[0001] 本发明涉及医药技术领域，具体涉及一种林下参低中极性皂苷及其制备方法和应用、药物组合物。

[0002] 人参(Panaxginseng C.A.Mey)一直作为补气的最佳药材。中医理论认为人参归脾肺心经，通过补脾、肺、心之气，充足后天之精，补先天不足。人参中的活性组分包括人参皂苷、多糖、肽类、聚炔醇和脂肪酸等，其中人参皂苷是主要具有生物活性的物质。研究报道表明林下参和园参中所含人参皂苷种类基本相同，但各人参皂苷的含量和所占比例不同，中国专利CN111912927A公开了一种利用人参皂苷成分含量及其比例鉴别野山参与园参、林下山参与园参的方法，当人参皂苷Rb1的含量占样品重量的百分比≥0.6％，Rb1/Ro≥2.0时，样品为野山参(生长年限≥15年的林下山参)，而园参无法同时满足上述两个条件；当Rb1/Ro≥2.0时，林下山参(5～14年)符合此参数的条件，而园参中90％的样品无法满足此条件。按化学结构分类，人参皂苷Rb1属于原人参二醇型皂苷，人参皂苷Ro属于齐墩果酸型人参皂苷，二者属于低中极性成分。

[0003] 现有技术“肖涵等.林下参根皂苷类化合物优化提取与鉴定[J].食品研究与开发,2019,40(24):132‑137.”等公开了以林下参根为试验对象，利用醇提法和超声波辅助优化提取人参皂苷，大孔吸附树脂纯化，紫外分光光度法测定有效物质含量，高效液相色谱法进行定性定量鉴定，提取物中人参皂苷Ro的提取率为74.6％，人参皂苷Rd的提取率为87.1％。
然而上述提取方法得到的是人参总皂苷，没有单独分离得到低中极性皂苷组分。

[0004] 有鉴于此，本发明的目的在于提供一种林下参低中极性皂苷及其制备方法和应用、药物组合物，本发明提供的制备方法能够得到林下参低中极性皂苷(包括林下参中极性皂苷和林下参低极性皂苷)，且所得林下参低中极性皂苷能够显著提高免疫力。

[0005] 为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

[0006] 本发明提供了一种林下参低中极性皂苷的制备方法，包括以下步骤：

[0007] 将林下参总皂苷溶解于水中，得到林下参总皂苷溶液；

[0008] 将所述林下参总皂苷溶液置于HP20大孔吸附树脂柱中进行吸附，依次采用25～35v/v％乙醇‑水溶液、55～65v/v％乙醇‑水溶液和75～85v/v％乙醇‑水溶液进行洗脱分离，收集75～85v/v％乙醇‑水溶液的洗脱液浓缩后干燥，得到林下参低中极性皂苷。

[0009] 优选的，所述林下参总皂苷溶液的浓度为0.01～0.1g/mL。

[0010] 优选的，所述吸附的时间为8～14h。

[0011] 优选的，所述林下参总皂苷的制备方法包括以下步骤：

[0012] 将林下参与乙醇水溶液混合，进行提取，得到提取液；

[0013] 将所述提取液依次进行浓缩、干燥和溶解于水中，得到醇提物溶液；

[0014] 将所述醇提物溶液置于D101大孔吸附树脂柱中进行吸附，依次采用25～35v/v％乙醇‑水溶液、55～65v/v％乙醇‑水溶液和75～85v/v％乙醇‑水溶液进行洗脱分离，收集75～85v/v％乙醇‑水溶液的洗脱液浓缩后干燥，得到林下参总皂苷。

[0015] 优选的，所述乙醇水溶液中乙醇的体积分数为65～75％；

[0016] 所述林下参的干重与乙醇水溶液的体积之比为1g：8～12mL；

[0017] 所述提取为回流提取，所述提取的次数为2～3次，单次提取时间为1.5～3h。

[0018] 优选的，所述林下参干重与溶解用水的质量比为1：3～5。

[0019] 优选的，所述吸附的时间为8～14h。

[0020] 本发明提供了上述技术方案所述制备方法得到的林下参低中极性皂苷。

[0021] 本发明提供了上述技术方案所述的林下参低中极性皂苷在制备提高免疫力药物或抗疲劳药物中的应用。

[0022] 本发明提供了一种药物组合物，包括活性组分和药学上可接受的辅料；所述活性组分包括上述技术方案所述的林下参低中极性皂苷。

[0023] 本发明将林下参总皂苷溶解于水中，利用HP20大孔吸附树脂柱吸附，然后利用乙醇体积分数分别为25～35％、55～65％和75～85％的乙醇水溶液进行洗脱分离，首次得到林下参低中极性皂苷。本发明制备得到的林下参低中极性皂苷经体内、体外模型、代谢组学和宏基因组学进行了初步测试和评价，研究林下参低中极性皂苷的免疫调节活性以及对肠道微生态环境的影响，显示本发明提供的林下参低中极性皂苷可通过“肠道菌群‑代谢物‑免疫轴”发挥免疫作用，本发明制备的林下参低中极性皂苷具有明显的免疫调节作用，在制备提高免疫力药物方面具有很好的应用前景。如实施例测试结果所示，通过小鼠脾细胞体外增殖实验比较林下参总皂苷和园参总皂苷的增殖效果，结果表明林下参总皂苷和园参总皂苷浓度在2～32μg/mL范围均可促进小鼠脾细胞体外增殖；在相同浓度下，林下参总皂苷对小鼠脾细胞体外增殖的促进作用均强于园参总皂苷(p＜0.01)；在相同浓度下，林下参高极性皂苷组分和园参高极性皂苷组分(Rg1、Re)对小鼠脾细胞体外增殖的促进作用无统计学差异(p＞0.05)，而林下参低中极性皂苷对小鼠脾细胞体外增殖的促进作用均强于园参低中极性皂苷(p＜0.01)。附图说明

