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一种高通量快速选育高核糖核酸酵母的方法
申请号	CN202310427005.1	申请日	2023-04-19	公开(公告)号	CN117947015A	公开(公告)日	2024-04-30
申请人	安琪酵母股份有限公司;			发明人	伍业旭; 肖明华; 胡悦; 张彦; 雷森林; 黄兴法;
摘要	本发明提供一种高通量快速选育高核糖核酸酵母的方法。本发明提供的高通量选育高核糖核酸酵母的方法包括如下步骤：(1)建立微生物突变体库；(2)将步骤(1)得到的菌体复苏；(3)突变体库适应性进化；(4)进化文库高通量筛选得到高RNA的酵母。采用本发明提供的方法，可以高效地筛选得到高RNA酵母菌株，快速选育出优势菌株，筛选出的优势菌株RNA含量可以达到15％以上。
权利要求	1.一种高通量选育高核糖核酸酵母的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤： (1)建立微生物突变体库； (2)将步骤(1)得到的菌体复苏； (3)突变体库适应性进化； (4)进化文库高通量筛选得到高RNA的酵母。 2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述建立微生物突变体库采用化学诱变、物理诱变或者化学诱变和物理诱变的结合。 3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，化学诱变剂为甲基磺酸乙酯、硫酸二乙酯、叠氮化钠中的一种或两种以上的组合；优选地，化学诱变剂的作用浓度为1‑6％(w/v)，优选地，作用时间为0.5‑2h。 4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，物理诱变采用紫外辐射、常压室温等离子体中的一种或两种以上的组合；优选地，物理诱变时间为30s‑90s；优选地，常压室温等离子体功率为80‑120W，气流量为8‑15L/min，优选地，常压室温等离子体功率为100W，气流量10L/min；优选地，紫外辐射功率为15w‑20w，照射距离为20‑30cm。 5.根据权利要求1‑4任意一项所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，将菌体在培养基中静置培养；优选地，所述培养基为YPD培养基；优选地，培养基pH 5.0‑6.0；优选地，培养温度为28‑32℃；优选地，培养时间为30‑60min。 6.根据权利要求1‑5任意一项所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，将步骤(2)得到的复苏的菌体在含有抑制物的进化培养基中培养，然后取培养液转接入新的进化培养基中进行培养，反复转接50‑150次；优选地，所述抑制物为6‑杂氮尿嘧啶、8‑氮鸟嘌呤、放线菌酮、6‑巯基嘌呤、二氨基嘌呤、5‑溴尿嘧啶、5‑氟尿嘧啶中的一种或两种以上的组合；优选地，转接后的培养基中抑制物浓度增高；优选地，转接过程中，培养基中抑制物的浓度增高50‑1000mg/L；优选地，培养20‑30h后进行转接，优选为24h；优选地，培养温度为28‑33℃，150‑220rpm震荡培养；优选地，抑制物浓度为50mg‑1000mg/L，优选地，抑制物浓度为50mg‑500mg/L；优选地，抑制物初始浓度为50mg‑100mg/L。 7.根据权利要求1‑6任意一项所述的方法，其特征在于，步骤(4)中，用RNA荧光染料对诱变文库进行染色，选取荧光高的菌株即得到高RNA的酵母； TM TM 优选地，所述RNA荧光染料为 RNASelect 、Hoechst 33258、Quant‑iT RNA Reagent或溴化乙锭中的一种或两种以上的组合，优选为 RNASelect。 8.根据权利要求1‑7任意一项所述的方法，其特征在于，所述方法还包括步骤(5)放大验证。 9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，步骤(5)中，在发酵罐中对步骤(4)分选出的菌株进行发酵验证，测定其RNA含量。 10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，发酵培养基包含：以质量百分比计，葡萄糖2‑6％，酵母浸出物0.5‑2％，七水硫酸镁0.2‑0.4％，七水硫酸锌0.2‑0.4％，磷酸二氢钾 0.5‑1.2％，余量为水；优选地，所述发酵培养基的pH为5.0‑6.0，优选地，发酵搅拌转速为300‑600rpm，优选地，发酵通气量为3‑6L/min。
