一种ε-聚赖氨酸的棒状纳米化方法及其ε-聚赖氨酸纳米颗粒的应用 |
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| 申请号 | CN202210798866.6 | 申请日 | 2022-07-06 | 公开(公告)号 | CN115152763A | 公开(公告)日 | 2022-10-11 |
| 申请人 | 西南大学; | 发明人 | 高长丹; 朱鑫; 马小舟; 孙现超; 冉茂; 徐小洪; 孙胡莲; 田绍锐; 刘维娜; 穆艳玲; | ||||
| 摘要 | 本 发明 公开了一种ε‑聚赖 氨 酸的棒状纳米化方法及其ε‑聚赖氨酸纳米颗粒的应用，属于ε‑聚赖氨酸纳米颗粒技术领域，包括以下步骤(1)将凹凸棒土或 膨润土 制备成1‑5％w/v浓度的 水 分散液，随后通过均质机分散15‑30min至稳定悬浮，得到悬浮水分散液；(2)将聚赖氨酸溶于水后在搅拌的条件下缓慢加入悬浮水分散液中，搅拌2‑4h后离心收集、干燥得到棒状ε‑聚赖氨酸纳米颗粒，制得的ε‑聚赖氨酸纳米颗粒解决目前ε‑聚赖氨酸在农业病害防治中成本高、抗菌效果差的问题。 | ||||||
| 权利要求 | 1.一种ε‑聚赖氨酸的棒状纳米化方法，其特征在于，所述方法为： |
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| 说明书全文 | 一种ε‑聚赖氨酸的棒状纳米化方法及其ε‑聚赖氨酸纳米颗粒的应用 技术领域[0001] 本发明涉及ε‑聚赖氨酸纳米颗粒技术领域，尤其涉及一种ε‑聚赖氨酸的棒状纳米化方法及其ε‑聚赖氨酸纳米颗粒的应用。 背景技术[0002] ε‑聚赖氨酸是一种基于酰胺键链接赖氨酸ε‑氨基和羧基构成的生物多肽，常由链霉菌分泌获得，当ε‑聚赖氨酸分子量在3600‑4300之间时，其抑菌活性最好，当分子量低于1300时，ε‑聚赖氨酸失去抑菌活性。受赖氨酸分子结构影响，ε‑聚赖氨酸分子结构中含有大量氨基并可通过与细菌细胞膜主动吸附，降低细胞膜流动性导致细菌菌体破裂，最终造成细菌死亡，这种基于物理相互作用的抗菌行为使ε‑聚赖氨酸表现出良好的广谱抗菌性，尤其是对革兰氏阳性菌、阴性菌以及某些支原体、衣原体。故这种聚多肽常用做食品防腐剂并在日本、中国等地广泛使用，但是对其除食品防腐剂外的其他功用研究较少。 [0003] 目前聚赖氨酸还可以制成多聚赖氨酸‑硅纳米颗粒(朱诗国等“. 一种新型的非病毒DNA传递载体:多聚赖氨酸‑硅纳米颗粒.”科学通报2002.)、多聚赖氨酸淀粉纳米颗粒(公开号：CN1462763A)作为基因载体进行应用，但是制备这些聚赖氨酸纳米颗粒时，均利用的是聚赖氨酸与阴离子型纳米颗粒之间的电荷相互作用合成，且均采用为α构型聚赖氨酸，分子量均在75000以上。目前将ε‑聚赖氨酸采用静电相互作用或复配协同作用制备相关药剂应用到农业相关领域虽然已有报道，但是实际运用到农业生产上仍未实现，其原因主要是成本高、实用性差。ε‑聚赖氨酸的市场价格在2‑6元/克不等，按平均40‑60L/亩的田间给药量算，平均1亩地喷药1次的聚赖氨酸抗病成本最高可达720元，对于农业生产来讲成本极其高昂。