一种博落回生物碱制备方法 |
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| 申请号 | CN202211315022.8 | 申请日 | 2022-10-26 | 公开(公告)号 | CN115505011B | 公开(公告)日 | 2023-12-15 |
| 申请人 | 贵州省化工研究院; | 发明人 | 王贵城; 周利; 邓勇; 戴天伦; 龙来早; 邹金鑫; | ||||
| 摘要 | 本 发明 涉及 生物 制药技术领域，尤其是一种博落回生物 碱 制备方法，经引入石油醚预处理博落回果荚粉，不仅能够充分保留活性成分，而且能够促使博落回果荚粉中脂溶性杂质、色素等能够被大量除去，有利于后续引入 乙醇 ‑ 微波 提取和大孔 树脂 吸附 纯化处理，继而使得博落回生物碱总含量达到60％以上，且血根碱含量达到41％以上，有助于提升博落回生物碱纯度，同时，缩短提取时间，减少洗脱、洗涤步骤，降低废液产生量。 | ||||||
| 权利要求 | 1.一种博落回生物碱制备方法，其特征在于，包括以下步骤： |
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| 说明书全文 | 一种博落回生物碱制备方法技术领域[0001] 本发明涉及生物制药技术领域，尤其是一种博落回生物碱制备方法。 背景技术[0002] 博落回生物碱是从罂粟科博落回属植物博落回(Macleaya cordata(Willd.)R.Br.)中提取得到的化合物，主要包含血根碱和白屈菜红碱，具有抗菌消炎、杀虫、抑制多种病原菌、抗病毒和抗肿瘤等多种药理作用。博落回生物碱已经被开发为天然抗生素，广泛应用于畜禽饲料中替化学类抗生素，具有无残留、无休药期的特点，且随着对化学类兽用抗生素的“减用”、“禁用”等，使得博落回生物碱市场应用前景大幅度改观，需求量日益递增。 [0003] 博落回生物碱制备方法主要有：低碳醇提取法、酸水提取法、超声波辅助提取法、微波辅助提取法等，但这些方法所获得的博落回生物碱提取物中杂质较多，造成所得的博落回生物碱总含量极低，需要进一步分离纯化得到更高纯度博落回生物碱，才能够使得博落回生物碱总含量达到50％左右。目前，根据生物碱物化性质的差异，可以采取不同的分离纯化方法，常见的方法有： [0004] (1)酸提或酸水提后碱沉法，即就是采用酸水提取法提取或者超声波辅助提取法提取、微波辅助提取法提取后，加碱沉淀，低碳醇回流提取，再加酸结晶成盐，最后得到博落回总生物碱，例如：专利公开号为CN 101849994A，采用酸水渗漉，加碱沉淀，再用低碳醇回流提取，浓缩提取液后再加酸结晶成盐得到血根碱含量不低于40％的博落回生物碱；该法在加碱沉淀后会产生大量深褐色的高COD废水，造成废水处理难度大。再例如：专利公开号为CN104739939A，采用水提醇沉法(实施例2)、醇提水沉法(实施例1)、酸水提取法(实施例3)，具体是采用醇回流提取得到提取液，再调pH，碱沉方式提取，或采用水提取，减压浓缩，加入乙醇得到提取液，再调pH，碱沉方式提取，或采用酸水回流提取，调pH至中性后，加入乙醇得到提取液，再调pH，碱沉方式提取，实现所得博落回总生物碱提取。可见该法始终贯穿着采用加碱沉淀的方式来实现提纯处理，导致会产生大量深褐色的高COD废水，造成废水处理难度大。 [0005] (2)醇提或酸水提后再树脂分离法，即就是采用采用乙醇或酸乙醇提取，然后将提取液用大孔吸附树脂吸附，再采用不同极性的洗脱液梯度洗脱，洗脱液浓缩、干燥得到一定纯度的博落回生物碱。例如：专利公开号为CN 101020703A，采用乙醇分步浸渍、超声波处理提取，提取液浓缩、活性炭处理、冷处静置12h、过滤后再加入少量酸再次冷处静置12h后过滤、加水及吐温配置成上样液后，大孔树脂上样吸附，然后用水和乙醇梯度洗脱，洗脱液浓缩、微波干燥得博落回生物碱。