用于脂质体中的有可裂解键的缀合物

发明所属的技术领域

本发明涉及一种缀合物(conjugate)，其中由疏水性部分、可裂 解的键和治疗剂构成。更特别的是，本发明涉及一种缀合物，由脂质、 可分离的键和药物构成，其掺入脂质体制剂中。在体内温和的硫解条件 下，缀合物可以裂解，释放出未经修饰状态的药物。

本发明的技术背景

脂质体是用于各种治疗目的的封闭的脂质微囊，尤其通过脂质体 的系统给药将治疗剂传送到靶区域或靶细胞。在表面接枝有水溶性的、 生物可耐受的聚合物-尤其是聚乙二醇-的链的脂质体，已成为重要的 药物载体。这些脂质体提供比缺少聚合物覆盖的脂质体更长的血液循环 周期。接枝的聚合物的链屏蔽或遮盖脂质体，因此减少与血浆蛋白质的 相互作用。因而降低体内脂质体清除或消除的速度，因为脂质体循环不 能被巨噬细胞和网状内皮系统的其他细胞识别。还因为所谓的增强的渗 透性和保留效果，脂质体趋向于聚集在受到破坏的部位和扩张的脉管 系统，如肿瘤和炎症部位。

通常需要延长的血液循环周期以使全身给药的脂质体到达靶区 域、细胞或部位。例如，针对肿瘤部位的脂质体治疗优选长于12小时的 血液循环周期，因为脂质体必需在系统中分布，然后渗透到肿瘤区域。

以脂质体为基础的治疗涉及的一个问题是，药物在脂质体中保留 足够的时间以达到系统分布。当用长期循环的脂质体-如有接枝的聚合 物链的脂质体-给药时，尤其涉及此问题。只有少数的药物能长时间地 在脂质体中有效地荷载和保留，并随后释放。

促进药物保留的一种途径是选择脂质双层组分，使双层结构有较少 的渗透性以截留药物。然而，脂质双层应有充分的流动性以使药物释放， 例如，在所需时间，如在靶部位定位后或经过充分的生物分布后，借助 通过脂质双层的传送或脂质微囊的破裂而使药物释放。

另一个促进药物保留的努力是将药物共价结合在脂质体的脂质双层 结构中的脂质上(Waalkes，等，《癌症的选择疗法》，6：15-22(1990)； Asai，等，《生物药学通报》(Biol.Pharm.Bull.)21：766-771 (1998))。

期望配制一种脂质体组合物，它有长的血液循环周期，并能将截留 的药物保留所需的时间，还能按需要释放药物。本领域为实现这些特点 而进行的努力，已从不形成微囊的脂质制备了一种脂质体，如二油酰基 磷脂酰乙醇胺(DOPE)，和脂质双层稳定的脂质，如甲氧基-聚乙二醇 -二硬脂酰基磷脂酰基乙醇胺(mPEG-DSPE)(Kirpotin，D，等.， FEBSLett.388：115-118(1996))。在这些尝试中，mPEG通过可裂解 的键连接在DSPE上。此键的裂解可以影响脂质体的稳定性，从而快速 释放脂质体中的内容物。

已公开了将PEG聚合物连接到脂质体的不稳定的键(美国专利 5,013,556，5,891,468；国际申请WO 98/16201)。在这些脂质体组 合物中的不稳定的键从脂质体中释放PEG聚合物链，例如，暴露一个 有靶配体连接的表面或引起脂质体与靶细胞的融合。

然而至今还未产生一种方法，能够在适于体内使用的条件下，使 聚合物链从脂质体断开。例如一些可裂解的链需要蛋白质硫解剂-如 1，4-二硫苏糖醇，以释放聚合物链。这些还原剂是不能在体内使用的。 已知的用可裂解的键将PEG连接到脂质体脂质的另一个问题是：可解除 的键的裂解产生非天然的和不期望的被修饰的脂质。相应地，本领域需 要一种可裂解的键，适于体内使用并且在裂解后产生天然的、未经修饰 状态的药物或治疗剂。

在EP 0317957中，Senter记载了一种药物-抗体药物前体，其中 用二硫化物苄基氨基甲酸酯或碳酸酯链接将抗体与药物相连接，二硫键 的还原会影响药物的释放。Senter的学说对于在还原剂-如1，4-二硫 苏糖醇、谷胱甘肽、NADH和NADPH-的作用下，药物-配体药物分子 的裂解是特殊的。当将药物掺入通过血液而循环的脂质体中时，不能根 据Senter公开的内容而预知这种连接的行为。例如在脂质体中，聚 合物和脂质之间的连接将埋藏或掩蔽在PEG外层中。相对容易想象如在 Senter的文献中的单一药物-配体药物前体的释放；然而，当在脂质 体表面包裹聚合物链而形成部分浓密的屏障时，连接的释放是不易预见 的。

如上所述，延长的血液循环时间是PEG包裹的脂质体的理想特性，血 液循环寿命长于12小时对于针对肿瘤区域的脂质体疗法是优选的。 Senter公开的文献未提供在内源性的还原条件下，如在脂质体的血液 循环中，对于掺入到脂质体中的缀合物的释放动力学的指导。

发明概述

相应地，本发明的一个目的是提供一种脂质体组合物，药物在其中 保留所需的时间从脂质体中释放。

本发明的另一个目的是提供一种用于脂质体中的缀合物，其中缀合 物由固着于脂质双层上的疏水部分、对温和的硫解条件反应的可裂解的 键和治疗剂组成。

一方面，本发明包括一个用于脂质体药物释放载体中的缀合物，此缀 合物有以下结构通式：

其中L是疏水的部分，适于掺入脂质体的脂质双层结构中，R1代表 治疗药物，以共价键连接在二硫苄基部分，而CH2R1基团的取向选自邻位 和对位。

在一个实施方案中，其中的治疗药物被选自尿烷、胺、酰胺、碳酸 酯、硫代碳酸酯、醚和酯的键共价连接。

在另一实施方案中，L选自胆固醇、二酰基甘油、磷脂及这些物质 的衍生物。

在另一实施方案中，L是二酰基甘油衍生物，产生具有如下结构通 式的缀合物：

其中R2和R3是有8-24个碳原子的烃，或在另一实施方案中，有 12-22个碳原子。在另一实施方案中，R2和R3是有同样长度的烃链。

在另一实施方案中，药物选自丝裂霉素C、丝裂霉素A、博来霉素、 阿霉素、柔红霉素、氟代脱氧尿苷、碘代脱氧尿苷、依托泊苷、AZT、 阿昔洛韦、阿糖腺苷、阿拉伯糖基胞嘧啶、喷司他丁、奎尼丁、阿托品、 苯丁酸氮芥、氨甲蝶呤、米托蒽醌、5-氟尿嘧啶。

还有另一实施方案，其中的治疗药物与二硫苄基部分以共价键连接， 形成具有如下结构的缀合物：

其中R4代表治疗药物的残基。

在一个实施方案中，R4的治疗药物残基含有伯或仲胺部分，从而在 二硫苄基和治疗药物之间形成尿烷键。在此实施方案中，治疗药物可以 例如是丝裂霉素C、丝裂霉素A、博来霉素和多肽。

在另一个实施方案中，R4是含有羧基的治疗药物残基，它在二硫苄基 和治疗药物之间形成酯键。在此实施方案中例举性的药物包括苯丁酸氮 芥和甲氨蝶呤。

在另一实施方案中，R4的治疗药物残基含有羟基部分，因而在二硫 苄基和治疗药物之间形成碳酸酯的键。在此实施方案中，例举药物包括 氟代脱氧尿苷、碘代脱氧尿苷、依托泊苷、AZT、阿昔洛韦、阿糖腺苷、 阿拉伯糖基胞嘧啶、喷司他丁、奎尼丁、米托蒽醌和阿托品。

另一方面本发明包括一种脂质体组合物，其中含有由形成微囊的脂 质构成的脂质体，它包括约1-约30摩尔百分比的缀合物，缀合物有 上述通式结构。治疗药物在体内对生理条件或人为地导致的条件产生反 应，从缀合物释放。

