美花风毛菊总倍半萜内酯及制备方法和其药物用途 |
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| 申请号 | CN202110629111.9 | 申请日 | 2021-06-05 | 公开(公告)号 | CN113350390A | 公开(公告)日 | 2021-09-07 |
| 申请人 | 吉林大学; | 发明人 | 刘云鹤; 李乐; 付书正; 王钟瑶; 谭璐瑩; 王彩霞; 余慧; 李卓俏; 李平亚; 刘金平; | ||||
| 摘要 | 本 发明 涉及一种美花 风 毛菊总倍半萜内酯及制备方法和其药物用途，属于中药有效成分制备和天然药物化学领域。将美花风毛菊的干燥全草 粉碎 ，采用正己烷或石油醚与乙酸乙酯混合 溶剂 进行提取，获得粗提物后，再经大孔 吸附 树脂 或 硅 胶柱层析进行富集，获得美花风毛菊总倍半萜内酯提取物。优点是首次从美花风毛菊中提取并富集具有抗炎作用的有效部位总倍半萜内酯，该提取物富含洋蓟苦素、美花风毛菊 碱 等成分，该提取物制备工艺简单，适合工业化生产，该提取物具有显著减轻骨关节病动物 炎症 反应、抑制软骨细胞凋亡、促进软骨 细胞增殖 、并明显减轻关节软病理损伤的药理作用，可用于制备具有抗骨关节炎作用的各种药物或保健食品。 | ||||||
| 权利要求 | 1.一种美花风毛菊总倍半萜内酯，其特征在于，是由下列步骤得到的： |
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| 说明书全文 | 美花风毛菊总倍半萜内酯及制备方法和其药物用途技术领域[0001] 本发明涉及中药有效成分制备和天然药物化学领域，具体涉及美花风毛菊总倍半萜内酯及制备方法及医药用途。 背景技术[0002] 菊科(Compositae)风毛菊属(Saussurea)植物主要分布在亚洲和欧洲地区，含有丰富的倍半萜，三萜，黄酮和木脂素等化学成分，具有显著的抗肿瘤，抗炎和抗衰老等药理活性，在民间被广泛长期应用。 [0003] 美花风毛菊(Saussureapulchella(Fisch.)Fisch)为风毛菊属多年生草本植物，始载于《中国高等植物图鉴》。《中华本草》和《新华本草纲要》中记载其味辛、苦；性寒，全草入药，具有祛风清热、除湿止痛之功效，用于风湿性关节炎、湿热泄泻等证，具有很高的药用价值。藏医中用来催吐、解热、止痛，并可治疗慢性风湿性关节炎。《中国植物志》中记载其分布于北京、黑龙江、吉林、辽宁、河北、山西、内蒙古等地，朝鲜、日本、蒙古、俄罗斯也有分布，生于草原、林缘、灌丛、沟谷草甸等海拔300‑2200米。此外，美花风毛菊也被收录在《中药大辞典》、《中药药名辞典》、《历代止痛方药》、《现代本草纲目》、《中国药用植物志》、《长白山植物药志》、《中国大兴安岭蒙中药植物资源志》、《黑龙江省植物志》等专著中。在国内外有丰富的形态学研究和民间应用。在韩国，美花风毛菊被广泛应用于治疗高血压、肝炎和关节炎等疾病，在俄罗斯，民间用全草煎剂治疗腹泻。在我国，虽然分布广泛，但与其同属植物雪莲(中国传统藏药)相比较，美花风毛菊这个药用植物资源并没有得到充分的开发与利用。 [0004] 近年来，对美花风毛菊化学成分的研究日渐增多，其中，韩国学者和俄罗斯学者对美花风毛菊的化学成分研究较多，从美花风毛菊中已鉴定出单萜，倍半萜及倍半萜内酯，黄酮，木脂素、苯丙醇苷等59种化学成分。其中，倍半萜内酯类成分是美花风毛菊的特征性成分。 [0005] 骨关节炎(OA)是一种与遗传、创伤、代谢、应力改变、炎症等多因素相关的关节退行性疾病，好发于中老年人，以关节软骨退变、骨质增生为病理特征，临床表现为关节疼痛、肿胀、僵硬、活动受限等，最终可致关节功能障碍和残疾。随着人口老龄化和肥胖患病率的增加，髋和膝关节OA成为全球第11大致残原因，造成沉重的经济及社会负担。