一种具有抗消化道肿瘤作用的铁皮石斛总生物碱提取物及其制备方法和应用专利检索-生物碱专利检索查询-专利查询网

一种具有抗消化道肿瘤作用的铁皮石斛总生物碱提取物及其制备方法和应用
申请号	CN202211606887.X	申请日	2022-12-14	公开(公告)号	CN116098965A	公开(公告)日	2023-05-12
申请人	安徽农业大学;			发明人	魏练平; 董文浩; 王亭; 陈晨; 祝豪杰; 金青; 蔡永萍;
摘要	本发明公开了一种具有抗消化道肿瘤作用的铁皮石斛总生物碱提取物及其制备方法和应用，制备方法包括以下步骤：(1)取铁皮石斛茎粉末，加入酸醇提取液先进行浸提处理，获得铁皮石斛总生物碱粗提液；(2)对铁皮石斛总生物碱粗提液萃取后静置分相，再旋蒸处理，获得总生物碱浸膏；(3)将总生物碱浸膏用无水乙醇溶解，获得总生物碱上样溶液；(4)将总生物碱上样溶液与大孔树脂混合，经过静态吸附后，先用乙醇水溶液洗去杂质，再用乙醇进行静态解吸附，获得乙醇洗脱液；(5)将乙醇洗脱液室温氮吹至恒重。按照本发明所述方法获得的铁皮石斛总生物碱提取物的各成分之间发挥显著的协同调控作用，对消化道肿瘤细胞活力具有显著的抑制作用。
权利要求	1.一种具有抗消化道肿瘤作用的铁皮石斛总生物碱提取物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤： (1)取铁皮石斛茎粉末，加入酸醇提取液先进行浸提处理，再进行超声提取处理，离心分离上清液，对沉淀重复上述提取过程，再次离心分离上清液，将两次上清液合并，获得铁皮石斛总生物碱粗提液； (2)向铁皮石斛总生物碱粗提液中加入氨水，调节pH为碱性，再与等量体积的二氯甲烷溶液混合，萃取后静置分相，收集下层二氯甲烷相，再旋蒸处理，获得总生物碱浸膏； (3)将总生物碱浸膏用无水乙醇溶解，再用蒸馏水稀释，且无水乙醇和蒸馏水形成浓度为20％的乙醇水溶液作为溶媒，获得总生物碱上样溶液； (4)将总生物碱上样溶液与大孔树脂混合，经过静态吸附后，先用乙醇水溶液洗去杂质，再用乙醇进行静态解吸附，获得乙醇洗脱液； (5)将乙醇洗脱液室温氮吹至恒重，获得有抗消化道肿瘤作用的铁皮石斛总生物碱提取物。 2.如权利要求1所述的具有抗消化道肿瘤作用的铁皮石斛总生物碱提取物的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述酸醇提取液含有体积分数0.05％～0.2％的盐酸和体积分数70％～90％的乙醇；铁皮石斛粉末与酸醇提取液的料液比为1g：10～30mL。 3.如权利要求1所述的具有抗消化道肿瘤作用的铁皮石斛总生物碱提取物的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，浸提处理温度为20～30℃，浸提处理时间为24～36h。 4.如权利要求1所述的具有抗消化道肿瘤作用的铁皮石斛总生物碱提取物的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，超声提取处理时间为30～60min，超声提取处理温度为30～60℃，超声提取处理频率为120～180Hz。 5.如权利要求1所述的具有抗消化道肿瘤作用的铁皮石斛总生物碱提取物的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，氨水的体积浓度为28％，氨水将总生物碱粗提液的pH值调节为 9.0～11.0；二氯甲烷溶液的体积浓度为99.5％，旋蒸处理温度为40～60℃，旋蒸处理转速为350～400rpm。 6.如权利要求1所述的具有抗消化道肿瘤作用的铁皮石斛总生物碱提取物的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，总生物碱上样溶液浓度为300～500μg/mL。 7.