在另一方面，本发明包括一种将药物保留在脂质体中的方法，包括： 制备由形成微囊(Vesicle)的脂质和约1-约30摩尔百分比的上述缀 合物构成的脂质体。脂质体有效地将药物保留在脂质体中直至对生理条 件或人为地导致的条件产生反应，从缀合物释放。

当结合附图阅读了以下详细的描述之后，将更全面地领会本发明的 这些和其他目的及特征。

对附图的简要说明

图1显示了制备对位-二酰基二甘油-二硫苄醇的合成反应流程，产物 将用于进一步与含胺、羟基或羧基的药物反应；

图2A显示了使含有胺基的药物连接到反应性的二酰基二甘油-二硫 苄基碳酸酯上的一般反应流程；

图2B显示了图2A所示的缀合物的硫解裂解后的产物；

图3A制备二酰基二甘油-二硫苄基-5-氟尿嘧啶缀合物的合成反应 流程；

图3B显示了图3A所示的缀合物的硫解裂解后的产物；

图4显示了制备二酰基二甘油-二硫苄基-5-氟尿嘧啶缀合物的另一 备选择性的合成反应路线及该缀合物硫解裂解后的产物；

图5显示了制备二酰基二甘油-二硫苄基-苯丁酸氮芥缀合物的合成 反应流程及缀合物硫解裂解后的产物；

图6A显示了制备二酰基二甘油-二硫苄基-丝裂霉素C缀合物的合 成反应流程；

图6B显示了图6A所示的缀合物硫解裂解后的产物；

图7显示了制备胆固醇二硫苄基-丝裂霉素-C缀合物的合成反应流 程；

图8显示了制备胆固醇二硫苄基-丝裂霉素-C缀合物的另一合成反 应流程；

图9A-9C显示了三种脂质-二硫苄基-丝裂霉素-C缀合物，对位-二 硬脂酰基-DTB-丝裂霉素-C(图9A)，对位-二棕榈酰-DTB丝裂霉素-C (图9B)和邻位二棕榈酰基-DTB-丝裂霉素-C(图9C)的结构；

图10A-10B是由HSPC/mPEG-DSPE/脂质-DTB-丝裂霉素C(图10A) 和HSPC/胆固醇/mPEG-DSPE/脂质-DTB-丝裂霉素C(图10B)构成的脂 质体的HPLC色谱图，其中每个图显示的一系列色谱都是在半胱氨酸存 在的条件下脂质体温育时间的函数；

图11此图形显示了从由HSPC/mPEG-DSPE/脂质-DTB-丝裂霉素 C(闭合的菱形)和HSPC/胆固醇/mPEG-DSPE/脂质-DTB-丝裂霉素C(闭 合的环)构成的脂质体释放的丝裂霉素C的百分比，是在有半胱氨酸存 在的条件下温育时间的函数；

图12A-12B，这些图形显示了从由HSPC/mPEG-DSPE/脂质-DTB-丝 裂霉素C(图12A)和HSPC/胆固醇/mPEG-DSPE/脂质-DTB-丝裂霉素 C(图12B)的构成脂质体释放的丝裂霉素C的百分比，是在有150μM(闭 合的符号)和1.5mM(开放的符号)浓度的半胱氨酸存在的条件下温育时 间的函数；

图13此图显示了M109细胞的生长速度，表示为在没有药物和半胱氨 酸的条件下M109细胞生长的百分比，是丝裂霉素C的量的函数，丝裂霉 素C分别为游离的丝裂霉素C(开放的三角)、由SPC/mPEG-DSPE/脂质 -DTB-丝裂霉素C(闭合的方块)构成的脂质体，由HSPC/胆固醇 /mPEG-DSPE/脂质-DTB-丝裂霉素C(开放的环)构成的脂质体，丝裂霉 素C的单位为nM；

图14A此图显示了M109细胞的生长速度，表示为在没有药物或半胱氨 酸的条件下M109细胞生长的百分比，是nM浓度的丝裂霉素C的量的函 数。显示的是分别用游离态的丝裂霉素C(开放的三角)和游离态丝裂 霉素C加1000μM半胱氨酸(封闭的三角)处理的细胞。也显示了用由 HSPC/PEG-DSPE/脂质-DTB-丝裂霉素C构成的脂质体制剂(开放的环) 和加入浓度为150μL(开放的菱形)、500μM(封闭的圆)和1000μM (开放的正方形)的另外半胱氨酸的脂质体制剂处理的细胞；

图14B此图显示了M109细胞的生长速度，表示为在没有药物或半胱氨 酸的条件下M109细胞生长的百分比，是nM浓度的丝裂霉素C的数量的函 数。显示的是分别用游离态的丝裂霉素C(开放的三角)和游离态丝裂 霉素C加1000μM半胱氨酸(封闭的三角)处理的细胞。也显示了用由 HSPC/胆固醇/mPEG-DSPE/脂质-DTB-丝裂霉素C构成的脂质体制剂(开 放的圆)和加入浓度为150μM(开放的菱形)、500μM(封闭的圆)和 1000μM(开放的正方形)的另外半胱氨酸的脂质体制剂处理的细胞；

图15显示了在体外实验中，在各种浓度的半胱氨酸存在的条件下， 游离丝裂霉素C(封闭的正方形)、与由HSPC/胆固醇/mPEG-DSPE/脂质 -DTB-丝裂霉素C的构成脂质体(封闭的圆)，和由HSPC/mPEG-DSPE/脂 质-DTB-丝-裂霉素C的脂质体(开放的三角)结合的丝裂霉素C对M109细 胞的细胞毒性的增长百分率(用(IC50无半胱氨酸/IC50半胱氨酸)×100)计算得 到)；

图16A显示了丝裂霉素C在大鼠血液中的浓度，它是静脉注射游离的 丝裂霉素C(开放的正方形)、由HSPC/胆固醇/mPEG-DSPE/脂质-DTB- 丝裂霉素C构成的脂质体(封闭的菱形)，和由HSPC/mPEG-DSPE/脂质 DTB-丝裂霉素C构成的脂质体(封闭的圆)之后以小时表示的时间的函 数；和

图16B显示了注射剂量在大鼠血液中剩余的百分比，是静脉注射游 离的丝裂霉素C(开放的正方形)、由HSPC/胆固醇/mPEG-DSPE/脂质 -DTB-丝裂霉素C构成的脂质体(封闭的菱形)，和由HSPC/mPEG-DSPE/ 脂质-DTB-丝裂霉素C构成的脂质体(封闭的圆)之后以小时表示的时间 的函数。

本发明的详细描述

I.定义

短语“适于掺入脂质体的脂质双层结构中的疏水部分”指含有能与 脂质体的脂质双层结构的疏水性双层区域整合的疏水性部分的任何材 料。这些疏水性部分典型地是脂质，包括有一个疏水性脂质尾和一个亲 水的极性头的两亲的脂质，如磷脂和二酰基甘油。也包括甘油三酯、甾 醇，磷脂、二酰基甘油、甾醇和甘油三酯的衍生物及其他天然来源或合 成制备的脂质。

术语“残基”用在“治疗药物残基”中指已经反应与另一分子成键 的药物分子，其中药物分子中的至少一个原子被取代或失去而形成了连 接键。

“多肽”在此处指氨基酸的聚合物，它不指氨基酸聚合物的一个特 定的长度。因此，例如术语肽、寡肽、蛋白质和酶都在多肽的定义范围 之内。此术语也包括多肽的后表达的修饰体，例如，糖基化、乙酰基化、 磷酸化等。

本文使用以下缩写：PEG，聚合(乙二醇)；mPEG，甲氧基-PEG；DTB， 二硫苄(dithiobenzyl)基；DSPE，二硬脂酰磷脂酰基乙醇胺；HSPC，氢 化大豆磷脂酰胆碱；MMC，丝裂霉素C。

