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用于抗病性功能测试的植物抗病基因文库的制备方法
申请号 CN202280047003.3 申请日 2022-05-11 公开(公告)号 CN117917951A 公开(公告)日 2024-04-23
申请人 双刃基金会; 发明人 M·J·莫斯寇; H·P·梵艾瑟;
摘要 本 申请 提供了用于制备针对感兴趣的 植物 病原体 的候选植物抗病(R)基因的文库的方法。所述方法涉及从一种或多种感兴趣的植物中的每一种中在一种或多种植物的器官或其它部分中组成性表达的核苷酸结合结构域和富含亮 氨 酸重复序列基因(NLR)群体中选择高度表达的NLR的亚群，以产生候选R基因的文库。本申请进一步提供了使用候选R基因的文库鉴定针对感兴趣的植物病原体的R基因的相关方法以及包含所鉴定的R基因的组合物。
权利要求

1.一种制备针对至少一种感兴趣的植物病原体的候选植物抗病(R)基因的文库的方
法，所述方法包括：
从一种或多种感兴趣的植物中的每一种中在一种或多种植物的器官或其它部分中组
成性表达的核苷酸结合结构域和富含亮氨酸重复序列基因(NLR)群体中选择高度表达的
NLR的亚群，以制备候选R基因的文库，
其中高度表达的NLR包含的在植物的器官或其它部分中的相对表达水平大于至少65％
的组成性表达的NLR在植物的器官或其它部分中的相对表达水平。
3.根据权利要求1所述的方法，其中组成性表达的NLR群体中的一个或多个所述NLR进
一步包含至少一个感兴趣的特征。
2.根据权利要求1所述的方法，其中选择高度表达的NLR的亚群进一步包括选择包含至
少一个感兴趣的特征的NLR。
4.根据权利要求2或3所述的方法，其中所述至少一个感兴趣的特征选自由以下组成的
组：
(a)NLR编码的氨基酸序列中存在种内变异；
(b)NLR编码的氨基酸序列中不存在种内变异；
(c)NLR编码的氨基酸序列中存在种间变异；
(d)NLR编码的氨基酸序列中不存在种间变异；和
(e)NLR编码的氨基酸序列中存在大量的种内等位基因变异。
5.根据权利要求1‑4中任一项所述的方法，其中所述NLR的表达水平是使用能够用于确
定基因相对表达水平的转录组分析方法确定的。
6.根据权利要求5所述的方法，其中所述转录组分析方法是RNA测序(RNAseq)。
7.根据权利要求1‑6中任一项所述的方法，其中所述方法还包括在选择高度表达的NLR
的亚群之前从植物的器官或其它部分分离RNA。
8.根据权利要求1‑7中任一项所述的方法，其中感兴趣的一种或多种植物不支持一种
或多种感兴趣的植物病原体的生长或生命周期的完成。
9.根据权利要求1‑9中任一项所述的方法，其中所述器官选自由叶、根和茎组成的组。
10.根据权利要求1‑9中任一项所述的方法，所述方法进一步包括用候选R基因的文库
中的候选NLR转化宿主植物，其中所述宿主植物是至少一种感兴趣的病原体的宿主。
11.根据权利要求1‑10中任一项所述的方法，其中所述宿主植物选自由小麦、大麦、水
稻、黑麦、玉米、高粱、燕麦、大豆、马铃薯、番茄、甘薯、棉花、甘蔗和木薯组成的组。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述感兴趣的植物是与宿主植物相同的物种。
13.根据权利要求11所述的方法，其中所述感兴趣的植物与宿主植物不是同一物种。
14.根据权利要求13所述的方法，其中所述感兴趣的植物与宿主植物来自同一科、亚
科、族和/或属。
15.根据权利要求13或14所述的方法，其中所述器官是叶。
16.根据权利要求15所述的方法，其中所述感兴趣的植物病原体是小麦的叶片病原体。
17.根据权利要求16所述的方法，其中所述感兴趣的植物病原体选自由柄锈菌属
(Puccinia)和稻瘟菌属(Magnaporthe)小麦病原体组成的组。
18.根据权利要求17所述的方法，其中所述感兴趣的植物病原体选自由小麦秆锈菌
(Puccinia  graminis f.sp.Tritici)、小麦条锈菌(Puccinia  striiformis 
f.sp.Tritici)、小麦叶锈菌(Puccinia triticina)和小麦型稻瘟病菌(Magnaporthe 
oryzae Triticum)组成的组。
19.根据权利要求15‑18中任一项所述的方法，其中所述宿主植物是小麦。
20.根据权利要求19所述的方法，其中一种或多种感兴趣的植物是禾本科(Poaceae)中
的物种。
21.根据权利要求20所述的方法，其中所述禾本科中的物种选自由以下物种组成的组：
芨芨草属(Achnatherum)，山羊草属(Aegilops)，冰草属(Agropyron)，燕麦属(Avena)，短柄草属(Brachypodium)，凌风草属(Briza)，洋狗尾草属(Cynosurus)，猬禾属(Echinaria)，绒毛草属(Holcus)，大麦属(Hordeum)， 草属(Koeleria)，黑麦草属(Lolium)，臭草属
(Melica)，虉草属(Phalaris)和早熟禾属(Poa)。
22.根据权利要求20或21所述的方法，其中所述禾本科中的物种选自由以下组成的组：
印度落芒草(Achnatherum hymenoides)，双角山羊草(Aegilops bicornis)，高大山羊草
(Aegilops longissima)，西尔斯山羊草(Aegilops searsii)、沙融山羊草(Aegilops 
sharonensis)，冰草(Agropyron cristatum)，埃塞俄比亚燕麦(Avena abyssinica)，二穗短柄草(Brachypodium distachyon)，凌风草(Briza media)，洋狗尾草(Cynosurus 