说明书全文	一种高通量快速选育高核糖核酸酵母的方法技术领域 [0001] 本发明涉及生物工程技术，具体涉及一种高通量筛选微生物菌株的方法。背景技术 [0002] 核糖核酸(即RNA，Ribonucleic Acid)是一种重要的生物大分子，其广泛运用于食品调味、营养保健、生物医药等领域。目前，RNA的工业化生产主要是从纯培养的假丝酵母、酿酒酵母或者啤酒酵母泥中提取。酿酒酵母不产生任何毒素，是食品安全级(GRAS)微生物，且生长传代速度较快，易培养，营养价值，是公认最理想的RNA来源。 [0003] 由于酿酒酵母RNA含量较低，平均在6％‑8％，导致由酿酒酵母衍生出的RNA、核苷酸等产品成本较高。为了降低生产成本，提高产品竞争力，需要进一步提高酵母菌株的RNA含量。发明内容 [0004] 现有技术中采用传统筛选方法，难以实现大规模高效筛选，而且操作繁琐。针对现有技术中存在的问题，本发明提供一种高效快速选育高核酸酵母的方法。 [0005] 本发明提供一种高通量选育高核糖核酸酵母的方法，所述方法包括如下步骤： [0006] (1)建立微生物突变体库； [0007] (2)将步骤(1)得到的菌体复苏； [0008] (3)突变体库适应性进化； [0009] (4)进化文库高通量筛选得到高RNA的酵母。 [0010] 优选地，步骤(1)中，所述建立微生物突变体库采用化学诱变、物理诱变或者化学诱变和物理诱变的结合。 [0011] 优选地，化学诱变剂为甲基磺酸乙酯、硫酸二乙酯、叠氮化钠中的一种或两种以上的组合； [0012] 优选地，化学诱变剂的作用浓度为1‑6％(w/v)， [0013] 优选地，作用时间为0.5‑2h。 [0014] 优选地，物理诱变采用紫外辐射、常压室温等离子体中的一种或两种以上的组合，[0015] 优选地，物理诱变时间为30s‑90s； [0016] 优选地，常压室温等离子体功率为80‑120W，气流量为8‑15L/min，优选地，常压室温等离子体功率为100W，气流量10L/min； [0017] 优选地，紫外辐射功率为15w‑20w，照射距离为20‑30cm。 [0018] 优选地，步骤(2)中，将菌体在培养基中静置培养； [0019] 优选地，所述培养基为YPD培养基； [0020] 优选地，培养基pH 5.0‑6.0； [0021] 优选地，培养温度为28‑32℃； [0022] 优选地，培养时间为30‑60min。 [0023] 优选地，步骤(3)中，将步骤(2)得到的复苏的菌体在含有抑制物的进化培养基中培养，然后取培养液转接入新的进化培养基中进行培养，反复转接50‑150次； [0024] 优选地，所述抑制物为6‑杂氮尿嘧啶、8‑氮鸟嘌呤、放线菌酮、6‑巯基嘌呤、二氨基嘌呤、5‑溴尿嘧啶、5‑氟尿嘧啶中的一种或两种以上的组合； [0025] 优选地，转接后的培养基中抑制物浓度增高； [0026] 优选地，转接过程中，培养基中抑制物的浓度增高50‑1000mg/L； [0027] 优选地，培养20‑30h后进行转接，优选为24h； [0028] 优选地，培养温度为28‑33℃，150‑220rpm震荡培养； [0029] 优选地，抑制物浓度为50mg‑1000mg/L，优选地，抑制物浓度为50mg‑500mg/L； [0030] 优选地，抑制物初始浓度为50mg‑100mg/L。 [0031] 优选地，步骤(4)中，用RNA荧光染料对诱变文库进行染色，选取荧光高的菌株即得到高RNA的酵母； [0032] 优选地，所述RNA荧光染料为 RNASelectTM、Hoechst 33258、Quant‑iTTMRNA Reagent或溴化乙锭中的一种或两种以上的组合，优选为RNASelect。 [0033] 优选地，所述方法还包括步骤(5)放大验证。 [0034] 优选地，在发酵罐中对步骤(4)分选出的菌株进行发酵验证，测定其RNA含量。 [0035] 优选地，发酵培养基包含：以质量百分比计，葡萄糖2‑6％，酵母浸出物0.5‑2％，七水硫酸镁0.2‑0.4％，七水硫酸锌0.2‑0.4％，磷酸二氢钾0.5‑1.2％，余量为水； [0036] 优选地，所述发酵培养基的pH为5.0‑6.0， [0037] 优选地，发酵搅拌转速为300‑600rpm， [0038] 优选地，发酵通气量为3‑6L/min。 [0039] 采用本发明提供的方法，可以高效地筛选得到高RNA酵母菌株，快速选育出优势菌株，筛选出的优势菌株RNA含量可以达到15％以上，菌体湿重可以达到200g/L以上，实现了高RNA菌株的高密度发酵，这类菌株在实际生产过程中可以降低RNA、核苷酸等相关产品的生产成本。附图说明 [0040] 图1所示为适应性进化菌体OD600与RNA含量随抑制物浓度变化情况，其中，(a)所示为适应性进化菌体OD600变化情况，(b)所示为适应性进化RNA含量变化情况； [0041] 图2所示为酵母细胞内RNA含量与荧光强度关系，其中，(A)所示为酵母细胞内RNA含量与荧光强度关系，(B)所示为酵母细胞内RNA含量与荧光强度相关性分析； [0042] 图3所示为流式细胞分选结果，其中，(a)所示为出发菌株荧光强度和侧向散射强度关系，(b)所示为出发菌株荧光强度和细胞个数关系，(c)所示为诱变进化文库荧光强度和侧向散射强度关系，(d)所示为诱变进化文库荧光强度和细胞个数关系； [0043] 图4所示为优势菌株3L 发酵罐放大验证结果，其中，(a)所示为实施例1、2、3得到的菌株和出发菌株酿酒酵母FX‑2菌株3L发酵罐生物量与RNA结果，(b)所示为实施例7、8、9得到的菌株和出发菌株酿酒酵母FX‑2菌株3L发酵罐生物量与RNA结果。