一种功能饮料及其制备方法 |
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| 申请号 | CN202311870641.8 | 申请日 | 2023-12-29 | 公开(公告)号 | CN117941786A | 公开(公告)日 | 2024-04-30 |
| 申请人 | 武汉市中心医院; | 发明人 | 文宠; 周庆; 邓艾平; | ||||
| 摘要 | 本 申请 提供一种功能饮料及其制备方法，该功能饮料由黑米 发酵 液、黄精液、白砂糖及 水 组成，所述黑米发酵液含有红曲色素，所述红曲色素选自红曲黄色素，所述红曲黄色素包括MFA和MFB，该功能饮料具有 预防 血尿酸水平升高的功效或可作为 辅助 治疗 高尿酸血症的功能食品，该功能饮料在常温或低温条件下能够长期保存，色泽均匀、质地均一、口感顺滑、回味好、具有令人适宜的米香与黄精香气，其由黑米发酵液、黄精液、白砂糖和水经过调配和均质得到。本申请还提供一种黑米发酵液及其制备方法，其由红曲发酵黑米粉经过煮制工艺制成，以红曲发酵黑米粉作为原料制成的黑米发酵液是制备本申请功能饮料的重要原液，其具有预防血尿酸水平升高的功效。 | ||||||
| 权利要求 | 1.一种功能饮料，其特征在于，由下列组分按质量百分比组成：黑米发酵液40‑80％、黄精液5‑25％、食糖3‑7％，其余组分为水。 |
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| 说明书全文 | 一种功能饮料及其制备方法技术领域背景技术[0002] 尿酸是一种含有三氧嘌呤结构的弱酸，由嘧啶和咪唑亚结构以及氧分子组成。在人体内，尿酸主要由肝脏、肌肉和肠道产生。它的代谢途径比较复杂，黄嘌呤是尿酸的直接前体。黄嘌呤通过黄嘌呤氧化还原酶的作用被降解为尿酸，并且这个过程中产生了一定量的氢离子和游离基，会对细胞造成一定程度的损伤。人类黄嘌呤和尿酸的主要来源可分为外源性嘌呤和内源性嘌呤，高嘌呤饮食会增加尿酸盐的生成，从而使得体内尿酸水平升高，增加了尿酸结晶形成、痛风和尿酸性肾病等疾病的风险。尿酸的产生可以通过消除尿酸来平衡，主要是在尿液中，很大一部分高尿酸血症的病因都与肾脏尿酸排泄下降有关。尿酸在肾脏的排泄主要依赖特异性转运蛋白URAT1和GLUT9的连续活动被重吸收，这两种转运体分别在肾近端小管的上皮细胞中通过根尖膜和基底外侧膜移动尿酸。 [0003] 黄嘌呤氧化酶(Xanthine oxidase，XO)是嘌呤代谢的主要酶，其活性强弱直接调控尿酸水平的高低，是作为防治高尿酸血症的主要靶点。黄嘌呤氧化酶在体内的催化机理：嘌呤核苷酸在嘌呤核苷磷酸酶的催化下转化成鸟嘌呤和次黄嘌呤，随后在一定条件下经过催化生成黄嘌呤。黄嘌呤进一步被黄嘌呤氧化酶催化氧化，形成尿酸并释放出二氧化碳和水分。这个过程中，黄嘌呤氧化酶作为一个催化剂，在催化过程中并不参与反应本身，而是通过调整反应物的构象、优化反应底物在酶活性中心的位置等方式来提高反应速率和效率。目前，抑制尿酸的生成主要通过XO抑制剂来实现，如别嘌呤醇、非布司他等是临床上典型的抑制剂，但该类药物具有一定的毒副作用，因此限制了其广泛使用。 [0004] 黑米是一种特殊的稻米，其富含各种生物活性成分，这些成分主要分布在其果皮、种皮和胚芽中，包括酚类化合物、谷维素、氨基酸、多种维生素、黄酮类化合物、膳食纤维、花青素、不饱和脂肪酸以及多种微量元素，这些成分使得黑米具有独特的营养价值和药理作用。黑米功能活性成分花色苷是天然存在的水溶性色素，结构由花青素与糖部分的α‑或β‑连接组成，属于酚类化合物中类黄酮类物质。花色苷易溶于水、甲醇、乙醇等极性溶剂，且易受光照、温度、pH值等因素的影响而发生结构变化。在黑米中，最主要的两种花色苷是矢车菊素‑3‑O‑葡萄糖苷和芍药色素‑3‑O‑葡萄糖苷，这两种花色苷具有较高的生物活性，黑米花色苷已被证实具有降血脂、抗癌、抗氧化等药理作用。 [0005] 发明人申请的专利CN202110522682.2，公开号CN113262274A利用酸醇浸提法对黑米粉末进行提取，得到了一种黑米提取物，该提取物含有丰富的矢车菊素‑3‑O‑葡萄糖苷，并首次披露其具有黄嘌呤氧化酶抑制活性，或可应用于降尿酸的药物中，该生物活性很可能是由于矢车菊素‑3‑O‑葡萄糖苷等花色苷所产生。 [0006] 红曲菌(又名红曲霉菌、红曲霉)是一种常见的微生物，广泛应用于食品、保健品和医药领域。红曲菌能代谢产生多种具有降血糖、降血脂、抗炎症、抗癌等功能的代谢产物，在医药领域有着巨大的应用前景。在红曲菌的生长过程中，它会产生许多代谢产物，其中最为重要的是红曲色素、他汀类物质、桔霉素、二甲酸和γ‑氨基丁酸等。红曲色素是一种优质的天然食用色素，是红曲霉的次级代谢产物，具有抗癌、抗菌、抗肥胖活性和抗氧化作用等一系列的生物活性，但尚未有红曲色素具有黄嘌呤氧化酶抑制活性或降低血尿酸水平的相关报道。因此，红曲菌代谢物的开发与推广应用有待科研人员进一步发现。 发明内容[0007] 发明人在专利CN202110522682.2，公开号CN113262274A研究的基础上，进一步探究黑米的黄嘌呤氧化酶抑制活性及降尿酸效果的产生机理。 [0008] 发明人用黑米粉进行红曲菌发酵，经过特定工艺处理，得到一种红曲发酵黑米粉。经过功效实验验证，发现发酵后得到的红曲发酵黑米粉相比发酵前的黑米粉，黄嘌呤氧化酶(XO)抑制活性及降尿酸效果均有显著性提升。经过化学成分分析，检测到发酵后得到的红曲发酵黑米粉产生了新的物质红曲色素，特别是红曲黄色素，而其矢车菊素‑3‑O‑葡萄糖苷等花色苷含量在发酵后大幅度降低，同时检测发现，发酵前的黑米粉却未检测到含有红曲黄色素。为了探究发酵前后对XO抑制活性及降尿酸效果产生显著差异的原因，发明人用其他方法制备了红曲黄色素样品，并检测到其中含有四种红曲黄色素组分，即Monasfluore A(MFA)、Monasfluore B(MFB)、红曲黄素(Monascin，MS)、安卡红曲黄素(Ankaflavin，AK)。 经过对红曲黄色素样品的功效实验验证，发明人惊奇的发现，含有上述四种组分的红曲黄色素样品，其XO抑制活性及降尿酸效果竟然比发酵后制得的红曲发酵黑米粉更加显著！发明人意外的发现红曲黄色素也具有XO抑制活性及降尿酸效果。 [0009] 发明人推测，发酵前黑米粉表现的XO抑制活性及降尿酸效果，可能是由于矢车菊素‑3‑O‑葡萄糖苷等花色苷所产生(发明人在先申请CN202110522682.2，公开号CN113262274A)，黑米经过红曲菌发酵后，产生了新的物质红曲色素(特别是红曲黄色素)，而红曲色素的XO抑制活性及降尿酸效果显著强于矢车菊素‑3‑O‑葡萄糖苷等花色苷，因此，在红曲色素的强化作用下，发酵后制得的红曲发酵黑米粉的XO抑制活性及降尿酸效果有了显著性提升。 [0010] 有鉴于此，本申请提出如下的技术方案，即一种红曲发酵黑米粉及其制备方法和用途，以及一种红曲色素(特别是红曲黄色素)在制备治疗高尿酸血症的药物或预防血尿酸水平升高的功能饮料中的用途。 [0011] 本申请基于上述红曲发酵黑米粉的用途，还提出如下的技术方案，即一种功能饮料及其制备方法和含有该功能饮料的饮料包装，以及一种黑米发酵液及其制备方法。 [0012] 本申请提供一种红曲发酵黑米粉，其由黑米经红曲菌发酵制成，其特征在于，所述红曲发酵黑米粉中含有至少一种红曲色素。 [0013] 作为本申请的一个实施例，上述发酵选自固态发酵或液态发酵。 [0014] 固态发酵，是微生物在没有或基本没有游离水的固态基质上的发酵方式，固态基质中气、液、固三相并存，即多孔性的固态基质中含有水和水不溶性物质。相比于液态发酵，固态发酵具有水分活度低，基质水不溶性高，微生物易生长，发酵设备构造简单，能耗低，易操作，后处理简便，污染少，基本无废水排放等优点。 [0015] 黑米作为一种特殊的稻米，不溶于一般的溶剂中，如水、乙醇、丙酮等，因此，作为一种优选，上述发酵为固态发酵。 [0016] 红曲菌(又名红曲霉菌、红曲霉)是一种小型丝状腐生真菌，依据其形态学、生理特征的差异、培养基形态、色素种类、发酵特性等进行归类，主要种类有红曲霉(M.anka)、红色红曲霉(M.ruber)、烟色红曲霉(M.fuliginosus)、发白红曲霉(M.albidus)、锈色红曲霉(M.rubiginosus)、变红红曲霉(M.serorubescens)和紫色红曲霉(M.purpureus)等。 [0017] 作为本申请的一个优选实施例，上述红曲菌选自紫色红曲霉(M.purpureus)，所述紫色红曲霉选自ATCC 96218。 [0018] 红曲色素是多种色素的混合物，主要由化学结构不同、性质相近的红、橙、黄3类色素组成，即红曲红色素、红曲橙色素、红曲黄色素。其中，红曲黄色素的典型代表包括红曲黄素(Monascin，MS)和安卡红曲黄素(Ankaflavin，AK)等；红曲橙色素的典型代表包括红斑素(Rubropunctatin)和红曲红素(Monascorubrin)等；红曲红色素的典型代表包括红斑胺(Rubropuntamine)和红曲红胺(Monascorubramine)等。此外，通过敲除某种基因，可从红色红曲菌M7中分离得到六种红曲黄色素，即红曲黄素(Monascin)、安卡红曲黄素(Ankaflavin)、Monasfluol A、Monasfluol B、Monasfluore A、Monasfluore B。其中，Monasfluore A简称MFA，Monasfluore B简称MFB，红曲黄素(Monascin)简称MS，安卡红曲黄素(Ankaflavin)简称AK。上述红曲色素的结构式如下： [0019] [0020] 上述化合物包括其外消旋体及各种异构体。 [0021] 作为本申请的一个实施例，上述红曲色素选自红曲黄色素。 [0022] 作为本申请的一个优选实施例，所述红曲黄色素包括MFA和MFB。 [0023] 本申请在制备红曲发酵黑米粉过程中，在发酵后，有多次提取操作，然后经过冻干得到红曲发酵黑米粉。提取一般可以酸醇浸提法提取发酵后黑米中的功能成分，提取的次数不同，最终红曲发酵黑米粉中红曲黄色素MFA、MFB含量也会不同，为了使红曲黄色素完全被提取，一般提取至沉淀物显无色。 [0024] 综合成本因素，本申请优选的一个实施例为提取三次，制备得到的红曲发酵黑米粉中，MFA的质量百分比含量不低于3.97％，MFB的质量百分比含量不低于7.24％。此时，沉淀物仍然具有少许颜色。 [0025] 本申请提供的红曲发酵黑米粉，除了包括MFA和MFB，还包括红曲黄素(Monascin，MS)和安卡红曲黄素(Ankaflavin，AK)。 [0026] 本申请还提供一种上述红曲发酵黑米粉在制备治疗高尿酸血症的药物或预防血尿酸水平升高的功能饮料中的用途。 [0027] 高尿酸血症(HUA)是在正常饮食状态下，体内尿酸生成过多和/或排泄过少所致。正常情况下，人类的尿酸严格控制在正常范围内，当机体尿酸代谢异常，血清尿酸水平会持续升高，进而导致痛风和高尿酸血症等疾症。但是，尿酸值的升高并不一定意味着疾病一定会发生。有些人可能会出现高尿酸血症，但并不会出现痛风等相关的症状，而有些人尽管尿酸值并不高，却仍然会出现痛风等相关的症状。因此，在临床上，只要诊断为血尿酸水平高于正常阈值或者出现由高血尿酸导致的病症(如痛风等)，均可在医学可接受的范围内应用红曲发酵黑米粉，并视情况添加辅料或赋形剂。 [0029] 本申请提供的红曲发酵黑米粉具有降低血尿酸水平的功效，将红曲发酵黑米粉原料经过特定工艺制成的功能饮料，可保留降尿酸功能成分，在预防血尿酸水平升高的同时，提高口感，扩大应用场景。 [0030] 功能饮料可视情况添加或不添加具有其他功效的成分或甜味剂等。 [0031] 尿酸运输涉及复杂的过程：尿酸盐转运蛋白1(URAT1)和葡萄糖转运蛋白9(GLUT9)负责肾脏重吸收，是尿酸转运过程中两个重要的尿酸重吸收蛋白，ATP结合盒亚家族G成员2(ABCG2)、有机阴离子转运蛋白1(OAT1)、有机阴离子转运蛋白3(OAT3)促进肾脏分泌。当机体处于高血尿酸状态时，URAT1、GLUT9蛋白表达升高。有研究表明，URAT1和GLUT9的某些增强蛋白功能的突变与高尿酸血症发生相关。 [0032] ABCG2是ATP结合盒转运蛋白超家族的一员，有研究表明，ABCG2转运蛋白的主要作用部位是调节肠道中的尿酸盐稳态，基于其功能和定位，ABCG2被认为是“守门人”，防止内毒素或外毒素和异生素穿过生物屏障进入敏感组织。ABCG2转运蛋白表达增加会使重吸收减少，尿酸排泄加速导致血尿酸浓度降低。 [0033] 作为本申请的一个优选实施例，红曲发酵黑米粉在实现治疗高尿酸血症或预防血尿酸水平升高的过程中，可以通过如下途径中的至少一种途径实现： [0034] 下调URAT1蛋白活性或基因表达水平； [0035] 下调GLUT9蛋白活性或基因表达水平； [0036] 上调ABCG2蛋白活性或基因表达水平。 [0037] 本申请还提供一种上述红曲发酵黑米粉的制备方法，包括如下发酵、提取和冻干步骤： [0038] i.发酵：将灭菌好的一定质量的黑米置于发酵容器中，按1‑15％(v/w％)的接种量接入红曲菌孢子悬浮液，控制温度为26℃‑42℃培养7‑30天，得到发酵后黑米； [0039] ii.提取：将步骤i中得到的发酵后黑米碾成粉末，加入乙醇溶液，搅拌混合均匀后加入酸调节pH至酸性，然后离心收集上清液，将离心后的沉淀物碾成粉末重复上述提取步骤，合并所有上清液，得到提取液； [0041] 作为本申请的一个实施例，红曲菌孢子悬浮液由如下方法制得：取活化好的红曲菌菌种接种在PDA培养基斜面上，置于恒温培养箱中30℃培养3‑10天，在无菌操作台上向培养好的斜面内加入5‑10ml无菌水，使孢子被顺利洗下，然后用无菌滤纸过滤，得到红曲菌孢子悬浮液。 [0042] PDA培养基即马铃薯葡萄糖琼脂培养基。 [0043] 作为本申请的一个优选实施例，步骤i中，所述接种量按10％的接种量接入红曲菌孢子悬浮液。 [0044] 作为本申请的一个优选实施例，步骤i中，所述温度为30℃。 [0045] 作为本申请的一个优选实施例，步骤ii中，所述乙醇溶液为70％乙醇水溶液，所述发酵后黑米与所述乙醇溶液的质量体积比(g:ml)为1:(5‑15)，优选为1:(5‑9)，进一步优选为1:7。 [0046] 作为本申请的一个优选实施例，步骤ii中，所述酸选自盐酸、硫酸、硝酸。盐酸为挥+ ‑发性酸，硫酸、硝酸等不易挥发，在提供H相同的情况下，用盐酸调节pH，可减少体系中Cl的含量，最终制备的红曲发酵黑米粉杂质含量更加可控。 [0047] 进一步优选，所述酸为盐酸。 [0048] 作为本申请的一个优选实施例，步骤ii中，所述调节pH至酸性为调节pH至1.0‑2.0，进一步优选为调节pH至1.0。 [0049] 作为本申请的一个优选实施例，步骤ii中，重复上述提取步骤为提取至沉淀物完全脱色。 [0050] 本申请提供的红曲发酵黑米粉的制备方法，在步骤(1)前，还包括黑米预处理的步骤：将黑米用2‑5倍体积的水在室温下浸泡4‑8小时，优选为用2倍体积的水在室温下浸泡4‑8小时。 [0051] 本申请提供的红曲发酵黑米粉的制备方法，在步骤(2)中，调节pH至酸性后，将混合溶液置于45℃恒温水浴锅中水浴120分钟，然后取出混合溶液进行离心操作。 [0052] 本申请还提供一种红曲色素在制备治疗高尿酸血症的药物或预防血尿酸水平升高的功能饮料中的用途。 [0053] 作为本申请的一个实施例，上述红曲色素选自红曲黄色素。 [0054] 作为本申请的一个优选实施例，上述红曲黄色素含有式I或II的化合物或其盐、同位素变体、异构体、代谢产物， [0055] [0056] 其中，R1选自烷基、环烷基、杂环基、烯基、炔基、芳基、杂芳基或Z取代的烷基、环烷基、杂环基、烯基、炔基、芳基、杂芳基； [0057] 当 为单键时，M为羟基，当 为双键时，M为O； [0058] X选自O或‑N(CH(R2)COOH)‑； [0059] R2选自氨基酸的侧链基团； [0060] Z选自卤基、胺基、羟基、巯基、氰基。 [0061] 氨基酸具有如下所示的结构： [0062] [0063] 氨基酸的侧链基团是指上述氨基酸结构中的R基团。因此，所有氨基酸R基团的集合就是R2可选择的范围。 [0064] 优选地，上述式I和式II中，R1为C1‑C14烷基； [0065] 进一步优选地，上述式I和式II中，R1为直链‑C5H11或直链‑C7H15。 [0066] 优选地，X为O或X为‑N(CH(R2)COOH)‑，且R2选自氢、烷基、环烷基、杂环基、芳基、杂芳基、酮基或Z取代的烷基、环烷基、杂环基、芳基、杂芳基、酮基；更优选地，R2选自氢、甲基、异丙基、正丁基、异丁基、苯基； [0067] 进一步优选地，式I化合物为红曲黄素(Monascin)或安卡红曲黄素(Ankaflavin)，式II化合物为MFA或MFB。 [0068] 作为本申请的一个优选实施例，上述红曲色素(特别是红曲黄色素)在实现治疗高尿酸血症或预防血尿酸水平升高的过程中，可以通过如下途径中的至少一种途径实现： [0069] 下调URAT1蛋白活性或基因表达水平； [0070] 下调GLUT9蛋白活性或基因表达水平； [0071] 上调ABCG2蛋白活性或基因表达水平。 [0072] “烷基”是指具有多个碳原子饱和烃基，在一些实施例中是具有1至14个碳原子的单价饱和脂肪族烃基。“Cx‑Cy烷基”是指具有x至y个碳原子的烷基。此术语包括(举例而言)直链及具有支链的烃基，例如甲基(CH3‑)、乙基(CH3CH2‑)、正丙基(CH3CH2CH2‑)、异丙基((CH3)2CH‑)、正丁基(CH3CH2CH2CH2‑)、异丁基((CH3)2CHCH2‑)、仲丁基((CH3)(CH3CH2)CH‑)、叔丁基((CH3)3C‑)、正戊基(CH3CH2CH2CH2CH2‑)及新戊基((CH3)3CCH2‑)。 [0073] “环烷基”是指具有3至14个碳原子且没有环杂原子且具有单环或包括稠合、桥连及螺环系统的多环的饱和或部分饱和环状基团。对于不具有环杂原子的具有芳香族及非芳香族环的多环系统而言，当附接点是位于非芳香族碳原子处时，术语“环烷基”适用(例如5,6,7,8‑四氢萘‑5‑基)。术语“环烷基”包括环烯基。环烷基的实例包括(例如)金刚烷基、环丙基、环丁基、环戊基、环辛基及环己烯基。 [0074] “杂环基”是指具有1至14个碳原子及1至6个选自由氮、硫或氧组成的群的杂原子的饱和或部分饱和环状基团且包括单环及包括稠合、桥连及螺环系统的多环系统。对于具有芳香族及/或非芳香族环的多环系统而言，当存在至少一个环杂原子且附接点是位于非芳香族环的原子处时，术语“杂环基”适用(例如1,2,3,4‑四氢喹啉‑3‑基、5,6,7,8‑四氢喹啉‑6‑基及十氢喹啉‑6‑基)。 [0075] “芳基”是指具有至少6个碳原子且不含环杂原子且具有单环(例如，苯基)或多个缩合(稠合)环(例如，萘基或蒽基)的芳香族基团。对于包括不具有环杂原子的具有芳香族环及非芳香族环的稠合、桥连及螺环系统的多环系统而言，当附接点位于芳香族碳原子处时，术语“芳基”适用。 [0076] “杂芳基”是指具有1至14个碳原子及1至6个选自由氧、氮及硫组成的群的杂原子的芳香族基团且包括单环(例如咪唑基‑2‑基及咪唑‑5‑基)及多环系统(例如咪唑并吡啶基、苯并三唑基、苯并咪唑‑2‑基及苯并咪唑‑6‑基)。对于包括具有芳香族及非芳香族环的稠合、桥连及螺环系统的多环系统而言，若存在至少一个环杂原子且附接点是位于芳香族环的原子处，则应用术语“杂芳基”(例如1,2,3,4‑四氢喹啉‑6‑基及5,6,7,8‑四氢喹啉‑3‑基)。 [0077] “卤基”是指氟、氯、溴及碘中的一或多者。 [0078] 式I及式II化合物中含有酯基，M可以为羟基，因此所述化合物还可能被以盐的形式进行应用，即本发明提供所述化合物的药学或食品领域可接受的盐，所述盐可以为化合物与碱反应生成的盐，包括所述化合物与无机碱(例如碱金属氢氧化物、碱土金属氢氧化物等)或与有机碱(例如单乙醇胺、二乙醇胺或三乙醇胺等)形成的盐。或者，所述盐可以为化合物与酸反应生成的盐，包括所述化合物与无机酸(例如盐酸、氢溴酸、氢碘酸、硝酸、高氯酸、硫酸或磷酸等)或与有机酸(例如甲磺酸、三氟甲磺酸、乙磺酸、苯磺酸、对甲苯磺酸、富马酸、草酸、马来酸、柠檬酸等)形成的盐。 [0079] 同理，其也有可能与某些酸或者醇发生反应而成为酯，所述化合物还可能被以酯的形式进行应用。因此，本申请还提供所述化合物的酯在制备治疗高尿酸血症的药物或预防血尿酸水平升高的功能饮料中的用途。 [0080] 由于各种原因，式I及II的化合物可能会与某些溶剂形成溶剂合物，所述溶剂合物为水合物或醇合物，因此所述化合物还可能被以溶剂合物的形式被应用于降尿酸用途。 [0081] “同位素变体”是指在组成此类化合物的原子中的一或多者处含有非天然比例的同位素的化合物。在某些实施例中，化合物的“同位素变体”含有非天然比例的一或多种同1 2 3 11 12 13 位素，包括(但不限于)氢(H)、氘(H)、氚(H)、碳‑11( C)、碳‑12( C)、碳‑13( C)、碳‑14 14 13 14 15 14 15 16 ( C)、氮‑13( N)、氮‑14( N)、氮‑15( N)、氧‑14( O)、氧‑15( O)、氧‑16( O)、氧‑17 17 18 ( O)、氧‑18( O)。 [0082] 式I及II化合物中，具有多个手性碳原子，同分异构体虽然分子量相同，但其化学性质，特别是在生物体内的代谢往往会产生显著差异，甚至会起到相反的生理作用。因此，本申请还提供式I及II化合物的异构体在制备治疗高尿酸血症的药物或预防血尿酸水平升高的功能饮料中的用途。 [0083] 选择和制备化合物的可接受的盐、酯和溶剂合物、同位素变体等是本领域公知技术。 [0084] 本领域技术人员应当知晓，物质在生物体内，在各种酶或蛋白质的作用下会进行一系列的代谢，产生各种代谢产物。根据专利CN201010145390.3(公开号CN101862327A)以及专利CN201010145501.0(公开号CN101862324A)报道，式I及式II化合物在生物体内还可能存在某种可逆的生物转化，因此，式I及式II化合物的代谢产物也可能具有降尿酸的功效。 [0085] 可选的，所述生物转化选自以下三种过程之一： [0086] (1)2、3位的内酯转化为开环结构； [0087] (2)4位的羰基还原为羟基结构(此时M为‑O‑或‑OH)； [0088] (3)6位的氧杂环转变为氮杂环化合物(此时X为‑O‑或‑N(CH(R2)COOH)‑)，且氮源来自于氨基酸的氨基。 [0089] [0090] 式I及式II化合物的代谢产物可通过本领域通行的方法进行合成制备。 [0091] 本申请还提供一种功能饮料，其由下列组分按质量百分比组成：黑米发酵液40‑80％、黄精液5‑25％、食糖3‑7％，其余组分为水。 [0092] 作为本申请的一个优选实施例，各组分质量百分比为：黑米发酵液40‑70％、黄精液10‑20％、食糖5‑7％，其余组分为水。 [0093] 进一步优选，各组分质量百分比为：黑米发酵液60％、黄精液17％、食糖6％，水17％。 [0094] 上述组分中的食糖主要是为了改善功能饮料的口感，使其不苦、酸甜适中、回味好，因此，能够达到上述目的的食糖均可以作为本申请功能饮料的原料。 [0096] 按日常生产习惯，食糖可分为原糖、白砂糖、绵白糖、赤砂糖、黄砂糖、红糖粉、块红糖(包括砖糖、碗糖、元宝糖等)、人造红糖、多晶体冰糖、单晶冰糖、冰片糖、方糖、保健红糖、保健冰糖、糖粉等。 [0097] 作为本申请的一个优选，本申请功能饮料的食糖选自白砂糖、绵白糖、赤砂糖、多晶体冰糖、单晶体冰糖、方糖、冰片糖、黄砂糖、加工红糖。 [0098] 作为本申请的一个优选，本申请功能饮料的食糖选自原糖、白砂糖、绵白糖、赤砂糖、黄砂糖、红糖粉、块红糖、人造红糖、多晶体冰糖、单晶冰糖、冰片糖、方糖、保健红糖、保健冰糖、糖粉。 [0099] 进一步地，食糖优选为白砂糖。 [0100] 本申请提供的功能饮料，其原料液之一的黑米发酵液中，含有红曲色素，特别的，含有红曲黄色素。 [0101] 作为本申请的一个优选实施例，黑米发酵液含有的红曲黄色素中包括MFA和MFB。 [0102] 本申请还提供上述功能饮料的制备方法，其包括如下步骤： [0103] 调配：将黑米发酵液、黄精液、白砂糖、水按照比例进行调配，得到调配液； [0104] 均质：将调配液在25‑35Mpa下进行均质即得到功能饮料。 [0105] 作为本申请的一个优选，均质步骤中压强选自30Mpa。 [0106] 微生物过度繁殖是造成多数饮料变质的主要原因，所以应在制作饮料的生产过程中添加灭菌的步骤来保证饮料正常的保质期。热杀菌是食品加工史上应用历史最悠久、使用最广泛的灭菌技术之一，包括两大类：湿热杀菌和干热杀菌。热杀菌过程中，微生物细胞内的蛋白质因高温热变性凝固导致微生物死亡。在饮料、乳制品杀菌中经常采用的低温长时间杀菌、高温短时杀菌和超高温瞬时灭菌，都是利用温度杀灭致病菌和大多数非致病菌。通常情况下，微生物尤其是孢子，在干热环境中比湿热环境中具有更大的耐热性。干热灭菌和湿热灭菌的效果取决于热量从热载体向微生物细胞传输的速度。从这点上来说，包材的表面性质会对热杀菌效果产生重要的影响。在正常处理情况下，热杀菌不会导致包材表面的有害残留，也不会产生环境危害，因此得到广泛应用。 [0107] 作为本申请的一个实施例，在均质后，还包括灭菌步骤。 [0108] 优选地，灭菌采用湿热杀菌和/或干热杀菌。 [0109] 当然，为了获得较长保质期的灭菌操作，除了在均质步骤之后，也可以在调配之前进行，即分别对黑米发酵液原液、黄精液原液、白砂糖及水进行灭菌，然后，在调配、均质等操作中，在无菌环境中进行；也可以把均质后的功能饮料进行灌装、封盖之后，再进行灭菌操作。 [0110] 本申请提供的功能饮料，由于其含有黑米发酵液，而黑米发酵液由红曲发酵黑米粉制备而来，保留了红曲发酵黑米粉的XO抑制活性及降尿酸功效，因此，该功能饮料具有预防血尿酸水平升高的功效，也可作为辅助治疗高尿酸血症的功能食品。 [0111] 本申请还提供一种含有上述功能饮料的饮料包装，其将上述的功能饮料或上述制备方法制得的功能饮料灌装入容器中，然后封盖即得。 [0112] 上述饮料包装视情况对其进行灭菌操作。若在灌装、封盖前没有灭菌，则在封盖后灭菌，若在调配前或者均质后进行了灭菌，则封盖后可以不进行灭菌。是否灭菌，主要依据饮料包装的保质期而定，保质期一般需要达到3个月、6个月、8个月、12个月、18个月或24个月。 [0113] 作为本申请的一个实施例，上述饮料包装所盛装的功能饮料的体积选自100mL、280mL、350mL、500mL、1000mL、1500mL或2000mL，相应的选择不同容积的容器盛装。 [0114] 本申请还提供一种黑米发酵液，其由红曲发酵黑米粉制成，其中，所述红曲发酵黑米粉由黑米经红曲菌发酵制成，且红曲发酵黑米粉中含有至少一种红曲色素。 [0115] 作为本申请的一个优选实施例，上述红曲色素选自红曲黄色素。进一步优选地，所述红曲黄色素包括MFA和MFB。 [0116] 由于红曲黄色素具有XO抑制活性及降尿酸功效，因此，本申请还提供一种黑米发酵液在制备预防血尿酸水平升高的功能饮料中的用途。 [0117] 本申请还提供上述黑米发酵液的制备方法，其由红曲发酵黑米粉经过煮制工艺X制成，所述煮制工艺X为：将红曲发酵黑米粉与水以1:(20‑60)的质量比进行配制，在60‑100℃温度下煮制60‑180min，即得黑米发酵液。 [0118] 本申请提供的红曲发酵黑米粉中含有丰富的花色苷、酚类、黄酮类物质及红曲色素，其具有XO抑制活性及降尿酸功效。现有技术报道黑米中含有丰富的花色苷、酚类、黄酮类物质，其具有抗氧化、抗炎、抗血脂、抗癌等作用。因此，本申请以红曲发酵黑米粉为原料制备黑米发酵液，在保证黑米发酵液也具有XO抑制活性及降尿酸功效的前提下，同时兼具其抗氧化、抗炎、抗血脂、抗癌等作用。因此，本申请黑米发酵液的煮制工艺X，以总黄酮含量为指标，考察红曲发酵黑米粉与水的配比、煮制温度、煮制时间等因素。 [0119] 本申请煮制工艺X的探究实验表明： [0120] 在煮制时间120min、煮制温度90℃条件下，红曲发酵黑米粉与水的质量比为1:(40‑60)时，总黄酮含量可以达到15‑18mg/g；红曲发酵黑米粉与水的质量比为1:60时，总黄酮含量接近18mg/g，且再增加比例，总黄酮含量增加缓慢。 [0121] 在红曲发酵黑米粉与水的质量比为1:50、煮制温度为90℃时，随着煮制时间的延长，总黄酮含量持续升高，在90min至150min时呈现出快速上升的趋势，由13.1mg/g升至18.4mg/g，在达到150min后增长速率降低。 [0122] 在红曲发酵黑米粉与水的质量比为1:50、煮制时间120min条件下，当反应温度从60℃提高至90℃，总黄酮含量由12.5mg/g升至21mg/g，这一结果表明，适度提高温度对于黄酮含量的提高具有积极促进作用。但当温度超过90℃时，黄酮含量开始降低，但依然还有较高的得率，表明高温可能会影响黑米中部分黄酮的稳定性，使黄酮含量减少。 [0123] 作为本申请的一个优选实施例，所述煮制工艺X中，将红曲发酵黑米粉与水以1:(40‑60)的质量比进行配制，在80‑100℃温度下煮制120‑180min。 [0124] 进一步优选地，所述煮制工艺X中，将红曲发酵黑米粉与水以1:60的质量比进行配制，在90℃温度下煮制150min。 [0125] 制备黑米发酵液的原料红曲发酵黑米粉，既是本申请提供的红曲发酵黑米粉，也是本申请所提供的制备方法制得的红曲发酵黑米粉。上述制备黑米发酵液的原料红曲发酵黑米粉的制备方法与前述红曲发酵黑米粉的制备方法相同。 [0126] 本申请提供的功能饮料的另外一个原料黄精液，其由黄精经过煮制工艺Y制成，所述煮制工艺Y为：黄精研磨成黄精粉，将黄精粉与水以1:(15‑35)的质量比进行配制，在60‑100℃温度下煮制60‑180min，即得黄精液。 [0127] 黄精是一种药用和食用同源的植物，黄精富含多种生物活性物质，现有技术表明，黄精多糖是其主要的活性成分，它是《中国药典2020》中规定的黄精的唯一含量测定成分，具有抗肿瘤、抗氧化、保护骨骼、护肝和调节免疫等多种药理作用。因此，本申请黄精液的煮制工艺Y，以黄精多糖含量为指标，考察黄精粉末与水的配比、煮制温度、煮制时间等因素。 [0128] 本申请煮制工艺Y的探究实验表明： [0129] 在煮制温度为80℃，煮制时间为180min条件下，随着黄精粉与水的质量比的增大，多糖含量也随之增加，当液料比在1:25～1:30之间时，多糖含量显著增加，说明多糖的浸出需要一定的水分，待黄精粉充分浸透后更易多糖的溶出。一般来说，溶剂量越大，多糖浸出越多，但当溶剂量超过一定范围时，即当料液比超过1:30时多糖含量增加变化不明显。 [0130] 在黄精粉与水的质量比为1:30，煮制温度为80℃条件下，随着时间的不断延长，测得黄精液中多糖含量不断增加，在150min前呈缓慢上升趋势，150min后多糖含量显著升高，相比于120min时多提升了约5％。 [0131] 在黄精粉与水的质量比为1:30、煮制时间为180min条件下，随着水浴温度的升高，多糖含量呈现出明显的先升高后下降的趋势，在温度达到90℃时，多糖得率达到了最高峰，当反应温度超过90℃时，多糖含量缓慢下降，可能是因为蒸汽压力增加，溶剂蒸发较快，黄精粉和溶剂接触的比表面积减小，造成多糖浸出降低，或是高温使多糖结构受到破坏降低了多糖的浸出率。 [0132] 作为本申请的一个优选实施例，所述煮制工艺Y中，将黄精粉与水以1:(25‑35)的质量比进行配制，在80‑100℃温度下煮制120‑180min。 [0133] 进一步优选地，所述煮制工艺Y中，将黄精粉与水以1:30的质量比进行配制，在80℃温度下煮制180min。 [0134] 本申请所述药物除含有对应的红曲发酵黑米粉或其衍生物外，还应根据药品、药物、制剂的特点，添加药学上可接受的辅料或赋形剂。所述药物可以为临床施用的任何剂型，例如片剂、栓剂、分散片、肠溶片、咀嚼片、口崩片、胶囊、糖衣剂、颗粒剂、干粉剂、口服溶液剂、注射用小针、注射用冻干粉针或大输液。根据具体剂型和施用方式，所述药物中的药学上可接受的辅料或赋形剂可以包括下述的一种或多种：稀释剂、增溶剂、崩解剂、悬浮剂、润滑剂、粘合剂、填充剂、矫味剂、甜味剂、抗氧化剂、表面活性剂、防腐剂、包裹剂、和色素等。 [0136] 图1为红曲发酵黑米粉与发酵前黑米粉对黄嘌呤氧化酶(XO)活性抑制率的柱状图，其中，每组浓度的两个柱形中，左侧柱形为发酵前黑米粉，右侧柱形为红曲发酵黑米粉； [0137] 图2为实施例3.1制备的MFA的HPLC图谱； [0138] 图3为实施例3.1制备的MFB的HPLC图谱； [0139] 图4为红曲黄色素样品的HPLC图谱； [0140] 图5为红曲黄色素样品等度洗脱的HPLC图谱； [0141] 图6为红曲黄色素样品梯度洗脱的HPLC图谱； [0142] 图7为发酵前黑米粉等度洗脱的HPLC图谱； [0143] 图8为红曲发酵黑米粉等度洗脱的HPLC图谱； [0144] 图9为红曲黄色素样品、红曲发酵黑米粉与发酵前黑米粉对黄嘌呤氧化酶(XO)活性抑制率的柱状图，其中，每组浓度的三个柱形中，左侧柱形为发酵前黑米粉，中间柱形为红曲发酵黑米粉，右侧柱形为红曲黄色素样品； [0145] 图10为各组小鼠血清的尿酸(UA)含量水平柱形图，其中，N表示空白组，M表示模型组，P表示别嘌呤醇组，PR表示发酵前黑米组，PO表示红曲发酵黑米粉组，MF表示红曲黄色素组； [0146] 图11为各组小鼠血清的尿素氮(BUN)含量水平柱形图，其中，N表示空白组，M表示模型组，P表示别嘌呤醇组，PR表示发酵前黑米组，PO表示红曲发酵黑米粉组，MF表示红曲黄色素组； [0147] 图12为各组小鼠血清的肌酐(Cr)含量水平柱形图，其中，N表示空白组，M表示模型组，P表示别嘌呤醇组，PR表示发酵前黑米组，PO表示红曲发酵黑米粉组，MF表示红曲黄色素组； [0148] 图13为各给药组对高尿酸血症小鼠肝脏中黄嘌呤氧化酶(XO)影响的柱形图，其中，N表示空白组，M表示模型组，P表示别嘌呤醇组，PR表示发酵前黑米组，PO表示红曲发酵黑米粉组，MF表示红曲黄色素组； [0149] 图14为各给药组对高尿酸血症小鼠肝脏中腺苷脱氨酶(ADA)影响的柱形图，其中，N表示空白组，M表示模型组，P表示别嘌呤醇组，PR表示发酵前黑米组，PO表示红曲发酵黑米粉组，MF表示红曲黄色素组； [0150] 图15为各给药组对高尿酸血症小鼠肝脏中5'‑核苷酸酶(5'‑NT)影响的柱形图，其中，N表示空白组，M表示模型组，P表示别嘌呤醇组，PR表示发酵前黑米组，PO表示红曲发酵黑米粉组，MF表示红曲黄色素组； [0151] 图16为各组小鼠肾脏苏木精‑伊红(HE)染色图，其中，图16A为N组，图16B为M组，图16C为P组，图16D为MF组，图16E为PR组，图16F为PO组，放大倍数为1600倍，比例尺为20.00μm； [0152] 图17为各组小鼠肾脏中URAT1蛋白的免疫组化染色图，放大倍数为1600倍，比例尺为20.00μm； [0153] 图18为各组小鼠肾脏中URAT1蛋白的蛋白质表达水平柱形图，其中，N表示空白组，M表示模型组，P表示别嘌呤醇组，PR表示发酵前黑米组，PO表示红曲发酵黑米粉组，MF表示红曲黄色素组，不同字母表示组间显著性差异(p<0.05)(X±SD,n＝10)； [0154] 图19为各组小鼠肾脏中GLUT9蛋白的免疫组化染色图，放大倍数为1600倍，比例尺为20.00μm； [0155] 图20为各组小鼠肾脏中GLUT9蛋白的蛋白质表达水平柱形图，其中，N表示空白组，M表示模型组，P表示别嘌呤醇组，PR表示发酵前黑米组，PO表示红曲发酵黑米粉组，MF表示红曲黄色素组，不同字母表示组间显著性差异(p<0.05)(X±SD,n＝10)； [0156] 图21为各组小鼠肾脏中ABCG2蛋白的免疫组化染色图，放大倍数为1600倍，比例尺为20.00μm； [0157] 图22为各组小鼠肾脏中ABCG2蛋白的蛋白质表达水平柱形图，其中，N表示空白组，M表示模型组，P表示别嘌呤醇组，PR表示发酵前黑米组，PO表示红曲发酵黑米粉组，MF表示红曲黄色素组，不同字母表示组间显著性差异(p<0.05)(X±SD,n＝10)； [0158] 图23为制备功能饮料及其饮料包装的流程图； [0159] 图24为不同料液比(红曲发酵黑米粉与水的质量比)对黑米发酵液中黄酮含量影响的曲线图； [0160] 图25为红曲发酵黑米粉不同煮制时间对黑米发酵液中黄酮含量影响的曲线图； [0161] 图26为红曲发酵黑米粉不同煮制温度对黑米发酵液中黄酮含量影响的曲线图； [0162] 图27为不同料液比(黄精粉与水的质量比)对黄精液中多糖含量影响的曲线图； [0163] 图28为黄精粉不同煮制时间对黄精液中多糖含量影响的曲线图； [0164] 图29为黄精粉不同煮制温度对黄精液中多糖含量影响的曲线图； [0165] 图30为黑米发酵液不同质量百分比添加量对功能饮料感官评分影响的曲线图； [0166] 图31为黄精液不同质量百分比添加量对功能饮料感官评分影响的曲线图； [0167] 图32为白砂糖不同质量百分比添加量对功能饮料感官评分影响的曲线图； [0168] 图33为白砂糖(C)添加量保持不变时，黑米发酵液(A)、黄精液(B)对功能饮料感官评分的响应面立体分析图； [0169] 图34为白砂糖(C)添加量保持不变时，黑米发酵液(A)、黄精液(B)对功能饮料感官评分的等高线图； [0170] 图35为黄精液(B)添加量保持不变时，黑米发酵液(A)和白砂糖(C)对功能饮料感官评分的响应面立体分析图； [0171] 图36为黄精液(B)添加量保持不变时，黑米发酵液(A)和白砂糖(C)对功能饮料感官评分的等高线图； [0172] 图37为黑米发酵液(A)添加量保持不变时，黄精液(B)、白砂糖(C)对功能饮料感官评分的响应面立体分析图； [0173] 图38为黑米发酵液(A)添加量保持不变时，黄精液(B)、白砂糖(C)对功能饮料感官评分的等高线图。 具体实施方式[0174] 以下参照具体的实施例来说明本发明。本领域技术人员能够理解，这些实施例仅用于说明本发明，其不以任何方式限制本发明的范围。 [0176] 实施例1发酵后的红曲发酵黑米粉的制备、发酵前的黑米提取物的制备以及发酵前后功效成分变化研究 [0177] 本实验所用黑米，由市面上购买(购自于湖北双水双绿生物科技有限公司)，所用红曲菌菌株选自红曲菌ATCC 96218(ATCC 96218由华中农业大学食品科学技术学院实验室前期制备所得，现保藏于华中农业大学食品科学技术学院)。 [0178] 1.1发酵后的红曲发酵黑米粉的制备 [0179] 制备例1 [0180] A.黑米原料预处理：将黑米用2倍体积的蒸馏水室温下浸泡6h，沥干后于高压菌锅内灭菌后等待接种。 [0181] B.真菌悬浮液的制备：取活化好的红曲菌菌种接种在PDA斜面上，置于恒温培养箱中30℃培养6天。在无菌操作台上向培养好的斜面内加入8mL无菌水，使孢子被顺利洗下，用5 无菌滤纸过滤，得到孢子悬液，用无菌水稀释到10个孢子/mL，待用。 [0182] C.发酵：将灭菌好的30g黑米置于250mL三角瓶中，接入3mL红曲菌孢子悬浮液，控制温度为30℃培养18天，得到发酵后黑米。 [0183] D.提取：用破碎机将发酵后的黑米碎成粉末，称取30g，加入210mL 70％乙醇，搅拌均匀后用盐酸调节pH至1.0，混合均匀后将其于45℃条件下恒温水浴120min，杯口用保鲜膜盖住防止溶液蒸发，结束后在8000r/min下离心15min，获取上清液。沉淀物倒于烧杯中重复上述操作直至脱色。将所有上清液合并，得到提取液。 [0184] E.冻干：利用旋转蒸发仪除去提取液中的乙醇，蒸发浓缩至30mL，真空冷冻干燥得到红曲发酵黑米粉。 [0185] 上述提取步骤中，提取次数为3次时，最终的沉淀物还存在少许颜色，提取液冻干后得到2.58g红曲发酵黑米粉。经计算，发酵后的红曲发酵黑米粉的得率为8.6％，列于表1中。该红曲发酵黑米粉性质稳定、能够在室温或低温环境下长期储存，有望作为一种可工业化大规模生产的原料广泛应用于医药及食品领域。 [0186] 得率计算方法：冻干后红曲发酵黑米粉质量÷黑米质量×100％。 [0187] 表1：红曲发酵黑米粉与发酵前黑米粉的制备 [0188] 制备例 黑米用量 提取次数 提取、冻干后质量 得率 备注1 30g 3次 2.58g 8.6％ 红曲发酵黑米粉 2 30g 3次 1.83g 6.1％ 发酵前黑米粉 [0189] 1.2发酵前的黑米提取物(发酵前黑米粉)的制备 [0190] 相较于1.1中制备例1的红曲发酵黑米粉的制备方法，黑米提取物的制备无需经过黑米预处理及发酵步骤，直接从提取步骤开始，即将发酵前的30.0g黑米碎成粉末，直接经过提取步骤，且提取次数为3次，最终的沉淀物无色，冻干后得到1.83g黑米提取物，记为发酵前黑米粉。经计算，发酵前的黑米提取物的得率为6.1％，记录于表1中。 [0191] 得率计算方法：黑米提取物质量÷提取前黑米质量×100％。 [0192] 发酵前黑米粉得率小于红曲发酵黑米粉的得率，说明黑米经红曲菌发酵后可能产生了新的功能物质。 [0193] 1.3发酵前后功效成分变化研究 [0194] 花色苷含量检测参考方法：鲁明,付欣,迟吉捷.pH示差法测定黑米发酵饮料中花色苷的含量[J].黑龙江农业科学,2017(4):100‑103.——文献1。 [0195] 总酚含量检测参考方法：谭晓舒,吴建文,梨贵卿,等.火麻仁油总酚含量福林酚测定法的优化[J].食品研究与开发,2021,42(2):166‑173.——文献2。 [0196] 总黄酮检测参考方法：薛凯利.黑米红枣乳酸菌饮料发酵工艺优化及功能研究[D].西北农林科技大学，2020.——文献3。 [0197] 花色苷含量的测定 [0198] 采用pH示差法测量发酵前后花色苷含量变化(文献1)。向洗净的10mL玻璃比色管中各加入1mL浓度为1mg/mL(溶剂为二甲基亚砜(DMSO)与水体积比为1∶24的混合溶剂)的发酵前黑米粉和红曲发酵黑米粉，分别用pH为4.5的HCl‑CH3COONa缓冲液和pH为1.0的HCl‑KCl溶液定容至10mL摇匀。测定条件：pH＝1.0，30℃平衡70min；pH＝4.5，30℃平衡30min。分别取平衡后溶液于510nm和700nm波长下利用酶标板分别测定吸光值，共四组。样品分别重复三次实验，根据以下公式计算花色苷含量： [0199] [0200] A＝(A510nm，pH1.0‑A700nm，pH1.0)‑(A510nm，pH4.5‑A700nm，pH4.5)[0201] 其中，A为吸光度：MV为矢车菊花素‑3‑O‑葡萄糖苷的分子量，449.38：ε为矢车菊花‑1 ‑1素‑3‑O‑葡萄糖苷的消光系数，26900L·cm ·mg ：DF为稀释因子：L为实际的光程：V为提取液体积，mL：Wt为样品质量，g [0202] 矢车菊花素‑3‑O‑葡萄糖苷简称C3G。 [0203] 总酚含量的测定 [0204] 采用福林酚比色法(文献2)。标准曲线绘制：准确称取10mg没食子酸(简称GAE)标准品，超纯水溶解定容至10mL，准确移取1mg/mL没食子酸标准溶液0、0.05mL、0.1mL、0.2mL、0.3mL、0.4mL、0.5mL、0.6mL、0.8mL、lmL于10mL容量瓶中，加入超纯水定容，再分别吸取1mL不同浓度的没食子酸样品，加入0.5mL福林酚(FC)试剂反应5min，再加入2mL 7.5％碳酸钠溶液，加超纯水定容至10mL，室温下避光放置2h，765nm处测定吸光值，以标准溶液浓度为横坐标，吸光值为纵坐标绘制标准曲线。 [0205] 将发酵前后的待测样品配成lmg/mL溶液，准确吸取lmL按上述标准曲线步骤加入试剂，测得的吸光值带入标准曲线，结果以没食子酸当量表示。 [0206] 总黄酮含量的测定 [0207] 参照文献3方案并加以改进。芦丁标准曲线的绘制：精密称取芦丁标准品4mg，用70％乙醇定容至25mL，得到0.16mg/mL的芦丁标准溶液。准确吸取芦丁标准溶液0mL，0.5mL， 1.0mL，2.0mL，3.0mL，4.0mL分别移入10mL容量瓶中，加入70％乙醇溶液至5mL，再各加入 0.3mL、5％的NaNO2溶液，摇匀静置6min，加入0.3mL、10％的Al(NO3)3溶液，摇匀静置6min；再加入4.0mL、4％的NaOH溶液，混匀后静置20min，于510nm下测定吸光度。 [0208] 发酵前后的待测样品用70％的乙醇配制成1mg/mL的浓度溶液，用吸管吸取1.0mL上述待测液，移入试管中，加入70％的乙醇溶液4mL，参照芦丁标准曲线操作进行实验，重复操作3次，取平均值，计算样品中总黄酮含量，计算结果以每克样品中芦丁当量表达，然后换算为槲皮素酸当量，即CAE当量。 [0209] 利用上述方法分别检测发酵前黑米粉及红曲发酵黑米粉中的花色苷含量、总酚含量及总黄酮含量，检测结果如表2所示。 [0210] 表2：发酵前的黑米提取物及红曲发酵黑米粉中花色苷、总酚、总黄酮含量[0211] [0212] 根据表2中数据可知，经红曲菌发酵黑米后，花色苷发生了大幅度降解，发酵前的黑米提取物中含量从26％下降为6％；总黄酮含量少许下降，由先前的5.75mg CAE/g变为4.66mg CAE/g；但总酚含量有所上升，可能是随着花色苷的降解同时生成了新的物质，可能与酚类化合物有关。 [0213] 实施例2红曲发酵黑米粉及发酵前黑米粉的黄嘌呤氧化酶(XO)抑制活性研究[0214] 试剂配制： [0215] (1)磷酸盐缓冲液(PBS，0.05mol/L、pH7.5)：准确称取0.6g NaH2PO4，用超纯水定容至100mL；称取3.6g Na2HPO4·12H2O，超纯水定容至200mL。取配制好的NaH2PO4溶液32mL与Na2HPO4·12H2O溶液168mL混合，搅拌均匀，即配制成pH为7.5、浓度0.05mol/L的PBS缓冲溶液，4℃条件下避光保存。 [0216] (2)黄嘌呤溶液(Xan，5×10‑5mol/L)：准确称取15.2mg的黄嘌呤(Xan)粉末，溶于‑22mL的1mol/L的NaOH溶液(取4g准确定容至100mL)中，配置成5×10 mol/L的母液Xan1，然后‑4 从母液中吸取0.1mL，加入9.9mL的PBS稀释为5×10 mol/L的分液Xan2，再从分液Xan2中吸‑5 取1mL，加入9mL配制成使用液Xan，其浓度为5×10 mol/L。所有的母液和使用液同样需在4℃条件下避光保存，使用液现配现用。 [0217] (3)黄嘌呤氧化酶溶液(XO，7.5×10‑8mol/L)：其实际的7.5×10‑8mol/L XO溶液浓度换算约为0.0081U/mL。瓶子内的XO原液是5U/0.5mL＝10U/mL，取0.1mL原液XO溶液，加水1.9mL超纯水配制成0.5U/mL的母液，然后从母液中取其0.1mL，加6.072mL的PBS稀释后可得使用液的目标浓度为0.0081U/mL。 [0218] (4)样品溶液：取各待测样品配置成1.0mg/mL的溶液(溶剂为二甲基亚砜(DMSO)与水体积比为1:24的混合溶剂)，再加不同体积的超纯水稀释成相应浓度的样品溶液，分别稀释成为0.1mg/mL、0.2mg/mL、0.3mg/mL、0.4mg/mL、0.5mg/mL，于4℃条件下分装保存，待检。取别嘌呤醇阳性药的13个浓度，分别为0.1mg/L至1.0mg/L(0.1mg/L的梯度，共10个浓度)、 4mg/L、6.8mg/L和8mg/L，作为待测所有阳性对照样品的浓度。 [0219] 上述试剂及待测样品溶液浓度如表3所示。 [0220] 表3：试剂及待测样品溶液浓度 [0221]试剂或待测溶液 浓度或pH PBS 0.05mol/L、pH7.5 Xan 5×10‑5mol/L ‑8 XO 7.5×10 mol/L 红曲发酵黑米粉待测溶液 0.1mg/mL、0.2mg/mL、0.3mg/mL、0.4mg/mL、0.5mg/mL发酵前黑米粉待测溶液 0.1mg/mL、0.2mg/mL、0.3mg/mL、0.4mg/mL、0.5mg/mL别嘌呤醇阳性药溶液 0.1‑1.0mg/L(0.1mg/L的梯度)、4mg/L、6.8mg/L、8mg/L[0222] Takahama,U.,Koga,Y.,Hirota,S.,&Yamauchi,R.(2011).Inhibition of xanthine oxidase activity by an oxathiolanone derivative of quercetin.Food chemistry ,126(4) ,1808–1811 .https://doi .org/10.1016/ j.foodchem.2010.12.009.——文献4。 [0223] 体外抑制XO能力的评价方法参考文献4。整个酶抑制实验过程均在标准的96孔酶‑8标板上进行，实验组的反应孔中依次加入100μL浓度为7.5×10 mol/L的XO稀释液及50μL的各组样品，实验浓度分别设定为0.1mg/mL、0.2mg/mL、0.3mg/mL、0.4mg/m及0.5mg/mL，于37‑5 ℃条件下恒温孵育5min。测定开始前，迅速在反应孔中加入100μL浓度为5×10 mol/L的Xan溶液以启动反应。每隔10s测定1次反应孔在290nm波长处的吸光度值，一共测26次，并绘制得到“吸光度‑时间”变化曲线及拟合方程。每个编号每种浓度均做5次平行实验，每次实验均设定4个实验复孔及4个空白对照孔(维持其它条件不变，以50μL的pH为7.5的PBS缓冲溶液代替样品溶液进行实验)。290nm波长处的吸光度值，并绘制得到“吸光度‑时间”变化曲线及拟合方程。利用公式计算在含有不同浓度，不同组样品的反应体系下XO的相对活性。其中R0和R分别表示为不含抑制剂(即空白组)和添加不同浓度样品抑制剂(即样品组)时，反应体系“吸光度‑时间”拟合方程直线的斜率，无抑制剂的空白对照孔相对酶活性被定义为 100％，计算公式如下： [0224] (1)XO相对活性(％)＝R/R0×100％； [0225] (2)抑制率(％)＝1‑XO相对活性(％)。 [0226] 不同浓度的红曲发酵黑米粉与发酵前黑米粉样品溶液的XO抑制率数据如表4所示。相应的做成不同样品之间XO活性抑制率效果对比柱状图，如图1所示。 [0227] 根据半数抑制浓度计算方法，得到红曲发酵黑米粉与发酵前黑米粉对XO抑制活性的IC50值，如表5所示。 [0228] 表4：不同浓度红曲发酵黑米粉与发酵前黑米粉样品溶液的XO抑制率数据[0229] [0230] 表5：红曲发酵黑米粉与发酵前黑米粉对XO活性抑制的IC50值 [0231] 待测样品 IC50(mg/mL)红曲发酵黑米粉 0.86±0.05 发酵前黑米粉 1.17±0.11 [0232] 从表4及图1的实验数据可以看出，红曲发酵黑米粉和发酵前黑米粉对黄嘌呤氧化酶(XO)均有不同程度的抑制作用，在各浓度下各组之间表现出不同程度的剂量效应关系。随着样品浓度的不断增大，抑制率也不断上升。在抑制剂浓度为0.2～0.5mg/mL范围内红曲发酵黑米粉的抑制率均高于发酵前黑米粉，说明浓度越大，红曲发酵黑米粉对XO的抑制量效关系越明显。IC50值可以用来衡量抑制剂的灵敏程度，IC50值越低，说明抑制剂的灵敏度越高，对酶的抑制作用越强。表5中，红曲发酵黑米粉的IC50值低于发酵前黑米粉的IC50值，说明红曲发酵黑米粉对XO的抑制敏感度更高，抑制作用更强。 [0233] 上述实验结合实施例1.3数据表明，虽然红曲发酵黑米粉中矢车菊花素‑3‑O‑葡萄糖苷等花色苷含量大幅度降低，但红曲发酵黑米粉的XO抑制活性并未降低，反而相比发酵前黑米粉显著提高，说明发酵后的红曲发酵黑米粉产生的新物质也具有XO抑制活性，并且新物质的XO抑制活性可能远大于矢车菊花素‑3‑O‑葡萄糖苷等花色苷的抑制活性。 [0234] 为了探究红曲发酵黑米粉中产生XO抑制活性的新物质成分，发明人进一步了解到，红曲菌发酵一般会产生红曲色素，因此，新产生的物质是否含有红曲色素？红曲色素是否具有XO抑制活性？为此，发明人制备了红曲黄色素样品，并进一步进行如下的红曲黄色素样品和红曲发酵黑米粉组分分析，以及XO抑制实验。 [0235] 实施例3红曲黄色素样品制备及其组分分析、红曲发酵黑米粉组分分析，以及红曲黄色素样品XO抑制活性研究 [0236] 3.1 MFA、MFB的制备 [0237] 称取一定量红曲发酵黑米粉，按照料液比为1:7加入70％的乙醇，盐酸调节pH＝1.0，超声30min，在45℃水浴锅中回流提取90min，离心得到提取液，沉淀物重复上述操作，连续提取3次直至沉淀物无色，将提取液旋蒸浓缩，冷冻干燥后用甲醇配制成1mg/mL溶液，采用v(石油醚)：v(乙酸乙酯)：v(丙酮)＝30:17:5的展开剂展开10min，层析结束后，取出薄板自然晾干后收集各色素带，超声提取30min，12000r/min离心10min取上清液，氮吹后以甲醇复溶稀释，经0.45μm滤膜分别过滤得到MFA和MFB。 [0238] 采用色谱条件(色谱柱：C18柱；柱温：室温；检测波长：385nm；流动相：甲醇‑水溶液(80:20，V/V)；流速：1.0mL/min；进样量20μL)对上述制备得到的MFA和MFB进行分析检测，MFA的HPLC图谱如图2所示，其MFA含量为98.2％；MFB的HPLC图谱如图3所示，其MFB含量为98.1％。 [0239] 3.2红曲黄色素样品制备 [0240] 称取一定量红曲发酵黑米粉，按照料液比为1:7加入70％的乙醇，盐酸调节pH＝1.0，超声30min，在45℃水浴锅中回流提取90min，离心得到提取液，沉淀物重复上述操作，连续提取3次直至沉淀物无色，合并提取液，经乙酸乙酯萃取后旋蒸浓缩，冷冻干燥后得到红曲黄色素样品，其HPLC图谱如图4所示。 [0241] 使用外标法，用3.1中制备的MFA、MFB定量计算可得，红曲黄色素样品中MFA含量为25.3％，MFB含量为45.5％。 [0242] 3.3红曲黄色素样品与红曲发酵黑米粉组分分析 [0243] 红曲黄色素HPLC检测方法参考如下文献5和文献6： [0244] 徐海笑.液态发酵红曲黄色素的分离鉴定及稳定性研究[D].江南大学,2019.——文献5。 [0245] 奚星平.红曲米色素分离纯化和十种色素分析方法建立[D].天津科技大学,2021.DOI:10.27359/d.cnki.gtqgu.2018.000035.——文献6。 [0246] HPLC等度洗脱条件：流动相A为100％甲醇，流动相B相为100％水；流速设定为0.5mL/min；进样体积为20μL，样品室温度为20℃；柱温为30℃；检测波长为385nm。检测方法如表6所示。 [0247] HPLC梯度洗脱条件：液相色谱柱：Diamonsil C18柱(4.6mm×250mm，5μm)；流动相：A相为乙腈，B相为水(0.1％甲酸)，在使用前需要过0.22μm的水相和有机相滤膜，之后超声脱气30min，静置10min；检测器：二极管阵列检测器(DAD)，检测波长为385nm；进样量：20μL； 流速：1mL/min；柱温：25±0.8℃。检测方法如表7所示。 [0248] 表6；红曲黄色素等度洗脱检测方法 [0249] 时间/min 流动相A：甲醇(100％) 流动相B：水(100％)0 80％ 20％ 40 80％ 20％ [0250] 表7；红曲黄色素梯度洗脱检测方法 [0251]时间/min 流动相A：乙腈 流动相B：水(0.1％甲酸) 0 60％ 40％ 12 60％ 40％ 25 90％ 10％ 30 90％ 10％ 40 60％ 40％ [0252] 用上述表6的等度洗脱检测方法，检测实施例3.1中制备的红曲黄色素样品，得到如图5的HPLC图谱，由图5可知，红曲黄色素样品在385nm处出现了两个大峰，按出峰顺序，保留时间分别为6.7min和10.4min，结合文献5和文献6可知，6.7min的峰为MFA，10.4min的峰为MFB。两者间隔时间不长，说明两者极性相近，结构相似，MFA较快于MFB被洗脱下来，说明MFA的极性略大于MFB。上述检测结果表明，红曲黄色素样品中含有MFA和MFB。 [0253] 用上述表7的梯度洗脱检测方法，检测实施例3.1中制备的红曲黄色素样品，得到如图6所示的HPLC图谱，由图6可知，红曲黄色素样品在385nm处出现了四个大峰，按出峰顺序，保留时间分别为9.4min、10.9min、16.9min、18.7min，结合文献5和文献6可知，9.4min的峰为MFA、10.9min的峰为红曲黄素(MS)、16.9min的峰为MFB、16.9min的峰为安卡红曲黄素(AK)。上述检测结果表明，红曲黄色素样品中除了含有MFA和MFB外，还含有红曲黄素(MS)和安卡红曲黄素(AK)。 [0254] 发明人用上述表6的等度洗脱检测方法，检测实施例1.2中制备的发酵前黑米粉，得到如图7所示的HPLC图谱，由图7可知，发酵前黑米粉中不含有红曲色素。 [0255] 发明人用上述表6的等度洗脱检测方法，检测实施例1.1中提取三次后所制备的红曲发酵黑米粉，得到如图8所示的HPLC图谱，由图8可知，红曲发酵黑米粉在385nm处出现了两个大峰，按出峰顺序，保留时间分别为7.0min和10.9min，结合图5的出锋时间及文献5和文献6可知，7.0min的峰为MFA，10.9min的峰为MFB。本实验方法制备的红曲发酵黑米粉中至少含有MFA和MFB，也就是说，经过红曲菌发酵产生的新物质至少含有红曲黄色素MFA和MFB。发明人猜测，MFA/MFB可能是红曲发酵黑米粉产生XO抑制活性的原因。 [0256] 使用外标法，用3.1中制备的MFA、MFB定量计算可得，实施例1.1中提取三次后所制备的红曲发酵黑米粉中MFA含量为3.97％，MFB含量为7.24％。 [0257] 由实施例2可知，本申请制备的红曲发酵黑米粉具有优异的XO抑制活性，并且该抑制活性显著大于发酵前黑米粉。为了探究显著增强的XO抑制活性的原因，发明人进一步使用实施例3.1制备的红曲黄色素样品进行XO活性抑制实验，并与红曲发酵黑米粉、发酵前黑米粉实验结果进行对比。 [0258] 3.4红曲黄色素样品对XO活性抑制研究及与红曲发酵黑米粉、发酵前黑米粉的对比 [0259] 使用实施例2中同样的方法，检测并计算实施例3.1制备的红曲黄色素样品在0.1mg/mL、0.2mg/mL、0.3mg/mL、0.4mg/mL、0.5mg/mL浓度时对XO活性的抑制率，抑制率数据如表8所示，将其与红曲发酵黑米粉、发酵前黑米粉的XO抑制率数据做成对比柱状图，如图9所示。相应的，红曲黄色素样品的IC50值为0.35±0.06mg/mL。 [0260] 表8：红曲黄色素样品的XO抑制率数据 [0261] [0262] 上述实验数据结合实施例2中表4和表5数据可知，在各浓度下各组之间表现出不同程度的剂量效应关系。由图9可以看出，发酵前黑米粉、红曲发酵黑米粉、红曲黄色素三者对黄嘌呤氧化酶(XO)均有不同程度的抑制作用，随着抑制剂浓度的不断增大，抑制率也不断上升。在抑制剂浓度为0.2～0.5mg/mL范围内，红曲发酵黑米粉的抑制率均高于发酵前黑米粉，说明浓度越大，红曲发酵黑米粉对XO的抑制量效关系越明显。同等浓度下，红曲黄色素的抑制效果均显著高于红曲发酵黑米粉和发酵前黑米粉，在浓度约为0.3mg/mL时抑制率便可达到50％。 [0263] 实施例2与实施例3通过体外酶动力学实验探究了红曲黄色素、红曲发酵黑米粉、发酵前黑米粉对XO的抑制作用，发现三者对XO均有一定程度的抑制作用，红曲发酵黑米粉的抑制效果要优于发酵前黑米粉，三者抑制活性的强弱顺序为红曲黄色素＞红曲发酵黑米粉＞发酵前黑米粉。三者的半数抑制浓度(IC50)分别为0.35±0.06mg/mL、0.86±0.05mg/mL、1.17±0.11mg/mL，红曲黄色素的IC50值均低于红曲发酵黑米粉、发酵前黑米粉，表明黑米经红曲发酵后的发酵产物(红曲黄色素)很可能是提高发酵后抑制效果的原因之一。 [0264] 综合实施例1‑3实验结果，使用本申请提供的方法，制备得到的红曲发酵黑米粉中至少含有红曲黄色素MFA和MFB，且只需提取三次，红曲发酵黑米粉中MFA的含量可达到3.97％，MFB的含量可达到7.24％，而发酵前黑米粉中不含有任何红曲色素，经过XO抑制实验验证，红曲发酵黑米粉的XO活性抑制能力显著强于发酵前黑米粉。结合红曲黄色素(样品中至少含有MFA、MFB、MS和AK)相比于红曲发酵黑米粉更加显著的XO抑制活性，发明人推测，红曲发酵黑米粉产生XO抑制活性的原因是由于发酵新产生的物质——MFA、MFB具有XO抑制活性，并且MFA、MFB的XO抑制活性显著强于发酵前黑米粉中含有的矢车菊素‑3‑O‑葡萄糖苷等花色苷。 [0265] 实施例4红曲黄色素、红曲发酵黑米粉、发酵前黑米粉三者对高尿酸血症小鼠的降尿酸活性评价 [0266] 本实验各项操作均严格以中华人民共和国制定的实验动物标准(GB 14925‑2010)、《世界医学协会赫尔辛基宜言》及华中农业大学实验动物中心动物饲养和使用指导原则(批准号：No.SYXK(Hubei)2020‑0084)开展。 [0267] 本实验利用高果糖饮水和氧嗪酸钾诱导建立高尿酸血症小鼠模型，对不同组小鼠分别灌给红曲黄色素、红曲发酵黑米粉、发酵前黑米粉进行治疗，实验结束后对小鼠体重、脏器指数、血清、肝脏及肾脏相关指标进行测定。探究红曲发酵黑米粉相较于发酵前黑米粉对血清尿酸(AU)、尿素氮(BUN)、肌酐(Cr)水平及肝脏中黄嘌呤氧化酶(XO)活性、5'‑核苷酸酶(5'‑NT)、腺苷脱氨酶(ADA)活性的影响，探究新物质红曲黄色素的降尿酸效果。同时对肾脏进行HE染色观察，利用免疫组织化学技术分析三者抑制尿酸与转运体URAT1、ABCG2、GLUT9蛋白表达的机制。 [0268] 5'‑核苷酸酶(5'‑NT)是一种对底物特异性不高的水解酶，可作用于多种核苷酸。5'‑核苷酸酶水解次黄苷‑5‑单磷酸盐(5‑IMP)生成次黄苷，在腺嘌呤核苷酸化酶(PNP)存在下，后者转化为次黄嘌呤，经黄嘌呤氧化酶(XO)作用下，次黄嘌呤转化为尿酸和H2O2。 [0269] 腺苷脱氨酶(ADA)是一种参与嘌呤代谢作用的酶。它是用作拆解食物组织中的核酸中的腺苷。ADA能催化腺嘌呤核苷转变为次黄嘌呤核苷，再经核苷磷酸化酶作用生成次黄嘌呤，其代谢终产物为尿酸。 [0270] 高尿酸血症(HUA)是一种以血清尿酸(UA)升高为特征的代谢性疾病，尿酸在肾小球中被自由过滤，但在正常成人中，由于近端小管的重吸收，尿酸的排泄分数仅为8％至10％。肾脏发生疾病时尿酸的排泄分数将增加到10％到20％，其余的尿酸排泄通过肠道被尿酸溶解细菌降解。尿酸运输涉及复杂的过程：尿酸盐转运蛋白1(URAT1)和葡萄糖转运蛋白9(GLUT9)负责肾脏重吸收，是尿酸转运过程中两个重要的尿酸重吸收蛋白，ATP结合盒亚家族G成员2(ABCG2)、有机阴离子转运蛋白1(OAT1)、有机阴离子转运蛋白3(OAT3)促进肾脏分泌。当机体处于高血尿酸状态时，URAT1、GLUT9蛋白表达升高。有研究表明，URAT1和GLUT9的某些增强蛋白功能的突变与高尿酸血症发生相关。 [0271] ABCG2是ATP结合盒转运蛋白超家族的一员，有研究表明，ABCG2转运蛋白的主要作用部位是调节肠道中的尿酸盐稳态，基于其功能和定位，ABCG2被认为是“守门人”，防止内毒素或外毒素和异生素穿过生物屏障进入敏感组织。ABCG2转运蛋白表达增加会使重吸收减少，尿酸排泄加速导致血尿酸浓度降低。ABCG2的肾脏表达模式与URAT1的表达模式部分相似，表明两者在肾尿酸盐处理中的功能作用相互。 [0272] 实验过程及方法如下： [0273] 试剂配制： [0274] (1)0.5％羧甲基纤维素钠(CMC‑Na)溶液：精确称量CMC‑Na 50.0mg，并将其转移至研钵，用研棒将其研磨均匀，转移至100mL容量瓶，加少量水全部溶解至成均匀混悬液，之后定容至100mL。混合均匀，按照实验周期天数分装后封口膜封口，置于‑20℃冰箱保存待用，实验开始前1h置于室温条件下自然解冻，避免反复冻融。 [0275] (2)氧嗪酸钾混悬溶液：精确称量适量氧嗪酸钾，将其转移至研钵后用研棒研磨均匀。利用0.5％的CMC‑Na溶液将氧嗪酸钾粉末全部溶解并混合均匀成混悬液，按照实验周期天数分装后用封口膜封口，置于‑20℃冰箱保存待用，实验开始前1h置于室温条件下自然解冻，避免反复冻融。 [0276] (3)别嘌呤醇混悬溶液：精确称量适量别嘌呤醇，将其转移至研钵后用研棒研磨均匀。利用0.5％的CMC‑Na溶液将别嘌呤醇粉末全部溶解并混合成为均匀混悬液，按照实验周期天数分装后用封口膜封口，置于‑20℃冰箱保存待用，实验开始前1h置于室温条件下自然解冻，避免反复冻融。 [0277] (4)样品混悬溶液：精确称量适量的不同样品，样品粉末用水全部溶解，并混合成为均匀混悬液，各样品浓度为别嘌呤醇混悬液0.5mg/mL、发酵前黑米粉混悬液10mg/mL、红曲发酵黑米粉混悬液10mg/mL、红曲黄色素混悬液5mg/mL，按照实验周期天数分装后用封口膜封口，置于‑20℃冰箱保存待用，实验开始前1h置于室温条件下自然解冻，避免反复冻融。 [0278] 动物分组与造模： [0279] 小鼠60只，随机分为6组，每组10只(n＝10)小鼠，空白组(Normal control group,N)，模型组(Model group,M)，别嘌呤醇组(Positive group,P)，发酵前黑米粉组(Pre‑fermentation group,PR)，红曲发酵黑米粉组(Post‑fermentation group,PO)，红曲黄色素组(Monascus flavin group,MF)。每笼小鼠鼠尾标记号码；适应性喂养3‑5天；之后除空白组外，其余各组日常饮用水皆换成15％的果糖水。 [0280] 在保证正常饮食饮水的条件下，每天上午8点对所有小鼠进行禁食处理，断粮1h之后开始灌胃；N组小鼠灌胃0.5％ CMC‑Na溶液，对除空白组以外的其它组全部进行氧嗪酸钾混悬液灌胃造模，按250mg/kg每天的剂量对小鼠连续灌胃14天，建立小鼠高尿酸血症引起的肾炎动物模型。在当天结束氧嗪酸钾混悬液灌胃1h后，给N组与M组小鼠灌胃蒸馏水，P组小鼠灌胃5mg/kg的别嘌呤醇混悬溶液，PR组小鼠灌胃100mg/kg的发酵前黑米粉混悬溶液，PO组小鼠灌胃100mg/kg的红曲发酵黑米粉混悬溶液，对MF组小鼠灌胃50mg/kg的红曲黄色素样品溶液。小鼠分组及各组小鼠给药情况如表9所示。 [0281] 表9：小鼠分组及给药情况 [0282] [0283] 数据分析与处理： [0284] 结果表示为平均值±标准差的形式；采用 22.0利用单因素方差分析(One‑way analysis of variance，ANOVA)和Duncan多重比较(Duncan’s multiple range test，DMRT)对数据进行显著性分析，p<0.05时判定数据间的差异有统计学意义。利用Origin 9.0针对数据分析结果绘制相应图表。 [0285] 4.1红曲黄色素、红曲发酵黑米粉、发酵前黑米粉对小鼠体重、肝肾重量及脏器指数的影响 [0286] 每天固定时间称量小鼠体重，以10mL/kg计算灌胃体积。小鼠灌胃体积依据当日小鼠实验前的体重计算得到，换算比例为100g小鼠灌胃1mL溶液。当天灌胃结束后，剩余药品直接丢弃，不做回收处理，避免反复冻融影响实验结果。第13天结束小鼠灌胃后，对其进行12h以上禁食不禁水处理，以便第14天结束灌胃后对小鼠进行血液和脏器的样本提取工作。 [0287] 在第14天小鼠灌胃结束之后，对小鼠进行摘取眼球处理并从眼眶处进行小鼠血液的采集，小鼠血液样本在室温条件下自然凝血1h后，以3000r/min离心15min离心分离出血清，迅速收集并分装后置于‑80℃下保存，避免发生溶血现象。小鼠在完成眼球取血后拉断颈椎处死，将死亡小鼠固定于解剖板上。分离其肝脏、肾脏组织，将得到的小鼠脏器组织在4℃预冷生理盐水中漂洗，除去血液及黏连的结缔组织，经滤纸拭干后称重并按照以下公式计算脏器指数： [0288] [0289] [0290] 经过测定，各组小鼠体重、肝脏重量、肝脏脏器指数、肾脏重量、肾脏脏器指数数据如表10所示。 [0291] 表10：各组小鼠体重、肝肾重量及脏器指数 [0292] 组别 体重(g) 肝脏重量(g) 肝脏脏器指数(％) 肾脏重量(g) 肾脏脏器指数(％)N 34.56±1.35b 1.47±0.07b 4.02±0.17b 0.53±0.05a 1.40±0.19aM 38.09±1.65a 1.62±0.11a 4.33±0.25a 0.45±0.37b 1.28±0.12b P 36.23±1.60ab 1.49±0.08b 4.07±0.21ab 0.52±0.06a 1.36±0.08a PR 36.72±1.82ab 1.50±0.05b 4.03±0.19b 0.50±0.03a 1.37±0.11a PO 35.68±1.11b 1.51±0.10ab 4.10±0.24ab 0.51±0.06a 1.38±0.14a ab b ab a a MF 36.38±2.20 1.50±0.09 4.08±0.13 0.49±0.04 1.37±0.05 [0293] 注：数值表示为Mean±SD(n＝10)；不同字母表示组间显著性差异，无字母上标表示无显著差异(Duncan检验，p<0.05)，本申请其他表格中上标字母的意义与此表格相同。 [0294] 从表10中数据可以看出，经过持续2周的灌胃，M组小鼠体重较N组体重对比显著(p<0.05)，上涨了约8.2％，但其余组并无显著性差异(p>0.05)，且PO组相对于PR组与M组相比下降趋势更明显(p<0.05)。M组肝脏重量显著高于N组，其肝脏脏器指数也明显(p<0.05)升高，可能是脂肪在肝脏堆积造成了脂肪肝。PR、PO、MF组的肝脏重量和脏器指数与M组相比均发生了下降，说明发酵前黑米粉、红曲发酵黑米粉、红曲黄色素减轻了高尿酸血症小鼠患脂肪肝的症状。 [0295] 在肾脏重量方面，M组的肾脏重量较轻，其肾脏脏器指数显著低于N组(p<0.05)，可能是由于氧嗪酸钾灌胃后引起的尿酸代谢综合征导致了小鼠肾脏出现萎缩，从而引发慢性肾病或肾炎的表现。经别嘌呤醇和红曲发酵黑米粉的治疗后，小鼠的肾脏重量与肾脏脏器数值均升高并恢复到了正常水平。 [0296] 综上，用红曲发酵黑米粉和红曲黄色素喂养小鼠可以降低小鼠因代谢异常引起的体重增加、肝脏脂肪堆积、肾脏萎缩的风险，在喂养期间，红曲发酵黑米粉与红曲黄色素没有显著影响小鼠的肝脏和肾脏指数，说明它们对小鼠的毒副作用较小，可能对调节小鼠代谢和维护器官健康具有一定的潜在价值。 [0297] 4.2红曲黄色素、红曲发酵黑米粉、发酵前黑米粉对小鼠血清中尿酸(UA)、尿素氮(BUN)、肌酐(Cr)水平的影响 [0298] 在实施例4.1中，采集的小鼠血液样本在室温条件下自然凝血1h后，将其置于4℃条件下经3000r/min离心10min，取上清液，即为实验用血清样本。将其分装后置于‑80℃条件下保存用于试剂盒检测待用。测定前于4℃条件下自然解冻后使用，避免反复冻融。测定过程严格按照相关测定试剂盒的操作说明进行(UA检测试剂盒、BUN检测试剂盒、Cr检测试剂盒均来自于南京建成生物工程研究所)，每项测定重复三次以上，以保证实验结果的准确可靠性，UA、BUN、Cr检测数据如表11所示。绘制各组小鼠的UA、BUN、Cr柱形图，分别如图10、图11、图12所示。 [0299] 表11：各组小鼠血清UA、BUN、Cr检测数据 [0300]组别 UA(μmol/L) BUN(mmol/L) Cr(μmol/L) b c b N 89.21±13.33 7.60±1.35 7.74±2.87 a a a M 192.51±40.63 10.16±1.70 15.87±13.71 d b b P 37.44±21.91 7.91±0.52 5.54±2.17 bc b b PR 98.88±13.08 8.24±1.97 8.92±3.72 cd b b PO 78.42±19.63 7.91±1.85 9.21±0.32 bc b bc MF 101.20±19.40 8.09±1.87 8.73±3.66 [0301] 尿酸值是反应是否达到高尿酸水平的最佳直观因素，如表11与图10所示，M组血清中尿酸水平显著高于N组，具有统计学意义(p<0.01)，说明高尿酸血症模型建立成功。P组相较于M组尿酸生成急剧下降，由192.51μmol/L下降到37.441μmol/L，达到了极低值。尿酸是血浆中主要抗氧化剂之一，但别嘌呤醇引起的长期极低尿酸水平可能容易诱发其他疾病。与M组相比，PR、PO、MF组均能不同程度的降低血清中尿酸值(p<0.05)，其中相对于PR组，PO组的尿酸值为78.42μmol/L，比PR组有着更明显的降尿酸效果，多下降了约22.6％。