cristatus)，Echinaria capitata，绒毛草(Holcus lanatus)，大麦(Hordeum vulgare)，草(Koeleria macrantha)，黑麦草(Lolium perenne)，小穗臭草(Melica ciliate)，天蓝虉草(Phalaris coerulescens)和普通早熟禾(Poa trivialis)。
23.通过权利要求1‑22中任一项所述的方法制备的候选R基因的文库。
24.一种转基因植物，其包含来自权利要求23所述的文库的候选R基因。
25.转基因植物集合，其中每个所述转基因植物都用来自权利要求23所述的文库的候
选R基因转化。
26.一种鉴定针对感兴趣的植物病原体的植物抗病(R)基因的方法，所述方法包括：
(i)通过用选自权利要求23所述的文库的候选R基因转化宿主植物来产生转化的植物，
其中所述宿主植物是感兴趣的植物病原体的宿主，
(ii)在适合病害发展的环境条件下，将所述转化的植物与感兴趣的植物病原体接触，
以及
(iii)与缺乏候选R基因的对照植物相比，确定所述转化的植物是否对感兴趣的植物病
原体表现出增强的抗性，其中当转化的植物对感兴趣的植物病原体引起的植物病害症状表
现出增强的抗性时，所述候选R基因是针对感兴趣的植物病原体的R基因。
27.一种鉴定针对感兴趣的植物病原体的植物抗病(R)基因的方法，所述方法包括：
(i)在适合病害症状发展的环境条件下，将根据权利要求24所述的转基因植物或根据
权利要求25所述的转基因植物集合与感兴趣的植物病原体接触，其中缺乏候选R基因的对
照植物是感兴趣的植物病原体的宿主，并且所述植物病原体能够在宿主植物上引起植物病
害症状，并且
(ii)评估转基因植物上的病害症状，其中与缺乏候选R基因的对照植物相比，当转基因
植物对由感兴趣的植物病原体引起的植物病害表现出增强的抗性时，所述转基因植物包含
针对所述感兴趣的植物病原体的R基因。
28.一种抗性植物或植物细胞，其包含通过权利要求26或27所述的方法鉴定的R基因，
其中R基因能够赋予植物对由感兴趣的植物病原体引起的植物病害的抗性。
29.根据权利要求28所述的抗性植物或植物细胞，其中所述R基因源自不是抗性植物物
种的不同物种。
30.根据权利要求28或29所述的抗性植物或植物细胞，其中所述抗性植物或植物细胞
的基因组包含含有R基因的异源多核苷酸构建体。
31.通过权利要求26或27所述的方法鉴定的分离的R基因。
32.用权利要求31所述的R基因转化的宿主细胞。
33.一种核酸分子，其包含选自以下的核苷酸序列：
(a)以下所示的核苷酸序列：SEQ ID NO：1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、29、
31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、
81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、
123、125、127、129、131、133、135、137、139、141、143、145、147、149、151、153、155、157、159、
161、163、165、167、169、171、173、175、177、179、181、183、185或187；
(b)编码包含以下所示的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列：SEQ ID NO：2、4、6、8、10、
12、14、16、18、20、22、24、26、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、
64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、
110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、
148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、
186或188，
(c)与(a)中所示的至少一个核苷酸序列具有至少75％序列同一性的核苷酸序列，其中
所述核酸分子能够赋予植物对选自由以下组成的组的植物病害的抗性：小麦秆锈病，小麦
条锈病，小麦叶锈病，小麦瘟病和小麦白粉病；和
(d)编码多肽的核苷酸序列，所述多肽与(b)中所示的至少一个全长氨基酸序列具有至
少75％的氨基酸序列同一性，其中所述核酸分子能够赋予植物对选自由以下组成的组的植
物病害的抗性：小麦秆锈病，小麦条锈病，小麦叶锈病，小麦瘟病和小麦白粉病。
34.根据权利要求33所述的核酸分子，其中所述植物是小麦。
35.根据权利要求33或34所述的核酸分子，其中所述核酸分子不是天然存在的。
36.一种表达盒，其包含权利要求33‑35中任一项所述的核酸分子和可操作连接的异源
启动子。
37.一种载体，其包含权利要求33‑35中任一项所述的核酸分子或权利要求36所述的表
达盒。
38.用权利要求33‑35中任一项所述的核酸分子、权利要求36所述的表达盒或权利要求
37所述的载体转化的宿主细胞。
39.用权利要求33‑35中任一项所述的核酸分子、权利要求36所述的表达盒或权利要求
37所述的载体转化的小麦植物、小麦种子或小麦细胞。
40.一种转基因植物或种子，其包含稳定并入其基因组中的多核苷酸构建体，所述多核
苷酸构建体包含选自由权利要求33(a)‑(d)所述的核苷酸序列组成的组的核苷酸序列。
