[0001] 本发明涉及用于促进植物生长和/或用于保护植物抵御至少一种植物害虫和/或至少一种植物疾病的组合物。本发明还涉及这种组合物的用途和用于获得这种组合物的方法。本发明还涉及用于至少部分地生产这种组合物的共培培养基(co‑culture medium)。

[0002] 在过去的几十年里，属于或不属于统一界的不同微生物的共培养策略(例如，细菌‑细菌或细菌‑真菌共培养)引起了许多微生物学家的注意。这一领域因为它在共培养菌株诱导产生天然次生代谢物的水平上取得了有吸引力的结果而基本上得到了探讨。然而，也研究了共培养的其他目标特征，诸如营养依赖和交互共生。

[0003] 代谢交互共生是指一种菌株能够利用另一种菌株代谢产生的分子作为营养源的过程。至于营养依赖，交互共生对相关菌株的生长至关重要。例如，在瘤胃细菌的情况下，氨基酸依赖性细菌在细菌生产能够利用可用底物之前是不可能生长的。在这方面，99％的细菌和古生菌在实验室条件下无法培养，部分原因肯定是微生物对它们的自然栖息地中其他微生物提供的营养或生长因子的依赖。

[0004] 事实上，根据用800个微生物群落建立的代谢模型(Zelezniak等人的2015.Metabolic dependencies drive species co‑occurrence in diverse microbial communities.PNAS.112(20),6449‑6454)，它们都包含交换糖、氨基酸和其他代谢物的代谢依赖性基团。为了理解和探索它们的意义，这种营养相互作用可以通过体外研究通过基因工程或者基本上通过使用培养基来实施，在基因工程中通过基因缺失可以产生一个营养缺陷型菌株，该培养基缺乏对共同栽培物种之一的生长所必需的营养。

[0005] 芽孢杆菌和木霉菌是与植物保护有关的属，并且它们被称为生物防治剂(biocontrol agent，BCA)。后者已经成为研究人员的极大兴趣，他们期待开发环境友好的解决方案来预防和治疗由生物和非生物因素引起的植物疾病。

[0006] 发现芽孢杆菌和木霉菌通常存在于植物根围(rhizosphere)，并且它们显示出对多种植物病原菌(特别是真菌)具有拮抗作用。发现有些病原菌被木霉菌和芽孢杆菌两者抑制。其他抑制作用仅限于一种生物防治剂。例如，木霉菌或芽孢杆菌的作用可以抑制葡萄孢属和镰刀菌属的生长(Coninck等人的2020.Trichoderma atroviride as a promising biocontrol agent in seed coating for reducing Fusarium damping‑off on maize.J Appl Microbiol.129(3),637‑651；Vos等人的2015.The toolbox of Trichoderma spp.in the biocontrol of Botrytis cinerea disease.Mol Plant Pathol.16(4),400‑412；Khan等人的2018.Antifungal Activity of Bacillus Species Against Fusarium and Analysis of the Potential Mechanisms Used in Biocontrol.Front Microbiol.2(9),
2363；Toral等人的2020.Crop Protection against Botrytis cinerea by Rhizhosphere Biological Control Agent Bacillus velezensis XT1.Microorganisms.8(7),992)。然而，证明芽孢杆菌对链核盘菌属有抑菌作用，而木霉菌对链核盘菌属无抑菌作用(Zhou等人的2019.Bacillus subtilis CF‑3Volatile Organic Compounds Inhibit Monilinia fructicola Growth in Peach Fruit.Front Microbiol.7(10),1804)。相比之下，在这两种生物防治剂中，只有木霉菌有效抵御导致葡萄衰枯病(petri disease of grapevine)的褐枝顶孢霉(Phaeoacremonium minimum)(Carro‑Fluerga等人的2020.Colonization of Vitis vinifera L.by the Endophyte Trichoderma sp.Strain T 154:Biocontrol Activity Against Phaeoacremonium minimum.Front Plant Sci.4(11),1170)。

[0007] 关于木霉菌的作用方式(真菌寄生、抗生和诱导植物系统抗性)及其作为BCA的优势(非生物胁迫耐受性(abiotic stress tolerance)、高生长率……)，Adnan等人对这些进行了很好的描述(Adnan等人的2019.Plant defense against fungal pathogens by antagonistic fungi with Trichoderma in focus.Microbial Pathogenesis,129,7‑8)。

[0008] 就其本身而言，芽孢杆菌以其产生抗微生物分子(特别是环状脂肽)的高遗传能力而闻名(Ongena等人的2008.Bacillus lipopeptides:versatile weapons for plant disease biocontrol.Trends Microbiol 16:115‑125)。其中，表面活性素(surfactin)、丰原素(fengycin)和伊枯草菌素(iturin)是主要的产科。属于丰原素和伊枯草菌素科的一些脂肽的异构体已经被描述为具有可以解释芽孢杆菌菌株的生物防治行为的抗微生物活性(Romano等人的2013.Antifungal cyclic  lipopeptides from Bacillus amyloliquefaciens strain B05A.Journal of Natural Products,76(11),2019‑2025；
Kupper等人的2020.Production of antifungal compounds by Bacillus spp.isolates and  its  capacity for  controlling  citrus  black  spot under field conditions.World Journal of Microbiology Biotechnology,36(1),1 ‑10)。

[0009] 芽孢杆菌和木霉菌也是参与植物生长的物种，如几项研究强调的(Bononi等人的2020.Phosphorus‑solubilizing Trichoderma spp.from Amazon soils improve soybean  plant growth.Scientific Reports,10(2858),1 ‑13；Chen等人的
2019.Antimicrobial,plant growth‑promoting and genomic properties of the peanut endophyte Bacillus velezensis LD02.Microbiological Research,218,41‑48；
Giridhar等人的2019.Characterization of Trichoderma asperellum RM‑28for its sodicsaline‑alkali tolerance and plant growth promoting activities to alleviate toxicity of red mud.Science of The Total Environment,662,462‑469；
Saechow等人的2018.Antagonistic Activity against Dirty Panicle Rice Fungal Pathogens and Plant Growth‑Promoting Activity of Bacillus amyloliquefaciens BAS23.Journal of Microbiology and Biotechnology,28(9),1527‑1535).

[0010] 芽孢杆菌和木霉菌种的结合对病原菌的生物防治、特别是对真菌病原菌的生物防治具有重要意义。与单独使用一种微生物相比，这些有益微生物的不同作用方式，以及它们共同或单独作用的广谱病原菌可以提高它们的效率。

[0011] 有鉴于此，令人感兴趣的是将产生抗真菌脂肽的芽孢杆菌和木霉菌种作为BCA进行共培养以用于获得更好的生物防治效果和植物促生长，特别是用于获得包括产生抗真菌脂肽的芽孢杆菌和木霉菌种的组合物作为BCA，该芽孢杆菌和木霉菌在同一培养基中生长和发育且优选伴随生长和发育。

[0012] 更具体地，令人感兴趣的是将产生抗真菌脂肽的芽孢杆菌和木霉菌种作为BCA共培养以用于促进植物生长和/或保护植物抵御至少一种植物害虫和/或一种植物疾病，特别是用于获得包括产生抗真菌脂肽的芽孢杆菌和木霉菌种的组合物作为BCA、来促进植物生长和/或保护植物抵御至少一种植物害虫和/或一种植物疾病。

[0013] 更具体地，令人感兴趣的是将产生抗真菌脂肽的芽孢杆菌和木霉菌种作为BCA共培养以控制主要由诸如真菌、卵菌、细菌、病毒、线虫和昆虫等植物害虫引起的疾病，特别是用于获得包括产生抗真菌脂肽的芽孢杆菌和木霉菌种的组合物作为BCA、来控制主要由真菌、卵菌、细菌、病毒、线虫和昆虫等植物害虫引起的疾病。