[0024] 图1为实施例1制备的林下参低中极性皂苷的总离子流图；

[0025] 图2为各组分对小鼠脾淋巴细胞增殖的影响图；

[0026] 图3为各组分对小鼠脾淋巴细胞周期的影响图；

[0027] 图4为脾细胞中Th17细胞与Treg细胞比例图；

[0028] 图5为AhR/MAPK通路相关蛋白表达结果图；

[0029] 图6为林下参皂苷组分对Balb/c小鼠的免疫调节作用图，其中，A为造模、给药期间小鼠体重变化图，B脾增殖指数结果图；

[0030] 图7为Th17细胞与Treg细胞比例图；

[0031] 图8为林下参皂苷组分对Balb/c小鼠的免疫调节作用图，其中A为各组脾脏HE染色结果图，B为各组胸腺HE染色结果图，C为各组结肠HE染色结果图；

[0032] 图9为小鼠结肠紧密连接蛋白的表达结果图；

[0033] 图10为林下参低中极性皂苷组干预免疫低下小鼠的粪便代谢组学分析结果，其中，A为各组小鼠粪便样品总离子流图，B为PCA得分图；

[0034] 图11为林下参低中极性皂苷组干预免疫低下小鼠粪便样本OPLS‑DA得分图；

[0035] 图12为林下参低中极性皂苷组干预免疫低下小鼠粪便样本置换检验结果图，其中，A、B、C分别为正离子模式下M组:Con组、M组:LML‑M组、M组:LMS组置换检验结果图；D、E、F分别为负离子模式下M组:Con组、M组:LML‑M组、M组:LMS组置换检验结果图；

[0036] 图13为林下参低中极性皂苷组干预免疫低下粪便代谢通路分析结果，其中，A、B、C分别为M组:Con组、LMS组:M组、LML‑M组:M组差异代谢物的代谢通路图；

[0037] 图14为林下参低中极性皂苷组干预免疫低下小鼠粪便潜在生物标志物相关代谢通路图，其中，A为基于门水平物种丰度的主坐标分析，B为基于属水平物种丰度的主坐标分析，C为基于属水平物种丰度的alpha多样性(Chao1指数和Shannon指数)；

[0038] 图15为林下参低中极性皂苷组对免疫低下小鼠肠道菌群结构的影响图，其中，A为Upset图展示各组中种水平物种数，B为门水平的物种相对丰度图，C为属水平的物种相对丰度；

[0039] 图16为林下参低中极性皂苷组对免疫低下小鼠肠道菌群结构的影响图，其中，A为种水平的物种相对丰度图，B为LEfSe分析进化分支图，C为LDA值分布柱状图；

[0040] 图17为林下参低中极性皂苷组对免疫低下小鼠肠道菌群结构的影响图，其中，A为各组小鼠KEGG代谢通路第一层级功能信息图，B为各组小鼠KEGG代谢通路第二层级功能信息图，C为各组小鼠eggNOG功能蛋白相对丰度统计比较图，D为各组小鼠CAZy蛋白家族相对丰度统计比较图；

[0041] 图18为林下参低中极性皂苷组对免疫低下小鼠肠道菌群结构的影响图，其中，A为各组小鼠粪便微生物KEGG蛋白家族相对丰度差异比较图，B为各组小鼠粪便微生物NOG蛋白家族相对丰度差异比较图，C为各组小鼠粪便微生物CAZy蛋白家族相对丰度差异比较图；

[0042] 图19为林下参低中极性皂苷组对免疫低下小鼠肠道菌群结构的影响图，其中，A为肠道菌群与免疫指标相关图，B为肠道菌群与代谢物相关图。

[0043] 本发明提供了一种林下参低中极性皂苷的制备方法，包括以下步骤：

[0044] 将林下参总皂苷溶解于水中，得到林下参总皂苷溶液；

[0045] 将所述林下参总皂苷溶液置于HP20大孔吸附树脂柱中进行吸附，依次采用25～35v/v％乙醇‑水溶液、55～65v/v％乙醇‑水溶液和75～85v/v％乙醇‑水溶液进行洗脱分离，收集75～85v/v％乙醇‑水溶液的洗脱液浓缩后干燥，得到林下参低中极性皂苷。

[0046] 如无特殊说明，本发明采用的原料均为市售商品。

[0047] 本发明将林下参总皂苷溶解于水中，得到林下参总皂苷溶液。在本发明中，所述林下参总皂苷溶液的浓度优选为0.01～0.1g/mL，更优选为0.05～0.1g/mL。

