[0001] 本发明属于生物技术领域，涉及CGT‑ODN在免疫调节中的应用。

[0002] 核酸是模式识别受体(PRRs)检测到的启动先天免疫反应的主要保守病原体决定簇。含有CpG基序的细胞外细菌单链DNA(ssDNA)及其合成模拟物CpG寡核苷酸(ODNs)可被免疫细胞内化，并被内体中的Tolllike受体9(TLR9)识别。CpG ODN已显示出对抗癌症、感染和过敏性疾病的巨大潜力。

[0003] 第一类待鉴定的PRRs是Toll样受体(TLRs)，它是识别细胞外或内体病原体配体的膜蛋白。然而，一些病原体可以逃避TLRs的检测，进入宿主细胞质或细胞核。因此，大多数TLR具有感知相似配体的细胞内互补PRR，如用于RNA的TLR3和RIG‑I/MDA5，以及用于脂多糖(LPS)的TLR4和胱天蛋白酶。Toll样受体9(TLR9)是ssDNA中CpG基序的特异性受体，内化到内体中，但它对胞质或核酸ssDNA“视而不见”，主要在专业免疫细胞中表达，这表明存在广泛表达的细胞内ssDNA PRR。然而，迄今为止，还没有明确鉴定出这种特异性检测细胞内ssDNA的TLR9互补受体。

[0004] 在TLR9被克隆的几十年前，细菌ssDNA被鉴定为卡氏杆菌(BCG)免疫治疗的关键活性成分，这是一种与科利毒素密切相关的策略。随后发现，未甲基化的CpG基序对某些免疫细胞内吞的ssDNA和合成寡核苷酸(ODN)的免疫刺激活性至关重要，这导致了基于CpG‑ODN的疫苗佐剂、抗肿瘤疗法以及过敏性和感染性疾病治疗的各种临床试验。值得注意的是，在这些应用中使用的递送系统，以及反义寡核苷酸(ASO)治疗、基于ssDNA供体的基因编辑和内吞作用也可以导致ssDNA在细胞质和细胞核中的积累。然而，目前还不清楚细胞内ssDNA是否以及如何刺激先天免疫反应。

[0005] 为了解决现有技术中存在的技术问题，本发明提供了如下的技术方案：

[0006] 本发明提供了一种CGT‑ODN核苷酸序列，所述CGT‑ODN核苷酸序列如下所示：

[0007] 5’‑(X)nCGT/A(X)m(G)a(X)b(G)c(X)d‑3’，

[0008] 其中，X为任意核苷酸碱基，n代表≥0的任意整数数值，m代表≥0的任意整数数值，a代表≥0的任意整数数值，b代表≥0的任意整数数值，c代表≥0的任意整数数值，d代表≥0的任意整数数值，C代表选自胞嘧啶、5‑甲基胞嘧啶，G代表选自鸟嘌呤，T代表胸腺嘧啶，A代表腺嘌呤，a、c至少有一项数值为≥1的整数；

[0009] 进一步，所述a、c至少有一项数值为≥2的整数；

[0010] 进一步，所述CGT‑ODN核苷酸序列侧翼序列富含连续G核苷酸；

[0011] 进一步，所述CGT‑ODN核苷酸序列具有磷酸二酯连接。

[0012] 在一些实施方案中，所述CGT‑ODN核苷酸序列不存在硫代磷酸(PS)和2’‑O‑甲基骨架，硫代磷酸(PS)和2’‑O‑甲基骨架会破坏ODN的免疫刺激活性。在一些实施方案中，所述CGT‑ODN核苷酸序列可以是甲基化序列。在一些实施方案中，所述CGT‑ODN核苷酸序列可以是回文序列。

[0013] 在一些实施方案中，所述CGT‑ODN核苷酸序列需要至少一个CGT/A基序，侧翼序列即下游序列存在连续的至少2个G核苷酸序列，连续的G核苷酸序列可直接排列于CGT/A基序后，也可间隔其他序列排列于CGT/A基序下游。

[0014] 在一些实施方案中，所述CGT‑ODN核苷酸序列并不限制核苷酸序列的长度，进一步的，所述核苷酸序列的长度包括但不限于10nt、11nt、12nt、13nt、14nt、15nt、16nt、17nt、18nt、19nt、20nt、21nt、22nt、23nt、24nt、25nt、26nt、27nt、28nt、29nt、30nt、31nt、32nt、
33nt、34nt、35nt、36nt、37nt、38nt、39nt、40nt、41nt、42nt、43nt、44nt、45nt、46nt、47nt、
48nt、49nt、50nt、51nt、52nt、53nt、54nt、55nt、56nt、57nt、58nt、59nt、60nt、61nt、62nt、
63nt、64nt、65nt、66nt、67nt、68nt、69nt、70nt、71nt、72nt、73nt、74nt、75nt、76nt、77nt、
78nt、79nt、80nt、81nt、82nt、83nt、84nt、85nt、86nt、87nt、88nt、89nt、90nt、91nt、92nt、
93nt、94nt、95nt、96nt、97nt、98nt、99nt、100nt、200nt、300nt、400nt、500nt、1000nt、
10000nt。

[0015] 在本发明中，术语“ODN”是指能够激活免疫应答的寡聚脱氧核苷酸，“ODN”在本发明中不具体限制核苷酸长度。特别的，术语“CGT‑ODN”是指具备CGT/A基序与下游连续G核苷酸序列的，显示出免疫激活功能的寡聚脱氧核苷酸。术语“连续G核苷酸序列”是指通过磷酸二酯键连续偶联至少2个鸟嘌呤脱氧核糖核酸到CGT‑ODN上的形式，所述“CGT”中的胞嘧啶脱氧核糖核酸可以是甲基化的，也可是非甲基化的，所述CGT‑ODN核苷酸序列可以是拥有回文序列的，也可以是不具有回文序列的。

[0016] 进一步，所述CGT‑ODN核苷酸序列与SEQ ID NO:1‑15任一所示的核苷酸序列具有至少90％、优选至少95％、优选至少96％、优选至少97％、优选至少97％、优选至少98％、优选至少99％的同一性。

[0017] 在本发明使用的术语“同一性”是指通过在比对窗里比较两个最佳比对序列(例如，核酸序列)测定的数值，其中为了两个序列的最佳比对，比较窗中序列的部分与参照序列(其不包含添加或缺失)相比可以包含添加或缺失(即，缺口)。通过测定两个序列中存在相同核苷酸或氨基酸残基的位置的数目以产生匹配位置数目，将匹配位置的数目除以比较窗中位置的总数，并将结果乘以100以产生序列同一性百分比来计算百分比。与参照序列相比每个位置处相同的序列说成与参照序列是100％相同的，且反之亦然。

[0018] 进一步，所述CGT‑ODN核苷酸序列如SEQ ID NO:1‑15任一所示。

[0019] 进一步，所述CGT‑ODN核苷酸序列如SEQ ID NO:1‑9任一所示。

[0020] 进一步，所述CGT‑ODN核苷酸序列如SEQ ID NO:1、3、4、6、8任一所示。

[0021] 进一步，所述CGT‑ODN核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。

[0022] 进一步，所述CGT‑ODN核苷酸序列可以是天然源或人工合成的。

[0023] 进一步，所述CGT‑ODN核苷酸序列具备CGT基序、CGA基序、CGT+CGA基序。

[0024] 在一些实施方案中，所述CGT‑ODN核苷酸序列不限制具体生物来源，所述生物来源可包括任何可具备CGT‑ODN核苷酸序列通式结构的生物，具体包括但不限于细菌、病毒、植物、动物等。