II.缀合物组合物及其制备方法

一方面，本发明包括以下形式的缀合物：

其中L是疏水的部分，适于掺入脂质体的脂质双层结构中，R1代表治 疗药物残基，以共价键连接在二硫苄基部分，且其中CH2R1基团的取向选 自邻位和对位。疏水性部分L典型地是如二酰基甘油、甾醇、磷脂等脂 质及这些脂质的衍生物，其他天然存在的脂质及其合成的类似物。

在缀合物中，通过共价键将治疗药物连接到二硫苄基部分，因而形 成了药物残基，在结构中表示为R1。此连接键随药物和反应化学而变化， 能够被本领域的技术人员所理解。在优选实施例中，治疗药物通过选自 尿烷、胺、酰胺、碳酸酯、硫代碳酸酯、醚和酯的键共价地连接到二硫 苄基部分。

尿烷键的形式为O(C＝O)NH-R4或O(C＝O)N＝R4，其中R4代表治疗药物 残基。例如，一种含有伯或仲胺的药物，如可以列举几种如丝裂霉素C、 丝裂霉素A、博来霉素和治疗性的多肽，它们反应形成与药物的胺基部 分的尿烷键。

碳酸酯连接键的形式为O(C＝O)O-R4，其中R4代表药物残基，碳酸 酯连接键衍生于药物的酚或醇或羟基部分。硫代-碳酸酯的形式为 O(C＝O)S-R4，其中R4代表药物残基，并且此连接键衍生于药物的一部 分。具有这样的部分而与二硫苄基醇反应形成碳酸酯连接键的典型的药 物包括：氟代脱氧尿苷、碘代脱氧尿苷、依托泊苷、AZT、阿昔洛韦、 阿糖腺苷、阿拉伯糖基胞嘧啶、喷司他丁、奎尼丁、米托蒽醌和阿托品。

酯键的形式为O(C＝O)-R4，其中R4代表药物残基。与治疗药物的羧 酸部分反应形成此键，以下记载了具有在苯丁酸氮芥和二硫苄基之间酯 键的缀合物的例子。甲氨蝶呤是另一个能够与缀合物的二硫苄基部分形 成酯键的药物的例子。

有尿烷、碳酸酯或酯键将药物连接到二硫苄基部分的缀合物，一般 可以用如下结构表示：

其中R4代表治疗药物残基。

在另一实施例中，缀合物包括一醚键，其形式为O-R4，其中R4代 表治疗药物残基。一般从与药物上的醇官能团反应而得到此连接键。

胺键的形式为N＝R4，其中R4代表药物残基，此键直接与二硫苄基 的CH2部分连接，在药物中有一个N。以下将记载与药物5-氟尿嘧啶形 成的缀合物，其中形成了一个胺键。也可以与作为治疗药物的肽形成胺 (amide)键，其中氨基酸残基-如天门冬氨酸或谷氨酸-的游离的羧 基，与二硫苄基胺缩合。

酰胺键的形式为NH(C＝O)-R4，其中R4代表药物残基。

图1显示了按照本发明制备示范性的缀合物的合成路线。在此实施 方案中，制备合成中间体对位-二酰基二甘油二硫苄醇(化合物IV)， 并进一步与选择的治疗药反应。按实施例1所述的方法制备化合物IV， 通过3-巯基-1，2-丙二醇(化合物I)与过氧化氢反应生成外消旋 (rac)-3，3’-二硫双(1，2-丙二醇)(化合物II)。用疏水性部分R 对外消旋3，3’-二硫双(1，2-丙二醇)酰化。例如，R可以是约有8-24 个碳原子的脂肪酸。实施例1详述了此反应过程，其中R是硬脂酸。在另 一实施方案中，R是约有12-22个碳原子的脂肪酸。化合物II的酰化产 生外消旋3，3’-二硫双(1，2-丙烷二硬脂酰)(化合物III)，它与磺酰氯 和4-巯基苯甲醇反应生成所需的中间体产物，对位二酰基二甘油-二硫 苄醇(化合物IV)。化合物IV与含有反应性的羧基部分(R’CO2H)的药物 容易地反应，形成脂质-二硫苄基(DTB)-药物缀合物，其中该药物通过 酯键掺入DTB中(化合物V)。化合物IV也与含有反应性的胺基部分 (R’-NH2)的药物容易地反应，产生脂质-DTB-药物缀合物，其中药物通 过尿烷键掺入DTB中(化合物VI)。化合物IV也与含有反应性的羟基部分 (R’OH)的药物容易地反应，产生脂质-DTB-药物缀合物，其中药物其中 通过碳酸酯键掺入DTB中(化合物VII)。

考察了各种药物用在本发明缀合物中。本发明特别考虑有适于反应 的胺基(NH或NH2)、羧基、巯基或羟基部分的药物。“适于反应”用于 此处意味着药物有一个所列举的能与以例如二硫苄醇的形式存在的二 硫苄基部分反应的部分。示例性的药物包括5-氟尿嘧啶，它有一个适于 反应的NH基团；苯丁酸氮芥，有一个反应性的羧基；丝裂霉素C，有一个 反应性的胺(氮丙啶基团)。用这些药物说明本发明的示例性的实施例 的合成，并根据图3-9进行讨论。其他打算使用的示例性药物包括丝裂 霉素C、丝裂霉素A、博来霉素、阿霉素、柔红霉素、氟代脱氧尿苷、碘 代脱氧尿苷、依托泊苷、AZT、阿昔洛韦、阿糖腺苷、阿拉伯糖基胞嘧 啶、喷司他丁、奎尼丁、阿托品、苯丁酸氮芥、甲氨蝶呤、米托蒽醌和 5-氟尿嘧啶。可以理解的是多肽、氨基糖甙、生物碱也适于用于本发明。

例1也详述了制备邻位二酰基二甘油二硫苄醇的反应条件，它可以 作为用于形成缀合物的中间体化合物。

图2A-2B显示了脂质-DTB-药物缀合物的制备(图2A)，和在还原剂 存在的条件下缀合物的硫解裂解(图2B)。如图2A所示，图1的化合物 VII，其中疏水性部分R得自脂肪酸R”(CO)OH，如硬脂酸(CH3(CH2) 16CO2H)，在有碳酰氯(COCl2)存在的条件下，与含有胺的药物，即H2N- 药物反应。此反应产生图2A所示的脂质-DTB-药物缀合物。此缀合物在 暴露于还原条件下时，即有还原剂如半胱氨酸或谷胱甘肽时，分解产生 图2B所示的产品。如图所示，缀合物的硫解裂解再生出未经修饰的、天 然状态的药物。这是所需的特点，因为，如下所示，缀合物中的药物可 以容易地掺入对接受治疗者体内给药所用的脂质体中。另外，同样如下 所示，缀合物形式的药物是无毒的。给药后并暴露于内源性或外源性还 原剂之下时，缀合物分解产生原始状态具有生物活性的药物。

在图3A中，图示了制备5-氟尿嘧啶缀合物的合成路线。化合物IV， 对位-二酰基-二甘油-二硫苄醇，与对位-甲苯磺酰氯反应产生中间体化 合物IX。与5-氟尿嘧啶阴离子或钠盐(化合物X)产生所需的脂质 -DTB-5-氟尿嘧啶缀合物(化合物XI)。图3B显示了脂质-DTB-5-氟尿 嘧啶缀合物(化合物XI)在暴露于还原剂R’-SH时的分解反应。此缀合 物的硫解裂解再生出未修饰状态的5-氟尿嘧啶。

图4显示了制备二酰基二甘油-DTB-5-氟尿嘧啶缀合物的另一种可选 的合成反应路线。在图4中，1-氯乙基氯甲酸酯(化合物XII)与对位- 二酰基-二甘油-二硫苄醇(化合物IV)反应，产生反应性的氯乙基碳酸 酯-DTB-二酰基二甘油中间体(化合物XII)。中间体随后在有三乙醇 胺(TEA)存在的条件下与5-氟尿嘧啶反应，产生脂质-DTB-5-氟尿嘧 啶缀合物(化合物XIV)。图4也显示了此缀合物的硫解裂解和5-氟尿 嘧啶的再生。