如权利要求1所述的具有抗消化道肿瘤作用的铁皮石斛总生物碱提取物的制备方法，其特征在于，步骤(4)中，所述大孔树脂为D101、HPD100、X‑5中的任意一种。 8.如权利要求1所述的具有抗消化道肿瘤作用的铁皮石斛总生物碱提取物的制备方法，其特征在于，步骤(4)中，大孔树脂与总生物碱上样溶液的料液比为0.5g：5～15mL；静态吸附和解吸附温度分别为25～45℃，静态吸附和解吸附时间分别为12～24h，静态吸附和解吸附在摇床上进行，摇床转速为100～150rpm；乙醇水溶液的乙醇体积分数为60％。 9.一种具有抗消化道肿瘤作用的铁皮石斛总生物碱提取物，其特征在于，按照权利要求1至8中任一项所述的制备方法制得。 10.如权利要求9所述的铁皮石斛总生物碱提取物在制备抗消化道肿瘤药物中的应用。
说明书全文	一种具有抗消化道肿瘤作用的铁皮石斛总生物碱提取物及其制备方法和应用技术领域 [0001] 本发明涉及生物医药领域，尤其涉及一种具有抗消化道肿瘤作用的铁皮石斛总生物碱提取物及其制备方法和应用。背景技术 [0002] 铁皮石斛(Dendrobium officinale Kimura et Migo)，作为传统中草药和保健食品在我国使用已有千年的历史。据2020年版《中国药典》(一部)记载，铁皮石斛味甘，微寒，归胃、肾经，主治益胃生津，滋阴清热，富含多种次级代谢产物，如多糖、类黄酮、生物碱等。 [0003] 生物碱是石斛属植物的重要活性成分之一。相对于其他石斛属植物，铁皮石斛富含吲哚生物碱和异喹啉生物碱，虽然生物碱含量较低，但活性较高，具有较高的开发价值。铁皮石斛总生物碱提取物成分复杂，不同结构的生物碱功能和极性差异较大。而目前未见从铁皮石斛中提取出具有抗消化道肿瘤效果的生物碱的相关报道。发明内容 [0004] 本发明的主要目的在于提供一种具有抗消化道肿瘤作用的铁皮石斛总生物碱提取物及其制备方法和应用。 [0005] 为实现上述目的，本发明提供了一种具有抗消化道肿瘤作用的铁皮石斛总生物碱提取物的制备方法，包括以下步骤： [0006] (1)取铁皮石斛茎粉末，加入酸醇提取液先进行浸提处理，再进行超声提取处理，离心分离上清液，对沉淀重复上述提取过程，再次离心分离上清液，将两次上清液合并，获得铁皮石斛总生物碱粗提液； [0007] (2)向铁皮石斛总生物碱粗提液中加入氨水，调节pH为碱性，再与等量体积的二氯甲烷溶液混合，萃取后静置分相，收集下层二氯甲烷相，再旋蒸处理，获得总生物碱浸膏； [0008] (3)将总生物碱浸膏用无水乙醇溶解，再用蒸馏水稀释，且无水乙醇和蒸馏水形成浓度为20％的乙醇水溶液作为溶媒，获得总生物碱上样溶液； [0009] (4)将总生物碱上样溶液与大孔树脂混合，经过静态吸附后，先用乙醇水溶液洗去杂质，再用乙醇进行静态解吸附，获得乙醇洗脱液； [0010] (5)将乙醇洗脱液室温氮吹至恒重，获得有抗消化道肿瘤作用的铁皮石斛总生物碱提取物。 [0011] 进一步地，步骤(1)中，所述酸醇提取液含有体积分数0.05％～0.2％的盐酸(V盐酸：V水)和体积分数70％～90％的乙醇(V乙醇：V水)；铁皮石斛粉末与酸醇提取液的料液比为1g：10～30mL。 [0012] 进一步地，步骤(1)中，浸提处理温度为20～30℃，浸提处理时间为24～36h。 [0013] 进一步地，步骤(1)中，超声提取处理时间为30～60min，超声提取处理温度为30～60℃，超声提取处理频率为120～180Hz。 [0014] 进一步地，步骤(1)中，离心分离转速为5000～7000rpm，离心分离时间为20～30min。 [0015] 进一步地，步骤(2)中，氨水的体积浓度为28％，氨水将总生物碱粗提液的pH值调节为9.0～11.0；二氯甲烷溶液的体积浓度为99.5％，旋蒸处理温度为40～60℃，旋蒸处理转速为350～400rpm。 [0016] 进一步地，步骤(3)中，总生物碱上样溶液浓度为300～500μg/mL。 [0017] 进一步地，步骤(4)中，所述大孔树脂为D101、HPD100、X‑5中的任意一种。 [0018] 进一步地，步骤(4)中，大孔树脂与总生物碱上样溶液的料液比为0.5g：5～15mL；静态吸附和解吸附温度分别为25～45℃，静态吸附和解吸附时间分别为12～24h，静态吸附和解吸附在摇床上进行，摇床转速为100～150rpm；乙醇水溶液的乙醇体积分数为60％(V乙醇：V水)。 [0019] 本发明还提供一种具有抗消化道肿瘤作用的铁皮石斛总生物碱提取物，按照上述制备方法制得。 [0020] 本发明还提供一种上述铁皮石斛总生物碱提取物在制备抗消化道肿瘤药物中的应用。 [0021] 本发明的有益效果体现在： [0022] 本发明采用酸醇辅助超声提取铁皮石斛总生物碱，利用大孔树脂兼具吸附和筛分的特性，通过大孔树脂纯化生物碱，高效获得较高纯度的具有抗消化道肿瘤效果的铁皮石斛总生物碱提取复合成分。实验表明，按照本发明所述方法获得的铁皮石斛总生物碱提取物的各成分之间发挥显著的协同调控作用，对消化道肿瘤细胞活力具有显著的抑制作用。附图说明 [0023] 图1为本发明铁皮石斛总生物碱提取物的制备方法的流程图。 [0024] 图2为本发明实施例6铁皮石斛总生物碱提取物对消化道肿瘤细胞活力影响实验结果图。 [0025] 图3为本发明实施例6铁皮石斛总生物碱提取物对消化道肿瘤细胞活力影响实验结果图。具体实施方式 [0026] 下面结合实施例对本发明作进一步描述： [0027] 以下实施例所使用的各种原料和设备，如未作特别说明，均为本领域公知的市售产品。其中铁皮石斛茎粉末为购自安徽省宁国市皖斛堂有限公司的两年生铁皮石斛超微粉。大孔树脂D101、HPD100、X‑5均购自南开科技有限公司。 [0028] 实施例1 [0029] 具有抗消化道肿瘤作用的铁皮石斛总生物碱提取物的制备 [0030] 参见图1，步骤包括： [0031] (1)称取40g铁皮石斛茎粉末，以料液比1g：12.5mL的比例加入酸醇提取液(酸醇提取液的溶剂为水，含0.05％盐酸(V盐酸：V水)和70％乙醇(V乙醇：V水))，在25℃条件下均匀浸提24h，再于60℃、120Hz条件下超声提取50min，之后在6000rpm条件下离心25min，收集上清液，对离心得到的沉淀重复上述提取步骤后再次离心分离，收集上清液，合并两次上清液，获得总生物碱粗提液。 [0032] (2)将总生物碱粗提液用体积浓度为28％的氨水调节pH至10.0，加入等量体积的体积浓度为99.5％的二氯甲烷溶液混合，萃取后静置分相，收集下层二氯甲烷相，于50℃、370rpm条件下旋蒸至无明显液体流动，获得铁皮石斛总生物碱浸膏。 [0033] (3)将铁皮石斛总生物碱浸膏用无水乙醇完全溶解，再加入蒸馏水稀释，且无水乙醇和蒸馏水形成浓度为20％的乙醇水溶液(V乙醇：V水)作为溶媒，铁皮石斛总生物碱浸膏为溶质，获得浓度350μg/mL的总生物碱上样溶液。 [0034] (4)将大孔树脂D101总与生物碱上样溶液按0.5g：10mL的料液比混合均匀，在25℃、120rpm摇床条件下静态吸附24h，使用乙醇体积分数为60％(V乙醇：V水)的乙醇水溶液冲洗10min洗去杂质，再用乙醇于25℃、120rpm摇床条件下进行静态解吸附24h，获得乙醇洗脱液。 [0035] (5)将乙醇洗脱液室温氮吹至恒重，获得富含生物碱类化合物且具有抗消化道肿瘤作用的铁皮石斛总生物碱提取物。 [0036] 实施例2 [0037] 具有抗消化道肿瘤作用的铁皮石斛总生物碱提取物的制备 [0038] 参见图1，步骤包括： [0039] (1)称取40g铁皮石斛茎粉末，以料液比1g：10mL的比例加入酸醇提取液(酸醇提取液的溶剂为水，含0.1％盐酸(V盐酸：V水)和80％乙醇(V乙醇：V水))，在20℃条件下均匀浸提36h，再于60℃、140Hz条件下超声提取60min，之后在7000rpm条件下离心20min，收集上清液，对离心得到的沉淀重复上述提取步骤后再次离心分离，收集上清液，合并两次上清液，获得总生物碱粗提液。 [0040] (2)将总生物碱粗提液用体积浓度为28％的氨水调节pH至9.0，加入等量体积的体积浓度为99.5％的二氯甲烷溶液混合，萃取后静置分相，收集下层二氯甲烷相，于40℃、400rpm条件下旋蒸至无明显液体流动，获得铁皮石斛总生物碱浸膏。 [0041] (3)将铁皮石斛总生物碱浸膏用无水乙醇完全溶解，再加入蒸馏水稀释，且无水乙醇和蒸馏水形成浓度为20％的乙醇水溶液(V乙醇：V水)作为溶媒，铁皮石斛总生物碱浸膏为溶质，获得浓度300μg/mL的总生物碱上样溶液。 [0042] (4)将大孔树脂HPD100总与生物碱上样溶液按0.5g：5mL的料液比混合均匀，在35℃、100rpm摇床条件下静态吸附18h，使用乙醇体积分数为60％(V乙醇：V水)的乙醇水溶液冲洗10min洗去杂质，再用乙醇于35℃、100rpm摇床条件下进行静态解吸附18h，获得乙醇洗脱液。 [0043] (5)将乙醇洗脱液室温氮吹至恒重，获得富含生物碱类化合物且具有抗消化道肿瘤作用的铁皮石斛总生物碱提取物。 [0044] 实施例3 [0045] 具有抗消化道肿瘤作用的铁皮石斛总生物碱提取物的制备 [0046] 参见图1，步骤包括： [0047] (1)称取40g铁皮石斛茎粉末，以料液比1g：30mL的比例加入酸醇提取液(酸醇提取液的溶剂为水，含0.2％盐酸(V盐酸：V水)和90％乙醇(V乙醇：V水))，在30℃条件下均匀浸提30h，再于30℃、180Hz条件下超声提取30min，之后在5000rpm条件下离心30min，收集上清液，对离心得到的沉淀重复上述提取步骤后再次离心分离，收集上清液，合并两次上清液，获得总生物碱粗提液。 [0048] (2)将总生物碱粗提液用体积浓度为28％的氨水调节pH至11.0，加入等量体积的体积浓度为99.5％的二氯甲烷溶液混合，萃取后静置分相，收集下层二氯甲烷相，于60℃、350rpm条件下旋蒸至无明显液体流动，获得铁皮石斛总生物碱浸膏。 [0049] (3)将铁皮石斛总生物碱浸膏用无水乙醇完全溶解，再加入蒸馏水稀释，且无水乙醇和蒸馏水形成浓度为20％的乙醇水溶液(V乙醇：V水)作为溶媒，铁皮石斛总生物碱浸膏为溶质，获得浓度400μg/mL的总生物碱上样溶液。 [0050] (4)将大孔树脂X‑5总与生物碱上样溶液按0.5g：15mL的料液比混合均匀，在45℃、150rpm摇床条件下静态吸附12h，使用乙醇体积分数为60％(V乙醇：V水)的乙醇水溶液冲洗 10min洗去杂质，再用乙醇于45℃、150rpm摇床条件下进行静态解吸附12h，获得乙醇洗脱液。 [0051] (5)将乙醇洗脱液室温氮吹至恒重，获得富含生物碱类化合物且具有抗消化道肿瘤作用的铁皮石斛总生物碱提取物。 [0052] 实施例4 [0053] 具有抗消化道肿瘤作用的铁皮石斛总生物碱提取物的制备 [0054] 参见图1，步骤包括： [0055] (1)称取40g铁皮石斛茎粉末，以料液比1g：25mL的比例加入酸醇提取液(酸醇提取液的溶剂为水，含0.15％盐酸(V盐酸：V水)和75％乙醇(V乙醇：V水))，在25℃条件下均匀浸提32h，再于50℃、150Hz条件下超声提取40min，之后在5000rpm条件下离心30min，收集上清液，对离心得到的沉淀重复上述提取步骤后再次离心分离，收集上清液，合并两次上清液，获得总生物碱粗提液。 [0056] (2)将总生物碱粗提液用体积浓度为28％的氨水调节pH至11.0，加入等量体积的体积浓度为99.5％的二氯甲烷溶液混合，萃取后静置分相，收集下层二氯甲烷相，于55℃、350rpm条件下旋蒸至无明显液体流动，获得铁皮石斛总生物碱浸膏。 [0057] (3)将铁皮石斛总生物碱浸膏用无水乙醇完全溶解，再加入蒸馏水稀释，且无水乙醇和蒸馏水形成浓度为20％的乙醇水溶液(V乙醇：V水)作为溶媒，铁皮石斛总生物碱浸膏为溶质，获得浓度350μg/mL的总生物碱上样溶液。 [0058] (4)将大孔树脂X‑5总与生物碱上样溶液按0.5g：12mL的料液比混合均匀，在30℃、150rpm摇床条件下静态吸附20h，使用乙醇体积分数为60％(V乙醇：V水)的乙醇水溶液冲洗 10min洗去杂质，再用乙醇于30℃、150rpm摇床条件下进行静态解吸附20h，获得乙醇洗脱液。 [0059] (5)将乙醇洗脱液室温氮吹至恒重，获得富含生物碱类化合物且具有抗消化道肿瘤作用的铁皮石斛总生物碱提取物。 [0060] 实施例5 [0061] 铁皮石斛总生物碱提取物的组成成分分析 [0062] 利用UPLC/MS/MS技术对实施例1制备获得的铁皮石斛总生物碱提取物的组成成分进行分析，共检测出655种化合物，生物碱类化合物共60种，占9.16％，如表1所示，其中包括异喹啉生物碱22种，吲哚生物碱12种，吡咯类生物碱5种，吡啶生物碱7种，喹啉生物碱5种，萜类生物碱2种，机胺类生物碱3种，其它4种。根据峰面积大小进行比较，其中吲哚类生物碱Harmane、Norharman分别占41％、36％，异喹啉类生物碱Palmatine、Norisoboldin分别占7％、4％。 [0063] 表1铁皮石斛总生物碱提取物中生物碱类化合物成分 [0064] [0065] [0066] 实施例6 [0067] 铁皮石斛总生物碱提取物对消化道肿瘤细胞活力的影响 [0068] 细胞系与细胞培养：选取人胃癌细胞系HGC‑27、MKN‑45、SGC‑7901，结直肠癌细胞系SW620、HCT 116、HT 29。将细胞置于含有10％ FBS的RPMI‑1640培养基中，在CO2浓度为5％，培养温度为37℃的二氧化碳培养箱中培养。 [0069] 采用MTT法测定细胞存活率：将对数期细胞接种在96孔板中，并用稀释200倍的DMSO溶液和不同浓度的实施例1制得的铁皮石斛总生物碱提取物(1.25、2.5、5、10、20和40nmol/mL)，在二氧化碳培养箱中培养24h，小心吸出上清液，向每个孔中加入200μL浓度为 0.5mg/mL的10％MTT溶液，并继续在二氧化碳培养箱中培养4h，小心吸出MTT溶液，向每个孔中加入150μL DMSO溶液，使用酶标仪在490nm处测量吸光度，采用4‑Parameter法计算其半数抑制浓度(IC50值)。 [0070] 细胞存活率(％)＝[(OD给药‑OD空白)/OD空白]×100％； [0071] 结果如图2和图3所示。铁皮石斛总生物碱提取物对三株结直肠癌细胞SW620、HCT116、HT29，及三株胃癌细胞HGC‑27、MKN‑45、SGC‑7901的细胞活力具有显著的抑制效果，且抑制效果呈现剂量依赖性变化，其中对结直肠癌细胞的IC50值分别为18.221nmol/mL、21.077nmol/mL、27.711nmol/mL，对胃癌细胞的IC50值分别为18.072nmol/mL、22.008nmol/mL、28.853nmol/mL。 [0072] 实验表明，孵育24h后，总生物碱提取物对结直肠癌细胞SW620的IC50值为18.221nmol/mL，对结直肠癌细胞HCT 116的IC50值为21.077nmol/mL，对结直肠癌细胞HT 29的IC50值为27.711nmol/mL，对胃癌细胞HGC‑27的IC50值为18.072nmol/mL，对胃癌细胞MKN‑45的IC50值为22.008nmol/mL，对胃癌细胞SGC‑7901的IC50值为28.853nmol/mL。 [0073] 以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

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