具体实施方式 [0044] 本发明提供的高通量选育高核酸酵母的方法通过荧光值反映RNA含量，采用流式细胞分选技术，快速选育出RNA含量高的优势菌株。 [0045] 高通量筛选是相比于常规筛选更加高效的一种方法。本发明提供的高通量选育高核酸酵母的方法，在大规模筛选过程中，首先用RNA染料对酵母细胞进行染色，染色后的细胞在特定波长下发出荧光，荧光强度与RNA含量呈正相关，采用流式细胞仪对染色后的细胞进行荧光分析，可以快速筛选出荧光强度高(即为RNA含量高)的细胞。 [0046] 在本发明提供的具体实施方式中，通过包含下述步骤的方法筛选高核酸酵母： [0047] (1)建立微生物突变体库： [0048] 在本发明的一种具体实施方式中，通过诱变得到微生物突变体库； [0049] 在本发明的一种具体实施方式中，所述诱变是化学诱变、物理诱变或者化学诱变和物理诱变相结合。 [0050] 在本发明的一种具体实施方式中，化学诱变剂选自甲基磺酸乙酯、硫酸二乙酯、叠氮化钠中的一种或两种以上的组合； [0051] 在本发明的一种具体实施方式中，化学诱变剂的作用浓度为1‑6％(w/v)，作用时间为0.5‑2h。 [0052] 在本发明的一种具体实施方式中，物理诱变方法为紫外辐射、常压室温等离子体中的一种或两种以上的组合； [0053] 在本发明的一种具体实施方式中，物理诱变时间为30s‑90s。 [0054] (2)菌体复苏： [0055] 在本发明的一种具体实施方式中，将经过诱变的菌体放入培养基中静置培养，在本发明的一种优选实施方式中，所述培养基为YPD培养基，pH5.0‑6.0，在30℃静置培养30‑60min。 [0056] (3)突变体库适应性进化： [0057] 在本发明的一种具体实施方式中，经过复苏的菌体，转接入含有抑制物的进化培养基中震荡培养，培养20‑30h后进行转接，转入到新鲜的进化培养基中继续培养，反复转接。并在转接培养过程中，不断提高抑制物浓度。 [0058] 在本发明的一种具体实施方式中，进化培养基中的抑制物为6‑杂氮尿嘧啶、8‑氮鸟嘌呤、放线菌酮、6‑巯基嘌呤、二氨基嘌呤、5‑溴尿嘧啶、5‑氟尿嘧啶中的一种或两种以上的组合。 [0059] 在本发明的一种具体实施方式中，抑制物初始浓度为50mg‑100mg/L。 [0060] (4)进化文库高通量筛选： [0061] 在本发明的一种具体实施方式中，用RNA特异性的荧光染料对诱变文库进行染色，染色后采用流式细胞仪对每一株细胞进行荧光分析，利用荧光强度与酵母细胞内RNA的含量呈正相关的特性分选出荧光高(即RNA含量高)的菌株。 [0062] (5)放大验证： [0063] 在本发明的具体实施方式中，还可以在发酵罐中对上一步分选出的菌株进行发酵验证，测定其RNA含量。 [0064] 在本发明的一种具体实施方式中，发酵培养基为：以质量百分比计，葡萄糖2‑6％，酵母浸出物0.5‑2％，七水硫酸镁0.2‑0.4％，七水硫酸锌0.2‑0.4％，磷酸二氢钾0.5‑1.2％，余量为水，pH5.0‑6.0， [0065] 在本发明的一种具体实施方式中，搅拌300‑600rpm，通气3‑6L/min，每隔一段时间测定其生物量和RNA含量。 [0066] 本发明实施例中采用常压室温等离子体进行诱变，其诱变功率为100W，气流量10L/min； [0067] 本发明实施例中采用紫外辐射进行诱变，其诱变功率为15w‑20w，照射距离为30cm。 [0068] 本发明实施例中的生物量和RNA含量检测方法如下： [0069] 生物量检测方法：1.取10mL离心管，精确称取空离心管重量m1；2.精确取发酵液10mL，5000rpm离心10min，倒上清后，放105℃烘干至恒重，称取重量m2；3.生物量DCW(g/L)＝(m2‑m1)*100。 [0070] RNA检测方法： [0071] 试剂：1.0.5N高氯酸(HClO4)：取400mL蒸馏水加入21.5mL 70％(或者22.1mL 68％)的高氯酸，再用蒸馏水定容至500mL。 [0072] 2.0.25N高氯酸(HClO4)：取250mL 0.5N高氯酸(HClO4)用蒸馏水稀释至500mL。 [0073] 设备：(1)毫克级天平；(2)4000转离心机，能分离酵母；(3)离心试管，容量至少10mL；(4)分光光度计(260nm)；(5)70℃热水浴；(6)4℃冷水浴；(7)10mL和1mL移液枪；(8) 100mL容量瓶。 [0074] 方法： [0075] 1.