41.一种产生对植物病害具有增强的抗性的植物的方法，所述方法包括将多核苷酸构
建体引入至少一个植物细胞中，所述多核苷酸构建体包含选自由权利要求33(a)‑(d)所述
的核苷酸序列组成的组的核苷酸序列。
42.根据权利要求41所述的方法，其中所述多核苷酸构建体稳定地并入植物细胞的基
因组中。
43.根据权利要求41或42所述的方法，其中所述多核苷酸构建体还包含可操作连接的
启动子，所述启动子用于在植物中表达核苷酸序列。
44.根据权利要求41‑43中任一项所述的方法，其中所述植物细胞再生为植物，所述植
物在其基因组中包含所述多核苷酸构建体。
45.通过权利要求41‑44中任一项所述的方法产生的植物。
46.权利要求45所述的植物的种子，其中所述种子包含所述多核苷酸构建体。
47.一种限制农作物生产中的植物病害的方法，所述方法包括种植权利要求39、40或46
中任一项所述的种子，并使植物在有利于植物生长发育的条件下生长。
48.权利要求39、40、45和46中任一项所述的植物或种子在农业中的用途。
49.使用权利要求39、40、45和46中任一项所述的植物或种子生产的人类或动物食品。
50.一种多肽，其包含选自以下的氨基酸序列：
(a)以下所示的氨基酸序列：SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、30、
32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、
82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、
124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、
162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186或188；
(b)由以下所示的核苷酸序列编码的氨基酸序列：SEQ ID NO：1、3、5、7、9、11、13、15、
17、19、21、23、25、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、
69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、
115、117、119、121、123、125、127、129、131、133、135、137、139、141、143、145、147、149、151、
153、155、157、159、161、163、165、167、169、171、173、175、177、179、181、183、185或187；和(d)与(a)中所示的至少一个全长氨基酸序列具有至少85％序列同一性的氨基酸序列，
其中所述多肽能够赋予植物对选自由以下组成的组的植物病害的抗性：小麦秆锈病，小麦
条锈病，小麦叶锈病，小麦瘟病和小麦白粉病。
51.一种制备针对至少一种感兴趣的植物有害生物的候选植物有害生物抗性(R)基因
的文库的方法，所述方法包括：
从一种或多种感兴趣的植物中的每一种在一种或多种植物的器官或其它部分中组成
性表达的核苷酸结合结构域和富含亮氨酸重复序列的基因(NLR)群体中选择高度表达的
NLR的亚群，以制备候选R基因的文库，
其中高度表达的NLR包含的在植物的器官或其它部分中的相对表达水平大于至少65％
的组成性表达的NLR在植物的器官或其它部分中的相对表达水平。
52.通过权利要求51所述的方法制备的候选R基因的文库。
53.一种转基因植物，其包含来自权利要求52所述的文库的候选R基因。
54.转基因植物集合，其中每个所述转基因植物都用来自权利要求52所述的文库的至
少一个候选R基因转化。
55.一种鉴定针对感兴趣的植物有害生物的植物有害生物抗性(R)基因的方法，所述方
法包括：
(i)通过用选自权利要求52所述的文库的候选R基因转化宿主植物来产生转化植物，其
中所述宿主植物是感兴趣的植物有害生物的宿主，
(ii)在适合病害症状或对转化的植物的其它损害发展的环境条件下，
将所述转化的植物与感兴趣的植物有害生物接触，以及
(iii)与缺乏候选R基因的对照植物相比，确定所述转化的植物是否对感兴趣的植物有
害生物变现出增强的抗性，其中当转化的植物对感兴趣的植物有害生物引起的植物病害或
其它损害表现出增强的抗性时，所述候选R基因是针对感兴趣的植物有害生物的R基因。
56.一种鉴定针对感兴趣的植物有害生物的植物有害生物抗性(R)基因的方法，所述方
法包括：
(i)在适合病害症状或其它损害发展的环境条件下，将根据权利要求53所述的转基因
植物或根据权利要求54所述的转基因植物集合与感兴趣的植物有害生物接触，其中缺乏候
选R基因的对照植物是感兴趣的植物有害生物的宿主，并且所述植物有害生物能够对宿主
植物引起病害症状或其它损害，并且
(ii)评估对转基因植物的损害，其中与缺乏候选R基因的对照植物相比，当转基因植物
对由感兴趣的植物有害生物引起的植物病害或其它损害表现出增强的抗性时，所述转基因
植物包含针对所述感兴趣的植物有害生物的R基因。
57.一种抗性植物或植物细胞，其包含通过权利要求55或56所述的方法鉴定的R基因，
其中R基因能够赋予植物对由感兴趣的植物有害生物引起的植物病害或其它损害的抗性。
58.根据权利要求57所述的抗性植物或植物细胞，其中所述R基因源自不是抗性植物物
种的不同物种。
59.根据权利要求57或58所述的抗性植物或植物细胞，其中所述抗性植物或植物细胞
的基因组包含含有R基因的异源多核苷酸构建体。
60.通过权利要求55或56所述的方法鉴定的分离的R基因。
61.用权利要求60所述的R基因转化的宿主细胞。
说明书全文