除此之外，聚赖氨酸的叶面粘附性差，易被雨水冲刷流失适应性差，且聚赖氨酸在碱性条件下，如施用硝基复合肥、草木灰等碱性肥料时或存在阴离子化合物，如偏磷酸时，其抑菌性和抗噬菌体性减弱，实用性较差。因此，ε‑聚赖氨酸在农业病害防治中的应用关键在于在保持聚赖氨酸抗菌效果的同时降低聚赖氨酸用量。 发明内容[0004] 鉴于此，本发明的目的是提供一种ε‑聚赖氨酸的棒状纳米化方法及其ε‑聚赖氨酸纳米颗粒的应用，解决目前ε‑聚赖氨酸在农业病害防治中成本高、抗菌效果差的问题。 [0005] 本发明同过以下技术方案解决上述问题： [0006] 一种ε‑聚赖氨酸的棒状纳米化方法，所述方法为： [0007] (1)将凹凸棒土或膨润土制备成1‑5％w/v浓度的水分散液，随后通过均质机分散15‑30min至稳定悬浮，得到悬浮水分散液； [0008] (2)将聚赖氨酸溶于水后在搅拌的条件下缓慢加入悬浮水分散液，搅拌2‑4h后离心收集、干燥得到棒状ε‑聚赖氨酸纳米颗粒。 [0009] 本发明是利用聚赖氨酸与凹凸棒土或膨润土表面二价离子与酰胺键的螯合作用制得棒状纳米化的ε‑聚赖氨酸纳米颗粒。利用凹凸棒土或膨润土棒状纳米材料对细菌表面的主动吸附，增加聚赖氨酸对菌体表面的吸附和破坏能力，同时棒状纳米聚赖氨酸也可有效提高聚赖氨酸进入植物体概率，进而提高聚赖氨酸诱抗性能，最终获得远优于未纳米化的聚赖氨酸病害防治性能。 [0010] 进一步，所述聚赖氨酸与凹凸棒土或膨润土的质量比为(1‑5):40。 [0011] ε‑聚赖氨酸与凹凸棒土或膨润土结合后制成棒状ε‑聚赖氨酸纳米颗粒，显著的降低了ε‑聚赖氨酸的用量，降低了使用成本。 [0012] 进一步，所述均质机的转速为13000‑20000rpm。 [0013] 进一步，对棒状ε‑聚赖氨酸纳米颗粒进行改性处理，所述改性处理包括以下原料：精氨酸、甜菜碱、氯化钙、鱼精蛋白、明胶、棒状ε‑聚赖氨酸纳米颗粒。 [0014] 进一步，所述原料包括以下质量份：0.8‑1.2份精氨酸、0.5‑1份甜菜碱、0.2‑0.4份氯化钙、0.2‑0.5份鱼精蛋白、0.1‑0.2份明胶、10‑12份棒状ε‑聚赖氨酸纳米颗粒。 [0015] 进一步，所述改性处理的步骤如下： [0016] (1)将氯化钙与水混合，搅拌均匀后得到35wt％的氯化钙溶液，加热至30‑35℃后加入棒状ε‑聚赖氨酸纳米颗粒，得到ε‑聚赖氨酸纳米颗粒水分散液，保温待用； [0017] (2)将精氨酸、甜菜碱与鱼精蛋白混合加入到ε‑聚赖氨酸纳米颗粒水分散液中，超声振荡10‑15min后加入明胶，加热至50‑55℃，搅拌15‑20min后进行冷冻干燥，取出后得到改性后的棒状ε‑聚赖氨酸纳米颗粒。 [0018] 本发明还公开了所述棒状ε‑聚赖氨酸纳米颗粒或改性后的ε‑聚赖氨酸纳米颗粒在防治抗茄科植物细菌性叶部病害中的应用。 [0019] 本发明通过纳米化后的ε‑聚赖氨酸纳米颗粒或改性后的ε‑聚赖氨酸纳米颗粒具有良好的抗菌和诱抗性能，较未纳米化的聚赖氨酸抗菌性增效可达5倍以上，大大降低了聚赖氨酸田间病害防治的用量及成本，有助于聚赖氨酸在田间病害防治中的应用。尤其是改性后的ε‑聚赖氨酸纳米颗粒能显著增加聚赖氨酸的叶面粘附性，且扩大了聚赖氨酸的使用范围，与碱性肥料同时施用也不会降低药效，提高防治效果，增加田间施用的实用性。 [0020] 进一步，所述棒状ε‑聚赖氨酸纳米颗粒或改性后的ε‑聚赖氨酸纳米颗粒在番茄斑疹病防治中的应用。 [0022] 进一步，所述所述棒状ε‑聚赖氨酸纳米颗粒或改性后的ε‑聚赖氨酸纳米颗粒与水混用，直接喷洒于植株表面。 [0023] 有益效果： [0024] 1、本发明制备的ε‑聚赖氨酸纳米颗粒通过生物基高分子构建，无毒且对环境无污染，同时材料利用原料间物理相互作用构建，能够主动吸附并破坏病原菌细胞膜，造成病原菌死亡，而改性后的ε‑聚赖氨酸纳米颗粒可以与碱性肥料、雨天同时使用，且仍能保持较高的病害防治性能，不降低药效，显著增加了实用性。 [0025] 2、纳米化后聚赖氨酸纳米颗粒能够更有效的诱导植物自身抗性，提高SOD含量，从而表现出较未纳米化聚赖氨酸更优的综合病害防治性能。 [0027] 图1：凹凸棒土(左)和ε‑聚赖氨酸纳米颗粒(右)放大图； [0028] 图2：番茄斑疹病防治效果图，从左至右分别为实施例6、对比例1、对比例2、对比例3、ε‑聚赖氨酸组、CK清水组防治图。 具体实施方式[0029] 以下将结合具体实施例和附图对本发明进行详细说明： [0030] 实施例1：棒状ε‑聚赖氨酸纳米颗粒制备 [0031] 将1g凹凸棒土溶于100mL去离子水中搅拌均匀，通过均质机在15000rpm的转速下剪切分散15min至稳定悬浮，得到悬浮水分散液； [0032] 将25mgε‑聚赖氨酸溶于20mL去离子水中，并在500rpm搅拌速率下缓慢加入凹凸棒土的悬浮水分散液中，继续搅拌混合液2h后通过5000rpm离心，倒去上清液，并将沉淀低温干燥即可获得棒状ε‑聚赖氨酸纳米颗粒。 [0033] 实施例2：棒状ε‑聚赖氨酸纳米颗粒制备 [0034] 将1g膨润土溶于100mL去离子水中搅拌均匀，通过均质机在15000rpm的转速下剪切分散15min至稳定悬浮，得到悬浮水分散液； [0035] 将25mgε‑聚赖氨酸溶于20mL去离子水中，并在500rpm搅拌速率下缓慢加入膨润土的悬浮水分散液中，继续搅拌混合液2h后通过5000rpm离心，倒去上清液，并将沉淀低温干燥即可获得棒状ε‑聚赖氨酸纳米颗粒。 [0036] 实施例3：棒状ε‑聚赖氨酸纳米颗粒制备 [0037] 将20g膨润土溶于2000mL去离子水中搅拌均匀，通过均质机在20000rpm的转速下剪切分散30min至稳定悬浮，得到悬浮水分散液； [0038] 将500mgε‑聚赖氨酸溶于400mL去离子水中，并在500rpm搅拌速率下缓慢加入膨润土的悬浮水分散液中，继续搅拌混合液2h后通过5000rpm离心，倒去上清液，并将沉淀低温干燥即可获得棒状ε‑聚赖氨酸纳米颗粒。 [0039] 实施例4：棒状ε‑聚赖氨酸纳米颗粒制备 [0040] 将20g凹凸棒土溶于2000mL去离子水中搅拌均匀，通过均质机在18000rpm的转速下剪切分散30min至稳定悬浮，得到悬浮水分散液； [0041] 将2gε‑聚赖氨酸溶于1000mL去离子水中，并在500rpm搅拌速率下缓慢加入凹凸棒土的悬浮水分散液中，继续搅拌混合液2h后通过5000rpm离心，倒去上清液，并将沉淀低温干燥即可获得棒状ε‑聚赖氨酸纳米颗粒。 [0042] 实施例5：改性棒状ε‑聚赖氨酸纳米颗粒制备 [0043] (1)将0.04g氯化钙与水混合，搅拌均匀后得到35wt％的氯化钙溶液，加热至35℃后加入实施例3制备的棒状ε‑聚赖氨酸纳米颗粒1g，得到ε‑聚赖氨酸纳米颗粒水分散液，于35℃保温待用； [0044] (2)将0.08g精氨酸、0.05g甜菜碱与0.02g鱼精蛋白混合加入到ε‑聚赖氨酸纳米颗粒水分散液中，于20KHz的超声频率下超声振荡10min后加入0.01g明胶，加热至55℃，搅拌20min后至明胶溶解，于‑10℃、10pa的条件下进行冷冻干燥，取出后得到改性后的棒状ε‑聚赖氨酸纳米颗粒。 [0045] 实施例6：改性棒状ε‑聚赖氨酸纳米颗粒制备 [0046] (1)将0.02g氯化钙与水混合，搅拌均匀后得到35wt％的氯化钙溶液，加热至35℃后加入实施例4制备的棒状ε‑聚赖氨酸纳米颗粒1.2g，得到ε‑聚赖氨酸纳米颗粒水分散液，于35℃保温待用； [0047] (2)将0.12g精氨酸、0.1g甜菜碱与0.05g鱼精蛋白混合加入到ε‑聚赖氨酸纳米颗粒水分散液中，于20KHz的超声频率下超声振荡15min后加入0.02g明胶，加热至55℃，搅拌20min后至明胶溶解，于‑10℃、10pa的条件下进行冷冻干燥，取出后得到改性后的棒状ε‑聚赖氨酸纳米颗粒。 [0048] 对比例1： [0049] 本发明与实施例6形成对比，主要区别在于改性步骤(1)中未使用氯化钙，步骤(2)与实施例6相同，其中步骤(1)具体操作如下： [0050] (1)将实施例4制备的棒状ε‑聚赖氨酸纳米颗粒1.2g与6g水混合，加热至35℃，得到ε‑聚赖氨酸纳米颗粒水分散液，保温待用； [0051] 步骤(2)与实施例6相同。 [0052] 对比例2： [0053] 本发明与实施例6形成对比，主要区别在于改性步骤(2)中未使用精氨酸和鱼精蛋白，步骤(1)与实施例6相同，其中步骤(2)具体操作如下： [0054] 步骤(1)与实施例6相同； [0055] (2)将0.1g甜菜碱混合加入到ε‑聚赖氨酸纳米颗粒水分散液中，于20KHz的超声频率下超声振荡15min后加入0.02g明胶，加热至55℃，搅拌20min后至明胶溶解，于‑10℃、10pa的条件下进行冷冻干燥，取出后得到改性后的棒状ε‑聚赖氨酸纳米颗粒。 [0056] 对比例3： [0057] 本发明与实施例6形成对比，主要区别在于改性步骤(2)中未使用甜菜碱，步骤(1)与实施例6相同，其中步骤(2)具体操作如下： [0058] 步骤(1)与实施例6相同； [0059] (2)将0.12g精氨酸与0.05g鱼精蛋白混合加入到ε‑聚赖氨酸纳米颗粒水分散液中，于20KHz的超声频率下超声振荡15min后加入0.02g明胶，加热至55℃，搅拌20min后至明胶溶解，于‑10℃、10pa的条件下进行冷冻干燥，取出后得到改性后的棒状ε‑聚赖氨酸纳米颗粒。 [0060] 对比例4： [0061] 本发明与实施例6形成对比，主要区别在于改性步骤(2)中未使用明胶，步骤(1)与实施例6相同，其中步骤(2)具体操作如下： [0062] 步骤(1)与实施例6相同； [0063] (2)将0.12g精氨酸、0.1g甜菜碱与0.05g鱼精蛋白混合加入到ε‑聚赖氨酸纳米颗粒水分散液中，于20KHz的超声频率下超声振荡15min后于‑10℃、10pa的条件下进行冷冻干燥，取出后得到改性后的棒状ε‑聚赖氨酸纳米颗粒。 [0064] 一、防治实验1： [0065] (1)将丁香假单胞杆菌通过穿刺接种方法接种于番茄叶片表面，得到感染番茄斑疹病的番茄植株，采用实施例3‑4制备的棒状ε‑聚赖氨酸纳米颗粒、实施例5‑6制备的改性后的ε‑聚赖氨酸纳米颗粒以及原料ε‑聚赖氨酸以及清水对照分别对感染植株进行防治实验，三次重复； [0066] (2)接种1天后，各组将制备的产品制成1mg/mL浓度的分散液喷施于接种叶，连续喷洒3天，每天喷洒1次，每次喷施30mL，清水组按相同的方法进行喷施，每次喷施30ml清水。3天后停止喷施，并于温度25‑28℃、湿度75‑80％的条件下培养接种植株3天，3天后测量接种叶病斑直径，得到的结果如表1所示： [0067] 表1 [0068] [0069] [0070] 二、防治实验2 [0071] 采用防治实验1的相同方法制得感染番茄斑疹病的番茄植株。实施例1的原料凹凸棒土和ε‑聚赖氨酸的质量比为1g:25mg，则实施例1制得的棒状ε‑聚赖氨酸纳米颗粒为含有25mg/gε‑聚赖氨酸的棒状聚赖氨酸纳米颗粒。 [0072] 将棒状聚赖氨酸纳米颗粒制成1g/L浓度的分散液用于喷施接种叶，连续3天，每天喷施1次，每次30mL,对照组使用ε‑聚赖氨酸0.1g/L的浓度按同样方法进行喷施，三个重复。3天后停止喷施，并培养接种叶3天，测量接种叶病斑直径以及使用SOD测试试剂盒对叶片内的SOD(超氧化物歧化酶)含量进行检测，得到的数据如表2所示： [0073] 表2 [0074] 喷施浓度 病斑直径 SOD含量实施例1 1g/L 0.25±0.05cm 1550±50U/g ε‑聚赖氨酸组 0.1g/L 1.20±0.10cm 1200±100U/g [0075] 三、抗菌稳定性实验 [0076] 采用防治实验1的相同方法制得感染番茄斑疹病的番茄植株。将实施例5‑6、对比例1‑4制备得到的改性后的ε‑聚赖氨酸纳米颗粒、原料ε‑聚赖氨酸以及清水分别对感染植株进行抗菌稳定性实验，其中清水组为空白对照，三次重复。 [0077] 番茄植株接种1天后，各组将制备的产品制成1mg/mL浓度的分散液喷施于接种叶，每次喷施30ml之后立即喷洒浓度为10mg/mL的草木灰浸出液20mL，清水组每天喷施30mL清水后喷施草木灰浸出液，按上述方法连续喷洒3天，每天喷洒1次。3天后停止喷施，并于温度25‑28℃、湿度75‑80％的条件下培养接种植株3天，3天后测量接种叶病斑直径，得到的结果如表3所示，其中实施例6、对比例1、对比例2、对比例3、ε‑聚赖氨酸组、清水组的防治图如图 2所示： [0078] 表3 [0079]实验组 喷施浓度 病斑直径 实施例5 1mg/mL 0.23±0.05cm 实施例6 1mg/mL 0.21±0.04cm 对比例1 1mg/mL 0.82±0.03cm 对比例2 1mg/mL 1.49±0.05cm 对比例3 1mg/mL 0.76±0.07cm 对比例4 1mg/mL 0.98±0.01cm ε‑聚赖氨酸组 1mg/mL 1.81±0.07cm 清水组 30mL 2.10±0.13cm [0080] 数据分析： [0081] 1、根据表1的结果可知，本发明实施例3‑4制备的棒状ε‑聚赖氨酸纳米颗粒或实施例5‑6制备的改性后的棒状ε‑聚赖氨酸纳米颗粒均具有良好的番茄斑疹病防治能力，接种叶病斑直径大小显著小于清水组。