[0025] 本发明中使用的术语“核苷酸”或“核酸”是指通过骨架连接的碱基组成的多脱氧核苷酸(DNA或其类似物)。在DNA中，常见的碱基是腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胸腺嘧啶(T)和胞嘧啶(C)，虽然核酸可以包含碱基类似物(如肌苷)和无碱基位置(例如，在一个或者读个位置缺乏核苷酸的磷酸二酯骨架，美国专利号5585481)。

[0026] 本发明提供了一种载体，所述载体包括前面所述的CGT‑ODN核苷酸序列。

[0027] 进一步，所述载体包括质粒载体、慢病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体、piggyBac载体或Sleeping Beauty转座载体。

[0028] 在本发明中使用的术语“载体”或“表达载体”包括能够指导核酸表达的任何核酸。术语“载体”包括病毒载体、质粒载体和类似物。可以使用两种基本的递送方案将表达载体递送至细胞：使用病毒载体的基于病毒的递送系统和使用例如质粒载体的基于非病毒的递送系统。

[0029] 本发明提供了一种药物组合物，所述药物组合物包括前面所述的CGT‑ODN核苷酸序列、前面所述的载体，和药学上可接受的辅剂。

[0030] 进一步，所述药学上可接受的辅剂包括静脉滴注、皮下注射、静脉推注、玻璃体内注射、肌肉注射所需的辅剂。

[0031] 在一些实施方案中，所述药学上可接受的辅剂包括稀释剂、载体、赋形剂以及稳定剂，药学上可接受的辅剂在所采用的剂量和浓度下对接受者无毒。在一些实施方案中，所述药学上可接受的辅剂还包括缓冲剂、抗氧化剂、防腐剂、蛋白质、亲水性聚合物、氨基酸、单糖、二糖以及其它碳水化合物类、螯合剂、糖类、成盐反离子、金属络合物、非离子型表面活性剂。

[0032] 在一些具体的实施方案中，所述缓冲剂包括磷酸盐、柠檬酸盐以及其它有机酸。在一些具体的实施方案中，所述抗氧化剂包括抗坏血酸和甲硫氨酸。在一些具体的实施方案中，所述防腐剂包括十八烷基二甲基苄基氯化铵、六甲氯铵、苯扎氯铵、苄索氯铵、苯酚、丁基或苄基醇、对羟基苯甲酸烷基酯、对羟基苯甲酸甲酯或丙酯、儿茶酚、间苯二酚、环己醇、3‑戊醇以及间甲酚。在一些具体的实施方案中，所述蛋白质包括血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白。在一些具体的实施方案中，所述亲水性聚合物包括聚乙烯吡咯烷酮。在一些具体的实施方案中，所述氨基酸包括甘氨酸、谷氨酰胺、天门冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸。在一些具体的实施方案中，所述单糖、二糖以及其它碳水化合物类包括葡萄糖、甘露糖或糊精。
在一些具体的实施方案中，所述螯合剂包括EDTA。在一些具体的实施方案中，所述糖类包括蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨糖醇。在一些具体的实施方案中，所述成盐反离子包括钠。在一些具体的实施方案中，所述金属络合物包括Zn‑蛋白络合物。在一些具体的实施方案中，所述非离子型表面活性剂包括TWEENTM、PLURONICSTM或聚乙二醇(PEG)。在一些实施方案中，活性药物成分还可例如通过凝聚技术或通过界面聚合包裹在所制备的微胶囊中，分别例如羟基甲基纤维素或明胶微胶囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊；包裹在胶体药物递送系统(例如脂质体、白蛋白微球体、微乳液、纳米颗粒以及纳米胶囊)或粗乳液中。

[0033] 本发明提供了前面所述的CGT‑ODN核苷酸序列、前面所述的载体、前面所述的药物组合物在免疫调节中的应用。

[0034] 进一步，所述免疫调节包括免疫反应的激活、免疫刺激活性、细胞因子表达的调控。

[0035] 进一步，所述细胞因子包括JNK、p38、NFκB信号通路的细胞因子。

[0036] 进一步，所述细胞因子包括TNF、IFNB1、CXCL8、IL‑11、IL‑12A、IL‑32、CCL2、CCL4、ANKRD1、TNFAIP3、JUN、FOS、FOSL1、FOSL2、NFKB1、NFKB2、CASP3、MAP3K14。

[0037] 进一步，所述细胞因子包括TNF、IFNB1、CXCL8。

[0038] 本发明提供了前面所述的CGT‑ODN核苷酸序列、前面所述的载体在用于制备治疗或预防感染性疾病、过敏性疾病、免疫缺陷性疾病、肿瘤的药物组合物中的应用。