[0048] 在本发明中，所述林下参总皂苷的制备方法包括以下步骤：

[0049] 将林下参与乙醇水溶液混合，进行提取，得到提取液；

[0050] 将所述提取液依次进行浓缩、干燥和溶解于水中，得到醇提物溶液；

[0051] 将所述醇提物溶液置于D101大孔吸附树脂柱中进行吸附，依次采用25～35v/v％乙醇‑水溶液、55～65v/v％乙醇‑水溶液和75～85v/v％乙醇‑水溶液进行洗脱分离，收集75～85v/v％乙醇‑水溶液的洗脱液浓缩后干燥，得到林下参总皂苷。

[0052] 本发明将林下参与乙醇水溶液混合，进行提取，得到提取液。在本发明中，所述乙醇水溶液中乙醇的体积分数优选为65～75％，更优选为70％。在本发明中，所述林下参的干重与单次提取乙醇水溶液的体积之比优选为1g：8～12mL，更优选为1g：10mL；所述林下参在使用前优选先进行粉碎，本发明对于所述粉碎没有特殊限定，采用本领域技术人员熟知的粉碎方式粉碎至粒径≤2cm即可；所述林下参优选为五加科(Araliaceae)人工播种无人为干预，自然生长12～15年的人参(Panaxginseng C.A.Meyer)的干燥根。在本发明中，所述提取优选为回流提取，所述提取的次数优选为2～3次，单次提取时间优选为1.5～3h，更优选为1.5～2h。

[0053] 得到提取液后，本发明将所述提取液依次进行浓缩、干燥和溶解于水中，得到醇提物溶液。本发明对于所述浓缩没有特殊限定，采用本领域技术人员熟知的提取林下参总苷的浓缩方式和浓缩条件即可。在本发明中，所述干燥优选为冷冻干燥，本发明对于所述冷冻干燥的条件没有特殊限定，冷冻干燥至恒重即可。在本发明中，所述林下参干重与溶解用水的质量比优选为1：3～5，更优选为1:4。

[0054] 得到醇提物溶液后，本发明将所述醇提物溶液置于D101大孔吸附树脂柱中进行吸附(记为第一吸附)，依次采用25～35v/v％乙醇‑水溶液、55～65v/v％乙醇‑水溶液和75～85v/v％乙醇‑水溶液进行洗脱分离，收集75～85v/v％乙醇‑水溶液的洗脱液浓缩后干燥，得到林下参总皂苷。在本发明中，所述第一吸附的温度优选为室温，所述第一吸附的时间优选为8～14h，更优选为10～12h。在本发明中，所述洗脱分离采用的洗脱剂优选依次为30v/v％乙醇‑水溶液、60v/v％乙醇‑水溶液和80v/v％乙醇‑水溶液；所述30v/v％乙醇‑水溶液和60v/v％乙醇‑水溶液的用量独立地优选为3～5BV，更优选为4～5BV；所述80v/v％乙醇‑水溶液的用量独立地优选为8～10BV，更优选为8～9BV。本发明对于所述浓缩没有特殊限定，采用本领域技术人员熟知的提取林下参总苷的浓缩方式和浓缩条件即可，在本发明中，所述干燥优选为冷冻干燥，本发明对于所述冷冻干燥的条件没有特殊限定，冷冻干燥至恒重即可。

[0055] 得到林下参总皂苷溶液后，本发明将所述林下参总皂苷溶液置于HP20大孔吸附树脂柱中进行吸附(记为第二吸附)，依次采用25～35v/v％乙醇‑水溶液、55～65v/v％乙醇‑水溶液和75～85v/v％乙醇‑水溶液进行洗脱分离，收集75～85v/v％乙醇‑水溶液的洗脱液浓缩后干燥，得到林下参低中极性皂苷。在本发明中，所述第二吸附的温度优选为室温，所述第二吸附的时间优选为8～14h，更优选为10～12h。在本发明中，所述洗脱分离采用的洗脱剂优选依次为30v/v％乙醇‑水溶液、60v/v％乙醇‑水溶液和80v/v％乙醇‑水溶液；所述30v/v％乙醇‑水溶液和60v/v％乙醇‑水溶液的用量独立地优选为3～5BV，更优选为4～
5BV；所述80v/v％乙醇‑水溶液的用量独立地优选为8～10BV，更优选为8～9BV。本发明对于所述浓缩没有特殊限定，采用本领域技术人员熟知的提取林下参总苷的浓缩方式和浓缩条件即可。在本发明中，所述干燥优选为冷冻干燥，本发明对于所述冷冻干燥的条件没有特殊限定，冷冻干燥至恒重即可。

[0056] 本发明首次提供了以林下参为原料，大量富集、制备林下参低中极性皂苷的方法，制备得到的林下参低中极性皂苷能够提高免疫力和抗疲劳，在制备提高免疫药物以及抗疲劳药物中具有很好的应用前景。

[0057] 本发明提供了上述技术方案所述制备方法得到的林下参低中极性皂苷。在本发明中，所述林下参低中极性皂苷优选包括Rf、F3、R4、Rh1、Rg2、20(R)Rg2、20(R)Rh1、Ra2、Rb1、Ro、Rc、Ra1、Rb2、Rb3、CK、Rd、Rs1、Rs2、Gypenoside XVII、Rg8、Notoginsenoside Fe、Rg6、Rg4、F2、Rg3、20(R)Rg3、Rs3、Rk1、Rg5和Rs4。