如果是酵母干粉，称取0.06‑0.15g酵母加入离心管中；如果是18％的酵母乳，称取0.4‑0.8g；如果是3.5％的液体，测称取1.5‑3.0g。 [0076] 2.加入8mL冷的0.25N HClO4到离心管中，4℃水浴15min。 [0077] 3.4000rpm离心10min。 [0078] 4.轻轻倒出浮在表面的物质，加入0.5N的HClO4 5mL振荡混匀，70℃水浴15min，每隔3‑4min振荡一次。4000rpm离心10min，吸取1mL上清液，用蒸馏水定容至100mL。 [0079] 5.260nm测定吸光度，蒸馏水作为空白对照。 [0080] 计算公式为：干酵母中 [0081] 本发明中干酵母中RNA含量计算过程中，样品重量以毫克计，例如，称取的干酵母重量是145mg，吸光度是0.7，固形物含量是96％，得到的干酵母中RNA含量计算过程为： [0082] 本发明中涉及的相关名词解释： [0083] OD260/OD600是指单位菌体RNA含量； [0084] FV/OD600是指单位菌体荧光强度(染色后)； [0085] DCW是指菌体干重。 [0086] 下面各实施例中所用到的各试剂和仪器来源如下表1中所示。 [0087] 表1 [0088] [0089] 本发明所采用酿酒酵母FX‑2(Saccharomyces cerevisiae FX‑2)于2016年8月1日保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC NO:M2016418。该菌株在公开号为CN108220175A的专利公开文本中已有记载。 [0090] 实施例1 [0091] 出发菌株诱变：酿酒酵母FX‑2在100mL YPD培养基中，30℃、200rpm振荡培养24h后，吸取1mL菌液，12000rpm离心1min收集菌体，用磷酸盐缓冲液洗涤沉淀两次，加入配制好的5％的甲基磺酸乙酯(EMS)1mL，混匀，30℃、50rpm振荡30min后离心，洗涤沉淀两次。 [0092] 菌体复苏：在上述菌体沉淀中加入5mL YPD培养基重悬，30℃静止培养60min后5000rpm离心5min收集菌体。 [0093] 诱变文库适应性进化：6.7g YNB、20g硫酸铵、100mg 6‑杂氮尿嘧啶配成1L进化培养基溶液，0.22μm过滤除菌，取50mL进化培养基重悬上述菌体，30℃、200rpm振荡培养24h后，吸取0.5mL培养液转入新鲜的进化培养基中继续培养24h，如此反复转接50次，并不断提高抑制物浓度至200、300、400、500mg/L。进化结束后，取最后一次培养得到的菌液，离心收集菌体，得到的菌体OD600与RNA含量随抑制物浓度变化情况如图1所示，其中，(a)所示为适应性进化菌体OD600变化情况，(b)所示为适应性进化RNA含量变化情况。从图1可以看出，菌体OD600值和RNA含量随抑制物浓度升高而升高。TM [0094] 进化文库高通量筛选：将 RNASelect 稀释10000倍制备成500nM染色液，吸取1mL，加入上述进化后离心得到的菌体中，重悬菌体，30℃、50rpm振荡孵育20min， 5000rpm离心5min收集菌体，用磷酸盐缓冲液洗涤沉淀两次并重悬，重悬液采用流式细胞仪进行荧光分析，分选条件：激发光波长490nm，发射光波长530nm。经过流式细胞仪分析，进化后的细胞文库，有一个细胞团荧光明显高于其他细胞。 [0095] 酵母细胞内RNA含量与荧光强度关系如图2所示，其中，(a)所示为酵母细胞内RNA含量与荧光强度关系，(b)所示为酵母细胞内RNA含量与荧光强度相关性分析。从图2可以看出，酵母细胞内RNA含量与荧光强度呈线性相关。 [0096] 流式细胞分选结果如图3所示，其中，(a)所示为出发菌株荧光强度和侧向散射强度关系，(b)所示为出发菌株荧光强度和细胞个数关系，(c)所示为诱变进化文库荧光强度和侧向散射强度关系，(d)所示为诱变进化文库荧光强度和细胞个数关系。从图3可以看出，进化后的细胞文库经流式细胞仪分选，有一个细胞团荧光明显高于其他细胞。 [0097] 放大验证：上述经过流式细胞仪筛选得到的优势菌株A，在3L发酵罐中进行发酵验证，发酵培养基为：以质量百分比计，葡萄糖6％、酵母浸出物2％，七水硫酸镁0.4％，七水硫酸锌0.4％，磷酸二氢钾1.2％，余量为水，pH5.5，搅拌600rpm，通气4L/min，每隔一段时间测定其生物量和RNA含量。发酵结束，RNA含量达到15.2％，菌体干重达到51.7g/L。 [0098] 优势菌株A在3L发酵罐放大验证结果如图4所示。从图4可以看出，筛选出的优势菌株A经3L发酵罐发酵培养后得到的RNA含量明显高于出发菌株酿酒酵母FX‑2。 [0099] 实施例2 [0100] 出发菌株诱变：酿酒酵母FX‑2在100mL YPD培养基中，30℃、200rpm振荡培养24h后，吸取1mL菌液，12000rpm离心1min收集菌体，用磷酸盐缓冲液洗涤沉淀两次，加入配制好的3％的叠氮化钠1mL，混匀，30℃、50rpm振荡60min后离心，洗涤沉淀两次。 [0101] 菌体复苏：在上述菌体沉淀中加入5mL YPD培养基重悬，30℃静止培养60min后5000rpm离心5min收集菌体。 [0102] 诱变文库适应性进化：6.7g YNB、20g硫酸铵、50mg 8‑氮鸟嘌呤配成1L进化培养基溶液，0.22μm过滤除菌，取50mL进化培养基重悬上述菌体，30℃、200rpm振荡培养24h后，吸取0.5mL培养液转入新鲜的进化培养基中继续培养24h，如此反复转接100次，并不断提高抑制物浓度至100、150、200、250、300mg/L。进化结束后，取最后一次培养得到的菌液，离心收集菌体。 [0103] 进化文库高通量筛选：将Quant‑iTTM RNA Reagent稀释成500nM染色液，吸取1mL，加入上述进化后离心得到的菌体中，重悬菌体，30℃、50rpm振荡孵育20min，5000rpm离心5min收集菌体，用磷酸盐缓冲液洗涤沉淀两次并重悬，重悬液采用流式细胞仪进行荧光分析，分选条件：激发光波长490nm，发射光波长530nm。经过流式细胞仪分析，进化后的细胞文库，有一个细胞团荧光明显高于其他细胞。 [0104] 放大验证：上述经过流式细胞仪筛选得到的优势菌株B，在3L发酵罐中进行发酵验证，发酵培养基为：以质量百分比计，葡萄糖2％、酵母浸出物0.5％，七水硫酸镁0.4％，七水硫酸锌0.4％，磷酸二氢钾1.2％，余量为水，pH6.0，搅拌400rpm，通气4L/min,每隔一段时间测定其生物量和RNA含量。发酵结束，RNA含量达到15.1％，菌体干重达到53.2g/L。 [0105] 优势菌株B在3L发酵罐放大验证结果如图4所示。从图4可以看出，筛选出的优势菌株B经3L发酵罐发酵培养后得到的RNA含量明显高于出发菌株酿酒酵母FX‑2。 [0106] 实施例3 [0107] 出发菌株诱变：酿酒酵母FX‑2在100mL YPD培养基中，30℃、200rpm振荡培养24h后，吸取1mL菌液，12000rpm离心1min收集菌体，用磷酸盐缓冲液洗涤沉淀两次，加入配制好的3％的硫酸二乙酯1mL，混匀，30℃、50rpm振荡60min后，常压室温等离子体(ARTP)条件下诱变60s，离心，洗涤沉淀两次。 [0108] 菌体复苏：在上述菌体沉淀中加入5mL YPD培养基重悬，30℃静止培养60min后5000rpm离心5min收集菌体。 [0109] 诱变文库适应性进化：6.7g YNB、20g硫酸铵、50mg放线菌酮配成1L进化培养基溶液，0.22μm过滤除菌，取50mL进化培养基重悬上述菌体，30℃、200rpm振荡培养24h后，吸取0.5mL培养液转入新鲜的进化培养基中继续培养24h，如此反复转接150次，并不断提高抑制物浓度至200、300、400、500mg/L。进化结束后，取最后一次培养得到的菌液，离心收集菌体。 TM [0110] 进化文库高通量筛选：将 RNASelect 稀释10000倍制备成500nM染色液，吸取1mL，加入上述进化后离心得到的菌体中，重悬菌体，30℃、50rpm振荡孵育20min，5000rpm离心5min收集菌体，用磷酸盐缓冲液洗涤沉淀两次并重悬，重悬液采用流式细胞仪进行荧光分析，分选条件：激发光波长490nm，发射光波长530nm。经过流式细胞仪分析，进化后的细胞文库，有1个细胞团荧光明显高于其他细胞。 [0111] 放大验证：上述经过流式细胞仪筛选得到的优势菌株C，在3L发酵罐中进行发酵验证，发酵培养基为：以质量百分比计，葡萄糖4％、酵母浸出物1％，七水硫酸镁0.2％，七水硫酸锌0.2％，磷酸二氢钾1％，余量为水，pH5.0，搅拌600rpm，通气6L/min，每隔一段时间测定其生物量和RNA含量。发酵结束，RNA含量达到15.5％，菌体干重达到37.1g/L。 [0112] 优势菌株C在3L发酵罐放大验证结果如图4所示。从图4可以看出，筛选出的优势菌株C经3L发酵罐发酵培养后得到的RNA含量明显高于出发菌株酿酒酵母FX‑2。 [0113] 实施例4 [0114] 出发菌株诱变：酿酒酵母FX‑2在100mL YPD培养基中，30℃、200rpm振荡培养24h后，吸取1mL菌液，12000rpm离心1min收集菌体，用磷酸盐缓冲液洗涤沉淀两次，加入配制好的5％的甲基磺酸乙酯1mL，混匀，30℃、50rpm振荡30min后，紫外辐射条件下诱变30s，离心，洗涤沉淀两次。 [0115] 菌体复苏：在上述菌体沉淀中加入5mL YPD培养基重悬，30℃静止培养60min后5000rpm离心5min收集菌体。 [0116] 诱变文库适应性进化：6.7g YNB、20g硫酸铵、50mg 6‑巯基嘌呤配成1L进化培养基溶液，0.22μm过滤除菌，取50mL进化培养基重悬上述菌体，30℃、200rpm振荡培养24h后，吸取0.5mL培养液转入新鲜的进化培养基中继续培养24h，如此反复转接60次，并不断提高抑制物浓度至100、150、200、250、300mg/L。