[0039] 在一些实施方案中，所述免疫缺陷性疾病类型包括但不限于炎症、抗磷脂综合征、系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、自身免疫性血管炎、乳糜泻、自身免疫性甲状腺炎、输血后免疫、母体胎儿不相容(maternal‑fetal incompatibility)、输血反应、免疫缺陷诸如IgA缺陷、常见变异型免疫缺陷、药物诱导性狼疮、糖尿病、I型糖尿病、II型糖尿病、幼年型糖尿病、幼年型类风湿性关节炎、银屑病性关节炎、多发性硬化、免疫缺陷、过敏、哮喘、银屑病、特应性皮炎、过敏性接触性皮炎、慢性皮肤病、肌萎缩侧索硬化、化疗所致损伤、移植物抗宿主病(graft‑vs‑host diseases)、骨髓移植排斥、强直性脊柱炎、特应性湿疹、天疱疮、白塞病、慢性疲劳综合症纤维肌痛、化疗所致损伤、重症肌无力、肾小球肾炎、过敏性视网膜炎、系统性硬化、亚急性皮肤型红斑狼疮、包括冻疮样红斑狼疮的皮肤型红斑狼疮、干燥综合征、自身免疫性肾炎、自身免疫性血管炎、自身免疫性肝炎、自身免疫性心脏炎、自身免疫性脑炎、自身免疫介导的血液病、lc‑SSc(局限性皮肤型硬皮病)、dc‑SSc(弥漫性皮肤型硬皮病)、自身免疫性甲状腺炎(AT)、格雷夫斯病(GD)、重症肌无力、多发性硬化(MS)、强直性脊柱炎、移植排斥、免疫衰老、风湿性/自身免疫性疾病、混合型结缔组织病、脊柱关节病、银屑病、银屑病性关节炎、肌炎、硬皮病、皮肌炎、自身免疫性血管炎、混合型结缔组织病、特发性血小板减少性紫癜、克罗恩病、人类佐剂病、骨性关节炎、幼年型慢性关节炎、脊柱关节病、特发性炎性肌病、系统性血管炎、结节病、自身免疫性溶血性贫血、自身免疫性血小板减少症、甲状腺炎、免疫介导的肾病、中枢或外周神经系统脱髓鞘病、特发性脱髓鞘多神经病、格林‑巴利综合征、慢性炎性脱髓鞘多神经病、肝胆疾病、传染性或自身免疫性慢性活动性肝炎、原发性胆汁性肝硬化、肉芽肿性肝炎、硬化性胆管炎、炎性肠病、谷蛋白敏感性肠病、惠普尔病、自身免疫性或免疫介导的皮肤病、大疱性皮肤病、多形性红斑、过敏性鼻炎、特应性皮炎、食物过敏、荨麻疹、肺部免疫性疾病、嗜酸性肺炎、特发性肺纤维化、过敏性肺炎、移植相关疾病、移植物排斥或移植物抗宿主病、银屑病性关节炎、银屑病、皮炎、多肌炎/皮肌炎、中毒性表皮坏死松解症、系统性硬皮病和硬化、与炎性肠病相关的应答、克罗恩病、溃疡性结肠炎、呼吸窘迫综合征、成人型呼吸窘迫综合征(ARDS)、脑膜炎、脑炎、葡萄膜炎、结肠炎、肾小球肾炎、过敏性状况、湿疹、哮喘、涉及T细胞浸润和慢性炎性应答的状况、动脉粥样硬化、自身免疫性心肌炎、白细胞黏附缺陷症、过敏性脑脊髓炎、与由细胞因子和T淋巴细胞介导的急性和迟发性过敏相关的免疫应答、结核病、结节病、包括韦格纳肉芽肿病的肉芽肿病、粒细胞缺乏症、血管炎(包括ANCA)、再生障碍性贫血、Diamond Blackfan贫血、包括自身免疫性溶血性贫血(AIHA)的免疫性溶血性贫血、恶性贫血、纯红细胞再生障碍(PRCA)、因子VIII缺乏症、血友病A、自身免疫性中性粒细胞减少症、全血细胞减少症、白细胞减少症、涉及白细胞渗出的疾病、中枢神经系统(CNS)炎性紊乱、多器官损伤综合征、重症肌无力、抗原‑抗体复合物介导的疾病、抗肾小球基膜病、抗磷脂抗体综合征、过敏性神经炎、白塞病、Castleman综合征、Goodpasture综合征、兰伯特‑伊顿肌无力综合征、雷诺综合征、干燥综合征、斯‑约综合征、大疱性类天疱疮、天疱疮、自身免疫性多内分泌腺疾病、Reiter病、僵人综合征、巨细胞性动脉炎、免疫复合物性肾炎、IgA肾病、IgM多神经病或IgM介导的神经病、特发性血小板减少性紫癜(ITP)、血栓性血小板减少性紫癜(TTP)、自身免疫性血小板减少症、包括自身免疫性睾丸炎和卵巢炎的睾丸和卵巢自身免疫性疾病、原发性甲状腺功能减退症、包括自身免疫性甲状腺炎的自身免疫性内分泌疾病、慢性甲状腺炎(桥本甲状腺炎)、亚急性甲状腺炎、特发性甲状腺功能减退症、爱迪生氏病、格雷夫斯病、自身免疫性多内分泌腺综合征(或多腺性内分泌病综合征)、席汉氏综合征、自身免疫性肝炎、淋巴细胞性间质性肺炎(HIV)、闭塞性细支气管炎(非移植)对NSIP、格林‑巴利综合征、大血管血管炎(包括风湿性多肌痛和巨细胞性(高安)动脉炎)、中血管血管炎(包括川崎病和结节性多动脉炎)、强直性脊柱炎、Berger病(IgA肾病)、快速进行肾小球肾炎、原发性胆汁性肝硬化、口炎性腹泻(Celiac sprue)(谷蛋白肠病)、冷球蛋白血症、和肌萎缩侧索硬化(ALS)。

[0040] 在一些实施方案中，所述肿瘤类型包括但不限于急性成淋巴细胞性白血病(ALL)、急性髓性白血病、肾上腺皮质癌、成人急性髓性白血病、成人原发部位不明癌、成人恶性间皮瘤、艾滋病相关癌症、艾滋病相关淋巴瘤、肛门癌、阑尾癌、星形细胞瘤、儿童小脑或大脑癌、基底细胞癌、胆管癌、膀胱癌、骨肿瘤、骨肉瘤/恶性纤维组织细胞瘤、脑癌、脑干胶质瘤、乳腺癌、支气管腺瘤/类癌、伯基特淋巴瘤、类癌瘤、原发性不明的癌、中枢神经系统淋巴瘤、小脑星形细胞瘤、大脑星形细胞瘤/恶性神经胶质瘤、宫颈癌、儿童急性髓性白血病、儿童原发部位不明的癌症、儿童癌症、儿童大脑星形细胞瘤、儿童间皮瘤、软骨肉瘤、慢性淋巴细胞白血病、慢性髓细胞性白血病、慢性骨髓增生性紊乱、结肠癌、皮肤T细胞淋巴瘤、促结缔组织增生性小圆细胞肿瘤、子宫内膜癌、子宫内膜子宫癌、室管膜瘤、上皮样血管内皮瘤(EHE)、食管癌、尤因肿瘤肉瘤家族、尤因肿瘤家族中的尤因肉瘤、颅外生殖细胞肿瘤、性腺外生殖细胞肿瘤、肝外胆管癌、眼癌、眼内黑素瘤、胆囊癌、胃(gastric)(胃(stomach))癌、胃类癌、胃肠道类癌肿瘤、胃肠道间质瘤(GIST)、妊娠性滋养层细胞瘤、脑干胶质瘤、胶质瘤、毛细胞白血病、头颈癌、心脏癌、肝细胞(肝)癌、霍奇金淋巴瘤、下咽癌、下丘脑和视觉途径胶质瘤、胰岛细胞癌(内分泌胰腺)、卡波西肉瘤、肾癌(肾细胞癌)、喉癌、急性成淋巴细胞性白血病(也称为急性淋巴细胞白血病)、急性髓性白血病(也称为急性髓细胞性白血病)、慢性淋巴细胞性白血病(也称为慢性淋巴细胞白血病)、白血病(leukaemia)、慢性髓细胞性白血病(也称为慢性髓性白血病)、毛细胞白血病(leukemia)、唇及口腔癌、脂肪肉瘤、肝癌(原发性)、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、淋巴瘤(艾滋病相关)、淋巴瘤、巨球蛋白血症、男性乳腺癌、骨恶性纤维组织细胞瘤/骨肉瘤、髓母细胞瘤、黑素瘤、梅克尔细胞癌、原发灶隐匿转移性颈部鳞状癌、口癌、多发性内分泌肿瘤综合征、儿童多发性骨髓瘤(骨髓癌)、多发性骨髓瘤/浆细胞赘生物、蕈样肉芽肿、骨髓增生异常综合征、骨髓增生异常/骨髓增生性疾病、慢性髓细胞性白血病、粘液瘤、鼻腔和副鼻窦癌、鼻咽癌、神经母细胞瘤、非霍奇金淋巴瘤、非小细胞肺癌、少突神经胶质瘤、口腔癌、口咽癌、骨肉瘤/骨恶性纤维组织细胞瘤、卵巢癌、卵巢上皮癌(表面上皮间质肿瘤)、卵巢生殖细胞瘤、卵巢低恶性潜能肿瘤、胰腺癌、胰岛细胞癌、副鼻窦和鼻腔癌、甲状旁腺癌、阴茎癌、咽癌、嗜铬细胞瘤、松果体星形细胞瘤、松果体生殖细胞瘤、松果体母细胞瘤和幕上原始神经外胚层肿瘤、垂体腺瘤、浆细胞赘生物/多发性骨髓瘤、胸膜肺母细胞瘤、原发性中枢神经系统淋巴瘤、前列腺癌、直肠癌、肾细胞癌(肾癌)、肾盂和输尿管移行细胞癌、视网膜母细胞瘤、横纹肌肉瘤、唾液腺癌、Sézary综合征、皮肤癌(黑素瘤)、皮肤癌(非黑素瘤)、梅克尔细胞皮肤癌、小细胞肺癌、小肠癌、软组织肉瘤、鳞状细胞癌、原发灶隐匿转移性颈部鳞状癌、胃癌、幕上原始神经外胚层肿瘤、皮肤T细胞淋巴瘤、睾丸癌、喉癌、胸腺瘤和胸腺癌、胸腺瘤、甲状腺癌、肾盂和输尿管移行细胞癌、输尿管和肾盂移行细胞癌、尿道癌、子宫肉瘤、阴道癌、视觉途径和下丘脑神经胶质瘤、儿童视觉途径和下丘脑神经胶质瘤、外阴癌、巨球蛋白血症和肾母细胞瘤(肾癌)。