[0014] 不幸的是，如今，产生抗真菌脂肽的芽孢杆菌与木霉菌种的共培养肯定不是有效和最佳的。事实上，由芽孢杆菌属的细菌产生的抗真菌脂肽(诸如表面活性素、丰原素和伊枯草菌素)抑制真菌的生长和发育，特别是木霉菌属的真菌的生长和发育。因此，目前产生抗真菌脂肽的芽孢杆菌与木霉菌种的共培养并不是有效和最佳的，芽孢杆菌种阻碍了木霉菌种的充分生长和发育。出于同样的原因，目前包括产生抗真菌脂肽的芽孢杆菌和木霉菌种的组合物不能有效和最佳地保证产生抗真菌脂肽的芽孢杆菌属的细菌的生长和木霉菌种的生长在共培养中同时进行(优选伴随进行)，以用作生物防治剂(BCA)或用作植物生长的促进剂。

[0015] 本发明的一个目的是克服至少部分上述缺点，并提供用于促进植物生长和/或用于保护植物抵御至少一种植物害虫和/或至少一种植物疾病的组合物。本发明的另一个目的是提供适合于促进植物生长和/或保护植物抵御至少一种植物害虫和/或至少一种植物疾病的组合物。

[0016] 具体地，本发明的目的是将产生抗真菌脂肽的芽孢杆菌和木霉菌种作为BCA进行共培养以用于获得更好的生物防治效果和更好的植物促生长，特别是用于获得包括产生抗真菌脂肽的芽孢杆菌和木霉菌种的组合物作为BCA、以在同一培养基中同时生长和发育且优选伴随生长和发育。

[0017] 更具体地，本发明的目的是将产生抗真菌脂肽的芽孢杆菌和木霉菌种作为BCA共培养以用于促进植物生长和/或保护植物抵御至少一种植物害虫和/或至少一种植物疾病，特别是用于获得包括产生抗真菌脂肽的芽孢杆菌和木霉菌种的组合物作为BCA、以促进植物生长和/或保护植物抵御至少一种植物害虫和/或至少一种植物疾病。

[0018] 更具体地，本发明的目的是将产生抗真菌脂肽的芽孢杆菌和木霉菌种作为BCA共培养以用于控制主要由诸如真菌、卵菌、细菌、病毒、线虫和昆虫的植物害虫引起的疾病，特别是用于获得包括产生抗真菌脂肽的芽孢杆菌和木霉菌种的组合物作为BCA、以用于控制主要由诸如真菌、卵菌、细菌、病毒、线虫和昆虫的植物害虫引起的疾病。

[0019] 为此，根据本发明，提供了一种用于促进植物生长和/或用于保护植物抵御至少一种植物害虫和/或至少一种植物疾病的组合物，所述组合物同时包括产生抗真菌脂肽(antifungal lipopeptide)的芽孢杆菌属的至少一种细菌、木霉菌属的至少一种真菌和至少一种矿物质氮源(nitrogen mineral source)。

[0020] 优选地，根据本发明，该组合物主要包括至少一种作为氮源的矿物质氮源。这意味着，有利地，如果根据本发明的组合物中既存在矿物质氮源又存在有机氮源，则该组合物包括按比例更多的矿物质氮。

[0021] 更优选地，根据本发明，该组合物仅包括作为氮源的至少一种矿物质氮源。这意味着，有利地，根据本发明的组合物除了所述至少一个矿物质氮源之外不包括有机氮源。换而言之，这意味着，有利地，根据本发明的组合物包括矿物质氮作为氮的唯一来源。

[0022] 在本发明的上下文中，基于FAO根据《国际植物保护公约》和世界植物检疫措施(FAO，1990；FAO修订本，1995；IPPC，1997)对“害虫”的定义，术语“植物害虫”指对植物有害的植物、动物或病原体的任何物种、菌株或生物型，例如真菌、卵菌、细菌、病毒、类病毒、病毒样生物、植原体、原生生物、原生动物、线虫、昆虫和寄生植物。从这个意义上说，术语“植物害虫”包括所有植物病原体，即，可以引起疾病症状和/或植物疾病和/或显著降低植物产量、品质、甚至导致植物死亡的所有生物有机体。

[0023] 在本发明的上下文中，术语“植物疾病”是指阻止植物发挥其最大潜能的任何疾病，尤其是在发育和生产力方面的疾病。

[0024] 在本发明的上下文中，术语“用于保护植物”是指旨在控制或减少害虫和/或使害虫对植物的影响最小化的机制或激活机制(例如，激活植物中的系统抗性)。例如，可以通过杀死害虫、延缓害虫的生长和/或繁殖或减少孢子形成来实现植物保护。

[0025] 在本发明的上下文中，术语“用于促进植物生长”是指旨在激活/强化确保植物生长的机制，特别是在水分胁迫条件下。

[0026] 在本发明的上下文中，术语“矿物质氮源”是指任何包括氮的化合物/分子，并且来自矿物质来源而不是有机物来源。

[0027] 在本发明的上下文中，术语“抗真菌脂肽”是指具有抗真菌活性的次级代谢物，特别是由非核糖体途径产生的氨基酸和脂肪酸链构成的次级代谢物，这意味着它可以抑制真菌的生长和繁殖。

[0028] 在本发明的上下文中，令人惊讶地确定，根据本发明的包括至少一种矿物质氮源的组合物允许产生抗真菌脂肽的芽孢杆菌属的至少一种细菌和木霉菌属的至少一种真菌在同一培养基中在共培养中同时且优选伴随共存、生长和发育。

[0029] 产生抗真菌脂肽的芽孢杆菌属的细菌和木霉菌属的真菌在同一培养基中在共培养中同时且优选伴随生长和发育是完全意想不到的，因为该细菌天然产生抗真菌脂肽(特别是表面活性素、丰原素和伊枯草菌素)，该抗真菌脂肽阻止真菌的生长和发育，特别是木霉菌属的真菌的生长和发育。此外，出乎意料的是，在本发明的上下文中，突出显示了木霉菌属的真菌促进和调节产生抗真菌脂肽的芽孢杆菌属的细菌的生长。特别地，出乎意料的是，突出显示了在共培养中，即在根据本发明的同时包括产生抗真菌脂肽的芽孢杆菌属的至少一种细菌、木霉菌属的至少一种真菌和至少一种矿物质氮源的组合物中，由芽孢杆菌属的细菌产生的抗真菌脂肽被木霉菌属的真菌所抑制。

[0030] 在本发明的上下文中，显示了根据本发明的包括至少一种矿物质氮源的组合物促进了根的产生并因此促进了植物的生长。还显示了根据本发明的包括至少一种矿物质氮源的组合物改善种子发芽，并因此改善植物生长，特别是在水分胁迫条件下。

[0031] 本发明由独立权利要求所限定。从属权利要求限定了有利的实施方案。

[0032] 优选地，根据本发明，所述至少一种矿物质氮源选自由以下构成的组：硝酸盐、亚硝酸盐及其混合物。

[0033] 有利地，根据本发明，所述硝酸盐选自包括以下的组：硝酸钠、硝酸钙、硝酸钾及其混合物。

[0034] 优选地，根据本发明，所述亚硝酸盐选自包括以下的组：亚硝酸钠、亚硝酸钙、亚硝酸钾及其混合物。

[0035] 优选地，根据本发明，特别是当组合物处于液体形式时，所述至少一种矿物质氮源(特别是所述一种或多种硝酸盐和/或一种或多种亚硝酸盐)以1mM至1M、优选为50mM至100mm、更优选为70mM的浓度范围存在于组合物中。

