一种苜蓿瞬转表达纤维素酶及其在文冠果叶片活性物质提取中的应用 |
|||||||
| 申请号 | CN202210952477.4 | 申请日 | 2022-08-09 | 公开(公告)号 | CN117587062A | 公开(公告)日 | 2024-02-23 |
| 申请人 | 西北师范大学; | 发明人 | 冯汉青; 梁俊玉; 张继; 王俊龙; 曹福亮; 吴建平; 马彦男; 贾凌云; | ||||
| 摘要 | 本 发明 涉及 生物 技术领域，具体涉及一种苜蓿瞬转表达 纤维 素酶及其在文冠果 叶片 活性物质提取中的应用，包括如下步骤：(1) 纤维素 酶编码基因构建载体，转化农杆菌，培养，离心，收集细菌，用缓冲液悬浮，稀释；(2)用步骤(1)得到的菌液对苜蓿叶片进行 真空 渗透，培养，用1‑500μM褪黑素喷施苜蓿叶片，每天喷洒一次；(3)步骤(2)得到的苜蓿叶片 研磨 ，匀浆，离心，提取上清液，得到纤维素酶酶液；在表达的过程中施加褪黑素，得到的纤维素酶活性显著提高，解决了 植物 表达纤维素酶活性低以及叶片活性物质生物酶提取的问题；且步骤简单，制备得到的纤维素酶不含有内毒素，可以用于文冠果叶片活性物质提取，具有广阔的应用前景。 | ||||||
| 权利要求 | 1.一种苜蓿瞬转表达纤维素酶的方法，其特征在于，包括如下步骤： |
||||||
| 说明书全文 | 一种苜蓿瞬转表达纤维素酶及其在文冠果叶片活性物质提取中的应用 技术领域背景技术[0002] 文冠果树属无患子科，是我国重要的经济作物。文冠果叶片富含蛋白质，氨基酸和多种微量元素；此外，文冠果叶片中也含有黄酮、多糖和皂苷等生物活性成分，具有较高的营养价值和生物学功效，是潜在的众多活性物质的提取原料，也是潜在的优质无抗养殖饲料添加剂。但是，文冠果叶片的活性物质主要存在于细胞质中，被细胞壁所保护。因此，文冠果叶片的利用需要将文冠果叶片细胞壁破裂，释放活性物质。目前仍然缺乏经济有效的技术去解决上述问题。 [0003] 植物细胞壁主要具有纤维素、半纤维素、木质素、果胶和糖蛋白等成分构成。其中，纤维素、半纤维素、木质素是构成植物细胞壁的主要成分。纤维素酶的施加可以有效水解植物细胞壁的纤维组织，破坏细胞壁完整性，从而促进植物细胞内有效成分的释放。但目前纤维素酶主要通过细菌、真菌等微生物产生，需要进行较为复杂的制备和制剂工艺以及设备，也具有细菌、真菌内毒素污染等问题，在一定程度上限制了纤维素酶在植物化学领域的应用。农杆菌介导的植物基因瞬时表达技术是将目的基因插入表达载体中，将载体转化到农杆菌中，利用渗透技术使农杆菌侵染植物宿主细胞。外源基因不需要整合在植物的基因组中就可以表达，因此不需要形成稳定遗传的转基因植株即可在短期内快速表达外源基因。 [0004] 目前，纤维素酶的表达主要使用的是细菌或真菌，例如，发明专利CN104404067A公开了使用乳酸杆菌表达纤维素酶，发明专利CN108624613A公开了使用酿酒酵母工业菌株分泌表达纤维素酶，发明专利CN104845954A公开了使用脉孢菌、曲霉、木霉、青霉、镰刀霉或侧孢霉表达木质纤维素降解及纤维素酶、半纤维素酶。但是，细菌真菌表达的纤维素酶中含有潜在的细菌真菌内毒素污染，若用于工业生产，则无影响或者影响很小，但是，若是将其用于活性物质的提取并继而用于动物或人体，则内毒素有可能会进入动物体内引起病变(参见文献张吉鹍.内毒素的生物活性及其对猪的危害[J].猪业科学,2020,37(11):134‑137.)，因此，如何获得不含有内毒素的纤维素酶是本领域技术人员重点解决的技术问题。 [0005] 因为植物不含有内毒素，因此用植物瞬时表达纤维素酶可以解决纤维素酶中含有内毒素的技术问题，目前报道的表达纤维素酶的植物仅有烟草，然而，烟草中具有烟碱等有害物质，需要对烟草纤维素酶纯化，否则不适用于活性物质提取，从而提高了植物源纤维素酶的生产成本，同时，植物瞬时表达的纤维素酶的活性较低低，如何提高植物瞬时表达的纤维素酶活性仍然缺乏简单有效的方法。 发明内容[0006] 针对上述技术问题，本发明的首要目的在于提供一种苜蓿瞬转表达纤维素酶的方法，包括如下步骤： [0007] (1)纤维素酶编码基因构建载体，转化农杆菌，培养，离心，收集细菌，用缓冲液悬浮，稀释菌液至OD值为0.6‑1.0； [0008] (2)用步骤(1)得到的菌液对苜蓿叶片进行真空渗透，培养，用1‑500μM褪黑素喷施苜蓿叶片，每天喷洒一次； [0010] 优选的，步骤(2)所述的褪黑素浓度为20‑500μM。 [0011] 优选的，步骤(1)所述的农杆菌为LBA4404菌株，首先在含有抗生素的YEB琼脂平板上培养出单菌落，然后将培养的单菌落接种在YEB液体培养基中培养。 [0012] 优选的，步骤(1)所述的OD值在600nm处。 [0013] 优选的，步骤(1)所述的缓冲液为10mM硫酸镁；10mM MES‑KOH，pH 5.5；100μΜ乙酰丁香酮。 [0014] 优选的，步骤(2)所述的培养条件为25℃下培养4‑9天。 [0015] 优选的，步骤(3)所述的离心速度是14000rpm，时间为20分钟。 [0016] 本发明的第二目的是提供所述的方法得到的纤维素酶在降解木质纤维素中的应用。 [0017] 本发明的第三目的是提供一种降解植物木质纤维素提取活性成分的纤维素酶，是由所述的方法制备获得。 [0018] 本发明的第四目的是提供所述的纤维素酶在提取文冠果叶片活性物质中的应用，所述的文冠果叶片活性物质包括黄酮、皂苷和多糖。 [0019] 本发明的有益效果是：(1)本发明提供了一种苜蓿叶片瞬转纤维素酶基因表达纤维素酶的方法，所述的方法在表达的过程中施加外源褪黑素，能够提高得到的纤维素酶的活性，解决了植物表达纤维素酶活性较低的技术问题；(2)所述的方法步骤简单，制备得到的纤维素酶不含有毒性物质内毒素，可以用于植物活性物质的提取；(3)通过所述的方法制备得到的纤维素酶，有效增加了文冠果叶片的活性物质的提取效率。附图说明 [0020] 图1瞬转表达苜蓿叶片粗酶液中纤维素酶的活性。 [0021] non‑transform：无瞬时转化苜蓿叶片的粗酶液(将其中纤维素酶活性设定为100)；transform：进行纤维素酶瞬时转化苜蓿叶片(未施加褪黑素)的粗酶液。 [0022] 图2不同浓度褪黑素对瞬转表达苜蓿叶片粗酶液中纤维素酶活性的影响。 [0023] control：纤维素酶瞬时转化苜蓿叶片(未施加外源物，并将其中纤维素酶活性设定为100)。1、20、100、200、500μM：纤维素酶瞬时转化苜蓿叶片分别施加1、20、100、200、500μM褪黑素。 [0024] 图3不同处理方法对文冠果叶片中的黄酮提取的影响 [0025] 1：文冠果叶片未经过粗酶液处理后的黄酮提取得率；2：文冠果叶片经过无瞬时转化苜蓿叶片粗酶液处理后的黄酮提取得率；3：文冠果叶片经过瞬时转化苜蓿叶片粗酶液处理后的黄酮提取得率；4：文冠果叶片经过瞬时转化和200μM褪黑素处理的苜蓿叶片粗酶液处理后的黄酮提取得率。 [0026] 图4文冠果叶片的皂苷提取得率 [0027] 1：文冠果叶片未经过粗酶液处理后的皂苷提取得率；2：文冠果叶片经过无瞬时转化苜蓿叶片粗酶液处理后的皂苷提取得率；3：文冠果叶片经过瞬时转化苜蓿叶片粗酶液处理后的皂苷提取得率；4：文冠果叶片经过瞬时转化和200μM褪黑素处理的苜蓿叶片粗酶液处理后的皂苷提取得率。 [0028] 图5文冠果叶片的多糖提取率 [0029] 1：文冠果叶片未经过粗酶液处理后的多糖提取得率；2：文冠果叶片经过无瞬时转化苜蓿叶片粗酶液处理后的多糖提取得率；3：文冠果叶片经过瞬时转化苜蓿叶片粗酶液处理后的多糖提取得率；4：文冠果叶片经过瞬时转化和200μM褪黑素处理的苜蓿叶片粗酶液处理后的多糖提取得率。 具体实施方式[0030] 下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。 [0031] 以下实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。 [0032] 以下实施例所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售获得的常规产品。 [0033] 实施例1纤维素酶的制备 [0034] (1)将纤维素酶编码基因构建于双元载体，并转化LBA4404农杆菌，将转化后的LBA4404菌株接种在含有抗生素的YEB琼脂平板上，在26摄氏度下培养2天；将培养的单菌落接种在YEB液体培养基中，在28摄氏度下180rpm培养1天；以5000rpm的转速离心10分钟，收集细菌，并用缓冲液悬浮；在600nm处测量OD值确定细菌浓度，并将其稀释至所OD值为0.6‑1.0之间。 [0035] 所述的缓冲液为：10mM硫酸镁；10mM MES‑KOH，pH 5.5；100μΜ乙酰丁香酮； [0036] 所述的纤维素酶是里氏木霉内切葡聚糖酶II编码基因，其基因序列如SEQ ID No.1所示，氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。 [0037] (2)将步骤(1)得到的菌液对苜蓿叶片进行真空渗透，将渗透处理后的苜蓿叶片在25℃下培养4‑9天，期间用1‑500μM的褪黑素喷施苜蓿叶片，每天喷洒一次。 [0038] (3)处理期结束后，将步骤(2)得到的苜蓿叶片用组织研磨机充分研磨，加入磷酸缓冲液，将叶片在磷酸缓冲液用匀浆仪均匀，以14000rpm离心20分钟，提取上清液，得到纤维素酶粗酶液，并进行酶活性测定。 [0039] 实施例2、酶活测定 [0040] (1)瞬转表达苜蓿叶片粗酶液中纤维素酶的活性 [0041] 以羧甲基纤维素为底物，通过3,5‑二硝基水杨酸法测定纤维素酶的活性。在0.8mL 1.0％的羧甲基纤维素水溶液中添加1.2mL酶溶液，混匀后孵育。再加入2.0mL的3,5‑二硝基水杨酸试剂，混匀后沸水中加热10min，再加入蒸馏水适当稀释后，在540nm波长处检测吸光度以反映纤维素酶的活性。 [0042] 以没有进行瞬时转化的苜蓿叶片获得的酶液作为对照，并将其纤维素酶活性设定为100。 [0043] 检测结果如图1所示，在不喷施褪黑素的情况下，进行纤维素酶基因瞬时转化苜蓿叶片的纤维素酶活性为对照组的4倍左右，说明纤维素酶基因瞬时转化苜蓿叶片中表达了一定水平的纤维素酶。 [0044] (2)不同浓度褪黑素对瞬转表达苜蓿叶片粗酶液中纤维素酶活性的影响 [0045] 进一步检测了不同浓度褪黑素对瞬转表达苜蓿叶片粗酶液中纤维素酶活性的影响。检测方法同上。 [0046] 以进行纤维素酶基因瞬时转化但未施加外源物的苜蓿叶片为对照(将其中纤维素酶活性设定为100)，检测不同浓度褪黑素对瞬转表达苜蓿叶片粗酶液中纤维素酶活性的影响。 [0047] 实验结果如图2所示，相较于对照组，施加1μM褪黑素对苜蓿叶片瞬转表达纤维素酶的活性没有显著性影响，施加20μM、100μM、200μM、500μM褪黑素均显著提升了纤维素酶的活性，且在施加200μM褪黑素以内，纤维素酶的活性随着剂量的上升而上升，超过200μM褪黑素，纤维素酶的活性下降。