用于抗病性功能测试的植物抗病基因文库的制备方法

[0001] 对相关申请的交叉引用
[0002] 本申请要求2021年5月11日提交的第63/186986号美国临时专利申请的权益，其通过引用整体并入本文。
[0003] 作为文本文件提交的序列表的引用
[0004] 序列表的官方副本通过EFS Web以电子方式提交，作为ASCII格式的序列表文件名为070294‑0201SEQLST.TXT，创建于2022年5月9日，大小为1.88兆字节，并与规范同时提交。
此ASCII格式文档中包含的序列表是本规范的一部分，并通过引用将其整体并入本文。

技术领域

[0005] 本发明涉及植物抗病性和农作物的改良领域，特别是涉及用于鉴定感兴趣的农作物中针对植物病原体的植物抗病基因的方法。

背景技术

[0006] 植物病害导致农业产量大幅下滑。最具破坏性的病害是丝状植物病原体，最值得注意的是真菌和卵菌。这些有害生物是种植者面临的关键挑战，并造成了巨大的管理成本。
管理这些病害的最具成本效益和环境友好的方式是使用抗性基因，这些基因通常可能在农
作物的野生近缘种或甚至不相关的植物物种中找到。驯化的农作物的野生近缘种含有许多
有用的抗病(R)基因。引入这种天然抗性是管理病害的精妙方式。然而，引入R基因的传统方法典型地涉及长久育种轨迹，以避免“连锁累赘”，即与R基因同时引入有害的性状。此外，当一次部署一个基因时，R基因往往会在几个季节内被病原体克服。
[0007] 防止病原体快速克服单个R基因提供的抗性的方法是在农作物中同时部署多个针对病原体的R基因。尽管这种方法能够通过传统的植物育种方法来实现，但很可能会发现多个R基因散布在感兴趣的植物的整个基因组中，这使得将多个R基因组合到单个植物中非常
费力且耗时。此外，如果控制多种病原体对确保成功收获至关重要，则这项任务将变得更具挑战性。备选地，可以使用转基因方法将多个R基因快速部署到单个农作物中。通过常规基因工程技术，能够将多个R基因作为转基因导入单个农作物。优选地，将多个R基因作为单个多转基因盒引入，该多转基因盒作为单个基因座分离，以促进多个R基因向育种系和农作物栽培品种的快速转移。
[0008] 尽管测序技术和生物学上的见解取得了巨大进步，但R基因的传统图位克隆仍然具有挑战性；由于缺乏重组，基于图位的遗传学无法达到大片植物基因组。大多数R基因属于编码核苷酸结合结构域和富含亮氨酸重复序列(NLR)的蛋白的结构类基因。NLR(即编码
NLR蛋白的基因)倾向于位于植物基因组中的复杂簇中，并且数百个NLR集中在典型的植物
基因组中。因此，使用传统的图位克隆方法的科学家由此经常划定包含多个NLR的图位区
间，并且必须找出哪一个赋予了感兴趣的抗性。最近，已经报道了一种称为抗性基因富集测序(Resistance Gene Enrichment Sequencing，RenSeq)的新方法，该方法能够快速检查植物内的所有NLR。(Jupe等人，2013，Plant J.76(3):530‑44)。虽然RenSeq方法可以用于快速鉴定植物中的NLR序列，但RenSeq方法不允许在没有其它遗传方法的情况下鉴定特异性针
对感兴趣的植物病害的NLR基因。