[0058] 本发明提供了上述技术方案所述的林下参低中极性皂苷在制备提高免疫力药物或抗疲劳药物中的应用。在本发明中，所述提高免疫力优选包括通过脾细胞增殖作用以及提高免疫力。

[0059] 本发明提供了一种药物组合物，包括活性组分和药学上可接受的辅料；所述活性组分包括上述技术方案所述的林下参低中极性皂苷。本发明对于所述药学上可接受的辅料没有特殊限定，采用本领域技术人员数熟知的药学上可接受的辅料即可。本发明对于所述药物组合物中林下参低中极性皂苷的含量没有特殊限定，采用本领域技术人员熟知的活性组分的含量即可。本发明对于所述药物组合物的剂型和给药方式没有特殊限定，采用本领域技术人员熟知的剂型和给药方式即可。

[0060] 下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

[0061] 实施例1

[0062] (1)将林下参100g粉碎至≤2cm后用70v/v％乙醇‑水溶液加热回流提取2次，将所得提取液浓缩后冻干，得到醇提物；其中，单次提取用70v/v％乙醇‑水溶液的体积为0.8L，单次提取时间为2h；林下参优选为五加科(Araliaceae)人工播种无人为干预，自然生长12～15年的人参(Panaxginseng C.A.Meyer)的干燥根。

[0063] (2)将所述醇提物溶解于150g水中，将所得醇提物溶液置于D101大孔吸附树脂柱中吸附12h，然后依次以5BV的30v/v％乙醇‑水溶液、5BV的60v/v％乙醇‑水溶液和8BV的80v/v％乙醇‑水溶液进行洗脱，收集80v/v％乙醇‑水溶液的洗脱液，浓缩后冻干，得到林下参总皂苷。

[0064] (3)将所述林下参总皂苷溶解于75g水中，将所得林下参总皂苷溶液置于HP20大孔吸附树脂柱中吸附12h，然后5BV的30v/v％乙醇‑水溶液、5BV的60v/v％乙醇‑水溶液和8BV的80v/v％乙醇‑水溶液进行洗脱，收集80v/v％乙醇‑水溶液的洗脱液，浓缩后冻干，得到林下参低中极性皂苷(3.18g，总产率为3.18％，纯度为86.4％)。

[0065] 定性分析：采用UPLC Orbitrap HRMS定性检测林下参低中极性皂苷组分

[0066] 检测条件：Supelco Ascentis Express C18柱(50mm×3.0mm×2.7μm)，梯度洗脱，流动相A为0.1v/v％甲酸溶液，流动相B为乙腈，洗脱梯度程序：0～5min，0～15％流动相B；5～10min，15～19％流动相B；10～13min，19～25％流动相B；13～15min，25～28％流动相B；15～18min，28％流动相B；18～22min，28～30％流动相B；22～25min，30～35％流动相B；25～30min，35～40％流动相B；30～35min，40～60％流动相B；35～38min，60～80％流动相B；
38～40min，80～100％流动相B；40～45min，100％流动相B，45～50min，100～15％流动相B，
50～60min，15％流动相B，以0～5min，0～15％流动相B为例，其含义为0～5min，流动相B的体积分数由0％增加至15％；45～50min，100～15％流动相B即45～50min，流动相B的体积分数由100％减少至15％。柱温为35℃，流速为0.4mL/min，进样量为5μL。

[0067] 图1为实施例1制备的林下参低中极性皂苷的总离子流图，由图1可知，林下参低中极性皂苷中含有30种人参皂苷，包括人参皂苷Rb1、Ro、CK、Rs3以及Pk1等30种化合物，详见表1。

[0068] 表1UPLC Orbitrap HRMS在负离子模式下检测林下参低中极性皂苷组分MS/MS数据

[0069]

[0070]

[0071]

[0072] 对比例1

[0073] 林下参高极性皂苷的制备

[0074] 将林下参100g粉碎至≤2cm后用70v/v％乙醇‑水溶液加热回流提取2次，将所得提取液经纱布过滤后合并，50℃旋转蒸发浓缩至无醇味，将所得溶液置于D101型大孔吸附树脂柱中，水洗至无色，然后用30v/v％乙醇‑水溶液洗脱，收集30v/v％乙醇‑水溶液洗脱的洗脱液，旋转蒸发至无醇味，将所得溶液置于hp‑20型大孔吸附树脂柱，水洗至无色，然后用30v/v％乙醇‑水溶液洗脱，收集30v/v％乙醇‑水溶液洗脱的洗脱液，旋转蒸发至无醇味后冷冻干燥，得到林下参高极性皂苷组分。其中，单次提取用70v/v％乙醇‑水溶液的体积为
0.8L，单次提取时间为2h；林下参优选为五加科(Araliaceae)人工播种无人为干预，自然生长12～15年的人参(Panax ginseng C.A.Meyer)的干燥根。