[0041] 本发明提供了前面所述的CGT‑ODN核苷酸序列、前面所述的载体在制备疫苗中的应用。

[0042] 进一步，所述疫苗包括亚单位疫苗、病毒载体疫苗。

[0043] 术语“亚单位疫苗”在本发明是指利用基因工程方法将CGT‑ODN核苷酸序列克隆到原核或真核表达系统中，使其高效表达而制成的疫苗。

[0044] 术语“病毒载体疫苗”中所述病毒载体具有复制能力可作为外源基因的载体而保持自身传染性。

[0045] 进一步，所述病毒载体疫苗中的载体自组装为病毒样颗粒。

[0046] 进一步，所述载体包括自我失活型载体。

[0047] 进一步，所述病毒选自慢病毒、流感病毒、肝炎病毒、甲病毒、丝状病毒、腺病毒、腺相关病毒和/或黄病毒。

[0048] 在一些实施方案中，所述疫苗是包括生物分子的制剂，该生物分子是例如蛋白质、或编码蛋白质的核酸分子、碳水化合物、脂质或上述各者的组合。在一些实施方案中，存在预防性和治疗性疫苗。术语疫苗通常是指给予受试者的产品，即包含佐剂(若存在)、载体(若存在)、活性成分(本发明代指CGT‑ODN核苷酸序列)、稳定剂或其他赋形剂。如本文中所使用的术语疫苗并不暗示制剂在预防疾病或治愈疾病中有效。

[0049] 本发明提供了前面所述的CGT‑ODN核苷酸序列、前面所述的载体在抗体生产中的应用。

[0050] 本发明中使用的术语“抗体”包括有相同结构特征的约150000道尔顿的异四聚糖蛋白，其由两个相同的轻链(L)和两个相同的重链(H)组成。每条轻链通过一个共价二硫键与重链相连，而不同免疫球蛋白同种型的重链间的二硫键数目不同。每条重链和轻链也有规则间隔的链内二硫键。每条重链的一端有可变区(VH)。其后是多个恒定区。每条轻链的一端有可变区(VL)，另一端有恒定区；轻链的恒定区与重链的第一个恒定区相对，轻链的可变区与重链的可变区相对。特殊的氨基酸残基在轻链和重链的可变区之间形成界面。

[0051] 本发明提供了前面所述的CGT‑ODN核苷酸序列、前面所述的载体在调控tRNA降解程度中的应用。

[0052] 进一步，所述tRNA包括type II tRNA。

[0053] 本发明提供了一种制备CGT‑ODN相关抗体的方法，所述方法包括使用前面所述的CGT‑ODN核苷酸序列、前面所述的载体进行非人类动物免疫获得抗体。

[0054] 进一步，所述非人类动物为哺乳动物。

[0055] 进一步，所述哺乳动物包括小鼠、大鼠、豚鼠、兔、羊、牛、马、非人类灵长类动物。

[0056] 术语“非人类动物”和“非人类哺乳动物”在本文可互换使用，且包括哺乳动物，诸如大鼠、小鼠、兔子、绵羊、猫、狗、奶牛、猪和非人类灵长类动物。附图说明

[0057] 图1是ssDNA的溴化乙锭(EB)染色和SYBR熔解曲线结果图；

[0058] 图2是ssDNA的TLR9非依赖性免疫刺激活性结果图；

[0059] 图3是细菌ssDNA与人ssDNA的细胞活力与细胞因子表达结果图；

[0060] 图4是人全基因组ssDNA筛选流程图；

[0061] 图5是ODN转染HEK293和293A细胞的优化方法凝胶检测结果图；

[0062] 图6是ODN转染HEK293和293A细胞后吸光度检测结果图；

[0063] 图7是检测ODN‑HEK293的剂量‑效应关系的结晶紫染色法结果和细胞形态图；

[0064] 图8是ODN60转染293A细胞后细胞形态变化的时程分析结果图；

[0065] 图9是ODN对不同细胞类型的免疫刺激作用结果图；

[0066] 图10是HEK293细胞转染不同形式的ODN或ORN后细胞的形态学变化和基于ATP的细胞活力结果图；其中，ODNrc，反向互补ODN；ORN，与ODN序列相同的寡核糖核苷酸；dsODN，由ODN和ODNrc退火得到的双链ODN；

[0067] 图11是ODN序列的长度对HEK293细胞活力的影响结果图；

[0068] 图12是ODN60与ODN60rc电转293A细胞12h的形态结果，以及不同ODN转染HEK293或ODN直接细胞外孵育48h的细胞活力分析结果图；

[0069] 图13是293A细胞中转染ODN60或ODN60rc后韦恩图与KEGG Orthology数据库分析图；

[0070] 图14是293A细胞处理后的细胞因子表达谱热图与上调的细胞因子qPCR验证结果图；

[0071] 图15是ODNs转染DU145细胞24h后qPCR检测结果图；

[0072] 图16是IPA数据库分析结果与TNFR通路相关的DEGs分析结果图；

[0073] 图17是ODN60与ODN60rc转染HEK293后免疫印迹分析通路活化的时间和剂量效应结果图；

[0074] 图18是DU145细胞转染指定的顶部和底部ODN 24h后抗体免疫印迹分析结果图；其中UT代表未处理细胞；

[0075] 图19是转染ODNs的293A细胞的核部分的抗体免疫印迹分析结果图；

[0076] 图20是不同siRNA转染的HEK293细胞使用ODN60刺激12h后qPCR检测IFNB1、CXCL8的表达结果图；

[0077] 图21是不同ODN的转染效率检测结果图；

[0078] 图22是ODN60中指示的邻近核苷酸的交换对刺激活性的影响结果图；

[0079] 图23是ODN60的3’端截短对刺激活性的影响结果图；

[0080] 图24是将ODN60的CGT基序进行不同突变后转染HEK293细胞后免疫刺激活性检测结果图；

[0081] 图25是对图6所示的排序区间内含ODN的CGT/A的百分比划分结果图；

[0082] 图26是HEK293细胞中转染携带CGT/A基序突变的顶级ODN的ATP细胞活力检测结果、细胞形态和细胞因子激活结果图；其中，CGT，野生型序列；AGT，CGT→AGT突变；CCG，CGT→CCG突变；CGG，CGT(CGA for ODN86)突变为CGG突变；

[0083] 图27是CGT/A基序在最高和最低ODN中的位置统计图；

[0084] 图28是顶级和中间ODNs的CGT基序侧翼序列特征分析结果与不同碱基百分比统计结果图；

[0085] 图29是根据ODN序列特征合成ODN‑H和ODN‑L的具体序列与转染HEK293后的细胞因子激活结果图；

[0086] 图30是ODN序列中CGT/A基序侧翼序列连续G或T碱基分布对细胞中细胞因子激活效力影响结果图；

[0087] 图31是ODN序列中CGT/A和CGT/A侧翼序列包含超过3个G的百分比统计结果图；

[0088] 图32是病毒基因组的更具刺激性的ODN的统计结果图；

[0089] 图33是CGT/A ODN中2’‑O甲基化修饰、RNA碱基替换、硫代磷酸酯(PS)键和胞苷甲基化对刺激活性的影响结果与CGT/A ODN与经典CpG ODN的比较结果图，其中，大写字母，磷酸二酯链接；小写，硫代磷酸酯链接；下划线，回文序列；