MF组在剂量为PR组一半的条件下，达到了与PR组相近的尿酸值。上述实验表明，红曲发酵黑米粉和红曲黄色素的降尿酸效果均显著强于发酵前黑米粉。结合实施例3.2中HPLC分析结果可知，红曲发酵黑米粉中含有的MFA和MFB，以及红曲黄色素中含有的红曲黄素(Monascin)和安卡红曲黄素(Ankaflavin)均具有显著的降尿酸效果。 [0302] 高尿酸血症被广泛认为是肾脏损伤的危险因素，血清BUN和Cr是临床上衡量肾功能的重要指标，它们的升高往往与肾小球滤过率的降低有关。如表11、图11及图12所示，与N组相比，M组Cr、BUN的含量均发生了显著上升(p<0.05)，说明造模后小鼠的肾脏受到了损伤。经过给药治疗后，各组的Cr、BUN的含量均降低，其中P、MF组的Cr含量下降较为明显，PR、PO组降幅差别不大，说明红曲黄色素干预肾功能损伤的趋势更为明显，四组的BUN含量均降低并维持在正常水平，与M组相比均有显著性差异(p<0.05)。与PR组相比，PO组的Cr、BUN含量无明显差异。研究结果表明，红曲发酵黑米粉及红曲黄色素均可独立影响小鼠血清中Cr、BUN含量，改善氧嗪酸钾诱导后造成的小鼠肾功能指标异常。 [0303] 4.3红曲黄色素、红曲发酵黑米粉、发酵前黑米粉对小鼠肝脏中黄嘌呤氧化酶(XO)、腺苷脱氨酶(ADA)、5'‑核苷酸酶(5'‑NT)活性的影响 [0304] 选取小鼠新鲜肝脏组织样本，准确称取0.50g组织，按照质量比1：9的比例加入4℃的预冷生理盐水，于冰浴条件下进行机械匀浆。匀浆液置于4℃低温条件下经3500r/min离心10min，轻轻吸掉表面脂肪组织后，缓慢吸取上清液，即为实验用10％肝组织匀浆待测样本。将其分装后置于‑20℃条件下保存待测。测定前于4℃条件下自然解冻后使用，避免反复冻融。测定过程严格按照相关测定试剂盒的操作说明进行(总蛋白(TP)检测试剂盒、黄嘌呤氧化酶(XO)检测试剂盒、腺苷脱氨酶(ADA)检测试剂盒、5'‑核苷酸酶(5'‑NT)检测试剂盒均来自于南京建成生物工程研究所)，每项测定均重复三次以上，以保证实验结果的准确可靠性。将测定所得结果与测定样本中的总蛋白质含量相除，最终结果表示为每单位质量蛋白所含有的酶活力。XO、ADA、5'‑NT检测活性数据如表12所示。绘制各组小鼠的XO、ADA、5'‑NT活性柱形图，分别如图13、图14、图15所示。 [0305] 表12：各组小鼠肝脏XO、ADA、5'‑NT活性数据 [0306] [0307] [0308] 在尿酸代谢体系中，XO可以促进黄嘌呤转化为尿酸，XO活性直接影响了肾脏中尿酸的生成。活性越低，转化途径被抑制，尿酸生成便减少。XO活性的增强会导致尿酸水平的升高，从而增加痛风、高尿酸血症等相关疾病发生的风险。如表12与图13所示，与N组相比，M组XO活性发生了明显上升，小鼠尿酸生成增加，表现出极显著差异(p<0.01)。别嘌呤醇是常见的XO抑制剂，可用于临床上治疗高尿酸血症，快速降低尿酸水平。与M组相比，PR、PO、MF组均能降低XO活性，在统计学上具有显著性差异(p<0.05)，说明红曲黄色素、红曲发酵黑米粉、发酵前黑米粉均可作为XO抑制剂，这与实施例2中体外实验结果相符。与PR组相比，相同剂量下，PO组XO活性下降更明显，经差异性分析后呈现出显著性差异(p<0.01)，说明红曲发酵黑米粉的抑制效果要优于发酵前黑米粉。当剂量降低一倍时，MF组也表现出比PR组更佳的XO抑制率，该结果可以推断出红曲黄色素相对于黑米中原有的活性成分更适合作为天然XO抑制剂，有望被开发为新型XO抑制药物，并应用于降尿酸相关的病症，或者作为辅助食品或食品添加剂，应用于具有控制尿酸水平的功能食品领域。 [0309] 小鼠体内尿酸酶的合成在肾脏，抑制肾脏中ADA和5'‑NT的活性可以降低尿酸合成效率，从而达到降低尿酸水平的作用。从表12、图14和图15可以看出，与N组相比，M组肝脏ADA和5'‑NT活力均有所提高，分别上升了35.9％和49.4％(p<0.05)。P组中ADA和5'‑NT活力较M组显著降低，也进一步验证了实施例4.2中别嘌呤醇可以大幅度使尿酸水平下降。与M组相比，PR、PO、MF组ADA和5'‑NT活力也有明显的下降(p<0.05)，表明发酵前黑米粉、红曲发酵黑米粉及红曲黄色素在抑制尿酸生成方面均有明显疗效。MF组给药剂量只有PR、PO组的一般，在抑制ADA活性方面，MF组与PR、PO组无差别；在抑制方面，MF组显示出比PR组更优异的能力，说明红曲黄色素在降低机体尿酸水平方面具有更大的潜力，这可能是由于其中含有的MFA、MFB、MS、AK发挥的作用。 [0310] 4.4红曲黄色素、红曲发酵黑米粉、发酵前黑米粉对高尿酸酸血症小鼠肾组织形态学的影响 [0311] 选取实验小鼠新鲜肾脏组织样本，置于4％多聚甲醛溶液中固定48h，经过不同浓度梯度的乙醇脱水，二甲苯清洗，脱水后石蜡包埋，4℃冷藏，常规切片、脱蜡后，进行苏木精‑伊红(HE)染色，最终在倒置显微镜400×条件观察各组肾小管、肾小球以及肾脏病理改变情况，结果如图16所示，其中，图16A为N组，图16B为M组，图16C为P组，图16D为MF组，图16E为PR组，图16F为PO组，放大倍数为1600倍，比例尺为20.00μm。 [0312] 图16表明，N组小鼠的肾脏细胞排列紧密、规则，形态结构正常、清晰，反映出肾小管和间质都没有发生明显的变化和损伤。肾小球形态和大小正常，基底膜和系膜也没有出现明显增厚或损伤，表明N组小鼠的肾小球结构完整，滤过功能良好。在肾间质区也没有观察到明显的炎症细胞浸润，表明N组小鼠的肾脏组织没有出现感染或炎症反应。 [0313] M组小鼠肾小球萎缩，肾小管扩张变形，内有充血，核仁模糊结构不清晰，周围可见炎性细胞浸润，广泛肾小管上皮细胞水肿，胞质疏松，部分严重至胞质空泡化，表明肾脏组织出现了明显病理性变化。经过14天别嘌呤醇、发酵前黑米粉、红曲发酵黑米粉和红曲黄素的治疗干预后，四组均在不同程度上减轻了肾小管损伤和炎性细胞浸润，肾脏指数和肾脏功能得到了恢复。 [0314] P组肾小球及近曲小管的形态学结构恢复正常，肾小管细胞排列紧密有序，部分肾小管上皮细胞脱落，有肿胀，胞浆空染，说明小鼠的肾脏损伤不具有完全可逆性，别嘌呤醇在降低尿酸的同时对肾脏也产生了一定的副作用。 [0315] PR组近曲小管空泡变性和肾小管上皮细胞肿胀被抑制，肾小球形态学结构逐渐恢复，维持了正常的形态结构，但广泛肾小球上皮细胞中度水肿，胞质淡染、疏松，部分空泡化。 [0316] PO组局部肾小球上皮细胞较PR组水肿程度更轻，肾间质炎性细胞浸润程度减弱，肾小管细胞排列更加紧密有序。说明红曲发酵黑米粉相较发酵前黑米粉更能改善小鼠肾脏损伤。 [0317] MF组肾单位结构完整清晰；肾小球在球腔内较饱满，少数肾小管上皮细胞刷状缘脱落。 [0318] 综上，黑米经红曲菌发酵后相较于发酵前在缓解小鼠的肾脏损伤方面更具有优势，也即红曲发酵黑米粉相较发酵前黑米粉在缓解小鼠的肾脏损伤方面更具有优势，其原因可能与发酵后产生的红曲黄色素MFA、MFB等有关。 [0319] 4.5红曲黄色素、红曲发酵黑米粉、发酵前黑米粉对高尿酸酸血症小鼠肾脏转运体蛋白URAT1、GLUT9、ABCG2表达的影响 [0320] 本实验用二甲苯和乙醇处理蜡包埋固定肾脏组织(4μm)，去除石蜡并脱水。抗原修复采用10mM柠檬酸盐缓冲液(pH6.0)进行两次5min的微波处理。切片用3％双氧水‑甲醇孵育10min，然后与10％血清在室温下孵育30min。之后加入抗体，并在4℃温度下孵化过夜。切片在室温下与二抗共同孵育30min，然后与辣根过氧化物酶标记链霉亲和素37℃孵育30min。蛋白质表达的观察利用30mg/mL含有0.03％双氧水的3,3'‑二氨基联苯胺四盐酸。所有切片均经过扫描成像后用Caseviewer在x400下记录。免疫组化阳性区域采用ImageJ软件对每个切片随机10个视野进行定量分析。各给药组对小鼠转运体蛋白URAT1的免疫组化染色结果和蛋白质表达水平如图17、图18所示，对GLUT9的免疫组化染色结果和蛋白质表达水平如图19、图20所示，对ABCG2的免疫组化染色结果和蛋白质表达水平如图21、图22所示。 [0321] URAT1、GLUT9转运蛋白表达降低时，肾小管的尿酸重吸收会减少，而体内尿酸的排出量则增加，这就导致了血液中尿酸浓度的降低。图17至图20表明，与N组相比，M组肾脏组织URAT1、GLUT9蛋白表达水平显著(p<0.05)上升，可能是经14天氧嗪酸钾灌胃后小鼠尿酸重吸收增加形成了高尿酸血症。同时也可能与将小鼠日常饮用水改成果糖水后造成高血糖、肾脏果糖代谢异常有关。经过别嘌呤醇、发酵前黑米粉、红曲发酵黑米粉及红曲黄色素的干预后，小鼠肾脏URAT1和GLUT9表达水平较M组显著(p<0.05)下降，这意味着通过下调URAT1和GLUT9表达，三种干预手段都能减少尿酸的重吸收，促进尿酸的排泄，从而改善氧嗪酸钾诱导的高尿酸血症小鼠的尿酸代谢异常。与PR组相比，PO组URAT1蛋白表达具有显著性差异(p<0.05)，PO组两个蛋白的阳性面积均比PR组低，说明红曲发酵黑米粉相较于发酵前黑米粉更能抑制转运体蛋白的表达，降低高尿酸血症小鼠的尿酸水平。MF组给药剂量只有PO、PR组的一半，但其URAT1蛋白表达却更低，说明红曲黄色素具有更加优异的降低高尿酸血症小鼠尿酸水平的能力，其原因可能与红曲黄色素样品中含有MFA、MFB、红曲黄素(Monascin)和安卡红曲黄素(Ankaflavin)有关。 [0322] ABCG2转运蛋白表达增加会使重吸收减少，尿酸排泄加速导致血尿酸浓度降低。图21和图22表明，M组在进行14天氧嗪酸钾的干预后，ABCG2蛋白表达水平较N组发生了显著下降(p<0.05)，与前期结果中URAT1蛋白表达水平升高相呼应，即该组尿酸重吸收增加，小鼠血清尿酸升高形成了高尿酸血症。与M组比较，PR、PO、MF组ABCG2蛋白表达明显上升，其中PO组具有统计学差异(p<0.05)，该结果表明红曲发酵黑米粉与红曲黄色素均可通过上调ABCG2表达来降低尿酸生成，在治疗高尿酸血症方面发挥了重要作用。 [0323] 综上，实施例4通过体内实验以氧嗪酸钾诱导的高尿酸血症小鼠为模型进行降尿酸效果评价，模型组小鼠血清尿酸水平明显高于空白组(p<0.05)，表示高尿酸血症小鼠模型建立成功。发酵前黑米粉、红曲发酵黑米粉与红曲黄色素均能有效降低小鼠血清UA、Cr、BUN水平，抑制肝脏XO、5'‑NT、ADA酶活性，其降尿酸的机制与上调ABCG2的表达水平、下调URAT1和GLUT9蛋白的表达水平相关。相同剂量条件下，红曲发酵黑米粉的降尿酸效果优于发酵前黑米粉，降低一半剂量时的红曲黄色素也能与发酵前黑米粉小鼠的尿酸值相近，表明红曲黄色素更有利于降低小鼠血清UA水平。通过对小鼠肾脏组织病理学观察得出：红曲发酵黑米粉在减缓高尿酸血症对肝脏、肾脏的损伤作用方面比发酵前黑米粉具有一定的优势。 [0324] 红曲发酵黑米粉与红曲黄色素样品表现出的比发酵前黑米粉更加优异的效果，与其含有的MFA、MFB、MS、AK相关，MFA、MFB等红曲黄色素具有XO抑制活性及降尿酸功效。红曲黄色素样品中MFA、MFB含量分别为25.3％和45.5％，红曲发酵黑米粉中MFA、MFB含量分别为3.97％和7.24％，发酵前黑米粉中不含有MFA、MFB，三者的XO抑制活性及降尿酸能力大小均依次为：红曲黄色素＞红曲发酵黑米粉＞发酵前黑米粉，因此，在一定范围内，XO抑制活性及降尿酸功效与其中MFA、MFB等红曲黄色素含量呈正相关。 [0325] 实施例3.2实验证实，实施例3.1制备的红曲黄色素样品中至少含有MFA、MFB、MS和AK四种组分，其结构式如下所示： [0326] [0327] 根据专利CN201010145390.3(公开号CN101862327A)以及专利CN201010145501.0(公开号CN101862324A)报道，红曲色素在生物体内可能存在某种可逆的生物转化。即在2、3位的内酯转化为开环结构，4位的羰基还原为羟基结构，6位的氧杂环转变为氮杂环化合物，且氮源来自于氨基酸的氨基。 [0328] [0329] [0331] 在上述红曲黄色素因含有MFA、MFB、MS、AK四种化合物而具有XO抑制活性、能够降低机体血尿酸水平的情况下，发明人可以合理的推测，本申请式I和式II化合物，以及它们的代谢产物，均具有此功效。 [0332] 实施例5功能饮料工艺优化探究实验 [0333] 本申请提供的功能饮料及其饮料包装的制备过程如下： [0334] S1：黑米经过红曲菌发酵后，提取、冻干得到红曲发酵黑米粉，红曲发酵黑米粉经过煮制工艺X后得到黑米发酵液，待用。经体内和体外实验验证，红曲发酵黑米粉和黑米发酵液均具有显著的XO抑制活性和降尿酸效果，且其中至少含有红曲黄色素MFA、MFB。 [0335] S2：黄精碾成粉末后，经过煮制工艺Y后得到黄精液，待用。 [0336] S3：将上述制备的黑米发酵液、黄精液，以及白砂糖、水，以特定比例混合后，经过调配、均质，即得到功能饮料。 [0337] S4：将功能饮料灌装、封盖、灭菌后，即得到饮料包装。 [0338] 上述灭菌过程可根据设备情况及成本因素调整至调配前或者均质后。制备功能饮料及其饮料包装的流程图如图23所示。 [0339] 以下探究黑米发酵液与黄精液制备的煮制工艺X和Y，以及黑米发酵液、黄精液、白砂糖、水的较佳的配置比例，并对制得的功能饮料进行质量检测。 [0340] 各组实验将三次的有效测定结果汇总，并处理为“平均值±标准差”的形式；采用SPSS22.0利用单因素方差分析(One‑way analysis of variance，ANOVA)和Duncan多重比较(Duncan’s multiple range test，DMRT)对数据进行显著性分析，p<0.05时判定数据间的差异有统计学意义。利用Design‑Expert.v8.0.6软件针对数据分析结果绘制相应响应面曲线。 [0341] 5.1黑米发酵液的制备及煮制工艺X的优化 [0342] 前述实验表明，红曲发酵黑米粉中含有丰富的花色苷、酚类、黄酮类物质及红曲色素，其具有XO抑制活性及降尿酸功效。现有技术报道黑米中含有丰富的花色苷、酚类、黄酮类物质，其具有抗氧化、抗炎、抗血脂、抗癌等作用。因此，本申请以红曲发酵黑米粉为原料制备黑米发酵液，在保证黑米发酵液也具有XO抑制活性及降尿酸功效的前提下，同时兼具其抗氧化、抗炎、抗血脂、抗癌等作用。因此，本申请黑米发酵液的煮制工艺X，以总黄酮含量为指标，考察红曲发酵黑米粉与水的配比、煮制温度、煮制时间等因素。 [0343] 黄酮含量测定方法参考实施例1.3。 [0344] 5.1.1料液比(红曲发酵黑米粉与水的质量比)单因素实验 [0345] 以5.0g红曲发酵黑米粉为基准，固定其他因素及相应水平：煮制时间120min、煮制温度90℃，考察不同料液比(红曲发酵黑米粉与水的质量比，1:20、1:30、1:40、1:50、1:60)对煮制液黄酮含量的影响，每个测试组重复3次。不同料液比单因素实验结果如表13，相应曲线如图24所示。 [0346] 表13：不同料液比(红曲发酵黑米粉与水的质量比)的单因素实验结果 [0347] [0348] [0349] 表13和图24表明，在煮制时间120min、煮制温度90℃条件下，随着料液比的增大，黑米发酵液中黄酮含量呈现迅速上升的趋势，由11.6mg/g上升到17.6mg/g。当料液比增加至1:60时，黄酮含量增长率下降，但含量依然增加，可能原因是黑米发酵后粉末变得疏松，需要吸收更多的水分才能将黄酮浸出。因此选用料液比为1:40、1:50、1:60进行正交优化。 [0350] 5.1.2煮制时间单因素实验 [0351] 以5.0g红曲发酵黑米粉为基准，固定其他因素及相应水平：料液比1:50、煮制温度90℃，考察不同煮制时间(60min、90min、120min、150min、180min)对煮制液黄酮含量的影响，每个测试组重复3次。不同煮制时间单因素实验结果如表14，相应曲线如图25所示。 [0352] 表14：红曲发酵黑米粉不同煮制时间的单因素实验结果 [0353] 煮制时间/min 60 90 120 150 180黄酮含量(mg/g) 11.00±0.63 13.00±0.42 15.50±0.58 17.70±0.71 18.40±0.55[0354] 表14和图25表明，在料液比1:50、煮制温度90℃时，随着煮制时间的延长，黄酮含量持续升高，在90min至150min时呈现出快速上升的趋势，由13.1mg/g升至18.4mg/g。在实验范围内，黑米发酵液中黄酮含量一直保持增长，尽管在达到150min后增长速率降低，但在煮制过程中发现，时间达到90min时黑米发酵粉与水并未很好相融，水面浮沫残渣明显，这可能是由于黑米发酵后质量减轻，谷皮漂浮，营养成分在短时间内无法浸透水而导致黄酮含量不高。因此选用煮制时间为120min、150min、180min进行正交优化。 [0355] 5.1.3煮制温度单因素实验 [0356] 以5.0g红曲发酵黑米粉为基准，固定其他因素及相应水平：料液比1:50、煮制时间120min，考察不同煮制温度(60℃、70℃、80℃、90℃、100℃)对煮制液黄酮含量的影响，每个测试组重复3次。不同煮制温度单因素实验结果如表15，相应曲线如图26所示。 [0357] 表15：红曲发酵黑米粉不同煮制温度的单因素实验结果 [0358] 煮制温度/℃ 60 70 80 90 100黄酮含量(mg/g) 12.50±0.55 15.80±0.58 17.70±0.47 21.00±0.71 20.60±0.66[0359] 表15和图26表明，在料液比1:50、煮制时间120min条件下，随着煮制温度的逐步升高，黄酮含量呈现出明显的先升高后下降的趋势，在达到90℃时，黄酮得率达到了最高值。 当反应温度从60℃提高至90℃，黄酮含量由12.5mg/g升至21mg/g，这一结果表明，适度提高温度对于黄酮含量的提取具有积极促进作用。但当温度超过90℃时，黄酮含量开始降低，但依然还有较高的得率，表明高温可能会影响黑米中部分黄酮的稳定性，使黄酮含量减少。考虑到70℃黄酮得率与100℃相差较大，因此选用煮制温度为80℃、90℃、100℃进行正交优化。 [0360] 5.1.4正交优化试验 [0361] 基于单因素实验结果，选出较好的实验参数设计四因素三水平L9(34)正交实验，确定红曲发酵黑米粉的最佳煮制工艺配方。 [0362] 由单因素实验分析结果可知，料液比、煮制时间和煮制温度都能有效的影响黑米发酵液中黄酮得率。基于单因素实验得出的最佳实验条件，设计了正交实验表，进行进一步优化，具体的正交试验水平表如表16，黑米发酵液正交实验主体间效应检验表如表17，黑米发酵液正交实验极差分析表如表18。 [0363] 表16：红曲发酵黑米粉正交试验水平表 [0364] [0365] 表17：黑米发酵液正交实验主体间效应检验表 [0366] III类平方 自由度 均方 F 显著性a 修正模型 85.307 6 14.218 81.503 0.012 截距 3139.734 1 3139.734 17998.478 0.000 料液比 38.682 2 19.341 110.873 0.009 时间 8.909 2 4.454 25.535 0.038 温度 37.716 2 18.858 108.102 0.009 误差 0.349 2 0.174 / / 总计 3225.390 9 / / / 修正后总计 85.656 8 / / / [0367] 注：R2＝0.996(调整后R2＝0.984)。 [0368] 表18：黑米发酵液正交实验极差分析表 [0369] [0370] [0371] 从表17可知，对红曲发酵黑米粉煮制工艺正交优化实验进行方差分析，由F值比较可知，料液比(A)、煮制时间(B)、煮制温度(C)对黑米发酵液中黄酮含量的作用程度为：料液比>煮制温度>煮制时间，黄酮含量受料液比的影响最大，煮制温度对黄酮得率的影响稍弱于料液比，具有极显著差异(p<0.01)，煮制时间影响显著性最小(p<0.05)。三个单因素变量对黄酮得率的影响略有不同，但总体上的影响趋势是相似的，这也说明这三个因素之间相互协同，共同促进了黄酮的浸出。 [0372] 以高黄酮含量为主要目标，根据表18中的极差值R值可知，根据各个因素对于黄酮含量的影响大小，将其从大到小排序依次为A>C>B，即三个因素中，对黄酮得率影响最大的是料液比，其次为煮制温度与煮制时间。该结论与方差分析相符合，得到的最优黑米发酵液煮制方案为A3、B2、C2，即最佳煮制工艺X为料液比1:60、煮制时间150min、煮制温度90℃。 [0373] 本实验数据表明，当红曲发酵黑米粉与水以1:(20‑60)的质量比进行配制，在60‑100℃温度下煮制60‑180min时，红曲发酵黑米粉经过煮制得到的黑米发酵液中的总黄酮含量较高；如果将红曲发酵黑米粉与水以1:(40‑60)的质量比进行配制，在80‑100℃温度下煮制120‑180min，煮制得到的黑米发酵液中的总黄酮含量将会进一步提高；如果在红曲发酵黑米粉与水以1:60的质量比进行配制，在90℃温度下煮制150min，红曲发酵黑米粉经过煮制工艺X得到的黑米发酵液中的总黄酮含量将达到最优效果。 [0374] 5.2黄精液的制备及煮制工艺Y的优化 [0375] 黄精是一种药用和食用同源的植物，黄精富含多种生物活性物质，现有技术表明，黄精多糖是其主要的活性成分，它是《中国药典2020》中规定的黄精的唯一含量测定成分，具有抗肿瘤、抗氧化、保护骨骼、护肝和调节免疫等多种药理作用。因此，本申请黄精液的煮制工艺Y，以黄精多糖含量为指标，考察黄精粉末与水的配比、煮制温度、煮制时间等因素。 [0376] 多糖检测方法 [0377] 总多糖含量测定标准曲线的制备：精密称取葡萄糖标准品10mg，于10mL容量瓶中，蒸馏水定容，配置浓度为1mg/mL的葡萄糖标准溶液。分别吸取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1mL于10mL具塞比色管中，加入蒸馏水至1mL。之后加入5％的苯酚溶液1mL，摇匀后立即缓慢加入浓硫酸5mL，摇匀静置冷却至室温，于490nm处测定其吸光度。以蒸馏水代替样品按上述操作测定吸光度作为空白组，平行操作3次，绘制多糖标准曲线。 [0378] 将黄精粉经过煮制工艺Y制得的黄精液稀释100倍，待测，用吸管吸取1.0mL上述待测液，移入试管中，参照标准曲线操作进行实验，重复操作3次，取平均值，计算样品中多糖含量。 [0379] 5.2.1料液比(黄精粉与水的质量比)单因素实验 [0380] 以5.0g黄精粉为基准，固定其他因素及相应水平：煮制温度80℃、煮制时间120min，考察不同料液比(黄精粉与水的质量比，1:15、1:20、1:25、1:30、1:35)对煮制液多糖含量的影响，每个测试组重复3次。不同料液比单因素实验结果如表19，相应曲线如图27所示。 [0381] 表19：不同料液比(黄精粉与水的质量比)的单因素实验结果 [0382] 料液比 1:15 1:20 1:25 1:30 1:35多糖含量/％ 32.20±1.42 35.80±1.32 40.00±1.36 48.30±1.48 50.50±1.50 [0383] 表19和图27表明，固定多糖的煮制温度为80℃，煮制时间为180min，随着料液比的增大，多糖含量也随之增加，当液料比在1:25～1:30之间时，多糖含量显著增加，说明多糖的浸出需要一定的水分，在黄精粉充分浸透后更易多糖的溶出。一般来说溶剂量越大多糖浸出越多，但当溶剂量超过一定范围时，即当料液比超过1:30时多糖含量增加变化不明显，因此，从多糖含量及成本方面考虑，选取最佳料液比为1:30作为最终煮制工艺Y的煮制条件。 [0384] 5.2.2煮制时间单因素实验 [0385] 以5.0g黄精粉为基准，固定其他因素及相应水平：料液比1:30、煮制温度80℃，考察不同煮制时间(60min、90min、120min、150min、180min)对煮制液多糖含量的影响，每个测试组重复3次。不同料液比单因素实验结果如表20，相应曲线如图28所示。 [0386] 表20：黄精粉不同煮制时间的单因素实验结果 [0387] 时间/min 60 90 120 150 180多糖含量/％ 38.10±1.71 40.50±1.45 42.30±1.23 43.60±1.36 48.30±1.63 [0388] 表20和图28表明，保持料液比为1:30，煮制温度为80℃不变，随着时间的不断延长，测得黄精液中多糖含量不断增加，在150min前呈缓慢上升趋势，150min后多糖含量显著升高，相比于120min时多提升了约5％。综合能耗及成本因素考虑，选取最佳煮制时间为180min作为最终煮制工艺Y的煮制条件。 [0389] 5.2.3煮制温度单因素实验 [0390] 以5.0g黄精粉为基准，固定其他因素及相应水平：料液比1:30、煮制时间120min，考察不同煮制温度(60℃、70℃、80℃、90℃、100℃)对煮制液多糖含量的影响，每个测试组重复3次。不同料液比单因素实验结果如表21，相应曲线如图29所示。 [0391] 表21：黄精粉不同煮制温度的单因素实验结果 [0392] 温度/℃ 60 70 80 90 100多糖含量/％ 25.10±1.51 34.90±1.49 48.30±1.83 49.20±1.92 46.80±1.68 [0393] 表21和图29表明，在料液比1:30、煮制时间180min条件下，煮制温度对黄精液中多糖含量影响显著。随着水浴温度的升高，多糖含量呈现出明显的先升高后下降的趋势，在温度达到90℃时，多糖得率达到了最高峰。这主要是因为温度升高，提取剂粘度降低，扩散系数增加，多糖分子的溶出加速。当反应温度超过90℃时，多糖含量缓慢下降，可能是因为蒸汽压力增加，溶剂蒸发较快，黄精粉和溶剂接触的比表面积减小，造成多糖浸出降低，或是高温使多糖结构受到破坏降低了多糖的浸出率。由于在80℃～90℃范围内多糖含量升高不明显，因此，选取最佳煮制温度为80℃作为最终煮制工艺Y的煮制条件。 [0394] 综上，将黄精研磨成黄精粉后，当将黄精粉与水以1:(15‑35)的质量比进行配制，在60‑100℃温度下煮制60‑180min时，黄精粉经过煮制得到的黄精液中的多糖含量较高；如果将黄精粉与水以1:(25‑35)的质量比进行配制，在80‑100℃温度下煮制120‑180min，煮制得到的黄精液中的多糖含量将会进一步提高；如果在黄精粉与水以1:30的质量比进行配制，在80℃温度下煮制180min，黄精粉经过煮制工艺Y得到的黄精液中的多糖含量将达到最优效果。 [0395] 5.3功能饮料响应面优化实验 [0396] 分别以黑米发酵液、黄精液、白砂糖按不同添加量作为自变量进行单因素实验。根据单因素试验结果，利用Box‑Behnken响应面试验设计原理，运用DesignExpert.v8.0.6软件进行四因素三水平响应面分析。选取单因素感官得分最优的黑米发酵液、黄精煮制液、白砂糖三个因素，通过对回归方程的分析，得到最优参数，其求得的回归方程准确度高，且等高线和响应面能直观的表达出各因素对感官评分的交互作用。最终结合成本进行综合评价，得出功能饮料最佳配方。 [0397] 感官评定方法 [0398] 评定小组成员对色、香、味有较强的区分力和灵敏度，身心健康，均无抽烟、酗酒等不良的生活习惯，且在检验前一个小时内不吃东西，不使用有气味的化妆品。试验前进行功能饮料的感官评定标准及评定办法的培训，根据饮料色泽、外观组织、气味、口感四个因素进行感官评价，每个因素作为一个重要的指标，各因素的评价标准如表22所示。 [0399] 表22：感官评分标准 [0400] [0401] 5.3.1黑米发酵液质量百分比含量单因素实验 [0402] 固定加入15％黄精液，6％白砂糖，设置黑米发酵液为40％、50％、60％、70％、80％进行感官评分，确定黑米发酵液的添加量。以配制100mL饮料为例，除上述添加三者成分以外，其余质量百分比加入纯净水补足。不同黑米发酵液质量百分比含量单因素实验结果如表23，相应感官评分曲线如图30所示。 [0403] 表23：不同黑米发酵液质量百分比含量单因素实验结果 [0404] 黑米发酵液添加量/％ 40 50 60 70 80感官评分/分 86.67±0.52 85.67±0.58 85.90±0.50 86.50±0.42 83.16±0.36 [0405] 表23和图30表明，保持黄精液、白砂糖的添加量不变，当黑米发酵液的添加量在40％～60％范围内时，曲线缓慢升高，对感官评分影响不大，得分维持在83分左右。当添加量继续升高时，感官得分开始逐渐下降，尤其当黑米发酵液添加量超过70％时，感官得分发生显著降低，这可能是由于黑米发酵后产生了特殊的苦涩味，添加白砂糖可以起到较好的中和作用，但当含量超过一定比例时，苦味无法被掩盖，饮料的涩味加重导致了感官得分降低，因此选用黑米发酵液质量百分比添加量为50％、60％、70％进行优化。 [0406] 5.3.2黄精液质量百分比含量单因素实验 [0407] 固定加入60％黑米发酵液，6％白砂糖，设置黄精液为5％、10％、15％、20％、25％进行感官评分，确定黄精液的添加量。以配制100mL饮料为例，除上述添加三者成分以外，其余质量百分比加入纯净水补足。