该法需要多梯度洗脱，洗脱效率低，且溶剂消耗量大，成本高。再例如：专利公开号为CN 105131005 A，采用将博落回原料用酸水进行雾化提取，提取液上弱极性大孔树脂吸附洗脱，洗脱液经回收溶剂并进行干燥，该过程需要使用酸水，导致大量的废液产生，而且所采用的酸水对提取设备腐蚀性较高，造成设备应用成本较高。 [0006] (3)石油醚处理‑酸乙醇超声辅助提取，再利用聚乙二醇、硫酸铵溶液摇床摇，离心分离而得，利用液‑液萃取、标准液来分析上下相中各生物碱含量，继而计算萃取率，即就是：进入到上液中的生物碱含量越高，所得萃取率越高，但是，萃取过程，是否伴随着其他杂质成分也被萃取，是否能够保障所得上层液相中生物碱的纯度较高，这在现有技术中并未作出相应研究，例如：专利公开号为CN111689976A所公开的相应内容。 [0008] 鉴于此，本研究者立足于现有博落回生物碱提取所存在相关技术难题和技术缺陷，综合考虑博落回生物碱提取工艺，引入索氏提取器设备，且经石油醚预处理博落回果荚，保障石油醚能够回收循环利用的基础上，能够除去和降低博落回果荚中的杂质和色素，继而保障后续提取博落回生物碱的纯度，降低博落回生物碱提取成本和废液处理成本，为博落回生物碱提取提供了一种新思路。 发明内容[0009] 为了解决现有技术中存在的上述技术问题，本发明提供一种博落回生物碱及其制备方法，经石油醚‑索氏提取器处理博落回果荚、乙醇‑微波提取博落回生物碱、大孔树脂吸附‑蒸馏水洗脱‑乙醇洗脱‑酸乙醇洗脱‑浓缩回收乙醇、调pH‑冷却结晶‑过滤‑干燥而得，极大程度避免了有机溶剂残留，提升有机溶剂、洗脱液等循环回收利用，降低废液产生量，且使得博落回生物碱含量达到60％以上，其中血根碱含量达到41％以上。 [0010] 具体是通过以下技术方案得以实现的： [0011] 博落回生物碱制备方法，包括以下步骤： [0012] (1)石油醚预处理： [0013] 取干燥博落回果荚粉碎制备成博落回果荚粉；将博落回果荚粉置于索氏提取器中，加入石油醚，100℃下处理6h，回收石油醚，得博落回渣； [0014] (2)乙醇‑微波提取： [0015] 将博落回渣与乙醇溶液混合，采用微波加热提取处理10‑30min，提取两次，合并两次提取液，得乙醇提取液，浓缩回收乙醇至占加入乙醇溶液体积的25％，得博落回提取液； [0016] (3)大孔树脂分离提纯： [0017] 将100gAB‑8树脂湿法装入30×500mm的色谱柱中，将博落回提取液以1‑2mL/min的流速上柱，待上柱完成后，采用蒸馏水洗柱至出水无色，紧接着采用乙醇洗脱液洗脱至出液无色，再用酸乙醇溶液洗脱至出液无色透明，收集酸乙醇洗脱液； [0018] (4)成盐精制： [0020] 本发明创造经引入石油醚预处理博落回果荚粉，不仅能够充分保留保留活性成分，而且能够促使博落回果荚粉中脂溶性杂质、色素等能够被大量除去，有利于后续引入乙醇‑微波提取和大孔树脂吸附纯化处理，继而使得博落回生物碱总含量达到60％以上，且血根碱含量达到41％以上，有助于提升博落回生物碱纯度，同时，缩短提取时间，减少洗脱、洗涤步骤，降低废液产生量。 [0021] 为了使得博落回果荚粉与石油醚充分接触，且降低石油醚用量，提高石油醚回收效率，优选，所述步骤(1)，博落回果荚粉与石油醚质量体积比为3g：20mL。更优选，所述博落回果荚粉是将干燥的博落回果荚粉碎，并过60目筛所得的粉末。 [0022] 为了避免提取过程造成设备腐蚀，且保障对博落回生物碱的提取，继而提高博落回生物碱的纯度，优选，所述步骤(2)，乙醇溶液是体积浓度为80‑95％，且乙醇溶液加入量为所述步骤(1)中加入乙醚体积的1.5倍。更优选，所述微波加热提取是采用微波功率为100‑300w加热至50‑70℃。