[0075] 对比例2

[0076] 按照实施例1的方法制备，与实施例1的区别仅在于：将林下参替换为园参，得到园参低中极性皂苷。

[0077] 对比例3

[0078] 按照对比例1的方法制备，与对比例1的区别仅在于：将林下参替换为园参，得到园参高极性皂苷。

[0079] 测试例1

[0080] (1)细胞培养：将无菌摘除的小鼠脾脏放入D‑hanks缓冲液中，充分研磨脾脏并用200目筛网过滤，反复多次，合并滤液。4℃、1500r/min条件下离心5min，弃去上清液，加入
1mL红细胞裂解液，振荡20s，置于冰上2min，4℃、1500r/min条件下离心5min，弃去上清液，加入D‑hanks液洗涤细胞，离心，弃去上清液，重复两次，得到脾细胞沉淀。将脾细胞沉淀悬
7
浮于3mL含10％胎牛血清和双抗的RPMI1640培养基中，计数，调整细胞浓度为1×10个/mL，将细胞转移至96孔板，每孔加入100μL脾淋巴细胞悬液，37℃、5％CO2条件下培养4h后给药。

[0081] (2)MTT法测定：在细胞培养至44h时，每孔中加入50μL 2mg/mL的MTT溶液，继续培养3h。3h后，取出培养板，用移液枪轻轻吸去上清液，每孔加入100μL DMSO，振荡20min后，用酶标仪于570nm下测定吸光值。以刺激指数＝受刺激细胞的OD值/阴性对照组的OD值作为脾细胞增殖的评价指标。

[0082] (3)样品的制备：用培养基配成浓度为1mg/mL的林下参低中极性皂苷母液，加药时用RPMI1640培养基稀释为2μg/mL、4μg/mL、8μg/mL的溶液(林下参高极性皂苷组分LH组、林下参低中极性皂苷组分LML组、园参高极性皂苷组分RH组、园参低中极性皂苷组分RML组)。阳性对照药ConA用RPMI1640培养基稀释为5μg/mL的溶液备用。

[0083] (4)Th17/Treg细胞表型的表达：流式细胞仪分析脾脏中Th17和Treg淋巴细胞亚群7
百分比。调整脾细胞浓度至1×10 个/mL，用PBS缓冲液洗涤，用小鼠T淋巴细胞亚群抗体混合物(Anti‑Mouse CD4 FITC和Anti‑Mouse IL‑17PE或Anti‑Mouse CD4 FITC、Anti‑Mouse CD25 APC和Anti‑Mouse FOXP3 PE进行标记)4℃、避光条件下染色30min。混合样品经PBS洗涤两次，用1％甲醛固定液固定，流式细胞仪分析测定Th17和Treg淋巴细胞。

[0084] (5)流式细胞技术检测小鼠脾细胞周期：按照周期试剂盒说明书操作，每管细胞加入碘化丙啶染色液，37℃、避光条件下温浴30min，进行流式检测，检测结果采用数据分析软件(FlowJo)进行分析。

[0085] (6)炎症因子测定：收集脾细胞，离心取上清液。按照试剂盒说明书进行操作，绘制标准曲线，计算出各组样品的IL‑17、TNF‑α、IL‑10、IL‑22、IL‑1β、TGF‑β含量。

[0086] (7)Real‑time PCR法检测脾细胞mRNA表达情况：用TriQuickReagent提取试剂提取脾细胞中总RNA，测定RNA质量和浓度，以检测RNA的完整性。样品进行反转录与荧光定量检测后见表2～4。

[0087] 表2反应设置

[0088]组成 体积
总RNA ≤lμg
5 xTransScript Uni All‑in‑One SuperMix for qPCR 4μL
gDNA Remover 1μL
RNase‑free Water Variable
总体积 20μL

[0089] 表3反应设置

[0090]

[0091] 表4反应设置

[0092]

[0093] 将八连管放入荧光定量PCR仪中，并在ABI QuantStudio 1软件上设定检测。

[0094] (8)AhR/MAPK通路相关蛋白检测：蛋白免疫印迹法测脾细胞AhR、p38MAPK、JNK、ERK1/2蛋白表达水平。取脾细胞进行裂解、离心制成细胞裂解液，然后用BCA法测定蛋白浓度。采用PVDF转膜，再用含有5％脱脂奶粉的TBST室温封闭3h，加入一抗AhR、p38MAPK、JNK、ERK，在4℃条件下恒温下孵育12h，TBST充分洗涤3次，洗涤时间分别为10min、5min、5min。加入辣根过氧化物酶(HRP)耦联标记的二抗，37℃条件下摇床孵育3h，TBST充分洗涤3次，洗涤时间分别为10min、5min、5min；最后用ECL高敏显色液显色并拍片，使用计算机Image‑J软件进行分析，测定灰度值。

[0095] (9)实验结果如图2～5和表5～8所示，其中，图2为各组分对小鼠脾淋巴细胞增殖的影响图；图3为各组分对小鼠脾淋巴细胞周期的影响图；图4为脾细胞中Th17细胞与Treg细胞比例图；图5为AhR/MAPK通路相关蛋白表达结果图。

[0096] 表5林下参中低级极性组分对脾淋巴细胞周期的影响(n＝3)

[0097]

[0098]

[0099] 表6酶联免疫法测定细胞因子(n＝3)

[0100]

[0101] 表7林下参低中极性皂苷组分对小鼠mRNA表达的影响(n＝3)