图5显示了缀合物的另一个实施方案。在此实施方案中，一个含有反 应性羧基部分的药物-苯丁酸氮芥(化合物XV)，在存在1，3-二环己 基碳化二亚胺(DCC)和二甲基氨基吡啶(DMAP)的条件下，与对位- 二酰基-二甘油-二硫苄醇(化合物IV)反应，产生脂质-DTB-苯丁酸氮 芥缀合物(化合物XVI)。暴露于还原剂之下时，缀合物硫解产生所示 的产品。苯丁酸氮芥随后再生成未经修饰的形态。

图6A显示了按本发明的另一实施例合成缀合物的方法。在所示的反 应路线中，丝裂霉素C(化合物XVII，图6B)，一种含有反应性胺部分 的药物，在有碳酰氯的条件下与对位-二酰基-二甘油二硫苄醇(化合物 IV)反应产生二酰基二甘油-二硫苄基-丝裂霉素-C缀合物(化合物 XVIII)。例2提供了此合成的详细步骤。

图6B显示了二酰基二甘油-DTB-丝裂霉素C缀合物的硫解。在有还原 剂的条件下，缀合物分解再生成丝裂霉素C(化合物XVII)和其他所 示的产物。

如上所述，缀合物的疏水性部分可以选自任何数目的疏水性部分， 如，脂质。在以上各例中，用二酰基二甘油脂质生成具有如下结构的缀 合物：

其中R2和R3是有约8-24个碳原子的烃。

除二酰基甘油作为疏水性部分外，也考虑了其他脂质。图7显示了另 一实施例，其中使用胆固醇作为缀合物中的疏水性部分。胆固醇(化合 物XIV)在有三乙醇胺(TEA)存在的条件下，与二氯甲烷中的甲磺酰氯 反应。然后将产生的中间体转化成巯基衍生物，最终成为主要的二硫苄 醇，以与上述二酰甘油相似的方式连接丝裂霉素C。

另一个可选的制备胆固醇-DTB-丝裂霉素C-缀合物的流程示于图8。 甲氧基羰基二硫乙胺直接与胆固醇反应生成尿烷键。用巯基苄醇得到 DTB-胆固醇化合物。按上述并示于实施例2的方式连接丝裂霉素C。

本领域的技术人员可以理解，各种上述缀合物仅作为示例。可以考 虑宽范围的各种其他疏水性部分和其他药物，如阿霉素和柔红霉素，并 适用于本发明中。在以下其他支持本发明的研究中，使用按图6A制备 的缀合物，化合物XVII、对位-二硬脂酰-DTB-丝裂霉素C。为方便于 参考，此缀合物示于图9A。可以理解的是可以使用其他二酰基脂质， 如二棕榈酰基脂质，图9B显示了对位-二棕榈酰基-DTB-丝裂霉素C缀 合物。也认识到缀合物也可以有一个异构键。通过图9C所示的邻位- 二棕榈酰基-DTB-丝裂霉素C缀合物可以显而易见地看到。

III.制备含有缀合物的脂质体

另一方面，本发明包括一种由形成微囊的脂质和上述缀合物构成的 脂质体组合物。脂质体是的被封闭的脂质微囊，用于各种治疗目的，尤 其用于通过脂质体的系统给药将治疗剂携带到达靶区域或细胞。特别 地，表面有亲水的聚合物链包裹的脂质体，如聚乙二醇(PEG)，适于 作为药物载体，因为这种脂质体提供一个比缺少聚合物包衣的脂质体延 长的血液循环寿命。聚合物作为血液蛋白质的屏障，阻止蛋白质的汇集 和脂质体的识别，防止脂质体被巨噬细胞和网状内皮系统的其他细胞摄 取和清除。

根据本发明，脂质体包括与脂质结合的缀合物，在一个实施例中， 所说的脂质是形成微囊的脂质，和可任选地其他双层成分。“形成微囊 的脂质”是在水中自发地形成双层微囊的脂质。形成微囊的脂质优选有 两个烃链-典型地是酰基链，和极性的端基基团。本领域已知有各种合 成的形成微囊的脂质和天然存在的形成微囊的脂质，其中两个烃链一般 地具有12-24个碳原子的长度，并且有各种不同的不饱和度。脂质的 例子包括磷脂，如磷脂酰胆碱(PC)，磷脂酰基胆胺(PE)，磷脂酸(PA)， 磷脂酰肌醇(PI)，和鞘磷脂(SM)。优选用于本发明的脂质是氢化大豆 磷脂酰胆碱(HSPC)。另一类优选的脂质是二酰甘油。这些脂质可以由 市售得到或按已公开的方法制备。

可以选择形成微囊的脂质以达到一定的流动度或刚度，以控制脂质 体在血清中的稳定性，并控制在脂质体中的截留药物的释放速度。可以 通过加入一种相对刚性的脂质，例如，有相对高的相转化温度-例如高 达约80℃-的脂质，制备有更坚硬的脂质双层或液态结晶的双层的脂 质体。刚性的脂质，如，饱和的脂质，为脂质双层提供更大的膜刚性。其 他脂质成分，如胆固醇，也已知对脂质双层结构的膜的刚性具有贡献。

通过加入相对流动性的脂质实现脂质的流动性，典型地是一种有相 对低的液态-液态结晶相转化温度-例如等于或低于室温(约20-25 ℃)-的脂质相的。

脂质体也可以包括其他可以掺入在脂质双层中的成分，例如甾醇。 这些其他的成分典型地有与双层膜的内部疏水性区域接触的疏水性的 部分，和指向及膜的外部的极性表面的极性端基部分。

本发明的脂质体的另一脂质成分，是用亲水性聚合物衍生的形成微 囊的脂质。在此脂质成分中，衍生的脂质导致在脂质双层表面的内部和 外部形成覆盖亲水性聚合物链的表面。典型地，脂质成分中包括约1- 20摩尔百分比的衍生的脂质。

适于衍生形成微囊的脂质的亲水的聚合物包括聚乙烯吡咯烷酮、聚 乙烯甲醚、聚甲基噁唑啉、聚乙基噁唑啉、聚羟基丙基噁唑啉、聚羟丙 基甲基丙烯酰胺、聚甲基丙烯酰胺、聚二甲基丙烯酰胺、聚羟丙基甲基 丙烯酸酯、聚羟乙基丙烯酸酯、羟甲基纤维素、羟乙基纤维素、聚乙二 醇和聚门冬酰胺。可以用这些聚合物作为共聚物或作为嵌段共聚物或无 规共聚物。

优选的亲水聚合物链是聚乙二醇(PEG)，优选分子量在约500-约 10000道尔顿的聚乙二醇链，优选分子量在约1,000-5,000道尔顿。 甲氧基或乙氧基封端的PEG类似物也是优选的亲水性聚合物。这些聚合 物可以市售得到，有多种聚合物大小，例如约12-220,000道尔顿。

本发明的脂质体典型地包括约1-30摩尔百分比的脂质-DTB-药物 缀合物，优选5-30摩尔百分比，更优选5-20摩尔百分比。在所进 行的支持本发明的研究中，按实施例4A-4B所示的方法制备了脂质体 和图9A所示的缀合物，对-二硬脂酰基-DTB-丝裂霉素C(化合物 XVIII)，这些脂质体由形成微囊的脂质氢化大豆磷脂酰胆碱(HSPC)， 和用甲氧基-聚乙二醇衍生的二硬脂酰基磷脂酰基乙醇胺(mpEG-DSPE) 构成。其中一种脂质体制剂包括胆固醇(例4A)，脂质HSCP/胆固醇 /mPEG-DSPE/对位-二硬脂酰基-DTB-丝裂霉素C(化合物XVIII)的摩 尔比为60/30/5/5。制备并表征了第二种不含胆固醇的制剂(例4B)。 在这些制剂中，脂质HSCP/mPEG-DSPE/对位-二硬脂酰基-DTB-丝裂霉 素C(化合物XVII)的摩尔比为90/5/5。