[0090] 图34是典型的CpG‑ODN与ODN‑H分别转染WT和TLR9敲除小鼠肺成纤维细胞后qPCR检测IFNB1表达水平结果图；

[0091] 图35是ODN60应答必需基因的全基因组CRISPR筛选示意图；

[0092] 图36是多个gRNA平均命中的基因丰度排序、ODN60和ODN60rc处理细胞之间的丰度倍数变化、及ODN60处理细胞的gRNA富集排序结果图；

[0093] 图37是SLFN11的缺失后ODN60和其他排名靠前的ODN触发的细胞因子、细胞活力统计结果图；

[0094] 图38是免疫印迹法检测SLFN11互补表达对ODN60诱导的p38和JNK激活的影响结果图；

[0095] 图39是不同ODN转染到WT和SLFN11‑/‑HEK293细胞后qPCR检测TNF和CXCL8的表达结果图；

[0096] 图40是细胞中SLFN11的表达水平免疫印迹分析结果图；

[0097] 图41是SLFN11敲除DU145细胞中不同类型的核苷酸诱导的细胞因子表达统计结果图；

[0098] 图42是发光ODN免疫沉淀(ODIP)和生物素‑ODN下拉试验示意图；

[0099] 图43是ODIP测定内源性和重新表达的SLFN11对ODN60和ODN60rc的结合活性结果图；

[0100] 图44是检测SLFN11和ODN在细胞中结合的ODIP和biotin‑ODN下拉实验结果图；

[0101] 图45是HEK293细胞中生物素pull‑down检测ODN60rc中获得“CGT”基序对与SLFN11结合的影响结果图；

[0102] 图46是SLFN家族三个亚群的结构预测示意图；

[0103] 图47是使用全长和截短的SLFN11示意图及表达全长和截短SLFN11的SLFN11‑/‑HEK293细胞进行ODN60转染后全长和截短SLFN11与ODN60的ODIP分析结果图；

[0104] 图48是SLFN11的ODN结合活性体外实验结果图；其中包括考马斯蓝染色、电泳迁移率改变实验、荧光ODN GST pull‑down实验、BLI实验；

[0105] 图49是截短SLFN11与ODN诱导的MAPK通路激活的免疫印迹分析结果图；

[0106] 图50是NCBI数据库的SLFN亚群在类群间的分布图；

[0107] 图51是TreeFam 9数据库中第三亚组SLFN、AIM2和cGAS的基因树比较结果图；

[0108] 图52是NCBI人类和小鼠冗余蛋白序列数据库与GTEx数据库中SLFN家族蛋白表达水平结果与SLFN11同源蛋白检索结果图；

[0109] 图53是SLFN亚组III成员的生物素‑ODN60实验结果图；

[0110] 图54是SLFN11与ODN60在细胞核中共聚的染色结果图；

[0111] 图55是HEK293细胞质和细胞核中SLFN11分布的免疫印迹检测结果图；

[0112] 图56是使用ODN60刺激HEK293细胞前后细胞质、细胞核周、细胞核中SLFN11分布的免疫印迹检测结果图；

[0113] 图57是ODN结合的SLFN11的亚细胞定位与ODN结合的SLFN11细胞质‑细胞核周‑细胞核组分ESMA测定结果图；

[0114] 图58是SLFN11和DU145细胞细胞质中排名最高的ODN之间的共定位结果图；

[0115] 图59是小鼠中SLFN11同源物的筛选结果图；

[0116] 图60是SLFN9‑KO小鼠的构建原理图；

[0117] 图61是WT和SLFN9‑KO小鼠中细胞因子qPCR检测结果图；

[0118] 图62是WT、SLFN9‑/‑和tr19‑/‑小鼠原代细胞分别转染HIV6441和经典TLR9 CpG ODN后qPCR检测Ifnb1mRNA表达水平结果与ELISA检测IFNα分泌结果图；

[0119] 图63是SLFN9在CGT‑ODN诱导的小鼠免疫应答结果图，其中，A‑F,CGT‑ODN诱导新生(B,C)和成年(D‑F)小鼠的免疫应答；静脉注射包裹在LNPs中的CpG ODNs和肝脏中荧光素酶mRNA‑LNPs的示意图(A)；qPCR和免疫印迹法分别检测细胞因子(B)和免疫通路(C)的激活；qPCR和HE染色分别检测注射后6h(D)细胞因子的表达水平和注射后3d(E)的组织学变化，并监测4天的生存情况；H和I,AAV2单链DNA基因组包裹到LNP后，静脉注射到小鼠体内，检测4天的生存情况和肝脏内验证因子的表达；J‑L，将WT或SLFN9‑/‑B16‑F10细胞分别接种于WT C57BL/6小鼠皮下，然后将转染试剂包裹的HIV6441注射于瘤内，治疗方案如J所示，测量各时间点各组的平均肿瘤体积(K)和单个小鼠的肿瘤体积(L)；

[0120] 图64是SLFN9和TRL9在B16‑F10和WT小鼠肝脏中的表达结果图；

[0121] 图65是SLFN9‑/‑和Trl9‑/‑B16‑F10小鼠细胞形态变化、基于ATP的细胞活力、细胞因子表达结果图；

[0122] 图66是CGT ODN和细菌或AAV等病原ssDNA导致tRNA切割降低的结果图；其中，A为PAGE凝胶电泳染色，B为量效关系分析，C‑D为SLFN11敲除对CGT‑ODN刺激导致的tRNA切割影响，E‑F为细胞存活结果，G为细胞因子表达结果，H为其他来源ssDNA对SLFN11的tRNA降解的影响，I为其他来源ssDNA中细胞存活结果，J为野生型SLFN11的HeLa细胞在接受CGT ODN刺激时tRNA的降解，K为外源SLFN11在HeLa细胞表达时下游细胞存活结果，L为外源SLFN11在HeLa细胞表达时炎症反应结果。

[0123] 实施例1细胞内ssDNA以序列特异性方式降低细胞活力

[0124] 1、人和细菌ssDNA的获取及ssDNA降低细胞活力的初步分析

[0125] 为了获得ssDNA，对人和细菌基因组DNA进行热变性，并使用dsDNA优选的溴化乙锭染色和SYBR绿色熔解曲线进行鉴定，结果如图1所示。为了测试ssDNA的TLR9非依赖性免疫刺激活性，将ssDNA和dsDNA转染到TLR9途径缺陷的HEK293细胞中，结果如图2所示，结果显示，细菌ssDNA比细菌dsDNA或人ssDNA更大程度地降低细胞活力。细菌ssDNA比细菌dsDNA或人ssDNA激活TNF和CXCL8的更大表达，结果如图3所示，表明细胞内ssDNA也可以以序列依赖的方式激活TLR9非依赖性免疫反应。