[0102] 组别 AhR CYP1B1 CYP1A1 p38MAPK JNK ERKK 0.95±0.02 0.81±0.03 0.96±0.24 1.03±0.03 1.00±0.13 0.93±0.06
ConA 2.39±0.43** 1.46±0.35* 1.47±0.11** 6.48±0.21** 3.95±0.22** 3.86±0.12**LML 5.21±0.57** 12.21±0.52** 8.65±0.52** 3.23±0.15* 6.76±0.73** 12.75±0.17**[0103] 表8林下参低中极性皂苷组分对小鼠蛋白表达的影响(n＝3)

[0104]组别 AhR/β‑actin p38MAPK/β‑actin JNK/β‑actin ERK/β‑actin
K 0.229±0.02 0.230±0.01 0.302±0.01 0.374±0.01
** ** ** **
ConA 0.501±0.05 1.900±0.02 1.288±0.01 0.913±0.03
** * ** **
LML 0.446±0.03 0.658±0.02 0.647±0.04 0.765±0.01

[0105] 注：表5～8中，与空白组(K)比较，*代表显著性差异(p<0.05)，**代表极显著性差异(p<0.01)；与园参中低极性皂苷组分(RML)相比，#代表显著性差异(p<0.05)，##代表极显著性差异(p<0.01)。

[0106] 由图2～5和表5～8可知，采用MTT法检测林下参低中极性皂苷组分在浓度为8μg/mL时，对小鼠脾淋巴细胞体外增殖活性最优。ELISA检测结果表明，林下参低中极性皂苷组分处理后，小鼠脾细胞上清中淋巴因子TNF‑α、IL‑1β的含量增加(p＜0.01)，IL‑17、IL‑22、TGF‑β含量降低(p＜0.01)，IL‑10无显著性差异。采用流式细胞术观察林下参低中极性皂苷组分对脾淋巴细胞周期和亚型的影响，发现G0/G1期的脾细胞百分比降低，S期和G2期脾细胞百分比升高，Th17细胞比例降低，Treg细胞比例增高。Real‑time PCR法检测林下参低中极性皂苷组分对小鼠mRNA表达的影响，其中AhR、CYP1A1、CYP1B1、ERK1/2、JNK的mRNA表达有显著性差异(p＜0.01)，p38MAPK无显著性差异(p＞0.05)。Western‑blot测小鼠脾细胞内AhR、p38MAPK、JNK及ERK1/2蛋白的表达，结果其蛋白表达均升高。

[0107] 测试例2

[0108] (1)实验动物及分组：实验动物均为Balb/c雄性小鼠，6～8周龄，体重20±2g，小鼠每天添加饲料1次，换水1次，自由摄食、饮水，适应性喂养3天后进行实验。小鼠按体重随机分为8组，每组10只。除正常组小鼠腹腔注射等量生理盐水外，其余小鼠均腹腔注射CTX 80mg/(kg·d)连续注射3天。各组给药方案如表9所示，其中，LML表示实施例1制备的林下参低中极性皂苷。

[0109] 表9各组小鼠给药方案(n＝10)

[0110]分组 造模期(3d) 干预期(14天)
正常对照组(Con) 生理盐水 生理盐水
免疫低下模型组(M) 环磷酰胺[80mg/(kg·d)] 生理盐水
阳性药组(LMS) 环磷酰胺[80mg/(kg·d)] 盐酸左旋咪唑[40mg/(kg·d)]
LML高剂量组(LML‑H) 环磷酰胺[80mg/(kg·d)] 高剂量组[80mg/(kg·d)]
LML中剂量(LML‑M) 环磷酰胺[80mg/(kg·d)] 中剂量组[40mg/(kg·d)]
LML低剂量组(LML‑L) 环磷酰胺[80mg/(kg·d)] 低剂量组[20mg/(kg·d)]

[0111] (2)一般情况观察：观察各组小鼠的精神、活动、饮食、排便、毛发等情况。小鼠实验前称重，实验开始后每天称重1次，并记录，实验结束后比较各组小鼠体重变化。

[0112] (3)生化指标测定：在实验最后一天将小鼠眼球取血，置于EP管中，4℃存放1h后离心，取上清，置‑80℃冰箱中保存备用，用于酶联免疫法检测IL‑17、TNF‑α、IL‑10、IL‑22、IL‑1β、TGF‑β因子以及血清LPS，按照试剂盒说明书进行操作检测。

[0113] (4)淋巴细胞增殖试验：无菌切除小鼠脾脏，过200目筛网，得到单细胞悬浮液，红细胞裂解液清除红细胞，加入含10％新生牛血清的RPMI1640培养基，上样培养72h。加入浓度为5mg/mL MTT 10μL继续培养4h。去除培养液，每孔加入150μLDMSO溶液。570nm处测量吸光度。以刺激指数＝受刺激细胞的OD值/阴性对照组的OD值作为脾细胞增殖的评价指标。

[0114] (5)Th17/Treg细胞亚型的测定：流式细胞仪分析脾脏中Th17/Treg淋巴细胞亚群7
百分比。调整脾细胞浓度至1×10 个/mL，用PBS缓冲液洗涤，用小鼠T淋巴细胞亚群抗体混合物(Anti‑Mouse CD4 FITC和Anti‑Mouse IL‑17PE或Anti‑Mouse CD4 FITC、Anti‑Mouse CD25 APC和Anti‑Mouse FOXP3 PE进行标记)4℃条件下避光染色30min。混合样品PBS洗两次，流式细胞仪分析测定Th17/Treg细胞亚型。