[0036] 最终，如果根据本发明的组合物是以浓缩组合物的形式存在，则所述至少一种矿物质氮源(特别是所述一种或多种硝酸盐和/或一种或多种亚硝酸盐)以0.05M至135M的浓度、优选1M的浓度范围存在于组合物中。

[0037] 有利地，根据本发明，芽孢杆菌属的所述至少一种细菌以2.103个细胞.g‑1至2.106‑1 4 ‑1个细胞.g 、优选2.10个细胞.g 的浓度范围存在于组合物中。

[0038] 最终，如果根据本发明的组合物是浓缩组合物的形式，则芽孢杆菌属的至少一种7 ‑1 11 ‑1 9 ‑1
细菌以2.10个细胞.g 至2.10 个细胞.g 、优选2.10个细胞.g 的浓度范围存在于组合物中。

[0039] 优选地，根据本发明，木霉菌属的所述至少一种真菌以2.104个孢子.g‑1至2.107个‑1 5 ‑1孢子.g 、优选为2.10个孢子.g 的浓度范围存在于组合物中。

[0040] 最终，如果根据本发明的组合物是浓缩组合物的形式，则木霉菌属的所述至少一8 ‑1 11 ‑1 9 ‑1
种真菌以2.10 个孢子.g 至2.10 个孢子.g 、优选为5.10 个孢子.g 的浓度范围存在于组合物中。

[0041] 优选地，根据本发明，产生抗真菌脂肽的芽孢杆菌属的所述至少一种细菌和木霉菌属的所述至少一种真菌以1：2的细胞浓度的比例、优选以1：5的比例、更优选以1：10的比例存在于组合物中。

[0042] 在本发明的意义上，术语“细胞”指一种或多种细胞，也指一种或多种孢子。

[0043] 优选地，根据本发明，所述至少一种矿物质氮源、特别是所述一种或多种硝酸盐和/或一种或多种亚硝酸盐以相对于组合物的总重量的0.5重量％至70重量％、优选以相对于组合物的总重量的10重量％存在于组合物中。

[0044] 优选地，根据本发明，芽孢杆菌属的所述至少一种细菌以相对于组合物的总重量的0.01重量％至2重量％、优选相对于组合物的总重量的0.1重量％存在于组合物中。

[0045] 优选地，根据本发明，木霉菌属的所述至少一种真菌以相对于组合物的总重量的0.2重量％至25重量％、优选相对于组合物的总重量的2重量％存在于组合物中。

[0046] 优选地，根据本发明，产生抗真菌脂肽的芽孢杆菌属的所述至少一种细菌选自包括以下的组：枯草杆菌、淀粉分解杆菌、环状芽孢杆菌、苏云金杆菌、短小芽孢杆菌、瓦氏芽孢杆菌(Bacillus vallismortis)、地衣芽孢杆菌、摩加夫芽孢杆菌(Bacillus mojavensis)、贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)、海内氏芽孢杆菌(Bacillus haynesii)、副地衣芽胞杆菌(Bacillus paralicheniformis)、索诺拉沙漠芽胞杆菌(Bacillus sonorensis)、大豆发酵芽孢杆菌(Bacillus glycinifermentans)及其混合物。这份列表并不是详尽的。

[0047] 优选地，根据本发明，木霉菌属的所述至少一种真菌选自包括以下的组：哈茨木霉(Trichoderma harzianum)、深褐木霉(Trichoderma atrobrunneum)、棘孢木霉(Trichoderma asperellum)、绿色木霉(Trichoderma virens)、深绿木霉(Trichoderma atroviride)、猬木霉(Trichoderma  erinaceum)、长枝木霉(richoderma longibrachiatum)及其混合物。这份列表并不是详尽的。

[0048] 优选地，根据本发明，该组合物为颗粒、片剂、粉末、液体、(微)乳剂、纳米制剂、(微)胶囊、(水溶性)浓缩物、(浓缩)悬浮液、(浓缩)分散体、润湿性颗粒和粉末或气雾剂的形式。这份列表并不是详尽的。

[0049] 最终，根据本发明的组合物还包括选自包括以下的组的溶剂和/或共制剂：洗涤剂、乳化剂、分散剂、消泡剂、渗透促进剂、湿润剂、离子或非离子润湿剂、防冻剂、诸如抗氧化剂的防腐剂(例如，类胡萝卜素和/或多酚和/或维生素E)、吸水剂、增稠剂、缓冲剂、粘贴剂、稀释剂及其混合物，优选地表面活性剂选自包括以下的组：洗涤剂、乳化剂、分散剂、消泡剂、渗透促进剂、润湿剂或离子或非离子润湿剂及其混合物。这份列表并不是详尽的。

[0050] 实际上，根据本发明的组合物可以包含附加组分(诸如共制剂)，以获得具有良好的操控性、有效性和稳定性的产品。根据本发明，术语“共制剂”指除一种或多种矿物质氮源、产生抗真菌脂肽的芽孢杆菌属的细菌和/或木霉菌属的真菌以外的任何物质。

[0051] 根据本发明的组合物可以包括表面活性剂，即，降低液体表面张力、允许更容易铺展的化合物。表面活性剂可以是洗涤剂、乳化剂(包括烷基多糖苷甘油酯或聚氧化乙烯(20)山梨醇酐月桂酸酯)、分散剂(包括氯化钠、氯化钾、硝酸钾、氯化钙或玉米淀粉)、发泡剂(包括酒石酸、苹果酸或醇的衍生物)、渗透促进剂、湿润剂(包括硫酸铵、甘油或尿素)或离子或非离子型润湿剂或这些表面活性剂的混合物。

[0052] 术语“渗透促进剂”指的是一种加速有效成分通过植物的角质层吸收到植物(即，吸收速度)和/或增加吸收到植物的有效成分的量的化合物。被称为渗透促进剂的物质类别包括磷酸烷基酯(诸如磷酸三丁酯和磷酸三丙酯)以及萘磺酸盐。

[0053] 术语“分散剂”是指添加到悬浮液中的物质，通常是胶体，以改善颗粒的分离并防止沉降或凝集。

[0054] 术语“乳化剂”是指稳定乳剂的物质，即，两种或两种以上液体的混合物。值得一提的是以 20( 20)为商标名销售的乳化剂，该 20主要包括聚氧化乙烯(20)山梨醇酐月桂酸酯(聚山梨醇酯20)。

[0055] 最终，根据本发明的组合物可以包括选自包括以下的组的一种或多种其他活性化合物/或物质：除草剂、杀虫剂、植物生长调节剂或植物免疫系统激发剂及其混合物。

[0056] 优选地，根据本发明的组合物来自天然的、合成的或生物合成的来源。更具体地，所述至少有一种矿物质氮源来自天然的、合成的或生物合成的来源。

[0057] 本发明还涉及用于获得根据本发明的组合物的方法，所述方法包括：

[0058] ‑形成共培培养基，特别是液体共培培养基，该共培培养基包括至少一种矿物质氮源，例如硝酸盐和/或亚硝酸盐，特别是选自包括以下的组的硝酸盐和/或亚硝酸盐：硝酸钠、硝酸钙、硝酸钾、亚硝酸钠、亚硝酸钙、亚硝酸钾及其混合物；以及

[0059] ‑向所述共培培养基添加产生抗真菌脂肽的芽孢杆菌属的至少一种细菌和木霉菌属的至少一种真菌，例如，产生抗真菌脂肽的芽孢杆菌属的至少一种细菌的冻干细胞或干燥细胞，以及木霉菌属的至少一种真菌的冻干孢子或干燥孢子。

