本发明属于化学合成药物及其制备方法，特别是关于对耐青霉素肺炎链球菌（PRSP)具 有抑制作用的多酸类抗菌药物及其制备方法。

肺炎链球菌属于革兰氏阳性菌，是严重侵袭性感染（如脑膜炎、败血症、急性中耳炎、 脓毒症、肺炎）和上呼吸道感染最重要的病原体之一。全球每年有400万至600万人死于这 种细菌感染。曾经认为青霉素是对肺炎链球菌的常规敏感药物，自从六、七十年代在澳大利 亚和南非首先报道了耐青霉素的肺炎链球菌（PRSP, penicilline-resistant str印tococcus pneumoniae)感染以来，近二十年PRSP感染在全世界都有了报道，有调査表明青霉素耐药 率在美国为40%，日本37%，香港45%，南韩高达77%。肺炎链球菌对青霉素耐药（耐药 机制为青霉素结合蛋白PBP2 '的改变）发生率的上升，使许多抗生素正在逐渐失去原有的效 力。医生们十分担心，如果细菌的耐药性这样增长下去，将来肺炎、肠炎等疾病都有可能变 成不治之症。随着肺炎链球菌对多种抗生素的抗性不断增强，改变原有治疗方案、开发新型 治疗药物是十分必要的。

本发明的目的之一是提供一类与以往抗生素不同的对耐青霉素的肺炎链球菌（PRSP)感 染有抑制活性的多酸类抗菌剂。
本发明的目的之二是提供制备上述多酸类抗菌药物的方法。
本发明的抗耐青霉素的肺炎链球菌（PRSP)感染多酸类抗菌剂是由金刚垸胺、吗啉胍、 氟脲嘧啶及异烟肼分别与Keggin型多阴离子:XM1204(T (这里X为P, As, Si, Ge; M为Mo, W, V，Nb); Dowson型多阴离子：X2M18062n-(这里X为P， As; M为Mo， W)和LnW1()036n-(Ln为 镧系元素)型多阴离子。金刚烷胺与上述多阴离子形成的超分子化合物是以下列通式为特征： (Ci0H18N)mXM12O4(rnH2O (这里X为P, As, Si， Ge; M=Mo, W， V， Nb; m为1, 2, 3， 4或5); (doH^N)mLnWK)036'nH20(这里Ln为镧系元素，m为1~9自然数）。其中C1()H18N为质子化 的金刚烷胺。吗啉胍与上述多阴离子形成的超分子化合物是以下列通式为特征：（C6H14N50) mXM1204o'nH20 (这里X为P， As， Si， Ge; M为Mo, W， V， Nb; m为1, 2， 3， 4或5); (C6H!4N50)mX2M!8062'nH20(这里X为P, As; M=Mo, W; m为1， 2， 3, 4， 5或6); (C6Hi4NsO)mLnWK)036'nH20(这里Ln为镧系元素，m为1~9自然数)。其中C6H14N50为质子
化的吗啉胍。氟脲嘧啶与上述多阴离子形成的超分子化合物是以下列通式为特征： (C4H5N3OF)mXM12O40'nH2O (这里X为P, As, Si， Ge ; M为Mo,W， V, Nb; m为1, 2, 3, 4或5); (C4H5N30F)mX2Mi8062'nH20(这里X为P, As; M=Mo, W; m为1 ， 2， 3， 4， 5或6); (QH5N30F)mLnWK)036'nH20(这里Ln为镧系元素，m为1~9自然数)。其中C4H5N3OF为 质子化的氟脲嘧啶。异烟肼与上述多阴离子形成的超分子化合物是以下列通式为特征： (C6H8N3O)mXM12O40'nH2O (X=P, As， Si, Ge; M为Mo, W, V, Nb; m为1, 2， 3， 4或5); ((:6?1^30)„^2]^18062*必20(这里X为P, As; M=Mo， W; m为1， 2， 3， 4， 5或6); (QH8N30)mLnWK)036TiH20(这里Ln为镧系元素，m为1~9自然数)。其中C6H8N30为质子 化的异烟肼。
金刚垸胺、吗啉胍、氟脲嘧啶及异烟肼这些有机分子分别与上述多酸阴离子形成的超分
子化合物结构有如下特征：
1这些有机分子，如金刚烷、吗啉胍、氟脲嘧啶及异烟肼等在形成的超分子化合物中一般 以质子化形式存在。
2质子化的金刚垸、吗啉胍、氟脲嘧啶及异烟肼等与上述多阴离子间以静电力和分子间力 (氢键）结合。
3在上述超分子化合物中， 一般金刚垸、吗啉胍、氟脲嘧啶、异烟肼及多阴离子结构保持不变。