[0115] (6)脏器指数测定：摘取小鼠胸腺、脾和结肠等组织，称重，并计算小鼠胸腺、脾和结肠指数。各脏器按需保存，进行其他指标测定。

[0116] (7)脏器组织病理切片HE染色：取固定于4％多聚甲醛中的脾脏、胸腺和结肠组织进行石蜡包埋。切片前将包埋好的组织样本置于‑20℃条件下冻，待组织达适当硬度即可切片。将包埋好的蜡块切成5～10μm的薄片，再用载玻片捞起放置在40℃温水皿中的切片，置于60℃烘箱中烤片3h。将组织切片常规脱蜡至水，水洗1～2min。切片入苏木精液染色3～6min，流水洗去苏木精液1～2min，加入1％盐酸酒精分化1～3s，水洗1～2s，促蓝液返蓝5～
10s，流水冲洗15～30s。然后切片入0.5％伊红液染色3min，自蒸馏水洗1～2s。最后依次放入80％v/v％乙醇‑水溶液(15～30s)→95v/v％乙醇‑水溶液(15～30s)→无水乙醇(1～2s)→二甲苯I(2～3s)→二甲苯Ⅱ(2～3s)→风干后中性树胶封片，最后通过显微镜拍照，LeicaApplication Suite图像系统采集样本相关部位。

[0117] (8)肠道紧密连接蛋白ZO‑1、Occludin及Claudin‑1取小鼠结肠组织进行裂解、匀浆、离心制成细胞裂解液，然后用BCA法测定蛋白浓度。采用PVDF转膜，再用含有5％脱脂奶粉的TBST室温封闭3h，加入一抗ZO‑1(1:1000)、Occludin(1:1000)、Claudin‑1(1:1000)、β‑Actin(1:1000)，在4℃恒温条件下孵育12h，TBST充分洗涤3次，每次10min、5min、5min。加入辣根过氧化物酶(HRP)耦联标记的二抗，37℃条件下摇床孵育3h，TBST充分洗涤3次，洗涤时间分别为10min、5min、5min；最后用ECL高敏显色液显色并拍片，使用计算机Image‑J软件进行分析，测定灰度值。

[0118] (9)林下参低中极性皂苷组分干预免疫低下小鼠的粪便代谢组学分析：分别收集正常对照组(Con)、免疫低下模型组(M)、阳性药组(LMS)、LML中剂量组(LML‑M)小鼠的粪便样本，将内容物存放于无菌管中备用。取‑80℃样品先于‑4℃溶解于1mL甲醇后，再在室温下溶解。样品在12000r/min条件下离心5min，取上清液200μL，加入800μL甲醇沉淀蛋白，涡旋1min，在12000r/min条件下离心5min，取上清液，氮吹，加入500μL甲醇复溶，涡旋1min，在
12000r/min条件下离心5min，取上清液置于液相小瓶中，‑4℃放置待LC‑MS检测。

[0119] LC‑MS检测条件：色谱柱为Supelco Ascentis Express C18柱(50mm×3.0mm×2.7μm)；梯度洗脱程序：流动相A为0.1v/v％甲酸水溶液，流动相B为乙腈，流动相洗脱梯度：0～5min，5～15％流动相B；5～8min，15～22％流动相B；8～15min，22～45％流动相B；15～
18min，45～70％流动相B；18～23min，70～95％流动相B；23～25min，95～5％流动相B；25～
28min，5％流动相B；以0～5min，5～15％流动相B为例，表示0～5min，流动相B的体积分数由
5％增加至15％；23～25min，95～5％流动相B即23～25min，流动相B的体积分数由95减少至
5％；柱温为35℃，流速为0.4mL/min，进样量为5μL。电喷雾离子源(ESI)，正负离子检出模式，喷雾电压2.5kV，毛细管温度320℃，透镜电压50V，鞘气流速40arb，辅助气流速10arb，辅助气温度300℃，质量扫描范围m/z 50.0～2000.0，质谱分辨率70000。质谱数据由Mass Hunter软件收集，通过SIEVE软件进行峰对齐和归一化处理得到代谢物的数据矩阵包括保留时间和准确的质荷比和峰面积。数据在SIMCA14.0中心化后，进行PCA和正交偏最小二乘判别分析(OPLS‑DA)多变量统计分析。基于VIP＞1及单因素方差分析p＜0.05筛选与林下参低中极性皂苷组分调节免疫的相关潜在代谢生物标志物，将所得差异性代谢物录入MetaboAnalyst 5.0在线数据分析平台即可提取相关差异性代谢通路。

[0120] (10)林下参低中极性皂苷组分对免疫低下小鼠肠道菌群结及功能的影响：分别收集正常对照组(Con)、免疫低下模型组(M)、阳性药组(LMS)和LML中剂量组(LML‑M)小鼠粪便样本，将粪便存放于无菌冻存管中，采集完毕立即放入液氮中速冻1h，速冻后将全部样品放于‑80℃超低温冰箱中保存，用于宏基因组基因测序。