目前OA的治疗仅限于对症，尚缺延缓病情进展的药物，其病理机制及治疗靶点、药物亟待研究。 [0006] 至今为止，国内外尚未见有美花风毛菊倍半萜内酯成分应用于防治骨关节炎疾病的相关研究报道。 发明内容[0007] 本发明提供一种美花风毛菊总倍半萜内酯及制备方法和其药物用途。 [0008] 本发明采取的技术方案是，是由下列步骤得到的： [0010] 本发明所述经大孔吸附树脂进行富集是指将粗提取物加于大孔树脂柱D4020,D101或AB‑8，以乙醇水混合溶剂进行梯度洗脱，采用液质联用技术分析检测，收集含倍半萜内酯的流份，合并后，干燥得总倍半萜内酯。 [0011] 本发明所述乙醇水混合溶液梯度洗脱是依次采用质量百分浓度为10～30％，以及40～90％的乙醇进行梯度洗脱。 [0012] 本发明所述经硅胶柱层析是指将粗提物加于硅胶柱，以混合有机溶剂梯度洗脱，收集含倍半萜内酯的流份，合并后，干燥得总倍半萜内酯。 [0013] 本发明所述混合有机溶剂是正己烷：乙酸乙酯＝20:1～1:20；正己烷：二氯乙烷＝30:1～1:30；石油醚‑：乙酸乙酯＝15:1～1:20；石油醚：二氯乙烷＝30:1～1:30；正己烷：丙酮＝20:1～1:20。 [0014] 本发明所述美花风毛菊总倍半萜内酯中总倍半萜内酯质量百分含量不少于50％。 [0015] 本发明所述美花风毛菊总倍半萜内酯在制备抗骨关节炎药物中的应用。 [0016] 本发明用于制备抗骨关节炎药物时，其口服或非口服给药均是安全的。在口服情况下,其可以是任何常规形式给药,如散剂、颗粒剂、片剂、胶囊剂、丸剂、滴丸、软胶囊、漂浮剂、口服液、悬浮液、糖浆、口腔含片、喷雾剂或气雾剂等当该药物非口服给药时,可采用任何常规形式,如栓剂、注射剂静脉注射、肌肉注射、软膏剂、吸入剂等。 [0017] 本发明制备抗骨关节炎药物时，是与固体或液体的赋形剂一起构成的，这里使用的固体或液体赋形剂在本领域是众所周知的,下面举几个具体例子,固体制剂的赋形剂有乳糖、淀粉、浆糊精、碳酸钙、合成或天然硫酸铝、氯化镁、硬脂酸镁,碳酸氢钠、干燥酵母等液体制剂的赋形剂有水、甘油、丙二醇、单糖浆、乙醇、乙二醇、聚乙二醇、山梨糖醇等软膏剂的赋形剂可以使用脂油,含水羊毛脂、凡士林、甘油、蜂蜡、木腊、液体石蜡、树脂、高级蜡等组合成的疏水剂或亲水剂。 [0018] 本发明的优点是首次从美花风毛菊中提取并富集具有抗炎作用的有效部位总倍半萜内酯，该提取物富含洋蓟苦素、美花风毛菊碱等成分，该提取物制备工艺简单，适合工业化生产，该提取物具有显著减轻骨关节病动物炎症反应、抑制软骨细胞凋亡、促进软骨细胞增殖、并明显减轻关节软病理损伤的药理作用，可用于制备具有抗骨关节炎作用的各种药物或保健食品。 具体实施方式[0019] 实施例1 [0020] 取美花风毛菊的干燥全草1.0kg,粉碎，过40目筛，采用正己烷‑石油醚(10：3)混合溶剂进行回流提取，回流时间每次3小时，回流次数3次，合并提取液后，减压浓缩，干燥后，加200mL水溶解后，加于AB‑8大孔吸附树脂，水洗至无色后，以30％乙醇洗脱，收集30％乙醇洗脱液，减压浓缩后，干燥，获得美花风毛菊总倍半萜内酯提取物18.9g。 [0021] 实施例2 [0022] 取美花风毛菊的干燥全草1.0kg,粉碎，过40目筛，采用正己烷‑石油醚(2：1)混合溶剂进行回流提取，回流时间每次3小时，回流次数3次，合并提取液后，减压浓缩，干燥后，加250mL水溶解后，加于D4020大孔吸附树脂，水洗至无色后，以50％乙醇洗脱，收集50％乙醇洗脱液，减压浓缩后，干燥，获得美花风毛菊总倍半萜内酯提取物23.5g。 [0023] 实施例3 [0024] 取美花风毛菊的干燥全草1.0kg,粉碎，过40目筛，采用石油醚‑乙酸乙酯(5：1)混合溶剂进行回流提取，回流时间每次3小时，回流次数3次，合并提取液后，减压浓缩，干燥后，加于硅胶柱(200‑300目)，以石油醚‑乙酸乙酯＝15:1～1:20洗脱，LC‑MS检测，收集含有倍半萜内酯的洗脱液，减压浓缩后，干燥，获得美花风毛菊总倍半萜内酯提取物26.8g。 [0025] 下边通过实验例来进一步说明本发明。 [0026] 实验例1美花风毛菊总倍半萜内酯所含组分鉴定 [0027] 洋蓟苦素(cynaropicrin)，无色油状。HR‑MS显示m/z 347[M+H]+准分子离子峰，结合NMR谱可以分析出其分子式为C19H22O6。 [0028] 1H NMR(600MHz，CD3OD)谱共给出19个质子信号，包括δ：6.33(1H,d,J＝1.2Hz,H‑3’),6.15(1H,d,J＝3.5Hz,H‑13),5.99(1H,d,J＝1.5Hz,H‑3’),5.67(1H,d,J＝3.1Hz,H‑ 13),5.46(1H,s,H‑15),5.37(1H,s,H‑15),5.18(1H,s,H‑14),5.17(1H,ddd,J＝15.1,12.6, 7.8Hz,H‑8),4.94(1H,s,H‑14),4.56(1H,t,J＝7.1Hz,H‑3),4.33(1H,s,H‑4’),4.27(1H,dd,J＝10.7,8.9Hz,H‑6),3.30(1H,dt,J＝9.5,3.3Hz,H‑7),2.92(1H,ddd,J＝15.0,12.0, 5.0Hz,H‑1),2.93(1H,t,J＝9Hz,H‑5),2.76(1H,dd,J＝14.6,5.1Hz,H‑9),2.43(1H,dd,J＝ 14.6,3.5Hz,H‑9),2.12(1H,ddd,J＝12.6,7.1,3.5Hz,H‑2),1.77(1H,ddd,J＝12.6,7.1, 3.5Hz,H‑2)。 [0029] 13C NMR(600MHz，CD3OD)谱共给出19个碳信号，包括δ：46.01(C‑1),39.83(C‑2),73.97(C‑3),153.87(C‑4),51.87(C‑5),75.46(C‑6),46.01(C‑7),80.12(C‑8),37.45(C‑ 9),141.77(C‑10),139.57(C‑11),166.37(C‑12),122.16(C‑13),117.95(C‑14),113.23(C‑ 15),154.48(C‑1’),143.88(C‑2’),125.77(C‑3’),61.45(C‑4’)。 [0030] 实验例2美花风毛菊总倍半萜内酯LC‑MS测定 [0031] 取实施例3所得美花风毛菊总倍半萜内酯提取物，以超高效液相色谱‑四极杆飞行时间质谱(UPLC‑Q/TOF‑MS)技术结合UNIFI天然产物解析平台，通过与对照品进行比对，或通过保留时间、精确分子量和典型碎片分析，鉴定或初步鉴定美花风毛菊总倍半萜内酯提取物，结果共鉴定了15个化学成分，分别为8α‑O‑(2,3’‑二羟基异丁酰基)‑11β,13‑二氢去酰洋蓟苦素；8α‑O‑(3’‑羟基‑3’‑甲基丁酰)去酰洋蓟苦素；美花风毛菊碱A；美花风毛菊碱B；美花风毛菊碱C；美花风毛菊碱D；美花风毛菊碱E；美花风毛菊碱F；美花风毛菊碱G；11β,13‑二氢去酰洋蓟苦素；秋刀鱼毒素；洋蓟苦素；去酰洋蓟苦素；11β,13‑二氢去酰洋蓟苦素 8‑O‑β‑D‑葡萄糖苷；8α‑(4’‑羟基千里光酰氧基)脱氢中美菊素C。 [0032] 实验例3美花风毛菊总倍半萜内酯对大鼠骨关节炎模型的炎症抑制作用 [0033] 方法：体外采用LPS诱导建立关节软骨细胞损伤模型，以不同浓度的美花风毛菊总倍半萜内酯提取物进行干预。通过染色法检测软骨细胞增殖、形态，ELISA法检测iNOS、TNF‑α、IL‑6和IL‑1β等炎性因子的水平。 [0034] 体内研究采用手术离断大鼠前交叉韧带法以建立骨关节炎模型，隔日关节腔内注射美花风毛菊总倍半萜内酯提取物，连续给药30天，HE及番红固绿染色检测病理损伤情况。 [0035] 结果：美花风毛菊总倍半萜内酯提取物可以显著促进软骨细胞的增殖，100μmol/L浓度时增殖作用最明显(p<0.01)；与模型组比较，软骨细胞活力明显增加(p<0.05)，IL‑1β、IL‑6、TNF‑α、iNOS等炎性因子的水平显著降低(均p<0.01)；病理检查结果显示，与模型组相比，美花风毛菊总倍半萜内酯提取物组关节软病理损伤程度明显减轻。 [0036] 结论：美花风毛菊总倍半萜内酯提取物可抑制LPS所致的炎症因子的表达和释放，减轻软骨细胞外基质降解，缓解骨关节炎的进展。 [0037] 实验例4美花风毛菊总倍半萜内酯对胶原诱导关节炎模型大鼠的影响 [0038] 方法：将雌性大鼠随机分为正常组、模型组、阳性对照组及美花风毛菊总倍半萜内酯提取物高、中、低剂量组，每组12只。除正常照组外，其余各组均构建CIA模型：将牛Ⅱ型胶原溶于0.1mol/L醋酸中，配成2mg/mL胶原溶液。次日与等体积弗氏完全佐剂(CFA)冰浴中充分乳化，以配制浓度为1mg/mL胶原乳剂。正常组外，其余各组大鼠皮内多点注射胶原乳剂0.4mL，1周后再同法给予胶原乳剂0.2mL，复制CIA大鼠模型，并第7天开始灌胃给予3个剂量的美花风毛菊总倍半萜内酯提取物，给药持续4周，给药结束后，静脉取血，处死大鼠后分离关节滑膜，采用ELISA法检测血清IL‑12、HIF‑1α、IL‑10的含量。 [0039] 关节炎症指数评分：根据5级评分法评价大鼠关节受累程度。每只大鼠关节炎指数(Arthritis index,AI)为四肢关节得分之和。标准如下：无关节红肿，0分；小趾关节稍肿，1分；趾关节和足跖肿胀，2分；踝关节以下的足爪肿胀，3分；包括踝关节在内的全部足爪肿胀，4分。 [0041] 结果：指数评分：与正常组比较，模型组关节炎症指数均显著升高(p<0.05),与模型组比较，总倍半萜内酯提取物各给药组在给药第28天时关节炎症指数评分显著降低(p<0.05)。 [0042] 总倍半萜内酯提取物对胶原诱导关节炎模型大鼠关节滑膜组织病理学的影响：结果显示，正常滑膜组织无炎细胞浸润，滑膜细胞排列整齐。关节炎模型大鼠滑膜组织可见滑膜细胞增生，淋巴细胞成弥漫性浸润，并可见肉芽肿改变。总倍半萜内酯提取物中、高剂量组和阳性对照组均可见滑膜轻度增生,炎性细胞浸润较少，与模型组比较，炎性浸润、增生、血管新生组织均被抑制。 [0043] 美花风毛菊总倍半萜内酯提取物对胶原诱导关节炎模型大鼠血清IL‑12、IL‑10含量的影响：与正常大鼠比较，模型组大鼠血清IL‑12水平显著升高，IL‑10水平显著降低(p<0.05)，说明模型成立。与模型组比较，总倍半萜内酯提取物各给药组的血清IL‑12水平显著降低(p<0.01)，IL‑10水平显著升高(p<0.01)。 [0044] 结论：综上，美花风毛菊总倍半萜内酯提取物可抑制RA病情的进展，缓解关节肿胀，降低炎症反应，防止骨破坏。 [0045] 实验例5美花风毛菊总倍半萜内酯提取物对类风湿关节炎模型大鼠的疗效 [0046] 方法：建立大鼠类风湿关节炎模型，治疗组大鼠每周灌胃给予美花风毛菊总倍半萜内酯提取物100mg/kg，每天给药2次，连续给药6周。苏木精‑伊红(HE)染色和甲苯胺蓝染色检测类风湿关节炎的病理改变程度；ELISA检测组织中TNF‑α，IL‑1β和IL‑17水平；Western blot检测RANKL和OPG蛋白表达。 [0047] 结果：美花风毛菊总倍半萜内酯提取物给药组大鼠关节炎评分和足趾容积明显低于模型组大鼠(p<0.05)。与模型组比较，总倍半萜内酯提取物给药组RANKL蛋白含量显著降低，OPG蛋白含量明显上升(p<0.05)；TNF‑α、IL‑1β和IL‑17含量明显下降(p<0.05)。 [0048] 结论：美花风毛菊总倍半萜内酯提取物可通过抑制细胞因子表达，降低ACCP、RF水平，发挥治疗大鼠类风湿关节炎的疗效。 |
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