4这些超分子化合物中常常含有一些溶剂分子，如水等。
上述这些多阴离子分别与金刚垸胺、吗啉胍、氟脲嘧啶及异烟肼形成的化合物对耐青霉 素的肺炎链球菌（PRSP)显示强的抑制活性。
抗耐青霉素肺炎链球菌（PRSP)的多酸化合物的制备方法:首先将一定质量金刚烷胺， 吗啉胍，氟脲嘧啶及异烟肼用稀盐酸或稀硫酸或稀硝酸溶液酸化到pH为3~6，之后按化学计 量比分别滴加到含有一定质量的Keggin型、Dowson型及LnW^O^XLn为镧系元素，n为 自然数，代表阴离子所带电荷数)型多金属氧酸盐的水溶液中，搅拌反应，生成大量沉淀（但 异烟肼的水溶液加入多金属氧酸盐的水溶液中不立即生成沉淀，放置一段时间生成），沉淀 用水、乙醇洗涤，干燥，即得产品。 具体实施方式
合成实施例1
金刚垸胺与Keggin型磷钼酸形成的化合物[(doH^N)3PMoi204(TxH20]的合成：将金刚 烷胺100g溶于200 ml水，稀盐酸酸化到pH约为6，在不断搅拌条件下逐滴加入到含有402 g磷钼酸水溶液中。随着金刚烷胺的加入，溶液逐渐变浑浊最后产生大量沉淀。继续搅拌lh 使反应进行完全，抽滤分离沉淀，用蒸馏水洗两次，再用乙醇洗涤，空气中干燥，得到黄色 的粉末为(C^Hi8N)3PMo,204oTiH20。以金刚烷胺计算产率85%。
合成实施例2
金刚垸胺与LnW1()0369—(Ln为镧系元素)形成的化合物(doH!8N)9PrWK)036'xH20的合成： 100g金刚烷胺溶于200 ml水，稀盐酸酸化到pH约为6，搅拌下将其逐滴加入到按化学计量 比确定的一定质量的Na7H2PrWK)036(合成方法见文献Shiozaki, R; Inagaki， A; Nishiro， ■A; Nishio, E; Maekawa， M; Kominami, H; Kera， Y. Journal of Alloys and Compounds, 1996, 234, 193-198.)的水溶液中，生成大量沉淀，抽滤分离沉淀，用蒸馏水洗两次，再用 乙醇洗涤，空气中干燥，得到淡绿色粉末为(CK)Hi8N)9PrWK)03圹nH20，以金刚垸胺计算产率 90%。
合成实施例3
吗啉胍与Keggin型硅钨酸自组装超分子化合物[(C6H14N50) ^\^1204()*川20]的合成： 100g吗啉胍溶于200mL蒸馏水中，搅拌溶解，用盐酸酸化到pH约为3〜4，将其按化学计量 比逐滴滴加到一定质量的H4SiWnO40水溶液中，有沉淀生成，直到不再生成沉淀为止，过滤， 用水、乙醇洗涤，干燥，得白色粉末，为(C6H,4N5O)4SiWi2O40，nH20。以硅钨酸计算产率为
78%。
合成实施例4
吗啉胍与Dowson型磷钨酸形成的化合物(C6H!4N50)6P2Wi8062'nH20的合成：100g吗啉 胍溶于200mL蒸馏水中，搅拌溶解，用盐酸酸化到pH约为3〜4，将其按化学计量比逐滴滴 加到一定质量的Dowson型磷钨酸溶液中，有沉淀生成，直到不再生成沉淀为止。过滤，用 水、乙醇洗涤，干燥，得白色粉末，为(CK)HwN)6P2Ww062 '必20。以Dowson型磷钨酸计算 产率为72%。
合成实施例5
吗啉胍与1^\¥1()0369-的形成的化合物((:61114>^0)9?]^1()036 *nH20的合成：100g吗啉胍 溶于200 ml水，用盐酸酸化到pH约为3〜4，将其按化学计量比逐滴加入到一定质量的 Na7H2PrWn)036(合成方法见文献Shiozaki, R; Inagaki, A; Nishiro， A; Nishio, E; Maekawa， M; Kominami, H; Kera， Y. Journal of Alloys and Compounds, 1996, 234， 193-198.)的 水溶液中，生成大量沉淀，抽滤分离沉淀，用蒸馏水洗两次，再用乙醇洗涤，空气中干燥， 得到淡绿色粉末为(C6HwN50)9PrWK)036 'nH20，以吗啉胍计算产率90%。
合成实施例6 异烟肼与Keggin型硅钨酸形成的超分子化合物(C6H8N3O)4SiWi2O40'nH20的合成：100g 异烟肼溶于250mL蒸馏水中，搅拌溶解，用盐酸酸化到pH约为5，将其按化学计量比逐滴 加入到一定质量的H4SiWi2O40水溶液中，有沉淀生成，直到不再生成沉淀为止，过滤，用水、 乙醇洗涤，干燥，得白色粉末，为(C6H8N30)4SiWu040 'nH20。以硅钨酸计算产率为70%。