[0060] 例如，冻干、喷雾干燥、冷冻干燥或固体流态化可以用于获得冻干或干燥细胞或孢子。

[0061] 优选地，根据本发明的方法还包括在向所述共培培养基添加产生抗真菌脂肽的芽孢杆菌属的所述至少一种细菌和木霉菌属的所述至少一种真菌之后的共培养的温育步骤。

[0062] 在根据本发明的第一实施方案中，形成共培培养基的步骤和向所述共培培养基中添加产生抗真菌脂肽的芽孢杆菌属的至少一种细菌和木霉菌属的至少一种真菌的步骤是同时执行的且优选伴随执行。

[0063] 在根据本发明的第二实施方案中，依次执行形成共培培养基的步骤和向所述共培培养基中添加产生抗真菌脂肽的芽孢杆菌属的至少一种细菌和木霉菌属的至少一种真菌的步骤。

[0064] 最终，根据本发明的另一实施方案，依次将产生抗真菌脂肽的芽孢杆菌属的所述至少一种细菌和木霉菌属的所述至少一种真菌添加到共培培养基中，特别是在共培养的温育之前。

[0065] 优选地，最迟在添加至所述共培培养基中的木霉菌属的所述至少一种真菌生长之前，向共培培养基添加产生抗真菌脂肽的芽孢杆菌属的所述至少一种细菌。

[0066] 更优选地，在先前向共培培养基添加木霉菌属的所述至少一种真菌之后2小时内、特别是在共培养的温育之前，向共培培养基添加产生抗真菌脂肽的芽孢杆菌属的所述至少一种细菌。

[0067] 有利地，根据本发明，只有当产生抗真菌脂肽的芽孢杆菌属的所述至少一种细菌和木霉菌属的所述至少一种真菌两者都存在于所述共培培养基中时，才开始共培养。

[0068] 本发明还涉及根据本发明的组合物特别是在农业和园艺应用中保护植物抵御至少一种植物害虫和/或植物疾病和/或促进植物生长的用途。

[0069] 例如，根据本发明的组合物可以通过充当激发剂来保护植物抵御至少一种植物害虫和/或至少一种植物疾病，这意味着根据本发明的组合物可以充当植物免疫系统的诱导剂，该诱导剂刺激植物抵御植物病害虫和植物疾病的防御反应。此外，根据本发明的组合物可以通过直接作用于病原菌(来自芽孢杆菌的抗真菌脂肽、来自木霉菌的真菌寄生和/或抗生性)来保护植物抵御至少一种植物害虫和/或至少一种植物疾病。

[0070] 优选地，当使用时，将根据本发明的组合物在收获前或收获后通过喷洒、喷淋(drenching)、浸泡、浸渍、注射、或者通过施肥系统或灌溉系统施用而施加于整个植物、根围、根系、叶、花、果实、种子、幼苗(seedling)或移植的幼苗(seedlings pricking out)、诸如块茎或根茎的繁殖材料、和/或在其中生长植物或期望在其中生长的土壤或惰性基质。

[0071] 有利地，根据本发明，所述植物害虫选自包括以下的组：真菌、卵菌、细菌、病毒、类病毒、病毒样生物体、植原体、原生生物、原生动物、线虫和昆虫。

[0072] 可以被根据本发明的组合物靶向的植物致病真菌和真菌样生物体的非限制性示例包括：梨孢霉属物种(Pyricularia spp.)、柄锈菌属物种(Puccinia spp.)、白粉菌属物种(Erysiphe  spp.)、旋孢腔菌属物种(Cochliobolus spp.)、长蠕孢属物种(Helminthosporium spp.)、内脐蠕孢属物种(Drechslera  spp.)、喙孢属物种(Rhynchosporium spp.)、尾孢属物种(Cercospora spp.)、葡萄孢属物种(Botrytis spp.)、链格孢属物种(Alternaria spp.)、黑星菌属物种(Venturia spp.)、枝孢属物种(Cladosporium spp.)、链核盘菌属物种(Monilinia spp.)、亚隔孢壳属物种(Didymella spp.)、茎点霉属物种(Phoma spp.)、曲霉菌属物种(Aspergillus spp.)、金黄担子菌属物种(Aureobasidium spp.)、壳二孢属物种(Ascochyta spp.)、匍柄霉属物种(Stemphylium spp.)、格孢菌属物种(Pleospora spp.)、霜霉属物种(Peronospora spp.)、；腐霉属物种(Pythium spp.)、疫霉属物种(Phytophthora spp.)、丝核菌属物种(Rhizoctonia spp.)、核盘菌属物种(Sclerotinia spp.)、小核菌属物种(Sclerotium spp.)、刺盘孢属物种(Colletotrichum spp.)、球腔菌属物种(Mycosphaerella spp.)、间座壳属物种(Diaporthe spp.)、痂囊腔菌属物种(Elsinoe spp.)、轮枝孢属物种(Verticillium spp.)、埋核盘菌属物种(Pyrenopeziza spp.)、镰刀菌素物种(Fusarium spp.)、核瑚菌属物种(Typhula spp.)、黑粉菌属物种(Ustilago spp.)、条黑粉菌属物种(Urocystis spp.)、腥黑粉菌属物种(Tilletia spp.)、柱隔孢属物种(Ramularia spp.)、青霉菌属物种(Penicillium spp.)、小枝顶孢属物种(Acremoniella spp.)、异水霉属物种(Allomyces spp.)、无定形膜菌属物种(Amorphothec spp.)、黑曲霉属物种(Aspergillius spp.)、芽枝霉属物种(Blastocladiella spp.)、念珠菌属物种(Candida spp.)、毛壳菌属物种(Chaetomium spp.)、球孢子菌属物种(Coccidioides spp.)、耳霉属物种(Conidiobolus spp.)、墨头菌属物种(Coprinopsis spp.)、棒囊壳属物种(Corynascus spp.)、隐丛赤壳菌属物种(Cryphonectria spp.)、隐球酵母属物种(Cryptococcus spp.)、小坎宁安霉属物种(Cunninghamella spp.)、弯孢属物种(Curvularia  spp.)、德巴利氏酵母属物种(Debaryomyces spp.)、色二孢属物种(Diplodia spp.)、翘孢霉属物种(Emericella ssp.)、脑胞内原虫属物种(Encephalitozoon spp.)、假囊酵母属物种(Eremothecium spp.)、顶囊壳属(Gaeumanomyces spp.)、地丝霉属物种(Geomyces spp.)、赤霉菌属物种(Gibberella spp.)、褐褶菌属物种(Gloeophyllum spp.)、球囊霉属物种(Glomus spp.)、肉座菌属物种(Hypocrea spp.)、克鲁维酵母菌属物种(Kluyveromyces spp.)、香菇属物种(Lentinula spp.)、白冬孢酵母属物种(Leucosporidium spp.)、壳球孢属物种(Macrophomina spp.)、巨座壳属物种(Magnaportha spp.)、绿僵菌属物种(Metharhizium spp.)、毛霉菌属物种(Mucor spp.)、脉孢菌属物种(Neurospora spp.)、丛赤壳属物种(Nectria spp.)、副球霉菌属物种(Paracocidioides spp.)、暗球腔菌属物种
(Phaeopsheria spp.)、原毛平革菌属物种(Phanerochaete spp.)、层锈菌属物种(Phakopsora spp.)、瘤梗孢属物种(Phymatotrichum spp.)、肺囊虫属物种(Pneumocystis spp.)、火丝菌属物种(Pyronema spp.)、丝核菌属物种(Rhizoctonia spp.)、根霉属菌物种(Rhizopus spp.)、酵母菌属物种(Saccharomyces spp.)、小菌核菌属物种(Scerotium spp.)、小壶菌属物种(Spizellomyces spp.)、嗜热真菌属物种(Thermomyces spp.)、根串珠霉属物种(Thielaviopsis spp.)、栓菌属物种(Trametes spp.)、毛癣菌属物种(Trichophyton spp.)、亚罗酵母属物种(Yarrowia spp.)、侵占木霉(Trichoderma agressivum)；拟茎点霉属物种(Phomopsis spp.)、葡萄座腔菌属物种(Botryosphaeria spp.)、弯孢壳属物种(Eutypa spp.)、嗜蓝孢孔菌属物种(Fomitiporia spp.)、褐枝顶孢霉物种(Phaeoacremonium spp.)、小褐球壳属物种(Phaeomoniella spp.)、黑星孢属物种(Fusicladium spp.)、粉孢属物种(Oidium spp.)、叉丝单囊壳属物种(Podosphaera spp.)、叉丝壳属物种(Microsphaera spp.)、高氏白粉菌属(Golonivomyces spp.)、内丝白粉菌属物种(Leveillula spp.)、球针壳属物种(Phyllactinia spp.)、巴西壳属物种(Brasiliomyces spp.)、单丝壳属物种(Sphaerotheca spp.)、白粉菌属物种(Blumeria spp.)、或新白粉菌属物种(Neoerysiphe spp.)。具体地，可以由根据本发明的组合物靶向的植物致病真菌和真菌样生物体是灰葡萄孢菌、福斯氏镰刀菌、核盘菌、立枯丝核菌、瓜果腐霉、葡萄藤猝倒病菌、葡萄座腔菌属、褐枝顶孢霉物种或小褐球壳属物种。