更优选，所述步骤(3)，蒸馏水洗柱流速为1‑2mL/min。更优选，所述步骤(3)，乙醇洗脱液是体积浓度为30％的乙醇溶液，且所述乙醇洗脱液流速为2‑5mL/min。更优选，所述酸乙醇溶液是在体积浓度为90‑95％的乙醇溶液中加入0.1％的盐酸混合而成，且所述酸乙醇溶液流速为2‑5mL/min。更优选，所述步骤(4)，向浓缩液中加入浓盐酸调节pH至1。更优选，所述真空干燥箱内的真空度为40‑60kPa。 [0023] 与现有技术相比，本发明创造的技术效果体现在： [0024] 本发明创造工艺流程简单，易于产业化推广实施，而且经引入石油醚预处理与微波‑乙醇提取工艺相结合，使得大孔树脂吸附纯化工艺简化，降低了废液产生量，而且使得所得博落回生物碱中生物碱总含量达到60％以上，且血根碱的含量达到41％以上。 [0025] 本发明创造最为突出的研究内容是：采用石油醚预处理博落回果荚粉，再引入乙醇‑微波加热提取，控制乙醇‑微波加热提取时候的乙醇体积浓度、微波功率和温度，同时，结合大孔树脂吸附先采用蒸馏水洗脱‑低浓度乙醇洗脱‑酸乙醇洗脱，且结合浓缩‑调节pH成盐处理工艺以及工艺参数的限定，使得提取出来的博落回生物碱中，生物碱总含量能够达到78％以上，且血根碱含量达到61％以上，使得提取出来的博落回生物碱纯化率得以提升。 [0026] 具体经过研究得知： [0027] ①将30g博落回果荚粉采用200mL乙醚100℃下预处理6h后，将体积浓度为95％的乙醇300mL加入混合后，再在微波功率300W下加热至60℃，提取处理30min，合并两次提取并浓缩乙醇至150mL，再结合乙醇溶液洗脱(30％体积浓度)上柱速率为3mL/min，且酸乙醇洗脱(体积浓度90％的乙醇溶液中加入0.1％盐酸混合而成)上柱速率3mL/min，浓盐酸调pH至1时，所得博落回生物碱的总生物碱含量为78.5％，且血根碱为61.38％。 [0028] ②将30g博落回果荚粉采用200mL乙醚100℃下预处理6h后，将体积浓度为95％的乙醇300mL加入混合后，再在微波功率300W下加热至70℃，提取处理30min，合并两次提取并浓缩乙醇至150mL，再结合乙醇溶液洗脱(30％体积浓度)上柱速率为3mL/min，且酸乙醇洗脱(体积浓度95％的乙醇溶液中加入0.1％盐酸混合而成)上柱速率3mL/min，浓盐酸调pH至1时，所得博落回生物碱的总生物碱含量为83.20％，且血根碱为65.40％。 [0029] ③将30g博落回果荚粉采用200mL乙醚100℃下预处理6h后，将体积浓度为95％的乙醇300mL加入混合后，再在微波功率300W下加热至70℃，提取处理30min，合并两次提取并浓缩乙醇至150mL，再结合乙醇溶液洗脱(30％体积浓度)上柱速率为3mL/min，且酸乙醇洗脱(体积浓度90％的乙醇溶液中加入0.1％盐酸混合而成)上柱速率3mL/min，浓盐酸调pH至1时，所得博落回生物碱的总生物碱含量为88.50％，且血根碱为73.26％。 [0030] 可见，对于在提取工艺过程中的工艺参数变化，将会极大程度影响着博落回生物碱中总生物碱的含量，同时影响着血根碱在总生物碱中的含量，继而影响着提取的博落回生物碱的品质。 [0031] 本发明创造经过工艺步骤的集成，并对提取工艺参数的恰当控制，确保所得博落回生物碱中总生物碱含量能够达到78％以上，且血根碱含量达到了61％以上，极大程度改善了从博落回果荚中提取博落回生物碱的品质。附图说明 [0032] 图1为本发明创造工艺流程图。 [0033] 图2为本发明创造实施例1所得的博落回生物碱HPLC分析图谱。 [0034] 色谱柱：C18柱(250mm×4.6mm 5μm)； [0035] 流速：1.0mL/min； [0036] 检测波长：270nm； [0037] 柱温：35℃； [0038] 进样量10μL； [0039] 流动相：乙腈‑0.1％磷酸的水溶液。 