[0126] 2、人和细菌ssDNA的筛选及ssDNA降低细胞活力的详细分析

[0127] 为了进一步研究ssDNA对人类基因组的刺激活性，通过制备全基因组24个核苷酸(nt)ODN文库来筛选刺激序列，结果如图4所示。使用如图5所示的优化的ODN转染方法，将文库转染到HEK293和293A细胞中。结果如图6所示，结果显示，并观察到200个ODN中有14个ODN将这些细胞的平均细胞活力降低到40％以下。在浓度梯度中验证了前11个活性高ODN，结果如图7所示，发现ODN60表现出最高的免疫刺激效力。因此，在后续研究中，使用ODN60作为ODN的代表。此外，ODN60的免疫刺激效力低至24nM，而其反向互补ODN(ODN60rc)即使在120nM也不会降低细胞活力，结果如图8所示，表明免疫刺激活性是由序列而不是其靶向基因组位置决定的。实验中使用到的ODN序列如表1所示。

[0128] 表1

[0129]

[0130]

[0131] 为了探索对ssDNA的反应是否是细胞类型限制性的，将排名靠前的ODN转染到多种类型的人类细胞中，结果如图9所示，发现ODN反应细胞类型包括DU145、T47D、U251和A549细胞以及HUVECs，但不包括293T细胞。通过观察这些反应性细胞表现出的形态学特征，明确表明刺激后细胞死亡。此外，通过如图10所示的结果，只有ODN，而不是寡核苷酸(ORN)或双链ODN(dsODN)，降低了细胞活力。这种免疫活性不限于24nt的长度，因为含有最高序列的96nt ODN也降低了细胞活力，结果如图11所示。最后，电穿孔和转染(而不是孵育)都使排名靠前的ODN具有活性，结果如图12所示，表明ssDNA在细胞内的存在对其免疫刺激活性是必要的。

[0132] 实施例2细胞内ssDNA激活细胞因子表达和免疫相关信号通路

[0133] 鉴于细胞活力不是评估免疫反应的特异性指标，为了进一步确定ODN的免疫刺激活性，使用ODN60或ODN60rc刺激293A细胞10和24小时后，对细胞进行了RNAseq测定。结果如图13所示，与未经处理的对照组中的免疫相关基因的表达相比，只有ODN60触发了它们的表达，ODN60rc没有触发表达。重要的是，ODN60刺激了许多细胞因子和趋化因子(以下简称“细胞因子”)的表达，具体细胞因子结果如图14所示，这进一步表明了ssDNA的免疫刺激活性，因为细胞因子的转录激活是病原体相关分子模式(PAMP)诱导的先天免疫反应的主要组成部分。同样的，在DU145细胞中进行实验，所有排名靠前的ODN都激活了细胞因子的表达，结果如图15所示，这些被激活的细胞因子中还包括在HEK293细胞中不能触发的IFNB1，具体结果如图14所示。

[0134] 此外，除了细胞因子激活所揭示的先天免疫反应外，ODN60处理的细胞中大多数顶端富集的信号通路与免疫反应有关，结果如图16所示，结果显示这些基因有助于TNFR1和TNFR2途径的富集。ODN60还激活JNK、p38和核因子‑κB(NFκB)信号通路，结果如图17所示。一致地，所有排名靠前的ODN都激活了DU145细胞系中的JNK、p38和NFκB通路，结果如图18所示。鉴于IκBα水平的降低表明NFκB途径的激活，对此进一步评估了NFκB的核转位，发现用排名靠前的ODN刺激后，p65和NF‑κB1向细胞核的转位显著增加，结果如图19所示。敲低p65和NF‑κB1部分降低了DU145细胞中ODN60诱导的IFNB1和CXCL8的激活，结果如图20所示。总之，细胞活力的下降、细胞因子表达和免疫途径激活的增加揭示了细胞内ODN的免疫刺激活性。

[0135] 实施例3具有连续G的CGT/A是细胞内ODN免疫刺激活性的核心基序

[0136] 在研究排名靠前的ODN中的免疫刺激序列模式之前，我们排除了排名靠前和排名靠后的ODN之间免疫活性差异是由不同的转染效率引起的可能性，结果如图21所示。接下来，我们设计了一系列ODN60突变和截短构建体。使用来自5′末端区而不是3′末端区的三对相邻碱基的位置开关灭活了ODN60，具体示意图如图22所示。一致地，大约8nt的3′末端截短对ODN60免疫活性几乎没有影响，结果如图23所示。重要的是，仅第一对相邻核苷酸的切换就足以显著降低ODN60的免疫活性，结果如图22所示。这些结果表明，ODN60的免疫活性主要由其5′端序列决定，并且对单核苷酸变化敏感。

[0137] 接下来，使用其他三种类型的核苷酸系统地取代ODN60 5′端的第1至第7个核苷酸，并通过评估细胞活力和TNF细胞因子和JNK途径的激活来评估所产生的活性，结果如图24所示。这些结果一致表明，对于ODN60的免疫刺激活性，第2和第3个核苷酸分别高度限制于C和G，第4个核苷酸T对A表现出一定的耐受性，这表明CGT/A基序不仅是细胞外ssDNA，而且是细胞内ssDNA激活免疫反应所出乎意料地需要的。然后，我们进一步分析了图1b中200个筛选的ODN中CGT/A基序的存在，发现CGT和CGA(CGT/A)基序的出现决定了ODN的刺激等级，结果如图25所示。CGT/A基序中的任何单核苷酸突变都会破坏排名靠前的ODN的免疫刺激活性，结果如图26所示。因此，CGT/A的存在是免疫刺激性ODN所必需的。

[0138] 我们发现在实例1的筛选实验中，并不是所有含有CGT/A基序的ODNs都具有很强的免疫刺激效果。因此，我们推测是CGT/A基序的侧翼序列协同CGT/A共同决定了细胞内ODN的免疫刺激效果。为了确定区分CGT/A基序效力的侧翼序列模式，我们首先分析了所有ODN的碱基组成，并将排名靠前(高活力)和排名居中(中活力)ODN的CGT/A侧翼基序进行比对。如图27所示，由于大多数排名垫底(低活力)的CGT/A ODN缺乏下游侧翼序列，因此它们被排除在该比对分析之外。我们观察到，排名靠前的ODNs中的CGT/A侧翼序列富含G，而其他ODNs中的侧翼顺序富含T，结果如图28所示。然后，我们合成了具有CGT/A基序的ODN‑H和ODN‑L，该基序分别被高活力和中活力侧翼序列所包围。正如预期的那样，如图29所示的结果中，只有ODN‑H触发TNF表达，而ODN‑L没有。此外，G被T取代和CGT/A基序下游G连续性的破坏损害了ODN‑H的免疫刺激活性，结果如图30所示，这表明高活性CGT/A基序需要CGT/A下游连续G的辅助。这也解释了为什么排名垫底的ODN中的CGT/A基序倾向于位于3′末端的最后10nt内，具体见图28。

[0139] 为了验证这一序列规律在预测单链DNA的潜在免疫刺激能力的普适性，我们分析了多个物种基因组中这种免疫刺激序列的存在比例。我们发现这种基序在细菌基因组中的比例远高于人类基因组，结果如图31所示，这解释了为什么细菌ssDNA比人类ssDNA更具免疫刺激性。Cas9蛋白是广泛应用于基因编辑的来源于细菌的蛋白，因此，它的编码序列同样含有很高比例的免疫刺激序列。相比于双链DNA病毒，大部分单链DNA病毒和逆转录病毒都含有较少的免疫刺激序列，但腺相关病毒的基因组是个例外，根据这个基序规则，我们分别检测了来源于细菌、艾滋病病毒和2型腺相关病毒基因组的单链DNA的免疫刺激能力，同时我们还搜索，合并并测试了来自其他病毒基因组的ODNs，测试结果如图32所示。总之，我们的结果表明，具有下游连续G的CGT/A是细胞内ssDNA的刺激基序，与ssDNA的物种来源没有关系。