IV.体外表征含有缀合物的脂质体

A.体外药物释放

按例4A-4B的方法制备脂质体，并在体外对其表征以确定其暴露于 还原剂后释放丝裂霉素C的速度。对于体外研究，通过向反应介质中加 入半胱氨酸产生还原条件，一般的浓度为150μM。可以理解，在体内， 内源性的还原条件可能足以影响脂质-DTB-药物缀合物释放药物的分 解反应。进一步考虑到可以通过服用适宜的还原剂而人为地产生体内的 还原条件，如半胱氨酸或谷胱甘肽。

脂质体制剂，如，HSPC/胆固醇/mPEG-DSPE/缀合物化合物XVIII (以下称为“含有胆固醇的制剂”)和HSPC/mPEG-DSPE/缀合物化合物 XVIII(以下称为“无胆固醇的制剂”)在37℃和有150μM半胱氨酸 的条件下培养24小时。在选定的时间点取出样品并用高效液相法分析 (HPLC)，对缀合物和游离的丝裂霉素C定量。实施例5记载了高效液相 的条件。

图10A-10B显示了2个脂质体制剂的HPLC色谱。在图10A中显示没有 胆固醇的脂质体的制剂的结果。在“0”时，没有可以检测到的游离丝 裂霉素C，所有可测定的药物以脂质-DTB-药物缀合物的形式存在，脂 质体结合的。随着温育时间的延长，从脂质体中释放，且以游离态存在 的可测定的丝裂霉素C的数量增加，以缀合物-结合态存在的丝裂霉素C 相应减少。

图10B显示了含有胆固醇的脂质体制剂的测定结果。在0时取得的 第一份样品，没有可检测的游离丝裂霉素C。在150μM半胱氨酸中保 温1小时后，可以测出少量的游离药物，显示了脂质体-结合的脂质 -DTB-丝裂霉素缀合物的分解。与图10A相比，含有胆固醇的脂质体有 较慢的缀合物分解速度和相应较慢的药物释放。

图11显示了从两种脂质体制剂中释放的丝裂霉素C的百分比，按 图10A-10B的色谱方法测得。无胆固醇的脂质体(封闭的菱形)的释 放速度高于含胆固醇的脂质体(封闭的圆)。无胆固醇的制剂在2小时后 从脂质体-结合缀合物释放了多于50％的丝裂霉素C。对于两种制剂， 在24小时的保温时间结束时，多于80％的药物得到释放。

在另一个研究中，将两种脂质体制剂在1.5mM半胱氨酸中保温。按 实施例5所述进行分析，结果示于图12A-12B。图12A显示了从掺入在 无胆固醇的脂质体中的脂质-DTB-药物缀合物(HSPC/PEG-DSPE/脂质 -DTB-丝裂霉素C)释放的丝裂霉素C百分比。也显示了在用150μM 保温过程中释放的百分比(封闭的菱形)，以此作为对比。可以看到，在 高浓度的还原剂中保温(1.5mM，开放的菱形)，导致缀合物分解速度和 药物释放速度提高。

图12B显示了含有胆固醇的制剂的结果。在1.5mM(开放的圆)中 保温的脂质体，其分解速度显著高于在150μM半胱氨酸(封闭的圆) 中保温的同样的脂质体。

B.体外细胞毒性

用M-109细胞，一种小鼠肺癌细胞系，评价了含有脂质-DTB-丝裂 霉素C缀合物(化合物XVIII)的脂质体的体外细胞毒性。如例6所述， 在游离丝裂霉素C或含有二硬脂酰-DTB-丝裂霉素C缀合物的脂质体中 使M109保温。测试了按例4A-4B方法制备的脂质体，其摩尔比为例6A 所述。将浓度为150μM、500μM和1000μM的半胱氨酸的加到一些受 试细胞中，以影响缀合物的硫解和丝裂霉素C的释放。

如实施例6所述，将导致50％对照生长速度抑制的药物浓度定义为 IC50值(IC50)。结果示于表1。

表1

在连续暴露于制剂中培养72小时后，M109肿瘤细胞的IC50值

1MMC＝丝裂霉素C

2HSPC/胆固醇/mPEG-DSPE/二硬脂酰-DTB-MMC(90/45/5/5)

3HSPC/mPEG-DSPE/二硬脂酰-DTB-MMC(90/5/5)

4n.d.＝未测

在细胞毒性研究中测定的M109小鼠肿瘤细胞的生长速度百分比示于 图13。生长速度百分比表示为相对于在无丝裂霉素C和半胱氨酸的条件 下M109细胞的生长速度的百分比，将其表示为nM数量级的丝裂霉素C浓 度的函数。按实施例6的方法测定细胞的生长速度。可以看到，随着半 胱氨酸浓度的升高，含有胆固醇的(开放的圆)和不含胆固醇的(封闭的 正方形)脂质体的制剂均使细胞生长速度降低。还可以看到，半胱氨酸 对游离丝裂霉素C的活性没有影响，从缀合物释放的丝裂霉素C能够有效 抑制细胞生长。

用游离态丝裂霉素C或以脂质体结合的脂质-DTB-药物缀合物形式 存在的丝裂霉素C处理的M109小鼠肿瘤细胞体外生长速度示于图 14A-14B。在图14A中，显示了不含胆固醇的脂质体制剂的结果。在此 图中，M109细胞的生长速度表示为相对于在无药物和半胱氨酸的条件 下M109细胞生长速度的百分比，将其表示为nM数量级的丝裂霉素C 浓度的函数。用游离的丝裂霉素C处理的细胞(开放的三角)和用游离的 丝裂霉素C加1000μM半胱氨酸(封闭的三角)处理的细胞显示生长速 度的降低，这是由于游离态药物的毒性所致。用含有 HSPC/PEG-DSPE/DSPE-DTB-丝裂霉素C的脂质体制剂(开放的圆)和用 此制剂与另外的半胱氨酸处理的细胞显示出半胱氨酸剂量依赖性的细 胞毒性，半胱氨酸的加入浓度为150μM(开放的菱形)、500μM(封 闭的圆)和1000μM(开放的正方形)。

图14B是含有胆固醇的脂质体制剂的类似的图。用含有胆固醇的脂 质体加另外的半胱氨酸处理的细胞显示出同样的结果，半胱氨酸的加入 量为150μM(开放的菱形)、500μM(封闭的圆)和1000μm(开放的正方 形)。随着半胱氨酸浓度的增加细胞生长速度降低。这表明半胱氨酸- 导致的丝裂霉C的释放与半胱氨酸浓度有直接的关系。与脂质体制剂相 反，用游离丝裂霉素C处理的细胞的体外生长速度(开放的三角)与用 游离丝裂霉素C加另外的1000μM半胱氨酸(封闭的三角)处理的细胞 的生长速度相同。

图15显示了游离丝裂霉C和脂质体制剂的细胞毒性增长百分比为μM 表示的半胱氨酸浓度的函数。由IC50百分比的降低能够确定细胞毒性的 增加，例如，有半胱氨酸存在的IC50相当于无半胱氨酸的IC50乘以100 ((IC50无半胱氨酸/IC50半胱氨酸)×100))。可见，随着半胱氨酸浓度增 加，无论是含有胆固醇的脂质体制剂(开放的三角)还是无胆固醇的脂 质体制剂(封闭的圆)，细胞毒性的百分比显著增加。游离丝裂霉素C(封 闭的正方形)的细胞毒性不受半胱氨酸的影响。