具体实施方式[0040] 下面结合附图和具体的实施方式来对本发明的技术方案做进一步的限定，但要求保护的范围不仅局限于所作的描述。 [0041] 如图1所示，在某些实施例中，博落回生物碱制备方法，包括以下步骤： [0042] (1)石油醚预处理： [0043] 取干燥博落回果荚粉碎制备成博落回果荚粉；将博落回果荚粉置于索氏提取器中，加入石油醚，100℃下处理6h，回收石油醚，得博落回渣； [0044] (2)乙醇‑微波提取： [0045] 将博落回渣与乙醇溶液混合，采用微波加热提取处理10‑30min，例如：10min，20min，30min等，提取两次，合并两次提取液，得乙醇提取液，浓缩回收乙醇至占加入乙醇溶液体积的25％，例如将博落回渣与300mL乙醇溶液混合，两次提取(600mL乙醇溶液)，则浓缩回收乙醇至150mL后，得博落回提取液； [0046] (3)大孔树脂分离提纯： [0047] 将100gAB‑8树脂湿法装入30×500mm的色谱柱中，将博落回提取液以1‑2mL/min，例如：1mL/min，2mL/min等的流速上柱，待上柱完成后，采用蒸馏水洗柱至出水无色，紧接着采用乙醇洗脱液洗脱至出液无色，再用酸乙醇溶液洗脱至出液无色透明，收集酸乙醇洗脱液； [0048] (4)成盐精制： [0049] 将酸乙醇洗脱液浓缩回收90％体积的乙醇，得浓缩液；向浓缩液中加入浓盐酸调节pH至1‑1.5，例如：1、1.3、1.5等，冷却至5℃，过滤，滤饼采用乙醇洗脱残留的酸液，在真空干燥箱60℃干燥至恒重，即得。 [0050] 利用石油醚预处理博落回果荚粉，除去脂溶性杂质和色素，极大程度便于乙醇‑微波超声提取博落回生物碱，并利用大孔树脂分离提纯，再经成盐精制，避免了传统博落回生物碱提取需要长时间、多次洗脱提纯处理，缩短了大孔树脂洗脱时间，提高了纯化效率，降低了废水、废液产生量。 [0051] 本发明创造经过对处理工艺参数的合理控制，使得博落回生物碱总含量达到88.5％，且血根碱含量达到73.26％。 [0052] 如图1所示，在某些实施例中，所述步骤(1)，博落回果荚粉与石油醚质量体积比为3g：20mL。能够充分保障博落回果荚粉与石油醚充分接触，保障后续对石油醚回流回收处理的难度较低。在某些实施例中，所述博落回果荚粉是将干燥的博落回果荚粉碎，并过60目筛所得的粉末。 [0053] 如图1所示，在某些实施例中，所述步骤(2)，乙醇溶液是体积浓度为80‑95％，例如：80％，85％，90％，95％等，且乙醇溶液加入量为所述步骤(1)中加入乙醚体积的1.5倍。在某些实施例中，所述微波加热提取是采用微波功率为100‑300w，例如100w、150w、200w、 250w、300w等加热至50‑70℃、例如：50℃、60℃、65℃、70℃等。能够更好的将博落回果荚粉中的博落回生物碱提取出来，提高提取效率和得率。 [0054] 如图1所示，在某些实施例中，所述步骤(3)，蒸馏水洗柱流速为1‑2mL/min，例如：1mL/min，2mL/min等。在某些实施例中，所述步骤(3)，乙醇洗脱液是体积浓度为30％的乙醇溶液，且所述乙醇洗脱液流速为2‑5mL/min，例如：2mL/min，3mL/min，4mL/min，5mL/min等。 在某些实施例中，所述酸乙醇溶液是在体积浓度为90‑95％的乙醇溶液中加入0.1％的盐酸混合而成，且所述酸乙醇溶液流速为2‑5mL/min，例如：2mL/min，3mL/min，4mL/min，5mL/min等。在某些实施例中，所述步骤(4)，向浓缩液中加入浓盐酸调节pH至1。在某些实施例中，所述真空干燥箱内的真空度为40‑60kPa，例如：40kPa、50kPa、60kPa等。 [0055] 为了能够更好的验证和说明本发明创造的技术效果，以便于本领域技术人员充分理解本发明创造的技术构思，本研究者经过对本发明创造在试验室开展研究，现将具体研究的相关试验列做出以下描述与阐述。 [0056] 实施例1 [0057] 如图1和图2所示，博落回生物碱制备方法，按照以下步骤提取： [0058] (1)取干燥博落回果荚粉碎并过60目筛制备成博落回果荚粉；称取博落回果荚粉30g，置于索氏提取器中，加入200mL石油醚，并在100℃下预处理6h，回收石油醚，得到博落回渣。 [0059] (2)将博落回渣与300mL乙醇溶液(体积浓度为80％)混合，控制温度为70℃回流提取2h，提取3次，合并3次的提取液合并得到乙醇提取液，将乙醇提取液浓缩回收乙醇至150mL，得到博落回提取液。 [0060] (3)将100gAB‑8树脂湿法装入30×500mm的色谱柱中，将博落回提取液以介于1‑2mL/min的流速上柱，待上柱完后，采用蒸馏水以相同的流速洗柱至出水无色，紧接着采用乙醇溶液(体积浓度为30％)以2mL/min流速洗脱至出液无色，再采用酸乙醇(体积浓度为 95％的乙醇溶液中加入0.1％的盐酸混合而成)，以2mL/min流速洗脱至出液无色，收集酸乙醇洗脱液。 [0061] (4)将酸乙醇洗脱液浓缩回收90％体积的乙醇，得到浓缩液；将浓缩液在搅拌下加入盐酸调节pH至1.5，冷却至5℃，过滤，乙醇洗出残留酸液，并置于真空度为50kPa的真空干燥箱内，采用60℃干燥至恒重，即得提取粉末。 [0062] 将所得的提取粉末称重，并测定博落回生物碱总含量以及血根碱含量，其结果如下表1所示。 [0063] 实施例2 [0064] 在实施例1的基础上，所述步骤(2)是将博落回渣与300mL乙醇溶液(体积浓度为80％)混合后，采用功率为100w的微波加热至50℃，恒温回流提取10min，提取两次，将两次的提取液合并得到乙醇提取液；所述步骤(3)是将采用蒸馏水洗脱至出液无色之后，紧接着采用乙醇溶液(体积浓度为30％)以5mL/min流速洗脱至出液无色后，再采用酸乙醇(体积浓度为90％的乙醇溶液中加入0.1％的盐酸混合而成)，以5mL/min流速洗脱至出液无色，收集酸乙醇洗脱液；所述步骤(4)是将浓缩液采用浓盐酸调节终点pH值为1，其他均参照实施例1进行操作，即得提取粉末。 [0065] 将所得的提取粉末称重，并测定博落回生物碱总含量以及血根碱含量，其结果如下表1所示。 [0066] 实施例3 [0067] 在实施例2基础上，重复按照实施例2的操作方式进行博落回生物碱的工艺制备，其中在微波加热提取时，所述的提取温度恒温在60℃，其他均同实施例2，并将所得的提取粉末称重，并测定博落回生物碱总含量以及血根碱含量，其结果如下表1所示。 [0068] 实施例4 [0069] 在实施例2基础上，重复按照实施例2的操作方式进行博落回生物碱的工艺制备，其中所述步骤(2)是将博落回渣与300mL乙醇溶液(体积浓度为90％)混合，其他均同实施例2，并将所得的提取粉末称重，并测定博落回生物碱总含量以及血根碱含量，其结果如下表1所示。 [0070] 实施例5 [0071] 在实施例4基础上，重复按照实施例4的操作方式进行博落回生物碱的工艺制备，其中在微波加热提取时，所述的提取温度恒温在60℃，其他均同实施例4，并将所得的提取粉末称重，并测定博落回生物碱总含量以及血根碱含量，其结果如下表1所示。 [0072] 实施例6 [0073] 在实施例5基础上，重复按照实施例5的操作方式进行博落回生物碱的工艺制备，其中在微波加热提取时的微波功率为300W，其他均同实施例5，并将所得的提取粉末称重，并测定博落回生物碱总含量以及血根碱含量，其结果如下表1所示。 [0074] 实施例7 [0075] 在实施例6基础上，重复按照实施例6的操作方式进行博落回生物碱的工艺制备，其中所述步骤(2)是将博落回渣与300mL乙醇溶液(体积浓度为95％)混合；微波加热提取时间为30min，且所述步骤(3)中，采用乙醇溶液(体积浓度为30％)以3mL/min流速上柱洗脱，且所述酸乙醇以3mL/min流速上柱洗脱，其他均同实施例6，并将所得的提取粉末称重，并测定博落回生物碱总含量以及血根碱含量，其结果如下表1所示。 [0076] 实施例8 [0077] 在实施例7的基础上，重复按照实施例7的操作方式进行博落回生物碱的工艺制备，其中所述酸乙醇是体积浓度为95％的乙醇溶液中加入有0.1％盐酸混合而成；微波加热提取时的温度控制为70℃，其他均同实施例7，并将所得的提取粉末称重，并测定博落回生物碱总含量以及血根碱含量，其结果如下表1所示。 [0078] 实施例9 [0079] 在实施例8的基础上，重复按照实施例8的操作方式进行博落回生物碱的工艺制备，其中所述酸乙醇是体积浓度为90％的乙醇溶液中加入有0.1％盐酸混合而成，其他均同实施例8，并将所得的提取粉末称重，并测定博落回生物碱总含量以及血根碱含量，其结果如下表1所示。 [0080] 实施例10 [0081] 在实施例1的基础上，所述步骤(1)是将博落回果荚直接粉碎后过60目筛制备成博落回果荚粉，再将博落回果荚粉直接与300mL乙醇溶液(体积浓度为80％)混合，其他均按照实施例1的步骤进行操作，将所得的提取粉末称重，并测定博落回生物碱总含量以及血根碱含量，其结果如下表1所示。 [0082] 实施例11 [0083] 在实施例2的基础上，所述步骤(1)是将博落回果荚直接粉碎后过60目筛制备成博落回果荚粉，再将博落回果荚粉直接与300mL乙醇溶液(体积浓度为80％)混合，其他均按照实施例2的步骤进行操作，将所得的提取粉末称重，并测定博落回生物碱总含量以及血根碱含量，其结果如下表1所示。 [0084] 表1博落回生物碱检测结果 [0085] 提取粉末质量(g) 博落回生物碱总含量(％) 血根碱含量(％) 实施例1 0.530 60.3 40.20 实施例2 0.436 60.5 41.30 实施例3 0.417 62.8 43.18 实施例4 0.441 62.1 43.50 实施例5 0.430 63.4 46.70 实施例6 0.432 65.3 47.90 实施例7 0.395 78.5 61.38 实施例8 0.393 83.2 65.40 实施例9 0.390 88.5 73.26 实施例10 0.538 51.24 33.36 实施例11 0.514 54.25 35.67 [0086] 由表1可知，①引入微波提取，并结合其他工艺参数变化，虽然导致所得提取粉末质量降低，但所得博落回生物碱总含量却趋于稳定，维持在60％以上，且博落回生物碱中血根碱含量有所提升，极大程度改善了从博落回中提取生物碱时，血根碱在生物碱中的含量达到41％以上。②微波提取过程的乙醇体积浓度的增加，将有助于提高提取粉末的质量，且提取温度提高，将使得博落回生物碱总含量达到62％以上，且血根碱含量达到43％以上。③将微波提取时，乙醇体积浓度控制在95％，提取温度70℃，提取时间30min，微波功率300w，30％乙醇洗脱速率为3mL/min，且酸乙醇成分组成为90‑95％体积浓度的乙醇中加入0.1％盐酸，酸乙醇洗脱速率为3mL/min，成盐pH终点为1时，提取所得的博落回生物碱总含量能够达到80％以上，且血根碱含量能够达到60％以上。 [0087] 本发明创造其他未尽事宜参照现有技术或者本领域技术人员所熟知的公知常识、常规技术手段加以实现即可。 [0088] 以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。 |
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