合成实施例7
异烟肼与D0WS0n型磷钨酸形成的化合物(C6HsN30)6P2W！8062 'nH20的合成：100g异烟
肼溶于250mL蒸馏水中，搅拌溶解，用盐酸酸化到pH约为5，将其按化学计量比逐滴加入 到一定质量的Dowson型磷钨酸溶液中，有沉淀生成，直到不再生成沉淀为止，过滤，用水、 乙醇洗涤，干燥，得白色粉末，为(C6HsN30)6P2W！8062 '111120。以Dowson型磷钨酸计算产 率为69%。
合成实施例8
异烟肼与稀土镨形成的杂多化合物[(C6H8N30)9PrWn)036'nH20]的合成：100gg异烟肼溶 于250mL蒸馏水中，搅拌溶解，用盐酸酸化到pH约为5.6，将其按化学计量比逐滴加入到一 定质量的Na7H2PrW!o036(合成方法见文献Shiozaki, R; Inagaki, A; Nishiro, A; Nishio, E; Maekawa, M; Kominami， H; Kera， Y. Journal of Alloys and Compounds, 1996, 234，193-198.)的7JC
溶液中，生成大量沉淀，用蒸馏水洗两次，再用乙醇洗涤，空气中干燥，得产物(C6H8N30)9
PrW1()036*nH20。以异烟肼计算产率为76%。 合成实施例9
氟脲嘧啶与Keggin型硅钨酸形成的超分子化合物(C4H5N30F)4SiWi204。 的合成： 100克的氟脲嘧啶溶于300mL水，用稀盐酸酸化到pH约为5，将其按化学计量比滴加到一定 量的H4SiWuO40水溶液中，将会得到大量沉淀，直到继续滴加氟脲嘧啶水溶液不再生成沉淀 为止，收集沉淀，乙醇洗涤，干燥，得白色粉末，为(C4HsN30F)4SiWn04o'nH20。以硅钨酸 计算产率为70%。
合成实施例10
氟脲嘧啶与Dowson型磷鸨酸形成的化合物(C4H5N30F)6P2W^062，xH20的合成：100克氟 脲嘧啶溶于300mL水，用稀盐酸酸化到pH约为5，将其按化学计量比滴加到一定量的Dcwson 型磷钨酸水溶液中，将会得到大量沉淀，直到继续滴加氟脲嘧啶水溶液不再生成沉淀为止，
收集沉淀，乙醇洗涤，干燥，得到化学式为(C4FH5N30)6P2W^062'nH20的白色粉末。以 HsP2Wi8062计算产率为65%。
合成实施例11
氟脲嘧啶与稀土镨形成的杂多化合物(C4H5N30F)9 PrWK)Cb6TiH20]的合成：100克氟脲瞎 啶溶于300mL水，用稀盐酸酸化到pH约为5，将其按化学计量比滴加到一定量的 Na7H2PrWn)036(合成方法见文献Shiozaki, R; Inagaki, A; Nishiro, A; Nishio, E; Maekawa, M; Kominami, H; Kera, Y. Journal of Alloys and Compounds, 1996， 234,193-198.)的水溶液中，生成 大量沉淀，用蒸馏水洗两次，再用乙醇洗涤，空气中干燥，得产物(C4HsN30F)9 PrW1()036'nH20。 以氟脲嘧啶计算产率76%。
抗菌活性实验方法及结果
实验方法
实验所用菌株均为标准菌株，购自中国药品生物制品检定所。
最小抑菌浓度（MIC)通过试管稀释法测定。在营养肉汤中采用二倍稀释法配制浓度为 256-0. 125 u g ，mL—1的化合物。向每个管中加入被测菌株至最终接种浓度达到5X 105CFU/mL。 对肺炎链球菌的试管，需补充5%脱纤维马血。培养基37。C孵育24h。化合物的MIC定义为孵 育时间内没有可观察到的细菌生长的化合物的最低浓度。