[0121] 使用CTAB法完成核酸的提取，宏基因组在裂解时加入5～10％的溶菌酶。使用Qubit3.0对于提取的核酸进行浓度检测，并使用琼脂糖电泳对完整性进行检测。使用Universal Plus DNA Library Prep Kit for IIIumina ND617试剂盒进行文库构建，按照说明书进行操作。样品基因组DNA检测合格后，将DNA打断，然后对片段化的DNA进行末端修复、3'端加polya(A)、连接测序接头、连接产物纯化片筛、文库扩增、产物纯化形成测序文库，文库质检合格后，由中国北京百迈客生物科技有限公司使用Illuminahiseq 
6000平台(PE150)对纯化的样品进行高通量测序分析。

[0122] (11)实验结果如图6～19和表10～12所示，图6中A为造模、给药期间小鼠体重变化图，图6中B脾增殖指数结果图。图7为Th17细胞与Treg细胞比例图。图8中A为各组脾脏HE染色结果图，图8中B为各组胸腺HE染色结果图，图8中C为各组结肠HE染色结果图。图9为小鼠结肠紧密连接蛋白的表达结果图。图10中A为各组小鼠粪便样品总离子流图，图10中B为PCA得分图。图11为小鼠粪便样本OPLS‑DA得分图。图12为小鼠粪便样本置换检验结果图，A、B、C分别为正离子模式下M组:Con组、M组:LML‑M组、M组:LMS组置换检验结果图；D、E、F分别为负离子模式下M组:Con组、M组:LML‑M组、M组:LMS组置换检验结果图。图13为粪便代谢通路分析结果，A、B、C分别为M组:Con组、LMS组:M组、LML‑M组:M组差异代谢物的代谢通路图。图14中A为基于门水平物种丰度的主坐标分析，图14中B为基于属水平物种丰度的主坐标分析，图14中C为基于属水平物种丰度的alpha多样性(Chao1指数和Shannon指数)。图15中A为Upset图展示各组中种水平物种数，图15中B为门水平的物种相对丰度图，图15中C为属水平的物种相对丰度。图16中A为种水平的物种相对丰度图，图16中B为LEfSe分析进化分支图，图16中C为LDA值分布柱状图。图17中A为各组小鼠KEGG代谢通路第一层级功能信息图，图17中B为各组小鼠KEGG代谢通路第二层级功能信息图，图17中C为各组小鼠eggNOG功能蛋白相对丰度统计比较图，图17中D为各组小鼠CAZy蛋白家族相对丰度统计比较图。图18中A为各组小鼠粪便微生物KEGG蛋白家族相对丰度差异比较图，图18中B为各组小鼠粪便微生物NOG蛋白家族相对丰度差异比较图，图18中C为各组小鼠粪便微生物CAZy蛋白家族相对丰度差异比较图。图19中A为肠道菌群与免疫指标相关图，图19中B为肠道菌群与代谢物相关图。

[0123] 表10林下参低中极性皂苷组分对小鼠脏器指数的影响(n＝6)

[0124]

[0125]

[0126] 表11酶联免疫法测定细胞因子(n＝6)

[0127]

[0128] 注：表10～11中，与空白组(Con)比较，*代表显著性差异(p<0.05)，**代表极显著性差异(p<0.01)；与模型组(M)相比，#代表显著性差异(p<0.05)，##代表极显著性差异(p<0.01)。

[0129] 表12免疫低下小鼠粪便中生物标志物组间比较

[0130]

[0131]

[0132] 注：Con表示空白组；M表示免疫低下模型组；LMS表示阳性对照组；LML‑M表示林下参低中极性皂苷组。趋势：ns表示无显著性差异(p＞0.05)；“↓”、“↑”表示(p＜0.05)；“↓↓”、“↑↑”表示(p＜0.01)；“↓↓↓”、“↑↑↑”表示(p＜0.001)。

[0133] 由图6～19和表10～12可知，采用腹腔注射环磷酰胺建立免疫低下模型，低极性皂苷组分干预后，小鼠体重随给药时间的增加，体重逐渐增加。病理切片结果表明，低中极性皂苷组分可改善小鼠脏器形态，使小鼠脾、胸腺、结肠形态基本恢复至正常水平。林下参低中极性皂苷组分能够在一定程度上改善免疫低下小鼠TNF‑α、IL‑17等免疫因子的活性；降低免疫低下小鼠血清中LPS浓度；降低Th17细胞比例，增加Treg细胞比例。低中极性皂苷组分干预后，小鼠的肠道紧密连接蛋白ZO‑1、Occludin及Claudin‑1表达有所升高。低中极性皂苷组分可显著上调尿胆素原、四氢皮质酮、吲哚、L‑色氨酸4种代谢标志物，下调三乙醇胺、次黄嘌呤、花生四烯酸等16种代谢标志物。其涉及4个主要的代谢通路，分别为花生四烯酸代谢、色氨酸代谢、苯丙氨酸代谢以及精氨酸生物合成。低中极性皂苷组分可有效调控免疫低下小鼠的门、属、种水平上的肠道菌群，增加拟杆菌属(Bacteroides)、乳酸杆菌属(Lactobacillus)、阿克曼菌属(Akkermansia)丰度，降低雷沃菌属(Prevotella)丰度；能够增加Muribaculaceae_bacterium_Isolate‑080_(Janvier)、Bacteroides_acidifaciens菌种相对丰度，减少其他有害菌的相对丰度。并通过功能菌群对宿主能量、碳水化合物、氨基酸等营养物质代谢和转运的调控而发挥免疫调控效应。

[0134] 以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。