进化结束后，取最后一次培养得到的菌液，离心收集菌体。 [0117] 进化文库高通量筛选：将溴化乙锭稀释成1ug/mL染色液，吸取1mL，加入上述进化后离心得到的菌体中，重悬菌体，30℃、50rpm振荡孵育20min，5000rpm离心5min收集菌体，用磷酸盐缓冲液洗涤沉淀两次并重悬，重悬液采用流式细胞仪进行荧光分析，分选条件：激发光波长490nm，发射光波长530nm。经过流式细胞仪分析，进化后的细胞文库，有1个细胞团荧光明显高于其他细胞。 [0118] 放大验证：上述经过流式细胞仪筛选得到的优势菌株，在3L发酵罐中进行发酵验证，发酵培养基为：以质量百分比计，葡萄糖2％、酵母浸出物0.5％，七水硫酸镁0.2％，七水硫酸锌0.2％，磷酸二氢钾0.5％，余量为水，pH5.0，搅拌300rpm，通气3L/min，每隔一段时间测定其生物量和RNA含量。发酵结束，RNA含量达到15.3％，菌体干重达到52.9g/L。 [0119] 实施例5 [0120] 出发菌株诱变：酿酒酵母FX‑2在100mL YPD培养基中，30℃、200rpm振荡培养24h后，吸取1mL菌液，12000rpm离心1min收集菌体，用磷酸盐缓冲液洗涤沉淀两次，加入配制好的5％的甲基磺酸乙酯(EMS)1mL，混匀，30℃、50rpm振荡30min后离心，洗涤沉淀两次。 [0121] 菌体复苏：在上述菌体沉淀中加入5mL YPD培养基重悬，30℃静止培养60min后5000rpm离心5min收集菌体。 [0122] 诱变文库适应性进化：6.7g YNB、20g硫酸铵、100mg二氨基嘌呤配成1L进化培养基溶液，0.22μm过滤除菌，取50mL进化培养基重悬上述菌体，30℃、200rpm振荡培养24h后，吸取0.5mL培养液转入新鲜的进化培养基中继续培养24h，如此反复转接120次，并不断提高抑制物浓度至200、300、400、500mg/L。进化结束后，取最后一次培养得到的菌液，离心收集菌体。 [0123] 进化文库高通量筛选：将Hoechst 33258稀释成1uM染色液，吸取1mL，加入上述进化后离心得到的菌体中，重悬菌体，30℃、50rpm振荡孵育20min，5000rpm离心5min收集菌体，用磷酸盐缓冲液洗涤沉淀两次并重悬，重悬液采用流式细胞仪进行荧光分析，分选条件：激发光波长490nm，发射光波长530nm。经过流式细胞仪分析，进化后的细胞文库，有一个细胞团荧光明显高于其他细胞。 [0124] 放大验证：上述经过流式细胞仪筛选得到的优势菌株，在3L发酵罐中进行发酵验证，发酵培养基为：以质量百分比计，葡萄糖6％、酵母浸出物2％，七水硫酸镁0.4％，七水硫酸锌0.4％，磷酸二氢钾1.2％，余量为水，pH5.5，搅拌600rpm，通气4L/min，每隔一段时间测定其生物量和RNA含量。发酵结束，RNA含量达到15.2％，菌体干重达到51.7g/L。 [0125] 实施例6 [0126] 出发菌株诱变：酿酒酵母FX‑2在100mL YPD培养基中，30℃、200rpm振荡培养24h后，吸取1mL菌液，12000rpm离心1min收集菌体，用磷酸盐缓冲液洗涤沉淀两次，加入配制好的3％的叠氮化钠1mL，混匀，30℃、50rpm振荡60min后离心，洗涤沉淀两次。 [0127] 菌体复苏：在上述菌体沉淀中加入5mL YPD培养基重悬，30℃静止培养60min后5000rpm离心5min收集菌体。 [0128] 诱变文库适应性进化：6.7g YNB、20g硫酸铵、50mg 5‑溴尿嘧啶配成1L进化培养基溶液，0.22μm过滤除菌，取50mL进化培养基重悬上述菌体，30℃、200rpm振荡培养24h后，吸取0.5mL培养液转入新鲜的进化培养基中继续培养24h，如此反复转接90次，并不断提高抑制物浓度至100、150、200、250、300mg/L。进化结束后，取最后一次培养得到的菌液，离心收集菌体。TM [0129] 进化文库高通量筛选：将Quant‑iT RNA Reagent稀释成500nM染色液，吸取1mL，加入上述进化后离心得到的菌体中，重悬菌体，30℃、50rpm振荡孵育20min， 5000rpm离心5min收集菌体，用磷酸盐缓冲液洗涤沉淀两次并重悬，重悬液采用流式细胞仪进行荧光分析，分选条件：激发光波长490nm，发射光波长530nm。经过流式细胞仪分析，进化后的细胞文库，有一个细胞团荧光明显高于其他细胞。 [0130] 放大验证：上述经过流式细胞仪筛选得到的优势菌株，在3L发酵罐中进行发酵验证，发酵培养基为：以质量百分比计，葡萄糖2％、酵母浸出物0.5％，七水硫酸镁0.4％，七水硫酸锌0.4％，磷酸二氢钾1.2％，余量为水，pH6.0，搅拌400rpm，通气4L/min,每隔一段时间测定其生物量和RNA含量。发酵结束，RNA含量达到15.4％，菌体干重达到53.2g/L。 [0131] 实施例7 [0132] 出发菌株诱变：酿酒酵母FX‑2在100mL YPD培养基中，30℃、200rpm振荡培养24h后，吸取1mL菌液，12000rpm离心1min收集菌体，用磷酸盐缓冲液洗涤沉淀两次，常压室温等离子体(ARTP)条件下诱变60s后离心，洗涤沉淀两次。 [0133] 菌体复苏：在上述菌体沉淀中加入5mL YPD培养基重悬，30℃静止培养60min后5000rpm离心5min收集菌体。 [0134] 诱变文库适应性进化：6.7g YNB、20g硫酸铵、50mg 5‑氟尿嘧啶配成1L进化培养基溶液，0.22μm过滤除菌，取50mL进化培养基重悬上述菌体，30℃、200rpm振荡培养24h后，吸取0.5mL培养液转入新鲜的进化培养基中继续培养24h，如此反复转接130次，并不断提高抑制物浓度至100、150、200、250、300mg/L。进化结束后，取最后一次培养得到的菌液，离心收集菌体。 [0135] 进化文库高通量筛选：将溴化乙锭稀释成1ug/mL染色液，吸取1mL，加入上述进化后离心得到的菌体中，重悬菌体，30℃、50rpm振荡孵育20min，5000rpm离心5min收集菌体，用磷酸盐缓冲液洗涤沉淀两次并重悬，重悬液采用流式细胞仪进行荧光分析，分选条件：激发光波长490nm，发射光波长530nm。经过流式细胞仪分析，进化后的细胞文库，有1个细胞团荧光明显高于其他细胞。 [0136] 放大验证：上述经过流式细胞仪筛选得到的优势菌株D，在3L发酵罐中进行发酵验证，发酵培养基为：以质量百分比计，葡萄糖6％、酵母浸出物2％，七水硫酸镁0.2％，七水硫酸锌0.2％，磷酸二氢钾1％，余量为水，pH5.5，搅拌400rpm，通气3L/min，每隔一段时间测定其生物量和RNA含量。发酵结束，RNA含量达到15.0％，菌体干重达到53.5g/L。 [0137] 优势菌株D在3L发酵罐放大验证结果如图4所示。从图4可以看出，筛选出的优势菌株D经3L发酵罐发酵培养后得到的RNA含量明显高于出发菌株酿酒酵母FX‑2。 [0138] 实施例8 [0139] 出发菌株诱变：酿酒酵母FX‑2在100mL YPD培养基中，30℃、200rpm振荡培养24h后，吸取1mL菌液，12000rpm离心1min收集菌体，用磷酸盐缓冲液洗涤沉淀两次，加入配制好的3％的硫酸二乙酯1mL，混匀，30℃、50rpm振荡60min后，常压室温等离子体(ARTP)条件下诱变60s，离心，洗涤沉淀两次。 [0140] 菌体复苏：在上述菌体沉淀中加入5mL YPD培养基重悬，30℃静止培养60min后5000rpm离心5min收集菌体。 [0141] 诱变文库适应性进化：6.7g YNB、20g硫酸铵、25mg 8‑氮鸟嘌呤、25mg放线菌酮配成1L进化培养基溶液，0.22μm过滤除菌，取50mL进化培养基重悬上述菌体，30℃、200rpm振荡培养24h后，吸取0.5mL培养液转入新鲜的进化培养基中继续培养24h，如此反复转接50次，并不断提高抑制物总浓度至100、150、200、250、300mg/L。进化结束后，取最后一次培养得到的菌液，离心收集菌体。 [0142] 进化文库高通量筛选：将Hoechst 33258稀释成1uM染色液，吸取1mL，加入上述进化后离心得到的菌体中，重悬菌体，30℃、50rpm振荡孵育20min，5000rpm离心5min收集菌体，用磷酸盐缓冲液洗涤沉淀两次并重悬，重悬液采用流式细胞仪进行荧光分析，分选条件：激发光波长490nm，发射光波长530nm。经过流式细胞仪分析，进化后的细胞文库，有1个细胞团荧光明显高于其他细胞。 [0143] 放大验证：上述经过流式细胞仪筛选得到的优势菌株E，在3L发酵罐中进行发酵验证，发酵培养基为：以质量百分比计，葡萄糖4％、酵母浸出物1％，七水硫酸镁0.2％，七水硫酸锌0.2％，磷酸二氢钾1％，余量为水，pH5.0，搅拌600rpm，通气6L/min，每隔一段时间测定其生物量和RNA含量。发酵结束，RNA含量达到15.4％，菌体干重达到52.6g/L。 [0144] 优势菌株E在3L发酵罐放大验证结果如图4所示。从图4可以看出，筛选出的优势菌株E经3L发酵罐发酵培养后得到的RNA含量明显高于出发菌株酿酒酵母FX‑2。 [0145] 实施例9 [0146] 出发菌株诱变：酿酒酵母FX‑2在100mL YPD培养基中，30℃、200rpm振荡培养24h后，吸取1mL菌液，12000rpm离心1min收集菌体，用磷酸盐缓冲液洗涤沉淀两次，加入配制好的5％的甲基磺酸乙酯1mL，混匀，30℃、50rpm振荡30min后，紫外辐射条件下诱变30s，离心，洗涤沉淀两次。 [0147] 菌体复苏：在上述菌体沉淀中加入5mL YPD培养基重悬，30℃静止培养60min后5000rpm离心5min收集菌体。 [0148] 诱变文库适应性进化：6.7g YNB、20g硫酸铵、40mg 5‑氟尿嘧啶、40mg 6‑巯基嘌呤配成1L进化培养基溶液，0.22μm过滤除菌，取50mL进化培养基重悬上述菌体，30℃、200rpm振荡培养24h后，吸取0.5mL培养液转入新鲜的进化培养基中继续培养24h，如此反复转接100次，并不断提高抑制物浓度至100、200、300、400、500mg/L。进化结束后，取最后一次培养得到的菌液，离心收集菌体。 [0149] 进化文库高通量筛选：将 RNASelectTM稀释10000倍制备成500nM染色液，吸取1mL，加入上述进化后离心得到的菌体中，重悬菌体，30℃、50rpm振荡孵育20min，5000rpm离心5min收集菌体，用磷酸盐缓冲液洗涤沉淀两次并重悬，重悬液采用流式细胞仪进行荧光分析，分选条件：激发光波长490nm，发射光波长530nm。经过流式细胞仪分析，进化后的细胞文库，有1个细胞团荧光明显高于其他细胞。 [0150] 放大验证：上述经过流式细胞仪筛选得到的优势菌株F，在3L发酵罐中进行发酵验证，发酵培养基为：以质量百分比计，葡萄糖2％、酵母浸出物0.5％，七水硫酸镁0.2％，七水硫酸锌0.2％，磷酸二氢钾0.5％，余量为水，pH5.0，搅拌300rpm，通气3L/min，每隔一段时间测定其生物量和RNA含量。发酵结束，RNA含量达到15.7％，菌体干重达到52.9g/L。 [0151] 优势菌株F在3L发酵罐放大验证结果如图4所示。从图4可以看出，筛选出的优势菌株F经3L发酵罐发酵培养后得到的RNA含量明显高于出发菌株酿酒酵母FX‑2。 [0152] 对比例1 [0153] 1)出发菌株诱变：酿酒酵母FX‑2在100mL YPD培养基中，30℃、200rpm振荡培养24h后，吸取1mL菌液，12000rpm离心1min收集菌体，用磷酸盐缓冲液洗涤沉淀两次，加入配制好的5％的甲基磺酸乙酯(EMS)1mL，混匀，30℃、50rpm振荡30min后离心，洗涤沉淀两次。 [0154] 2)菌体复苏：在上述菌体沉淀中加入5mL YPD培养基重悬，30℃静止培养60min后5000rpm离心5min收集菌体。 [0155] 3)进化文库高通量筛选：将 RNASelectTM稀释10000倍制备成500nM染色液，吸取1mL，加入上述进化后离心得到的菌体中，重悬菌体，30℃、50rpm振荡孵育20min，5000rpm离心5min收集菌体，用磷酸盐缓冲液洗涤沉淀两次并重悬，重悬液采用流式细胞仪进行荧光分析，分选条件：激发光波长490nm，发射光波长530nm。 [0156] 4)放大验证：上述经过流式细胞仪筛选得到的优势菌株，在3L发酵罐中进行发酵验证，发酵培养基为：以质量百分比计，葡萄糖6％、酵母浸出物2％，七水硫酸镁0.4％，七水硫酸锌0.4％，磷酸二氢钾1.2％，余量为水，pH5.5，搅拌600rpm，通气4L/min，每隔一段时间测定其生物量和RNA含量。发酵结束，RNA含量达到11.8％，菌体干重达到52.3g/L。 [0157] 对比例2 [0158] 1)出发菌株诱变：酿酒酵母FX‑2在100mL YPD培养基中，30℃、200rpm振荡培养24h后，吸取1mL菌液，12000rpm离心1min收集菌体，用磷酸盐缓冲液洗涤沉淀两次，加入配制好的5％的甲基磺酸乙酯(EMS)1mL，混匀，30℃、50rpm振荡30min后离心，洗涤沉淀两次。 [0159] 2)菌体复苏：在上述菌体沉淀中加入5mL YPD培养基重悬，30℃静止培养60min后5000rpm离心5min收集菌体。 [0160] 3)诱变文库适应性进化：6.7g YNB、20g硫酸铵、100mg 6‑杂氮尿嘧啶配成1L进化培养基溶液，0.22μm过滤除菌，取50mL进化培养基重悬上述菌体，30℃、200rpm振荡培养24h后，吸取0.5mL培养液转入新鲜的进化培养基中继续培养24h，如此反复转接50次，并不断提高抑制物浓度至200、300、400、500mg/L。进化结束后，取最后一次培养得到的菌液，离心收集菌体。 [0161] 4)进化文库筛选：将上述进化后离心得到的菌体重悬，30℃、50rpm振荡孵育20min，5000rpm离心5min收集菌体，用磷酸盐缓冲液洗涤沉淀两次并重悬，将重悬液稀释至合适浓度并涂布于YPD固体平板，30℃静置培养24h后挑取单菌落逐一测定RNA含量。 [0162] 5)放大验证：选取RNA含量高的菌株在3L发酵罐中进行发酵验证，发酵培养基为：以质量百分比计，葡萄糖6％、酵母浸出物2％，七水硫酸镁0.4％，七水硫酸锌0.4％，磷酸二氢钾1.2％，余量为水，pH5.5，搅拌600rpm，通气4L/min，每隔一段时间测定其生物量和RNA含量。发酵结束，RNA含量达到12.6％，菌体干重达到51.6g/L。 [0163] 以上所述，仅是本发明实施的较佳实施例，并非对本发明做任何形式上的限制，凡在本发明的精神和原则之内做的修改、等同替换和改进等，均需包含在本发明的保护范围内。

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