[0140] 尽管细胞内活性ODNs与TLR9感测的A类CpG ODNs具有一定的序列相似性，但TLR9不能够被5‑甲基化修饰的CpG ODN激活，而具有硫代磷酸(PS)骨架的ODNs会加强对TLR9的激活。如图33所示，我们发现，CGT‑ODN的脱氧核糖骨架只能是天然的，替换成硫代磷酸(PS)骨架、2’‑O甲基化骨架和核糖核苷酸(RNA)骨架都会破坏了细胞内ODNs的免疫刺激活性，而CGT/A基序中的5‑甲基化胞嘧啶修饰对细胞内ODN的效力几乎没有影响。因此，我们发现的这类ODNs同TLR9识别的CpG ODNs并不是一类ODNs。这些元素定义了一类细胞内活性的ODNs：具有天然的磷酸二酯(PO)连接和甲基化耐受性的CGT/A基序在3′下游是poly G，回文序列是可有可无的。为了简洁，我们把具备这些元素的ODNs称为CGT ODNs。因此当传递到细胞中时，典型的CpG‑ODN不如ODN‑H那么活跃。同时，TLR9缺乏不影响ODN‑H的刺激活性，结果如图34所示。这些结果进一步说明导入到细胞内的CGT‑ODNs不通过TLR9激活免疫反应，也进而提示存在一种新的细胞内CGT‑ODNs的受体。

[0141] 实施例4 SLFN11对ODN诱导的免疫反应至关重要

[0142] 为了鉴定细胞内ssDNA的潜在受体，我们进行了全基因组CRISPR‑Cas9筛选，示意图如图35所示。我们专注于敲除基因消除ODN60诱导的细胞耗竭相关基因。有趣的是，SLFN蛋白家族成员SLFN11在单轮和三轮筛选中富集最显著，而其他已鉴定的DNA基因，如TLR9、AIM2和cGAS，则没有高度富集，结果如图36所示。SLFN11先前被鉴定为干扰素刺激基因(ISG)，在抑制HIV翻译和肿瘤对DNA损伤剂的反应中发挥作用。为了验证SLFN11在细胞内CGT‑ODN诱导的免疫反应中的作用，我们从HEK293、293A和DU145细胞中产生了SLFN11敲除克隆。SLFN11的缺失完全阻断了所有先前确定的免疫反应，包括由ODN60和其他排名靠前的ODN触发的细胞因子激活、细胞活力下降，结果如图37所示。我们未能使用慢病毒在‑/‑SLFN11 HEK293细胞中建立稳定的SLFN11再表达，因为来自载体的过表达SLFN11强烈抑制‑/‑
慢病毒的产生。短暂的SLFN11互补表达使SLFN11 HEK293细胞对ODN60有反应，尽管SLFN11的这种再表达本身也部分触发了免疫反应，结果如图38所示。此外，病毒衍生的CGT/A ODN以及细菌ssDNA仅在WT 293A细胞中激活TNF和CXCL8表达，而在SLFN11‑/‑293A细胞不激活，结果如图32、39所示。与图9一致地，只有携带SLFN11表达的细胞对排名靠前的ODN有反应，结果如图40所示。最后，在DU145细胞中，SLFN11对于CGT‑ODNs激活IFNB1和CXCL8是必需的，结果如图41所示。

[0143] 实施例5 SLFN11是一种序列特异性ssDNA结合蛋白

[0144] 为了确定SLFN11是否能以ODN的形式结合和识别ssDNA，我们开发了一种称为发光ODN免疫沉淀(ODIP)的生物素下拉互补方法来量化SLFNs的细胞内ODN结合活性，ODIP示意图如图42所示。ODN60与SLFN11特异性免疫沉淀，而ODN60rc不能，并且ODN60的ODIP信号依赖于SLFN11，结果如图43所示。此外，ODN与SLFN11的结合是CGT基序依赖性的，因为ODN60的CGT基序中的任何单个突变都会减少其与SLFN11中的结合(图44)，而ODN60rc中CGT基序的获得增强了其与SLFN11的结合(图45)。正如预期的那样，SLFN11特异性结合排名靠前的ODN，但不结合排名靠后的ODN(图44)，表明对SLFN11的高亲和力对于ODN的免疫刺激活性是必要的。

[0145] SLFN11属于SLFN家族的亚群III，其成员包含三个预测结构域：N‑末端AAA结构域、SWADL结构域和C‑末端解旋酶结构域，示意图如图46所示。截短分析显示，能够结合ssDNA的为含有残基349至901的SLFN11 C末端片段，并且残基349至901之间的任何指示缺失降低了SLFN11的ssDNA结合活性(图47)。SLFN11的直接ssDNA结合活性也用纯化的GST融合和His融合的C末端SLFN11测定(图48)。值得注意的是，在SLFN11‑/‑HEK293细胞中，只有全长的SLFN11能够恢复对ODN60的反应性(图49)。这表明C端解旋酶结构域负责ssDNA的结合，而N端结构域是细胞内ssDNA存在的信号传导所必需的。总之，对CGT‑DNA诱导的免疫反应的需求和对含CGT/A基序的特异性结合活性表明，SLFN11是一种细胞内CGT‑DNA免疫传感器。

[0146] 与其他SLFN亚组相比，亚组III中只有SLFN含有整个C末端ssDNA结合结构域，并且从象鼻鱼到人都是保守的(图50)。此外，亚组III SLFNs在具有dsDNA传感器的分类群中显示出相似的进化分布(图51)，表明全长亚组III的SLFNs处于潜在的选择压力下。然而，在人类中表达的所有亚组III SLFNs中(图52)，只有SLFN11具有可检测的ssDNA结合活性(图53)。

[0147] 实施例6 SLFN11与细胞质中的CGT‑ODNs共定位并结合

[0148] 在ODN60刺激下，SLFN11被输出到细胞核外，并聚集到与ODN60在细胞质中共定位的点状物中。这与在基础条件下观察到的SLFN11在细胞核中的扩散分布形成对比(图54)。当我们通过免疫印迹分析细胞质和细胞核提取物时，我们发现内源性SLFN11的分布对不同的提取方案敏感程度不同(图55)。为了进一步研究这一观察结果，我们将细胞划分为细胞核、核周和胞质溶胶，发现SLFN11在基础条件下主要稳定在核周部分，但在ODN60刺激下转移到细胞质中(图56)。与免疫荧光结果一致，生物素下拉实验和EMSAs测定显示ODNs结合的SLFN11主要分布在胞质部分(图57)。最后，我们证实了SLFN11和DU145细胞细胞质中排名最高的ODN之间的共定位(图58)。

[0149] 实施例7 SLFN9(SLFN11同源物)对CGT‑ODN诱导的小鼠免疫反应至关重要

[0150] 由于小鼠不具有SLFN11，为了进一步研究SLFNs在体内对CGT‑ODNs的反应中的作用，我们筛选了一种可以在功能上补充人类SLFN11的小鼠SLFN。在所有与人SLFN11高度同‑/‑源的小鼠亚组III SLFNs中，发现只有SLFN9能够在SLFN11 HEK293细胞中结合ssDNA并恢‑/‑
复ssDNA存在信号传导(图59)。因此，我们建立了Slfn9敲除小鼠(图60)。对Slfn9 小鼠的初步评估表明，在特定的无病原体条件下，它们在我们的群体中是健康和可育的。