体外细胞毒性实验通过在微孔板上的HeU细胞生长确定。Hela细胞用含有10%胎牛血 清及抗生素的RPMI-1640全培养基在5。/oC02, 37。C条件下培养。对数生长期细胞用Tripan 蓝排染。向96孔培养板中每孔加入90yL细胞，每孔再加纯化的溶于DMSO中的测试样品的 体积为10liL，使之总体积为100yL，调细胞浓度为每孔含5乂103个细胞，于CCh培养箱中 培养48h后从井中除去介质。MTT制成5mg 'ml/1储备液0.15M PBS缓冲溶液通过0. 22 u m 过滤器过滤，并在含抗生素的RMPI-1640中稀释为1 mg • mL—1。每井加入200微升上述溶 液并孵育4h。所有未转化的MTT(介质)从井中仔细吸出。兰色formazan晶体溶解在100!i Lisopropano卜IN HC1 (24:1)中。振荡孔板确保兰色formazan晶体溶解，在DG3022酶联 免疫检测仪上测定光密度值(0D),取波长560nm，参考波长为690咖，溶剂做对照。
肺炎链球菌在lmL Todd-Hewitt肉汤中孵育到指数级生长并同各种浓度的化合物共同培 养30min。然后在每种细胞的悬浊液中加入放射性前驱体（37kBq[SH]胸苷，27.75 kBq[^]尿 苷，148 kBq^H]亮氨酸，lllkBqN-乙酰葡萄糖胺），37。C反应10min后，通过加入5°/。三氯乙 酰酸(TCA)终止反应。TCA不溶部分用玻璃漏斗真空过滤，连续用5。/。TCA和95。/。乙醇洗。空 气干燥过滤器，放射性残留物用Beckman LS6500液体闪烁记数仪记数。
结果
1抗菌活性
金刚垸胺、吗啉胍、氟脲嘧啶及异烟肼与多金属氧酸盐自组装化合物对肺炎链球菌 (Molecular formula)禾口耐青霉素月市炎链球菌(Penicilline Resistant Streptococcus Pneumoniae, PRSP)的抑制活性，以临床有效药物氨苄青霉素（Ampicillin)为对照，得到的结果见表l。 可见， 一些含有金刚烷胺、吗啉胍、氟脲嘧啶及异烟肼的多金属氧酸盐对肺炎链球菌和耐青 霉素肺炎链球菌有强的抑制活性，其最小抑菌范围低于对照药物氨苄青霉素。
表1多金属氧酸盐对肺炎链球菌及其耐青霉素肺炎链球菌的抑菌活性
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2细胞毒性
以3个典型的化合物(doHi8N)6As2Mow062'nH20 (化合物4)、 （C6H14N50) 4SiW1204()(化 合物8)和(QH5N30F)9 PrW1G036 (化合物14)为例，探讨了上述化合物的细胞毒性和抗菌 活性机理。
用不同浓度的(CK)HwN)6As2Mo!8062'nH20 (化合物4)、 （C6H14N50) 4SiW1204o (化合物 8)和(C4HsN30F)9PrWu)036(化合物14)处理HeLa细胞后，观察形态变化，发现低浓度(〈12. 5 nmol • mL—》时，化合物4、 8和14处理后HeLa细胞形态没有发生明显变化，说明低浓度时 化合物的毒性很小。对化合物4和14，当浓度大于12. 5 nmol • mL—'时，随着浓度的增加对 HeLa细胞的毒性也逐渐增加，而化合物8，当浓度范围是12.5-100 nmoHnL—1时，对HeLa细 胞的毒性不随浓度增加而发生明显变化。 3.作用机理探讨
化合物4 [(d。Hi8N)6As2Mo^Od、8 [(C6H14N50) 4SiW1204op 14 [(C4H5N3OF)9 PrW10O36] 对肺炎链球菌细胞生物合成DNA， RNA蛋白质及细胞壁合成的影响，通过检验放射性胸苷、 尿苷、亮氨酸及N-乙酰葡萄糖胺掺入肺炎链球菌细胞来确定。化合物4、 8和14对葡萄糖掺 入肺炎链球菌细胞的影响也被检验。如表2所示，化合物4、 8和14非选择性抑制胸苷、尿 苷、亮氨酸及葡萄糖掺入肺炎链球菌细胞，其ICso范围是0.08-0.32 nmoHnl/1，接近于化合 物的MIC值。而化合物4、 8和14对N-乙酰葡萄糖胺掺入细胞抑制的ICso则为1. 28-2. 56 nmol'mU1。 ICP分析用化合物4、 8和14处理30 min后的肺炎链球菌细胞，结果表明有大 量K+从细胞中流出。这些结果暗示多金属氧酸盐化合物在细胞膜上底物和离子交换的部位发 挥抗菌活性。
表2化合物对葡萄糖掺入肺炎链球菌细胞的影响 IC50 (nmol , mL-1) Thymidine Uridine Leucine Glucose N-Acetylglucosaminetable see original document page 10