[0073] 可以由根据本发明的组合物靶向的由真菌引起的植物疾病主要包括酵母病(yeast)、锈病、黑粉病、霉病(mildew)、霉菌病(mold)、蘑菇形病(mushroom)和毒菌病(toadstool)。

[0074] 可以由根据本发明的组合物靶向的植物致病菌的非限制性示例包括欧文氏菌属、假单胞菌属、黄单胞菌属、罗尔斯通菌属和木杆菌属(Xylella)。

[0075] 可以由根据本发明的组合物靶向的植物致病病毒的非限制性示例包括黄瓜花叶病毒、大麦黄花叶病毒、草莓轻度黄边病毒、草莓潜伏环斑病毒、甜菜坏死性黄脉病毒和马铃薯Y病毒。

[0076] 可以由根据本发明的组合物靶向的植物致病昆虫的非限制性示例主要包括蚜虫、甲壳虫、臭虫、跳虫、蝗虫、螨虫、蚂蚁、扁虱(tick)、白粉虱、根虫、蛆虫、象鼻虫、(茎)钻孔虫、毛虫、蝴蝶、卷叶虫(leaf‑roler)和潜叶虫(leaf‑miner)。

[0077] 本发明还涉及一种用于促进植物生长和/或用于保护植物抵御至少一种植物害虫和/或至少一种植物疾病的方法，该方法包括：

[0078] ‑向植物的至少一部分以有效且基本上无植物毒性的量施加根据本发明的组合物；以及

[0079] ‑使所述植物得到抵御至少一种植物害虫和/或至少一种植物疾病的保护和/或获得使所述植物得到促生长，特别使植物得到抵御选自包括以下的组的至少一种植物害虫的保护：真菌、卵菌、细菌、病毒、类病毒、病毒养生物体、植原体、原生生物、原生动物、线虫、昆虫和寄生植物。

[0080] 在本发明的上下文中，术语“有效且非植物毒性的量”是指足以控制或破坏和/或诱导控制或破坏植物上存在的或可能出现的植物害虫并且对所述植物没有植物毒性影响的根据本发明的组合物的量和/或促进植物生长的根据本发明的组合物的量。

[0081] 优选地，根据本发明的方法允许植物得到抵御选自包括以下的组的植物害虫的保护：真菌、卵菌、细菌、病毒、类病毒、病毒样生物体、植原体、原生生物、原生动物、线虫和昆虫。

[0082] 有利地，根据本发明，将组合物在收获前或收获后，通过喷洒、喷淋、浸泡、浸渍、注射、或通过施肥系统或灌溉系统施用而施加于整个植物、根围、根系、叶、花、果实、种子、幼苗或移植的幼苗、诸如块茎或根茎的繁殖材料、和/或在其中生长植物或期望在其中生长的土壤或惰性基质。

[0083] 根据本发明的组合物可以准备好通过诸如喷洒设备的适当设备施加到植物上，或者可以是在施加到植物上之前必须稀释的商业浓缩组合物。

[0084] 本发明还涉及一种用于至少部分生产根据本发明的组合物的共培培养基，该组合物同时包括产生抗真菌脂肽的芽孢杆菌属的至少一种细菌和木霉菌属的至少一种真菌，所述共培培养基包括至少一种矿物质氮源。

[0085] 优选地，在根据本发明的共培培养基中，所述至少一种矿物质氮源选自包括以下的组：硝酸盐、亚硝酸盐及其混合物。

[0086] 有利地，根据本发明，所述硝酸盐选自包括以下的组：硝酸钠、硝酸钙、硝酸钾及其混合物。

[0087] 优选地，在根据本发明的共培培养基中，所述亚硝酸盐选自包括以下的组：亚硝酸钠、亚硝酸钙、亚硝酸钾及其混合物。

[0088] 优选地，根据本发明，所述至少一种矿物质氮源、特别是所述一种或多种硝酸盐和/或一种或多种亚硝酸盐以1mM至1M的浓度范围、优选为50mM至100mM的浓度范围、更优选为70mM的浓度存在于共培培养基中。附图说明

[0089] 本发明的这些方面和其他方面将通过示例并参考附图更详细地解释，附图中：

[0090] 图1A、图1B和图1C示出了根据单一培养(真菌在“无细菌”条件下和细菌在“无真菌”条件下)或共培养的不同培养条件下产生抗真菌脂肽物种的芽孢杆菌的生长水平(以mg‑1 ‑1干物质.l 为单位)和木霉菌物种的生长水平(以mg干物质.l 为单位)，共培养为:在含有酪蛋白氨基酸(酪氨酸，casamino acid)(酪蛋白水解物)作为有机氮源(MM酪蛋白氨基酸)的最小培养基中(图1A)；在含有NaNO3作为矿物质氮源(MM硝酸盐)的最小培养基中(图1B)；在含有NaNO2作为矿物质氮源(MM亚硝酸盐)的最小培养基中(图1C)。在共培养条件下(MM酪蛋白氨基酸、MM硝酸盐、MM亚硝酸盐)，针对不同芽孢杆菌与同一木霉菌物种共培养，用3种细菌得到的真菌干物质以平均值表示。

[0091] 图2示出了(1)根据本发明的包括NaNO3作为矿物质氮源和哈茨木霉IHEM5437(MM硝酸盐+哈茨木霉IHEM5437)的组合物/共培培养基中贝莱斯芽孢杆菌LMG P‑32278随时间‑1的生长(以mg干物质.l 为单位)以及(2)在仅包含NaNO3作为矿物质氮源(MM硝酸盐)的组合物/‑1
共培培养基中贝莱斯芽孢杆菌LMG P‑32278随时间的生长(以mg干物质.l 为单位)。

[0092] 图3示出了UPLC产生的用于检测根据本发明的组合物/共培培养基中脂肽的UV光谱，该组合物/共培培养基包括NaNO3作为矿物质氮源(MM硝酸盐)和贝莱斯芽孢杆菌LMG P‑32278和哈茨木霉IHEM5437(A)，与贝莱斯芽孢杆菌LMG P‑32278在MM赖氨酸(B)、伊枯草菌素的标准品(C)、丰原素的标准品(D)和表面活性素的标准品(E)的比较。