其中，施加200μM褪黑素时纤维素酶的活性上升最显著。 [0048] 实施例3纤维素酶降解文冠果叶片并提取活性物质 [0050] (1)黄酮提取 [0051] 孵育物质加入60％乙醇(终浓度)，70℃下浸提1h。浸提后过滤，收集滤液。滤渣同法再提取1次，合并滤液。浓缩后用60％乙醇(终浓度)定容，得供试品溶液。 [0052] 实验结果如图3所示，文冠果叶片未经过粗酶液处理后的黄酮提取得率和经过无瞬时转化苜蓿叶片粗酶液处理后的黄酮提取得率无显著性区别，说明无瞬时转化苜蓿叶片粗酶液中的酶活不高或者是纤维素酶含量不高，对文冠果叶片的细胞壁分解不够，活性物质黄酮未释放出来。文冠果叶片经过瞬时转化苜蓿叶片粗酶液处理后的黄酮提取得率显著性增高，说明瞬时转化得到的粗酶液纤维素酶活性高，能够使得文冠果叶片释放活性物质。文冠果叶片经过瞬时转化和200μM褪黑素处理的苜蓿叶片粗酶液处理后的黄酮提取得率进一步提高，说明经过瞬时转化苜蓿叶片粗酶液中的纤维素酶能够提高文冠果叶片黄酮的提取效率，且该作用可通过外源施加200μM褪黑素而进一步提高，说明外源施加褪黑素能够提高纤维素酶的酶活，促进文冠果叶片中活性物质的释放。 [0053] (2)皂苷提取 [0054] 孵育物质加入70％乙醇(终浓度)，60℃下浸提60分钟后过滤，收集滤液。滤渣同法再提取1次，合并滤液。浓缩成浸膏。浸膏溶解稀释后，3500r/min离心15min取上清液，将上清液用乙酸乙酯和水饱和的正丁醇等体积萃取3次，合并正丁醇相，浓缩得浸膏，冷冻干燥后得总皂苷。 [0055] 实验结果如图4所示，文冠果叶片未经过粗酶液处理后的黄酮提取得率和经过无瞬时转化苜蓿叶片粗酶液处理后的皂苷提取得率无显著性区别，说明无瞬时转化苜蓿叶片粗酶液中的酶活不高或者是纤维素酶含量不高，对文冠果叶片的细胞壁分解不够，活性物质未释放出来。但文冠果叶片经过瞬时转化苜蓿叶片粗酶液处理后的皂苷提取得率显著性增高。文冠果叶片经过瞬时转化和200μM褪黑素处理的苜蓿叶片粗酶液处理后的皂苷提取得率进一步提高，说明经过瞬时转化苜蓿叶片粗酶液中的纤维素酶能够提高文冠果叶片皂苷的提取效率，且该作用可通过外源施加200μM褪黑素而进一步提高，说明外源施加褪黑素能够提高纤维素酶的酶活，促进文冠果叶片中活性物质的释放。 [0056] (3)多糖提取 [0057] 孵育物质加石油醚脱脂，加入95％乙醇脱色素，加入水在40W超声下提取30分钟，抽滤，滤液浓缩后加入4倍体积乙醇，4℃静置，抽滤，滤渣醇洗，冷冻干燥称重。 [0058] 实验结果如图5所示，文冠果叶片未经过粗酶液处理后的多糖提取得率和经过无瞬时转化苜蓿叶片粗酶液处理后的多糖提取得率无显著性区别，说明无瞬时转化苜蓿叶片粗酶液中的酶活不高或者是纤维素酶含量不高，对文冠果叶片的细胞壁分解不够，活性物质未释放出来。但文冠果叶片经过瞬时转化苜蓿叶片粗酶液处理后的多糖提取得率显著性增高。文冠果叶片经过瞬时转化和200μM褪黑素处理的苜蓿叶片粗酶液处理后的多糖提取得率进一步提高。说明经过瞬时转化苜蓿叶片粗酶液中的纤维素酶能够提高文冠果叶片多糖的提取效率，且该作用可通过外源施加200μM褪黑素而进一步提高，说明外源施加褪黑素能够提高纤维素酶的酶活，促进文冠果叶片中活性物质的释放。 [0059] 综上所述，本发明提供了一种苜蓿叶片瞬转纤维素酶基因表达纤维素酶的方法，所述的方法在表达的过程中施加外源褪黑素，能够提高得到的纤维素酶的活性，解决了植物表达纤维素酶活性较低的技术问题；同时，所述的方法步骤简单，制备得到的纤维素酶不含有毒性物质内毒素，可以用于植物活性物质的提取；通过所述的方法制备得到的纤维素酶，有效增加了文冠果叶片的活性物质的提取效率。 |
||||||
QQ群二维码
意见反馈
意见反馈