细胞毒性数据显示无胆固醇的脂质体制剂受到半胱氨酸更多的影 响。在确定的半胱氨酸浓度下，无胆固醇的脂质体制剂的IC50仅为游离 药物的1/2。含有胆固醇的脂质体制剂比无胆固醇的脂质体制剂细胞毒 性低。数据也显示半胱氨酸对肿瘤细胞没有细胞毒效应，对游离丝裂霉 素C的细胞毒性没有影响。从此数据也显然可以看到半胱氨酸以剂量依 赖型的方式增加脂质体-结合丝裂霉素C的毒性。因此，从脂质体制剂观 察到的细胞毒效应大部分是由于半胱氨酸介导的丝裂霉素C从脂质 -DTB-药物缀合物中的释放。

C.体内药动学

在大鼠体内测定了含有胆固醇的脂质体和无胆固醇的脂质体制剂的 体内药动学。如实施例7所述，用单一的浓注剂(a single bolus) 对动物静脉内注射，输入约0.1mg/mL游离态的丝裂霉素C，或掺入在 本发明的脂质-DTB-丝裂霉素C缀合物形式的脂质体中的丝裂霉素C。 注射后，采取血样并分析丝裂霉素C的数量。结果示于图16A-16B。

图16A显示大鼠血液中丝裂霉素C的浓度(μg/mL)，是静脉注射后 20小时表示的时间的函数。如看到的，静脉给药的游离的丝裂霉素C(开 放的正方形)从血液中快速清除。以脂质体-结合脂质-DTB-药物缀合 物形式的丝裂霉素C在循环中保持显著更长的时间。测得与含有胆固醇 的脂质体结合的丝裂霉素C(封闭的菱形)和与无胆固醇的脂质体结合 的丝裂霉素C(封闭的圆)在20-25小时内血液中的浓度大于10μg/mL。

图16B显示保留在血液中的注射的剂量百分比为静脉注射试验制剂 后以小时表示的时间的函数。事实上，在长于5分钟的时间点血液中已 实际上没有游离的丝裂霉素C(开放的正方形)。然而，在注射脂质体制 剂后20小时，还有约15-18％剂量的丝裂霉素C存在于血液循环中。这 显示在血液循环中丝裂霉素C-DTB-脂质缀合物在脂质体中保持稳定， 在血浆中仅有最小的硫解分解。因此，此系统显示与长循环的脂质体 脂质体)相容，它有延长的血液循环寿命，并能加强在肿瘤 部位的聚集。

V.实施例

以下实施例进一步说明本发明而不限制本发明的范围。

材料

所有材料均由市售途径得自于适宜的销售商，如Aldrich公司。

实施例1

对位-二酰基二甘油二硫苄醇(化合物IV)和邻位-二酰基二甘 油二硫苄醇的合成

A.对位-二酰基二甘油二硫苄醇

本反应示于图1。按照Snyder，W.R.(类脂研究杂志，28：949(1987)) 的过程制备化合物II和III。

将一100ml圆底烧瓶中，用5ml水溶解3-巯基-1，2-丙二醇(化合 物I，1g，9.26mmol)，置于冰浴上。向此快速旋转的烧瓶中滴加过 氧化氢(精确地0.5摩尔等当量，525μl，4.63mmol)，同时保温30-40 ℃。放热过程结束时，将反应物在室温搅拌过夜。连续加入20ml等份的 乙腈，旋转蒸发使水共沸。加入乙腈的过程重复3-4次或直至除去所 有的水，得到澄清的油状物。用金属刮铲刮取烧瓶中的物质，在-20℃ 冷却过夜，油状产物固化(化合物II，外消旋-3，3’-二硫双(1，2-丙二 醇))。真空条件下用P2O5干燥似白垩质的固体，产率：630mg，63％。 1HNMR(CD3OD，360MHz)δ 2.77，2.95(2×d，CH2OH，2H)， 3.59(M，SCH2，2H)，3.87(m，CH，1H)ppm。

将外消旋-3，3’-二硫双(1，2-丙二醇)产物(化合物II)(980 mg，4.6mmol)加入烘干的100mL圆底烧瓶中，溶解在二氯甲烷中 (40mL)，使其酰化。向其中加入硬脂酸(4.92g，17.1mmol)和4-二 甲氨基)吡啶葎4-苯甲基磺酸酯(1.38g，4.6mmol)作为催化剂，在 室温搅拌(250C)20分钟。然后用移液管加入二异丙基碳化二亚胺 (3.1mL，20mmmol)，在室温反应过夜。以GF(10％乙酸乙酯己烷溶液) 展开的硅胶TLC显示二醇基团已完全反应(外消旋-3，3’-二硫双 (1，2-丙二醇)Rf＝0.60；外消旋-3，3’-二硫双(1，2-丙烷二硬脂 酰)Rf＝0.35)。在反应混合物中加入 A-21弱碱性离子交 换树脂(-3g)和 15强酸性离子交换树脂(-3g)。振荡30 分钟后，将残余物过滤并将滤液干燥。用异丙醇(每次100mL)将残余 物重结晶3次。收集固体产物外消旋-3，3’-二硫双(1，2-丙烷二硬 脂酰)(化合物III)并用P2O5干燥。产率：70％，4.1g。熔点54-55℃。 1HNMR(CDCl3，360MHz)δ 0.86，(t，CH3，6H)，1.22(s，脂质，56H)， 1.48(m，CH2CH2(CO)O，4H)，2.26(2xt，CH2(CO)O，4H)，2.87(d， CH2S，2H)，4.03 & 4.22(2×d，脂质的CH2CH，2H)，4.97(m，脂质 的CHCH2)ppm。

在下一步中，外消旋-3，3’-二硫双(1，2-丙烷二硬脂酰)(化合 物III)(2.97g，2.33mmol)的溶液溶解在甲苯(30mL)中中并置于 冰浴上。用移液管取磺酰氯(1.9mL，23.2mmol)加入烧瓶中，将混合 物在冷的冰浴温度下搅拌30分钟。然后将烧瓶置于室温再搅拌30分钟。 用旋转蒸发器除去过量的磺酰氯。在反应烧瓶中加入等份新鲜的甲苯 (20mL)，并置于冰浴上。慢速向其中加入4-巯基苄醇(780mg，5.6 rnmol)的甲苯溶液。反应5小时后，用旋转蒸发器将所有溶剂蒸发至 干。向反应烧瓶中加入热的乙酸乙酯(10mL)溶解其中的固体，并过 滤除去不溶物。向乙酸乙酯溶液中加入50mL乙醚以产生沉淀，过滤 收集固体产物对位-二酰基二甘油-二硫苄醇，化合物IV)。此过程重 复2次，产率：75％。

为纯化产物对位-二酰基二甘油-二硫苄醇(化合物IV)，制备用氯仿 洗脱的硅胶柱(20×2.5cm)。将样品溶解在最少量的氯仿中，加入两种 不同的移动相进行色谱洗脱。首先用100％ CHCL3(100ml)洗脱。此部 分含有不纯的二硫苄醇。用1HNMR加以确认。然后将流动相变为15％甲醇 的氯仿溶液，用快速色谱法收集纯化产物。通过用500ml的 CH3OH:CHCL3(15:85)混合溶液洗脱，收集纯的DGTBA(TLC显示单点)。 蒸发除去溶剂后，用正丁醇对固体冷冻干燥，并用P2O5真空干燥。最终 的纯化使产率降至40％，1.4g。1HNMR：(CDCL3，360MHz)δ 0.86(t， CH3，6H)，1.22(s，脂质，56H)，1.48(m，CH2CH2(CO)O，4H)，2.26(2 ×t，CH2(CO)O，4H)，2.87(d，CH2S，2H)，4.03 & 4.22(2×d，脂质 的CH2CH，2H)，4.69(s，CH2，bz，2H)，4.97(m，脂质D的CHCH2)， 7.36 & 7.56(d，CH2，芳香的，4H)ppm。