[0151] 我们首先分析了CGT‑ODNs刺激后原代细胞中的Slfn9。原代骨髓衍生巨噬细胞(BMDMs)中Slfn9的缺乏阻断了ODN‑H和HIV6441(一种来自HIV的CGT ODN)对Ifnb1、Il6和Cxcl2的激活，但不阻断poly(dA:dT)、poly(I:C)或LPS(图61)，这表明Slfn9是细胞内CGT‑ODNs诱导反应所特异性需要的。在小鼠细胞中发现HIV6441比ODN‑H更具活性；因此，我们使用HIV6441来表示用于以下小鼠实验的细胞内ODN。为了探索SLFN9和TLR9在对不同类型ODN的反应中的作用，我们将HIV6441和所有三种类型的典型CpG ODN，ODN1585(A类)、ODN1826(B类)和ODN2395(C类)，分别递送到原代小鼠成纤维细胞(MAFs)、肺纤维细胞(LFs)、原代BMDM和浆细胞样树突状细胞(pDC)中。

[0152] 据报道，TLR9主要在pDCs和B细胞中发挥作用。与此一致，所有类型的ODN都刺激WT和Slfn9‑/‑pDCs中IFNα的产生，但不刺激Tlr9‑/‑pDC中的IFNα产生，这表明当Tlr9高表达时，转染的ODN也可以由于内吞作用而激活内体中的Tlr9。然而，只有Slfn9的敲除，而不是Tlr9的敲除了，阻断了HIV6441和ODN1585在MAFs、LFs和BMDM中诱导的Ifnb1表达(图62)。因此，典型的CpG ODN和CGT ODN的细胞内刺激活性都依赖于SLFN9，并且SLNF9在比TLR9更广泛的组织类型中发挥作用。

[0153] 我们通过用脂质纳米颗粒(LNP)系统在细胞内递送的ODN刺激WT和Slfn9‑/‑小鼠，将我们的发现扩展到原代小鼠细胞，该系统也用于严重急性呼吸系统综合征冠状病毒2型信使核糖核酸疫苗。由于LNP的静脉注射主要导致核苷酸在肝脏中的积累(图63A)，我们主要评估了Slfn9在肝脏对ODNs的反应中的作用。HIV6441激活了肝脏中Ifnb1、Tnf、Il6、Cxcl2和Cxcl10的表达，以及STAT1、JNK和NFκB通路(图63B、C)。Slfn9缺乏几乎完全消除了HIV6441诱导的反应。类似地，在成年小鼠肝脏中，Slfn9也是HIV6441诱导的细胞因子表达所必需的(图63D)，除了Ifnb1。与实施例1人类细胞中细胞死亡的形态学特征一致，HIV6441甚至引发了肝脏的组织学坏死和急性肝炎(图63E、F)，这也是SLFN9依赖性的。值得注意的是，CpG‑ODNs诱导的致命毒性休克仅在D半乳糖胺致敏的小鼠中报道，并且根据报道只有将CpG‑DNA注射到小鼠中是无毒的，即使在相当高的剂量下也是如此。然而，我们发现静脉注‑/‑射60μg LNP包装的HIV6441足以导致WT小鼠死亡(图63G)。相反，所有Slfn9 小鼠在相同的刺激中存活下来。除此之外，我们把2型腺相关病毒(AAV2)单链DNA基因组包裹进LNP静脉注射到小鼠体内后，同样可以刺激起来SLFN9依赖的免疫反应(图63H、I)。总之，这些体内结果证实了先前的细胞研究，表明SLFN11和SLFN9分别对人类和小鼠的细胞内ODN诱导的免疫反应至关重要。

[0154] 先前的基础和临床研究已经显示了经典CpG‑ODNs的肿瘤内单药治疗活性，其通常被视为TLR9激动剂。而我们推测CGT ODN通过激活SLFN9也应该具有很好的肿瘤治疗效果。‑/‑ ‑/‑
为了阐明SLFN9和TLR9在ODN抗肿瘤单药治疗中的作用，我们分别产生了SLFN9 和TLR9‑/‑
B16‑F10细胞，尽管WT B16‑F10细胞几乎不表达TLR9(图64)。我们发现Slfn9 细胞，而不是‑/‑
Tlr9 ，对ODN诱导的细胞活力下降和细胞因子激活增加具有完全抗性(图65)。为了进一步‑/‑
证实这些发现，将WT和Slfn9 B16‑F10细胞皮下移植到小鼠中(图63g)。一致地，肿瘤内递‑/‑
送HIV6441显著降低了WT肿瘤的生长，但对Slfn9 肿瘤的生长没有影响(图63h、i)，表明Slfn9是肿瘤细胞中ODN单药治疗的关键靶点。

[0155] 实施例8 CGT ODN和细菌或AAV等病原ssDNA导致tRNA切割降低

[0156] 用CGT ODN刺激293A细胞后，提取细胞的RNA，用PAGE凝胶电泳染色分析，可以发现type II tRNA的丰度明显降低(图66A)，并且CGT ODN的用量和tRNA的降解程度具有量效关系(图66B)。在HUVEC细胞中，CGT ODN同样可以导致tRNA的切割。为了验证CGT ODN导致的type II tRNA的降低是不是SLFN11 tRNA切割活性依赖的，我们在HEK293细胞中对内源SLFN11的tRNA切割活性位点E209进行了原位突变，突变为209A，使HEK293表达的内源SLFN11丧失了tRNA切割能力。当我们用CGT ODN刺激HEK293细胞时，只有WT细胞和E209A杂合子细胞(一条等位基因表达WT SLFN11,另一个等位基因表达的是E209A SLFN11)能够响应CGT ODN的刺激产生tRNA的切割，而SLFN11敲除的细胞和只表达E209A SLFN11的细胞完全抵抗了CGT ODN刺激导致的tRNA的切割(图66C‑D)。并且E209A SLFN11也不能介导下游的细胞死亡(图66E‑F)和细胞因子的表达(图66G)，说明SLFN11的tRNA切割活性对引起下游的天然免疫反应是必要的。除了CGT ODN外，我们还验证了由细菌，AAV，HIV基因组来源的ssDNA，细菌和AAV来源的ssDNA能够引起SLFN11依赖的tRNA的降解(图66H)，同样SLFN11的tRNA切割活性对这些病原的ssDNA导致的细胞死亡也是必要的(图66I)。HeLa细胞几乎不表达内源SLFN11，对CGT ODN的刺激也不敏感。因此，在HeLa细胞中，我们人为构建了外源野生型SLFN11和切割活性突变的SLFN11(E209A,E214A,E209/214A)稳定表达的细胞株。当表达野生型SLFN11的HeLa细胞在接受CGT ODN刺激时，我们能看到明显的tRNA的降解(图66J)，而表达tRNA切割活性丧失的SLFN11的HeLa细胞则不能响应CGT ODN的刺激。和HEK293细胞内源SLFN11 tRNA活性点突变的结果一样，外源SLFN11在HeLa细胞表达时，响应CGT ODN的刺激导致下游细胞死亡(图66K)和炎症反应(图66L)同样是需要SLFN11的tRNA切割活性的。结合我们工作里SLFN11可以直接识别结合CGT ODN的数据，我们把SLFN11鉴定为是一个受ssDNA的激活的RNase。这也是真核细胞中被发现的第一个ssDNA激活的RNA核酸水解酶。直接预示着type II tRNA水平可以作为ssDNA诱发免疫反应的临床检测和诊断指标。

[0157] 上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。