80％乙醇溶液洗脱10个BV，浓缩(3)中的洗脱液，加浓氨水调节PH＝10，用等体积氯仿萃取8次，氯仿层浓缩得金钗石斛总生物碱116g。 [0086] 金钗石斛总生物碱含量为85.6％，总生物碱收率为1.16％。 [0087] 以上所述的具体实施方式，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施方式而已，并不用于限定本发明的保护范围，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。 |
||||||
QQ群二维码
意见反馈
意见反馈