用5mg样品进行试验室元素分析(Midwest Micro Lab)。

  分析 理论值 测得值 C 70.93％ 70.67％ H 10.50％ 10.41％ S 8.25％ 8.31％

B.邻位-二甘油二硫苄醇

外消旋-3，3’-二硫双(1，2-丙烷二硬脂酰)(化合物III)(200 mg，0.156mmol)的溶液溶解在甲苯中(30mL)并置于冰浴上。用移液 管取磺酰氯(39μL，0.47mmol)加入烧瓶中，将混合物在冷的冰浴温度 下搅拌30分钟。然后将烧瓶置于室温再搅拌30分钟。用旋转蒸发器除去 过量的磺酰氯。在反应烧瓶中加入等份新鲜的甲苯(20mL)，并置于冰 浴上。慢速向其中加入2-巯基苄醇(48mg，35mmol)的甲苯溶液。反 应5小时后，用旋转蒸发器将所有溶剂蒸发至干。向反应烧瓶中加入热 的乙酸乙酯(10mL)溶解其中的固体，并过滤除去不溶物。向乙酸乙 酯溶液中加入50mL乙醚以产生沉淀，过滤收集固体产物邻位-二酰基 二甘油-二硫苄醇，化合物IV)。此过程重复2次，用P2O5进行真空干燥。 产率：75％，190mg。1HNMR：(CDCL3，360MHz)δ 0.86(t，CH3，6H)， 1.25(s，脂质，56H)，1.58(m，CH2CH2(CO)O，4H)，2.28(2×t， CH2(CO)O，4H)，2.91(d，CH2S，2H)，4.14 & 4.35(2×d，脂质的 CH2CH，2H)，4.86(s，CH2，bz，2H)，5.26(m，脂质的CHCH2)，7.31 (m，芳香性的，2H)，7.48 & 7.75(d，芳香性的，2H)ppm。

实施例2

合成对位-二酰基二甘油二硫苄醇-丝裂霉素C(化合物XVIII)

此反应示于图6A。

在50mL圆底烧瓶中加入碳酰氯(3.1mmol)和甲苯(5mL)，将溶 液冷却至0℃。制备对位-二酰基二甘油-二硫苄醇(化合物IV，按例 1方法制备，0.31mmol)溶于甲苯(2.5mL)的溶液。然后将醇溶液滴 加到碳酰氯溶液中。将混合物加热到室温过夜。18小时后，真空浓缩 溶液以除去过量的碳酰氯。将粗的酰基氯再溶解在甲苯(5mL)中。

制备丝裂霉素C(0.31mmol)、二甲基氨基吡啶(0.031mmol)和DMF (1mL)的溶液。将丝裂霉素C的溶液滴加到酰基氯溶液中。1小时后， 蒸发除去甲苯，在硅胶上用色谱法纯化粗产品(1:1己烷:乙酸乙酯)。 将纯化产物加入正丁醇中(50mL)并冷冻干燥。产物为紫色固体(183 mg，53％)。Rf＝0.38(50％己烷:乙酸乙酯)；1HNMR(360MHz，CDCl3)δ 0.88(t，J＝6.8Hz，6H)，1.26(s，58H)，1.58-1.63(m，4H)， 1.76(s，3H)，2.29(t，J＝7.6Hz，4H)，2.93-2.96(m，2H)， 3.19(s，3H)，3.29(dd，J＝4.7和2.9Hz，1H)，3.41(dd，J＝ 5.0和2.2Hz，1H)，3.48(dd，J＝13.7和2.5Hz，1H)，3.67(dd， J＝11.5和4.7Hz，1H)，(ddd，J＝12.2和5.8和2.5Hz，1H)， 4.27-4.36(m，2H)，4.43(d，J＝13.3Hz，1H)，4.61(s，2H)，4.90 (ddd，3＝10.4和5.0和2.2Hz，1H)，5.00-5.12(m，3H)，5.26-5.30 (m，1H)，7.32(d，J＝8.6Hz，2H)，7.50(d，J＝7.9Hz，2H)； MALDI MS：C62H99N4O11S2Na计算值1164，测得的m/z 1164(M+Na)。

实施例4

脂质体的制备

A.含有胆固醇的脂质体

1.脂质体的制备

将59mg HSPC，14.4mg胆固醇，17.4mg mPEG-DSPE，和7.4mg 对位二硬脂酰-DTB-丝裂霉素C(摩尔比60/30/5/5)加入60-65℃的 1mL乙醇二水合物中，混合约10分钟直至溶解。

将在蒸馏水中溶解有10mM组氨酸和150mM NaCl的水合介质加 热到70℃。

将热的脂质溶液快速滴加到热的(63-67℃)水合介质中，同时加 以搅拌，形成具有不同大小的脂质体的悬浮液。在63-67℃将悬浮液搅 拌1小时。

2.挤出

用安装在Teflon-lined不锈钢容器上的聚碳酸酯过滤筒进行挤出， 对此过程加以控制，将脂质体的大小调整到所需的平均颗粒直径。在挤 塑过程中将脂质体悬浮液保持在63-65℃，时间为6-8小时。

3.渗滤

通过渗滤除去脂质体悬浮液中的乙醇。将组氨酸和氯化钠溶解在无 菌水中而制备组氨酸/氯化钠溶液。将溶液的pH调整到约为7。通过 0.22μm Durapore滤器将溶液过滤。用组氨酸/氯化钠溶液按1:1(v/v) 的比例将脂质体稀释，用聚砜空穴纤维超滤器进行膜渗漉。进行8倍于 组氨酸/氯化钠溶液体积的交换以除去乙醇。在此过程中将流动体的温 度控制在约20-30℃。整个渗漉的时间约为4.5小时。

4.无菌过滤

将脂质体悬浮液加热到33-38℃，并通过0.2μm Gelman Supor聚 醚砜滤器过滤。过滤总时间约为10分钟。

每个步骤后(水合，挤塑，透析和过滤)，用HPLC测定脂质浓度和 缀合物/药物浓度。用动态的光散射测定脂质体颗粒体积，用HPLC测 定在外部悬浮介质中游离的未键合的丝裂霉素C的数量。

1缀合物＝化合物XVIII，对位-二硬脂酰-DTB-丝裂霉素C

2MMC＝丝裂霉素C

B.无胆固醇的脂质体制剂

如上所述用摩尔比为90/5/5的脂质组合物HSPC、mPEG-DSPE和对位 -二硬脂酰-DTB-丝裂霉素C制备脂质体。特定地，将88.5mg HPSC，17.9 mg mPEG-DSPE(PEG MW 2000Daltons)和7.3mg缀合物溶解在1mL 乙醇中。在每步操作之后测定脂质体的体积、脂质和药物浓度和外部悬 浮介质中游离丝裂霉素C的浓度。

1缀合物＝化合物XVIII，对位-二硬脂酰-DTB-丝裂霉素C

2MMC＝丝裂霉素C

实施例5

体外表征的HPLC条件

将按例4A-4B方法制备的脂质体稀释在0.6M辛基(octayl)吡喃葡 萄糖甙。在有150mM半胱氨酸存在的条件下将脂质体在37℃保温。在 0时、30分钟、1小时、2小时、4小时和24小时取出样品。通过HPLC分 析20μL体积的样品，使用Water Symmetry C8 3.5×5cm柱。流速为 1mL/分钟，流动相的梯度变化为：

  开始 10％甲醇 90％ 10mM NaPO4，pH＝7 5分钟 25％甲醇 75％ 10mM NaPO4，pH＝7 10分钟 25％甲醇 75％ 10mM NaPO4，pH＝7 15分钟 100％甲醇 -- 25分钟 100％甲醇 -- 30分钟 10％ 90％ 10mM NaPO4，pH＝7 35分钟 10％甲醇 90％ 10mM NaPO4，pH＝7

实施例6

细胞毒性研究

A.制备脂质体

按例4A-4B的方法制备脂质体，由HSPC/mPEG-DSPE/二硬脂酰基 -DTB-丝裂霉素C(90/5/5)或HSPC/胆固醇/mPEG-DSPE/二硬脂酰基 -DTB-丝裂霉素C(90/45/5/5)构成。脂质体制剂通过0.45μm纤维素 膜无菌过滤，不经过挤塑降低体积的过程。形成脂质体后，在360nm 测定用异丙醇稀释10-20倍的脂质体溶液中的丝裂霉素C的浓度，用 无机磷酸盐测定法测定磷脂的浓度。