[0093] 图4示出了根据施加的处理每株烟草的新鲜根系生物量(《对照》、《硝酸钠》、《贝莱斯芽孢杆菌FZB42》、《哈茨木霉MUCL29707》、《贝莱斯芽孢杆菌FZB42+哈茨木霉MUCL29707》、《贝莱斯芽孢杆菌FZB42+哈茨木霉MUCL29707+硝酸钠》)。在90天内对10个植物/处理(n＝10，平均+/‑标准差)评估了这些数据。用星号标记的平均值与对照值明显不同。

[0094] 图5A、图5B、图5C和图5D示出了在没有渗透胁迫和存在轻度(mild)渗透胁迫、中度(moderate)渗透胁迫和高度渗透胁迫下，不同处理(《对照》、《硝酸钠》、《贝莱斯芽孢杆菌FZB42》、《哈茨木霉MUCL29707》、《贝莱斯芽孢杆菌FZB42+哈茨木霉MUCL29707》、《贝莱斯芽孢杆菌FZB42+哈茨木霉MUCL29707+硝酸钠》)对番茄种子发芽动力学的影响。给出的值是5次重复+/‑标准差的平均值。具体实施方案

[0095] 已经对以下芽孢杆菌和木霉菌菌株进行了几项实验：

[0096] 芽孢杆菌菌株

[0097] 已经考虑了以下菌株：贝莱斯芽孢杆菌LMG P‑32278；贝莱斯芽孢杆菌FZB42(商业上可获得‑‑公众可得的；ABiTEP GmbH，德国)和贝莱斯芽孢杆菌LMG P‑32279。

[0098] 所有菌株都在‑80℃的40％甘油中冷冻。在含有1％(w/v)胰蛋白胨、0.5％酵母提取物、0.5％ NaCl的胰蛋白胨‑酵母提取物培养基(Tryptone‑Yeast extract medium，TY)中进行过夜预培养，以用于接种培养物。回收细菌，并将细菌用生理水通过离心法洗涤3次4 ‑1
且加入培养物中，以获得2.10个细胞.ml 的最终浓度。

[0099] 木霉菌菌株

[0100] 已经考虑了以下菌株：哈茨木霉IHEM 5437、木霉菌属MUCL 58094、哈茨木霉MUCL29707(商业上可获得‑‑公众可得的；BCCM目录)和深褐木霉MUCL 58095。

[0101] 在马铃薯葡萄糖琼脂板(PDA，Merck KGaA，达姆施塔特，德国)上、在30℃温育10天后产生孢子且随后在4℃下保存孢子。用生理水回收孢子，在生理水中加入2滴吐温20并且5 ‑1
使用比尔克尔室(Burker chamber)计数。将孢子接种到培养物中，以得到2.10个孢子.ml的最终浓度。

[0102] 1.比较试验：不同组合物/培养基中产生抗真菌脂肽的芽孢杆菌多的生长和木霉菌种的生长

[0103] 根据本发明的组合物/共培培养基已经在产生抗真菌脂肽的芽孢杆菌的生长和发育方面以及木霉菌种的生长和发育方面进行了测试。

[0104] 实验在填充有以下培养基的500ml的烧瓶中进行：

[0105] ‑使用不含氮的100ml培养基：7mM的KCl、11mM的KH2HPO4、2mM的MgSO4和1％(w/v)葡萄糖和微量元素(500x原料；38mM的ZnSO4、89mM的H3BO3、12.5mM的MnCl2、9mM的FeSO4、3.55mM的CoCl2、3.2mM的CuSO4、3.1mM的Na2MoO4和87mM的EDTA‑NA2；或

[0106] ‑使用包括酪蛋白氨基酸(酪蛋白水解物)作为有机氮源的100ml培养基：0.2％(w/v)酪蛋白水解物、7mM的KCl、11mM的KH2HPO4、2mM的MgSO4和1％(w/v)葡萄糖和微量元素(500x原料；38mM的ZnSO4、89mM的H3BO3、12.5mM的MnCl2、9mM的FeSO4、3.55mM的CoCl2、3.2mM的CuSO4、3.1mM的Na2MoO4和87mM的EDTA‑NA2)；或

[0107] ‑使用包括NaNO3作为矿物质氮源的100ml最小培养基(MM)：70mM的NaNO3、7mM的KCl、11mM的KH2HPO4、2mM的MgSO4和1％(w/v)葡萄糖和微量元素(500x原料；38mM的ZnSO4、89mM的H3BO3、12.5mM的MnCl2、9mM的FeSO4、3.55mM的CoCl2、3.2mM的CuSO4、3.1mM的Na2MoO4和
87mM的EDTA)(根据本发明的组合物)；或

[0108] ‑使用相同的最小培养基(MM)，该最小培养基包括70mM NaNO2作为矿物质氮源，而不是70mM NaNO3(根据本发明的组合物)。

[0109] 在上述接种条件(针对木霉菌为2.105个孢子.ml‑1的最终浓度、并且针对芽孢杆菌4 ‑1
为2.10个细胞.ml )下一式三份进行不同的培养：对几个芽孢杆菌菌株单独培养，对几个木霉菌菌株单独培养，以及对在不同的受试培养基中同时/伴随加入的不同组合的芽孢杆菌和木霉菌菌株共培养。培养物在30℃下温育6天且以120rpm的速度震荡。培养基pH为6.5，在培养过程中不控制培养基pH。

[0110] 用V‑1200分光光度计或微孔板读取器(spectarMax M2e，分子设备，西格玛‑奥德里奇)在600nm处跟踪培养物的光密度来测量芽孢杆菌的生长速度。在微孔板读取器中，使用96孔板并将孔板在30℃下摇动培养基进行温育。为了更准确，用Accuri C6流式细胞仪(BD Accuri，圣何塞，加利福尼亚州，美国)来计数细胞。对于所有的测量，样品通过CA5 pm膜(德国赛多利斯公司，哥廷根，德国)过滤以去除真菌孢子和菌丝。根据先前确定的标准曲线，将测得的OD和细胞浓度进一步转换为干物质。

[0111] 通过测定培养结束时的干物质进行木霉菌的定量。为此，通过用已知重量的重叠纱布层过滤共培养物来回收生物量。将含有真菌生物量的纱布放入已确定重量的金属容器中。将容器和生物量在106℃下温育24h。测量总重量，并将该总重量、与容器和纱布初始重量的差值指定为真菌生物量的干物质。所获得的结果见表1和图1A、图1B和图1C。

[0112] 表1

[0113]

[0114] 表1和图1A、图1B和图1C示出了根据不同培养条件：(A)在包括酪蛋白氨基酸(酪蛋白水解物)作为有机氮源的最小培养基中(MM酪蛋白氨基酸)、(B)在包括NaNO3作为矿物质氮源的最小培养基中(MM硝酸盐)、(C)在包括NaNO2作为矿物质氮源的最小培养基中(MM亚硝酸盐)下产生抗真菌脂肽物种的芽孢杆菌的生长和木霉菌物种的生长。在图1A、图1B和图1C上，在不同MM中共培养中哈茨木霉IHEM5437、木霉菌属MUCL 58094和深褐木霉MUCL 58095的干物质分别表示为由不同细菌获得的干物质的平均值(相对于每种真菌的干物质可以在表1中找到)。