不同黄精液质量百分比含量单因素实验结果如表24，相应感官评分曲线如图31所示。 [0408] 表24：不同黄精液质量百分比含量单因素实验结果 [0409] 黄精液添加量/％ 5 10 15 20 25感官评分/分 81.85±0.34 82.42±0.28 83.71±0.24 82.16±0.16 82.00±0.40 [0410] 表24和图31表明，当黑米发酵液、白砂糖的添加量不变时，在黄精液添加量为5％～25％范围内，感官评分随着添加量的增加呈现先上升后下降的趋势，且在黄精液添加量为15％时感官评分达到最大，达到了83.94，继续增加黄精液的比例反而造成了感官得分下降。而添加量超过20％后评分较低的原因可能是由于黄精粉煮制过后颜色较深，表现为黑褐色，当添加过量时饮料整体颜色色泽偏重，不易被人们接受，造成了总体的感官值下降。说明黄精液添加量过高或者过低都不利于饮料的感官评分，因此选择黄精液添加量为 10％、15％、20％进行响应面优化试验。 [0411] 5.3.3白砂糖质量百分比含量单因素实验 [0412] 固定加入60％黑米发酵液，15％黄精液，设置白砂糖为3％、4％、5％、6％、7％进行感官评分，确定白砂糖的添加量。以配制100mL饮料为例，除上述添加三者成分以外，其余质量百分比加入纯净水补足。不同黄精液质量百分比含量单因素实验结果如表25，相应感官评分曲线如图32所示。 [0413] 表25：不同白砂糖质量百分比含量单因素实验结果 [0414] 白砂糖添加量/％ 3 4 5 6 7感官评分/分 81.25±0.35 83.80±0.35 85.00±0.44 86.33±0.26 84.80±0.32 [0415] 为了改善功能饮料的适口性，选用白砂糖作为甜味剂来调节饮料的风味与口感，当然，除了白砂糖外，还可以选择其他食糖，如原糖、绵白糖、冰糖、方糖、红糖等。 [0416] 表25和图32表明，白砂糖质量百分比添加量在3％至6％之间时，感官评分呈直线上升的趋势，且在6％时达到最高峰，感官得分为86.4。但此后随着白砂糖浓度的增加，在6％至7％之间感官评分逐步下降。这一结果说明白砂糖添加量对感官评分的影响较大，添加量较低时饮料口感苦涩造成得分较低，超过6％的添加量时得分下降的原因可能是因为部分感官评定人员对甜味的敏感程度较高，尽管得分下降但最终分数还是维持在一个较高水平，因此选择白砂糖添加量为5％、6％、7％进行响应面优化试验。 [0417] 5.3.4响应面优化分析 [0418] 根据单因素实验结果，使用Design‑Expert软件进行三因素三水平优化实验，以感官评分作为响应值，自变量分别为黑米发酵液(A)、黄精液(B)、白砂糖(C)，功能饮料感官得分的因素与水平表如表26所示。对设计方案中所有组进行感官评分，响应面分析实验方案及结果如表27所示。 [0419] 表26：功能饮料感官得分的因素与水平表 [0420] [0421] 表27：响应面分析实验方案及结果 [0422]序号 黑米发酵液(％) 黄精液(％) 白砂糖(％) 感官评分 1 50 10 6 81.32 2 70 10 6 80.45 3 50 20 6 81.14 4 70 20 6 81.34 5 50 15 5 81.46 6 70 15 5 79.83 7 50 15 7 81.07 8 70 15 7 81.53 9 60 10 5 82.49 10 60 20 5 81.5 11 60 10 7 81.97 12 60 20 7 83.53 13 60 15 6 85.12 14 60 15 6 84.5 15 60 15 6 85.17 16 60 15 6 84.67 17 60 15 6 85.02 [0423] 回归拟合得到的二次多项式回归方程如下： [0424] Y＝84.89‑0.23*A+0.16*B+0.35*C+0.27*AB+0.52*AC+0.64*BC‑2.61*A2‑1.21*B2‑2 1.30*C。 [0425] 回归模型方差分析结果如表28所示。此模型的F＝103.45，P值<0.001，表明该响应面回归模型高度显著；失拟项P值为0.9245>0.05不显著，说明该模型对本实验拟合程度较2 2 好。R＝0.9925，说明回归方程拟合的实验情况较好、模型的相关性比较高。预测的R 与调整 2 后的R差值小于0.2，说明该模型较为精确。一次项A、C，交互相AC、BC对感官值影响显著，平 2 2 2 方项A 、B、C影响极其显著。三个因素对感官评分的影响顺序为黑米发酵液(A)＞白砂糖(C)＞黄精液(B)，因此，可用该模型代替真实试验点对试验结果进行分析预测。 [0426] 表28：回归模型方差分析结果 [0427]方差来源 平方和 自由度 均方 F值 P值 模型 50.89 9 5.65 103.45 ＜0.0001*** A 0.42 1 0.42 7.74 0.0037** B 0.2 1 0.2 3.75 0.0941 C 0.99 1 0.99 18.19 0.0272* AB 0.29 1 0.29 5.24 0.0559 AC 1.09 1 1.09 19.98 0.0029** BC 1.63 1 1.63 29.74 0.0010** 2 A 28.79 1 28.79 526.71 ＜0.0001*** 2 B 6.21 1 6.21 113.68 ＜0.0001*** 2 C 7.17 1 7.17 131.15 ＜0.0001*** 残差 0.38 7 0.055 / / 失拟值 0.039 3 0.013 0.15 0.9245 纯误差 0.34 4 0.086 / / 总和 51.27 16 / / / [0428] 注：***表示极显著差异，P<0.001；**表示显著差异，P<0.01；*表示较显著差异，P<0.05。 [0429] 表29：R2综合分析表 [0430] 2 2 2统计项目 R Radj Rpred C.V.％ 数值 0.9925 0.9829 0.9774 0.28 [0431] R2综合分析表如表29所示。模型的相关系数R2＝0.9925，校正系数Radj2＝0.9829，说明该模型可以解释98.29％的感官变化都是由自变量引起，C.V.值为2.8％小于5％，即模型与试验的拟合程度较好，能很好的反应真实的饮料感官评分，说明试验的可靠性较高。 [0432] 各因素交互作用对感官评分的影响 [0433] 基于回归模型方差分析，为了进一步探究三个因素间的交互作用并且确定最优点，利用Design‑Expert.v8.0.6软件对回归模型进行响应面分析，做出黑米发酵液(A)、黄精液(B)、白砂糖(C)对功能饮料感官评分的响应面立体分析图和等高线图。从等高线图可以看出各因素间交互效应的强弱程度，若形状为圆形，说明交互作用不显著；若形状越接近椭圆，则说明交互作用越显著。从响应面曲线图可以看出各因素对感官评价的影响程度，若曲面越陡，影响程度越大；若曲面越平坦，则说明该因素的影响程度越小。 [0434] 当白砂糖(C)添加量保持不变时，黑米发酵液(A)、黄精液(B)对功能饮料感官评分的响应面立体分析图和等高线图如图33、图34所示。从图33、图34可以看出，当白砂糖(C)添加量保持不变时，随着黑米发酵液(A)和黄精液(B)的增加，感官评分呈现先上升后下降的趋势，等高线图呈现椭圆形，表示两者交互作用显著。进一步观察响应面曲线，与黄精液添加量相比，黑米发酵液添加量的响应面倾斜角度更大，曲面坡度更陡峭，说明黑米发酵液对感官评分的影响更大。 [0435] 当黄精液(B)添加量保持不变时，黑米发酵液(A)和白砂糖(C)对功能饮料感官评分的响应面立体分析图和等高线图如图35、图36所示。从图35、图36可以看出，交互作用等高线图呈椭圆形，交互作用显著。随着黑米发酵液和白砂糖添加量的增加，饮料感官评分先上升后下降，响应面较弯曲，即黑米发酵液和白砂糖添加量对饮料感官评分影响显著。当黑米发酵液和白砂糖添加量分别在58％～62％、5.9％～6.3％的范围内时，饮料感官评分达到最大值，随着黑米发酵液和白砂糖添加量的增加或减小，饮料感官评分也随之下降。进一步观察3D响应面图，黑米发酵液上升的幅度比白砂糖上升的幅度陡峭，说明黑米发酵液对饮料感官评分影响较大。 [0436] 当黑米发酵液(A)添加量保持不变时，黄精液(B)、白砂糖(C)对功能饮料感官评分的响应面立体分析图和等高线图如图37、图38所示。从图37、图38可以看出，黄精液(B)和白砂糖(C)交互作用等高线图呈椭圆形，交互作用显著。随着黄精液和白砂糖添加量的增加，饮料感官评分先上升后下降，即黄精液和白砂糖添加量对饮料感官评分影响显著。而白砂糖一侧曲面的幅度比黄精液的幅度大，说明白砂糖对饮料感官评分影响大于黄精液。 [0437] 综上，由响应面和等高线分析可以判断出影响顺序：黑米发酵液(A)＞白砂糖(C)＞黄精液(B)，该结果与方差分析一致。由软件分析得出红曲黑米黄精饮料的理论最佳配方为：黑米发酵液59.87％，黄精液16.93％，白砂糖6.16％，预计感官评分84.93。由于实际操作所限，容易产生误差，因此将优化后参数修正为：黑米发酵液60％，黄精液17％，白砂糖6％，三次重复性实验得到平均值为84.44，与模型预测值相差较小，证明该模型可以用于功能饮料感官评价的分析及预测。 [0438] 功能饮料响应面优化实验表明，以质量百分比计，当以黑米发酵液40‑80％、黄精液5‑25％、白砂糖3‑7％调配(其余质量百分比加入纯净水补足)时，功能饮料感官评分较高；如果以黑米发酵液40‑70％、黄精液10‑20％、白砂糖5‑7％调配(其余质量百分比加入纯净水补足)时，功能饮料感官评分可进一步提高；如果以黑米发酵液60％、黄精液17％、白砂糖6％、水17％调配时，功能饮料感官评分达到最大。 [0439] 5.4功能饮料的制备，以及饮料包装的制备 [0440] 功能饮料的制备： [0441] (1)红曲发酵黑米粉在料液比1:60、煮制时间150min、煮制温度90℃条件下，制备成黑米发酵液，待用； [0442] (2)黄精碾成粉末后，在料液比1:30、煮制时间180min、煮制温度80℃条件下，制备成黄精液，待用； [0443] (3)调配：取黑米发酵液150g、黄精液42.5g、白砂糖15g、水42.5g进行调配，得到调配液； [0444] (4)均质：取上述调配液在30Mpa下均质，得到功能饮料； [0445] 饮料包装的制备： [0446] (5)灌装：取上述均质后的功能饮料趁热灌装于250mL瓶中，封盖，得到包装物； [0447] (6)灭菌：将灌装后的包装物在121℃下灭菌15min，得到250mL规格的饮料包装。 [0448] 上述饮料包装在获得法律规定的生产/销售许可证后可作为最终商品直接售卖。 [0449] 参照实施例2中黄嘌呤氧化酶(XO)抑制活性实验方法，检测制备的黑米发酵液对黄嘌呤氧化酶的抑制率。以红曲发酵黑米粉质量计，将黑米发酵液配制成浓度为0.02mg/mL，检测其XO抑制率为43％，说明黑米发酵液具有一定的XO抑制活性及降尿酸功效。以简单的调配、均质等物理方法将黑米发酵液制成功能饮料后，功能饮料中也会含有功能物质红曲色素(特别是红曲黄色素MFA、MFB)，因此，功能饮料也具有一定的XO抑制活性及降尿酸功效。 [0450] 5.5功能饮料的质量检测 [0451] 对实施例5.4制备的功能饮料进行总糖、总酸、pH、总黄酮、可溶性固形物指标检测。 [0452] 总酸的测定 [0453] 参考GB 12456‑2021中总酸的测定方法，根据试样总酸的可能含量，使用移液管吸取50mL试液，置于250mL三角瓶中，加入2～4滴(10g/L)酚酞指示液，用0.1mol/L氢氧化钠标准滴定溶液滴定至微红色30s不褪色。记录消耗0.1mol/L氢氧化钠标准滴定溶液的体积数值。总酸含量计算公式如下： [0454] [0455] 式中： [0456] X——试样中总酸的含量，单位为克每千克(g/kg)或克每升(g/L)； [0457] C——氢氧化钠标准滴定溶液的浓度，单位为摩尔每升(mol/L)； [0458] V1——滴定试液时消耗氢氧化钠标准滴定溶液的体积，单位为毫升(mL)； [0459] V2——空白试验时消耗氢氧化钠标准滴定溶液的体积，单位为毫升(mL)； [0460] k——酸的换算系数，0.067； [0461] F——试液的稀释倍数； [0462] N——试样的质量，单位为克(g)或吸取试样的体积，单位为毫升(mL)； [0463] 1000——换算系数。 [0464] 可溶性固形物的测定 [0465] 参考GB/T 31326‑2014《植物饮料》分类中QB/T 4221‑2011《谷物饮料》的检测方法，称取10.0g试样于已知称量恒重并盛有一定量海砂的称量皿中，在水浴上蒸发至干，取下称量皿，擦干附着的水分，再放入恒温干燥箱内，在101℃～105℃下烘2h，取出移入干燥器内冷却，30min后称量。然后，再放入恒温干燥箱内烘干，直至恒重。可溶性固形物含量计算公式如下： [0466] Y＝(m2‑m1)/m×100 [0467] 式中：Y——样品中总固形物的含量，单位为克每百克(g/100g)； [0468] m2——烘干后试样加海砂加称量皿的质量，单位为克(g)； [0469] m1——海砂和称量皿的质量，单位为克(g)； [0470] m——试样的质量，单位为克(g)。 [0471] 总糖含量的测定参照GB 15672‑2009及实施例5.2中的方法，总黄酮含量测定参照实施例1.3中的方法。 [0472] 总糖、总酸、pH、总黄酮、可溶性固形物等理化指标检测结果如表30所示。 [0473] 表30：功能饮料理化指标 [0474]项目 含量 总糖 1.23g/mL 总酸 2.64g/L PH 4.63 总黄酮 15.34mg/mL 可溶性固形物 7.0(g/100g) [0475] GB/T 31326‑2014《植物饮料》中要求可溶性固形物含量大于6(g/100g)，本申请制备的功能饮料满足该质量要求。 [0476] 本申请提供的功能饮料具有出色的XO抑制活性及降尿酸功效，这款饮料不仅口感丰富，而且具有明显的药用价值，可用于缓解尿酸过高的问题。 [0477] 以上所述的具体实施例，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施例，并不用于限制本发明，凡在本申请的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。 |
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