含有胆固醇的脂质体的平均直径为275±90nm。不含胆固醇的脂质体 的平均直径为150±50nm。在两种脂质体中磷脂浓度为10μM/mL，丝裂 霉素C在两种制剂中的浓度为120μg/mL。

B.化学敏感性测定和生长速度测定

对前述亚甲蓝染色法(Horowi tz，A.T.等生物化学与生物物理学报， 1109：203-209(1992))进行少许改进，用比色法测定游离丝裂霉 素C或以二硬脂酰基-DTB-丝裂霉素C缀合物的形式掺入在脂质体中的 丝裂霉素C的细胞毒性。完成此测定后，将细胞固定，用亚甲蓝染色测 定法评估细胞。

在此测定中，将在200μl等份(RPMI-1640介质+10％胎牛血 清)介质中以指数方式培养生长的1500 M109小鼠肿瘤细胞置于96孔平 底微量滴定皿上。继续在培养物中20小时存留，在此期间内，细胞聚集 并重新开始生长，在每孔中加入20μl试验制剂(游离丝裂霉素C或脂 质体制剂)。每种的药物浓度以10倍增长，测定了4个药物浓度点。每 个试验在3份孔中进行，并在两个平行皿中进行了试验。连续测定细胞 72小时。

72小时的处理周期后，向每孔中加入50μl 2.5％戊二醛，将培养 物固定10分钟。用去离子水将培养皿洗涤3次，用0.1M硼酸盐缓冲 液(pH8.5)洗涤一次，然后用100μL亚甲蓝(溶于0.1M硼酸盐缓 冲液的1％溶液，pH8.5)在室温(20-25℃)染色60分钟。用去离子 水冲洗培养皿5次，除去未与细胞结合的染料，然后干燥。在37℃用 200μl 0.1N HCl提取染料60分钟，用微皿分光光度计测定光密度。

用与分光光度法的吸光度相关联的血细胞计数器对细胞计数从而测 定细胞数量。选择初始细胞平皿的密度以保证细胞数量和研究末期的吸 收度之间的线性关系。在每个研究中，在加入药物测定初始平均吸收之 前固定6个孔。用此值计算生长速度(GR)，并通过以下等式DT＝1n 2/1n[(ODt/0Dc)/h]计算对照细胞和药物处理细胞的倍增时间 (doubl ingtimes)(DT)，其中DT＝以小时表示的倍增时间；ODt＝研 究结束时受试孔的光密度；ODc＝研究开始时对照孔的光密度；h＝保温 持续的小时数。

按GR＝(In2/DT)计算生长速度。用药物处理细胞的生长速度除 以未经药物处理的对照细胞的生长速度得到生长抑制百分率或对照动 物生长速度百分率。通过内插生长抑制曲线的的两个最接近的值计算使 产生对照生长速度50％抑制的药物浓度(IC50)。

测定丝裂霉素C在10-8-10-55M范围。测得有结合的缀合物的脂质体 制剂在10-8-3×10-5M。相互作用研究中，半胱氨酸(SIGMA，St. Louis，MO)与丝裂霉素C或脂质体制剂一起加入，直至终浓度为150,500 或1000μM。

结果示于表1和图13、14和15A-15B。

实施例7

体内药动学研究

A.脂质体制剂

按例5A和5B的方法制备含有胆固醇或不含胆固醇的脂质体。

将11.9mg丝裂霉素C溶解在119μL乙醇中制备游离丝裂霉素C的溶 液。溶解后，加入约11.8μL 10mM组氨酸/150mM盐水。使用前，用组氨 酸/盐水溶液将丝裂霉素C溶液稀释到100μg/mL并过滤。

B.动物

将8只大鼠随机分入以下治疗组：

  鼠号 体重(mg) 制剂 MMC浓度 (mg/mL) 剂量(mL) 剂量(mg/kg) 1 262.9 有胆固醇的脂质体 0.088 1.5 0.50 2 268.2 有胆固醇的脂质体 0.088 1.5 0.49 3 264.0 无胆固醇的脂质体 0.106 1.5 0.53 4 238.1 无胆固醇的脂质体 0.106 1.5 0.67 5 226.0 游离MMC 0.1 2.26 0.66 6 232.0 游离MMC 0.1 2.32 0.88 7 250.0 游离MMC 0.1 2.60 0.80 8 263.0 游离MMC 0.1 2.63 0.59

将试验制剂以浓注剂的形式单次静脉注射给药。在注射后的以下时 间点取每只动物的血样：30秒、15分钟、30分钟、1小时、2小时、4小 时、8小时、24小时、48小时、72小时和96小时。用下述HPLC过程测定 血样中丝裂霉素C的数量。将199.3mg碘化乙酰胺加入5.1mL 7.5％ EDTA 中制备200mM碘化乙酰胺溶液。在每1μL血样中加入15μL 200mM碘 化乙酰胺溶液。

C.测定血浆中丝裂霉素C的HPLC方法

1.溶液的制备

将1.321g磷酸铵加入1L容量的装有去离子水的烧瓶中，制备含 有10mM磷酸铵的缓冲水溶液，其pH＝7。搅拌溶液，用正磷酸将pH 调到7.0。使用前用0.45μm尼龙滤器将缓冲液过滤。

用Waters Alliance二元泵按梯度程序将甲醇与缓冲水溶液混合形 成流动相。

2.制备标准溶液和定量对照样品

分别取一定重量的丝裂霉素C和丝裂霉素C缀合物作为标准和定量 对照样品。分别称取1mg丝裂霉素C和丝裂霉素C缀合物并溶解在1mL 稀释剂中(20％氯仿和80％甲醇混合物)。两种化合物的备用溶液的浓 度为1mg/mL。以稀释剂制备一些稀释液，得到从5μg/mL至100μg/mL 的浓度作为标准和定量对照样品。

在0.1mL大鼠血浆的等分试样中加入适量体积(10μL-50μL)的丝 裂霉素C和丝裂霉素C缀合物标准溶液使其产生尖峰信号。丝裂霉素C 和丝裂霉素C缀合物的浓度范围分别为0.05-5.0μg/mL和0.1-5 μg/mL。用甲醇将终体积调整到1mL。随后以相似的过程制备定量对照 样品。大鼠血浆中定量对照样品的浓度，丝裂霉素C为0.1、0.5和 5μg/mL，丝裂霉素C缀合物为0.1、1和5μg/mL。将样品在室温以 3,000rpm的转速旋转10分钟。将300μL上清液转入含有300μL的 注射器的HPLC小瓶中。

3.样品制备

用900μL甲醇将100μL血浆样品以3,000rpm转速离心10分钟， 使其变性。取300μL上清液转入含有300μL注射器的HPLC小瓶中。

4.色谱条件

用 C-8，5μ，4.6mm×5cm柱。流动相A为10mM磷酸铵， pH7。流动相B为甲醇。流速为1mL/分钟，以360nm的紫外光进行检测。 注射体积为40μL，典型的运行时间为15分钟。梯度程序如下：

  时间(分钟) 流动相A的量(％) 流动相B的量(％) 0 90 10 4 70 30 8 0 100 12 90 10 15 90 10

5.测定和计算

注射制备的从低浓度至高浓度的线性标准溶液(6个浓度水平)。 然后注射质量对照和血浆样品进行分析。

用PE-Nelson Turbochrom(版本4.1)系统测定蜂面积和保留时间。 用线性回归程序计算丝裂霉素C和丝裂霉素C缀合物的浓度。用6个浓度 水平的标准反应评价此方法的线性。将数据填入线性回归方程中 y＝B*x+A，重量加权因子为1/x2。从标准溶液和定量对照样品的后计 算(back-calculated)浓度评价此方法的精密度和准确性。

结果示于图16A-16B。

虽然已根据特定的实施方案说明了本发明，对本领域的技术人员显 而易见的是，可以作出各种改变和改进而不背离本发明。