[0115] 这些结果强调了：

[0116] ‑在没有氮源的情况下不能获得根据本发明的包括产生抗真菌脂肽的芽孢杆菌属的细菌和木霉菌属的真菌的组合物/共培培养基(参见表1中的MM无氮)；

[0117] ‑当单独存在(不是在共培养中)时，产生抗真菌脂肽的芽孢杆菌属的细菌和木霉菌属的真菌能够在包含有机氮源的培养基中生长；

[0118] ‑如果氮源是有机氮源，则不能获得包括根据本发明的产生抗真菌脂肽的芽孢杆菌属的细菌和木霉菌属的真菌的组合物/共培培养基：只有产生抗真菌脂肽的芽孢杆菌属的细菌生长并长满覆盖木霉菌属的真菌；

[0119] ‑当单独存在(不是在共培养中)时，产生抗真菌脂肽的芽孢杆菌属的细菌不能在包括矿物质氮源的培养基中生长；

[0120] ‑如果氮源是矿物质氮源，则根据本发明的包括产生抗真菌脂肽的芽孢杆菌属的细菌和木霉菌属的真菌的组合物/共培培养基允许细菌和真菌两者生长：细菌和真菌都生长；

[0121] ‑在根据本发明的不同共培养中或在单一培养中测量的木霉菌菌株数量(干物质)是相等的，这表明根据本发明的组合物/共培培养基即使在存在产生抗真菌脂肽的芽孢杆菌的情况下也允许木霉菌菌株的正常生长；

[0122] ‑在单一培养中没有芽孢杆菌菌株生长的情况下测量根据本发明的不同共培养物中的芽孢杆菌菌株数量(干物质)，这表明根据本发明的组合物/共培培养基调节和优化芽孢杆菌的生长和发育。在本发明的上下文中，强调了细菌生长部分地附着在被确定为有利于细菌生长的真菌丝上。

[0123] 2.比较试验：贝莱斯芽孢杆菌LMG P‑32278在根据本发明的包含NaNO3作为矿物质氮源和哈茨木霉IHEM5437的组合物/共培培养基中的生长以及在仅包含NaNO3作为矿物质氮源的组合物/共同培养基中的生长

[0124] 已经执行了比较试验以比较贝莱斯芽孢杆菌LMG P‑32278在根据本发明的包括NaNO3作为矿物质氮源和哈茨木霉IHEM5437(MM硝酸盐+哈茨木霉IHEM5437)的组合物/共培培养基中的生长与在仅包含NaNO3作为矿物质氮源(MM硝酸盐)的组合物/共培培养基中的生长。每隔24小时测量两种培养物的OD600nm，连续6天。所获得的结果如图2所示。

[0125] 图2示出了贝莱斯芽孢杆菌LMG P‑32278在(1)根据本发明的包括NaNO3作为矿物质氮源和哈茨木霉IFIEM5437(MM硝酸盐+哈茨木霉IFIEM5437)的组合物/共培培养基中生长的生长和(2)在仅包括NaNO3作为矿物质氮源(MM硝酸盐)的组合物/共培培养基中的生长。90小时后可以看出，贝莱斯芽孢杆菌LMG P‑32278仅在根据本发明的组合物/共培培养基中生长，即，在包括NaNO3作为矿物质氮源和哈茨木霉IHEM5437的组合物/共培培养基中生长。如果不存在真菌哈茨木霉IHEM5437，则不会观察到贝莱斯芽孢杆菌LMG P‑32278的生长，只会随着时间的推移检测到初始接种量。在这个意义上和在本发明的上下文中，已经出人意料地表明，真菌木霉菌的存在有利于细菌芽孢杆菌的生长。

[0126] 3.在根据本发明的组合物/共培培养基中由贝莱斯芽孢杆菌LMG P‑32278生产脂肽

[0127] 使用ACQUITY UPLC系统(Waters，米尔福德，马塞诸塞州，美国)在6天龄的根据本发明的组合物/共培培养基中检测抗真菌脂肽，该组合物/共培培养基包括作为矿物质氮源的NaNO3、贝莱斯芽孢杆菌LMG P‑32278和哈茨木霉IHEM5437。

[0128] 样品被离心且经0,2μm纤维素滤器过滤。将10μl的样品注入Interchim C18柱(UP5TP18‑250/030 C18，Interchim，Montlugon，法国)。采用分别对应于含有0.1％三氟乙‑1酸的水和含有0.1％三氟乙酸的乙腈的溶剂A和B的梯度、在流速为0.6mL.min 下进行脂肽的分离和洗脱。梯度如下：0至20min，70％A/30％B；20至25min，55％A/45％B；25至30min，
0％A/100％B；30至35min，70％A/30％B。在这种条件下，在24分钟处洗脱伊枯草菌素，在28分钟处洗脱丰原素，在36分钟处洗脱表面活性素。

[0129] 所获得的结果如图3所示，示出了UPLC产生的用于检测根据本发明的组合物/共培培养基中的脂肽的UV光谱，该组合物/共培培养基包括NaNO3作为矿物质氮源以及贝莱斯芽孢杆菌LMG P‑32278和哈茨木霉IHEM5437两者(A)与贝莱斯芽孢杆菌LMG P‑32278在MM酪蛋白氨基酸(有机氮源)(B)、伊枯草菌素的标准品(C)、丰原素的标准品(D)和表面活性素的标准品(E)的比较。

[0130] 如图3A所示，在根据本发明的组合物/共培培养基中(即，在包括NaNO3作为矿物质氮源、贝莱斯芽孢杆菌LMG P‑32278和哈茨木霉IHEM5437的组合物/共培培养基中)没有检测到主要脂肽类伊枯草菌素、丰原素和表面活性素。在这个意义上和在本发明的上下文中，出人意料地表明，至少就主要脂肽而言，由芽孢杆菌属的细菌产生的脂肽被抑制。相反地，如图3B所示，当氮源为有机氮源时，已经检测到脂肽类伊枯草菌素、丰原素和表面活性素。

[0131] 在本发明的上下文中，鉴于所有提出的结果与所有的期望，已经确定根据本发明的组合物/共培培养基(即，包括矿物质氮源的组合物/共培培养基)允许产生抗真菌脂肽的芽孢杆菌属的至少一种细菌与木霉菌属的至少一种真菌之间的互利共生关系。实际上，利用根据本发明的组合物/共培培养基(即，利用包括矿物质氮源的组合物/共培培养基)，已经确定：

[0132] ‑抑制/减少由芽孢杆菌属的所述至少一种细菌产生的、有利于木霉菌属的所述至少一种真菌的生长的脂肽(至少就主要脂肽而言)；

[0133] ‑真菌的存在有利于产生抗真菌脂肽的芽孢杆菌属的所述至少一种细菌的生长，带来了后者的生长能力。

[0134] 4.在营养受限条件下烟草的根施(root application)试验

[0135] 将烟草种子播种在湿润的堆肥/沙(1：1)混合料上以打破休眠(23℃+/‑1℃，光周期16h/8h)。

[0136] 在4叶期，生长2周后，将幼苗单独移栽到含有与前一种相同的堆肥/沙子混合物的盆中。从这个阶段开始，在整个试验过程中定期给幼苗浇水。

[0137] 两周后(播种后D+28天)，植物在各植株的根茎接种以下溶液(1mL)而接受第一次处理(每种处理方式重复10次)：《对照(生理水)》、《0.5M硝酸钠》、《贝莱斯芽孢杆菌FZB428 8 8
(1.10CFU/ml)》、《哈茨木霉MUCL29707(1.10CFU/ml)》、《贝莱斯芽孢杆菌FZB42(1.10CFU/
8 8
ml)+哈茨木霉MUCL29707(1.10CFU/ml)》、《贝莱斯芽孢杆菌FZB42(1.10CFU/ml)+哈茨木霉
8
MUCL29707(1.10CFU/ml)+0.5M硝酸钠》(根据本发明的组合物)。在D+42天和D+66天重复相同处理的接种。