且实施例3‑4与未纳米化的ε‑聚赖氨酸组相比防治能力提高4倍以上，说明ε‑聚赖氨酸与凹凸棒土或膨润土混合制备的棒状ε‑聚赖氨酸纳米颗粒具有明显的增效作用，而实施例5‑6制备的改性后的ε‑聚赖氨酸纳米颗粒增效作用更强，病斑直径与ε‑聚赖氨酸组相比缩小将近6倍，说明改性后的ε‑聚赖氨酸纳米颗粒法防治效果更好。 [0082] 2、分析表2的数据可知，当凹凸棒土或膨润土与ε‑聚赖氨酸的复配比例达到40：1时，ε‑聚赖氨酸纳米颗粒制得的1g/L的水分散液中含有ε‑聚赖氨酸的量为0.025g/L(25mg/mL)，与ε‑聚赖氨酸组的ε‑聚赖氨酸含量0.1g/L相比，ε‑聚赖氨酸用量减少4倍，但是其防治能力突出，优于大剂量的ε‑聚赖氨酸组，当用于田间时其防治成本显著降低。除此之外，SOD与植物的抗逆性有显著正相关关系，已经被广泛用于指示植物的抗性能力，实施例1的SOD含量显著高于ε‑聚赖氨酸组，说明实施例1的侵染后的番茄植株活力较高且能具有较好的番茄诱抗性能，能降低番茄植物的染病几率。 [0083] 3、分析表1、3的数据可知，实施例5、实施例6与ε‑聚赖氨酸组的病斑直径相比，其病斑直径显著减小，且ε‑聚赖氨酸组与表1中的数据相比也可知，其病斑直径增大明显，说明ε‑聚赖氨酸与碱性的草木灰浸出液同时施用会造成抑菌性能下降，防治效果降低，而实施例5‑6与表1中的病斑直径相比，差距不大，说明经过改性后的ε‑聚赖氨酸纳米颗粒能与碱性肥料同时使用且不降低药效。 [0084] 4、实施例6与对比例1‑4形成对比，与对比例1相比对比例1中未使用氯化钙、对比例2未使用精氨酸和鱼精蛋白、对比例3未使用甜菜碱、对比例4未使用明胶，其抗菌效果均下降明显，病斑直径显著增大，尤其是对比例2病斑直径达到了1.49cm，结果如图2所示。这是由于ε‑聚赖氨酸的抗菌原理为微生物体通过静电吸收作用被吸附到细胞表面，之后使细胞膜物理裂解，内物质渗漏以至菌体死亡，从而达到抗菌作用，但是ε‑聚赖氨酸是一种聚阳离子化合物，在碱性条件下阴离子含量过多，ε‑聚赖氨酸阳离子电荷的减少，吸附到微生物细胞膜上的阴离子也相应减少，减弱了ε‑聚赖氨酸对菌体表面的吸附和破坏能力进而降低了抑菌活性。而本发明中的对ε‑聚赖氨酸纳米颗粒的改性是通过精氨酸与鱼精蛋白在甜菜碱的作用下与ε‑聚赖氨酸纳米颗粒结合，形成阴离子络合点进而固定捆绑阴离子，减少阴离子对ε‑聚赖氨酸纳米颗粒的影响，添加适量的钙离子也可以结合大部分肥料中的偏磷酸根，进一步扩大ε‑聚赖氨酸纳米颗粒的使用范围，加入的明胶即可以进一步将精氨酸、鱼精蛋白、甜菜碱、钙离子缚束于ε‑聚赖氨酸纳米颗粒表面，还可以增加一定的粘性，显著增加ε‑聚赖氨酸纳米颗粒的叶面粘附性，进一步防止雨水或肥料的冲刷，进而提高防治效果，增加药效。 |
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