[0138] 在D+90天时，收获植株，并测定其新鲜根系生物量。

[0139] 所得结果如图4所示。由此可见，用《硝酸钠》、《贝莱斯芽孢杆菌FZB42》、《哈茨木霉MUCL29707》、《贝莱斯芽孢杆菌FZB42+哈茨木霉MUCL29707》处理获得的新鲜根系生物量与用《对照》获得的生物量没有显著差异：生物量在34.7至44g的范围内。

[0140] 使用根据本发明的组合物(《贝莱斯芽孢杆菌FZB42+哈茨木霉MUCL29707+硝酸钠》)的处理实现了显著更高的根系产量(约60g)。

[0141] 用Minitab 19.2020.1软件进行统计分析。在实验过程中，用分类标准(广义线性模型)对目标的空间排列进行方差分析。在拒绝各种处理的平均值相等的零假设的情况下，与对照相比，这些使用Dunnett检验进行分类。

[0142] 与在没有矿物质氮源的情况下单独施用微生物或它们的组合相比，这些结果证实了根据本发明的组合物在刺激根系生产以及因此在烟草植物中的生长方面的效率。

[0143] 5.番茄经受水分胁迫条件下的体外发芽试验

[0144] 番茄种子用14％次氯酸钠和96％乙醇灭菌，然后用脱盐水彻底漂洗，并且随后放入培养皿中。

[0145] 每个皮氏培养皿放置20粒种子。根据研究的渗透胁迫水平，将各盒子中的惠特曼(Whatman)过滤器浸泡在特定的PEG(Polyethylene glycol，聚乙二醇)溶液中，以产生0、‑0.1、‑0.2或‑0.3MPa的水分胁迫。

[0146] 以下溶液《0.5M硝酸钠》、《贝莱斯芽孢杆菌FZB42(1.108CFU/ml)》、《哈茨木霉8 8
MUCL29707(1.10CFU/ml)》、《贝莱斯芽孢杆菌FZB42(1.10 CFU/ml)+哈茨木霉MUCL29707
8 8 8
(1.10CFU/ml)》、《贝莱斯芽孢杆菌FZB42(1.10 CFU/ml)+哈茨木霉MUCL29707(1.10 CFU/ml)+0.5M硝酸钠》(根据本发明的组合物)与对照(生理水)一起通过微量移液管(5μL/种子)直接接种到种子上。每个测试中，每个处理模式对每个水平的水分胁迫进行5次重复。

[0147] 将含有接过种子的皮氏培养皿密封并放置在培养箱中10天(23℃+/‑1℃，16h/8h光周期)。

[0148] 每天，连续10天，对发芽的种子进行计数。10天后，对发芽种子的地上部分和根系部分进行称重。

[0149] 所得结果如图5A至5D所示。番茄种子发芽动力学根据渗透胁迫水平的不同而不同。事实上，在没有胁迫或存在轻度渗透胁迫的情况下，对于所有处理发芽动力学都是相似的(参见图5A和5B)。

[0150] 在存在中等渗透胁迫和高度渗透胁迫的情况下(参见图5C和5D)，根据本发明的组合物(贝莱斯芽孢杆菌FZB42+哈茨木霉MUCL29707+NaNO3)具有显著的积极效果。如图5C和图5D所示，只有用根据本发明的组合物处理的种子能够在‑0.2和‑0.3MPa的渗透应力下发芽。播种10天后，约50％和30％的种子发芽。

[0151] 用Minitab 19.2020.1软件进行统计分析。在实验过程中，用分类标准(广义线性模型)对目标的空间排列进行方差分析。在拒绝各种处理的平均值相等的零假设的情况下，与对照相比，这些使用Dunnett检验进行分类。

[0152] 这些结果证明根据本发明的组合物(贝莱斯芽孢杆菌FZB42+哈茨木霉MUCL29707+硝酸钠)有助于提高番茄种子的发芽，从而有助于番茄植株在存在显著渗透胁迫下的生长。

[0153] 6.生菜植物保护试验

[0154] 提供四叶期的生菜(Lucreta，Rijk Zwaan)未经处理的试管苗。这些植物是4周前在泥炭区(peat block)播种的，从那一刻起就没有受到任何作物保护。在试验之前，给植物浇水以保持在育苗室中的生长(22℃光照14小时，95％RV；以及18℃黑暗10小时，100％ RV)。

[0155] 11天后，这些植物(每个处理30株植物)接受了《硝酸钠》、《贝莱斯芽孢杆菌LMG P‑8 8
32279(1.10 CFU/ml)》、《哈茨木霉MUCL29707(1.10 CFU/ml)》、《贝莱斯芽孢杆菌LMG P‑
8 8
32279(1.10CFU/ml)+哈茨木霉MUCL29707(1.10CFU/ml)》、《贝莱斯芽孢杆菌LMG P‑32279
8 8
(1.10CFU/ml)+哈茨木霉MUCL29707(1.10CFU/ml)+0.1M硝酸钠》(根据本发明的组合物)的保护处理。通过在整个试管苗上喷洒施加这种处理。对于每个植株，使用了1g的产品。然后用200mL的水把产品淋掉，这样产品可以吸进泥炭区，并到达植物根系。

[0156] 一周后，这些植物用立枯丝核菌(Rhizoctonia Solani)感染(将受感染的谷粒放在植物的底部)。在试验期间，这些植物被放在托盘上，它们可以得到有效地浇水并保持在温暖和潮湿的条件下。一周后对保护进行了评估。

[0157] 使用汤森德‑弗洛伊贝格(Townsend‑Fleuberger)公式计算了“丝核菌指数”：(0*具有0级丝核菌的植物数目+1*具有1级丝核菌的植物数目+2*具有2级丝核菌的植物数目+3*具有3级丝核菌的植物数目+4*具有4级丝核菌的植物数目)/(4*植物重复)*100。各级对应于以下标准：0级＝无感染；1级＝开始感染(叶脉或叶柄上的锈斑)；2级＝1‑3片叶被感染，茎基部上有锈斑；3级＝开始枯萎，叶片被进一步感染；4级＝全部枯萎。高分意味着显著的症状，因此处理的保护效果低。然而，低分对应于对丝核菌的较高保护。

[0158] 所获得的结果列于表2。由此可见，根据使用的处理获得不同的“丝核菌指数”。利用《硝酸钠》(得分4)、《贝莱斯芽孢杆菌LMG R‑32279》(得分5)、《哈茨木霉MUCL29707》(得分5)、《贝莱斯芽孢杆菌LMG P‑32279+哈茨木霉MUCL29707》(得分10)处理获得的保护低于用根据本发明的组合物(《贝莱斯芽孢杆菌LMG P‑32279+哈茨木霉MUCL29707+硝酸钠》)(得分
2)的处理获得的保护。

[0159] 表2

[0160]

[0161] 这些结果证明，根据本发明的组合物(贝莱斯芽孢杆菌LMG P‑32279+哈茨木霉MUCL29707+NaNO3)有助于保护植物抵御植物害虫和植物疾病。事实上，由于与其他处理相比减少了该病原菌对生菜的影响，因此证实了根据本发明的组合物在保护生菜植物抵御丝核菌感染的有效性。

[0162] 已经根据特定实施方案描述了本发明，这些具体实施方案是本发明的说明性的，并且不被解释为限制。更一般地，本领域技术人员将理解，本发明不受上文具体示出和/或描述的限制。

[0163] 使用动词“包含”、“包括”、“由……构成”或任何其他变体以及它们各自的词形变化，并不排除存在所述元素以外的其他元素。

[0164] 在元素之前使用冠词“一个(a/an)”或“该/所述”并不排除存在多个这样的元素。

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