[0009] 最近，MutRenSeq被开发以用于在没有其它基于图位的遗传学的情况下鉴定特异性针对感兴趣的植物病害的R基因(Steuernagel等人，2017，Methods Mol.Biol.1659:215‑
229)。虽然MutRenSeq已被证明可用于从包含对感兴趣的植物病害的抗性的植物中鉴定NLR
基因，但是该方法取决于通过诱变对感兴趣的病害具有抗性的植物来产生易感植物，然后
比较来自抗性植物和易感植物的NLR基因的核苷酸序列，以鉴定在易感植物中经修饰的NLR
基因。然而，由于产生这种易感植物可能具有挑战性，因此用于鉴定针对感兴趣的病害的R基因的新方法限制了潜在的候选R基因的数量，并且不依赖于通过诱变携带针对感兴趣的
病害的R基因的植物产生易感植物。

发明内容

[0010] 本发明提供了针对一种或多种感兴趣的植物病原体的候选植物抗病(R)基因的文库的制备方法，所述R基因尤其是编码核苷酸结合结构域和富含亮氨酸重复序列(NLR)的蛋
白的R基因。所述方法包括从一种或多种感兴趣的植物中的每一种植物中在一种或多种植
物的器官或其它部分中组成性表达的核苷酸结合结构域和富含亮氨酸重复序列基因(NLR)
的群体中选择高度表达的NLR亚群，以产生候选R基因的文库。高度表达的NLR的亚群包含在没有植物或其任何器官或其它部分与一种或多种感兴趣的植物病原体接触或以其它方式
暴露于一种或多种感兴趣的植物病原体的情况下在所述植物的器官或其它部分中组成性
高度表达的NLR。这种高度表达的NLR是这样的NLR，所述NLR包含的在植物的器官或其它部
分中的相对表达水平大于在植物的器官或其他部分中组成性表达的NLR群体中至少约65％
的NLR在植物的器官或其它部分中的相对表达水平。
[0011] 本发明进一步提供了用于鉴定能够赋予植物对感兴趣的植物病原体抗性的R基因的方法。这些方法包括将包含候选R基因的转基因植物或每个转基因植物包含候选R基因的
转基因植物集合与感兴趣的植物病原体接触。候选R基因来自如上所述产生的候选R基因的
文库。每种这样的转基因植物都能够通过用候选R基因转化宿主植物来产生。宿主植物是感兴趣的植物病原体的宿主(即易感植物)。也就是说，植物病原体能够在适当的环境条件下
在宿主植物上引起植物病害症状。这些方法进一步包括在适合在易感植物上发展病害症状
的环境条件下，将转基因植物与感兴趣的植物病原体接触或以其它方式将转基因植物暴露
于感兴趣的植物病原体，并确定与不包含候选NLR基因的对照宿主植物相比，转基因植物是否对感兴趣的植物病原体表现出增强的抗性。赋予这种转基因植物对由感兴趣的植物病原
体引起的植物病害症状的抗性的候选NLR基因被鉴定为功能性NLR基因。
[0012] 进一步提供了包含候选NLR基因的文库、包含候选NLR基因的转基因植物集合、包含根据本发明方法鉴定的一个或多个NLR基因的核酸分子以及包含一个或多个此类NLR基
因的植物、植物细胞和其它宿主细胞。
附图说明
[0013] 图1是来自大麦(Hordeum vulgare)种质(accession)Golden Promise的从头组装转录组的NLR转录本丰度的图形表示。转录本丰度是根据以每百万转录本(transcripts 
per million，TPM)测量的自比对RNAseq数据估算的。显示了针对小麦条锈病(小麦条锈菌
(Puccinia striiformis f.sp.tritici))的两个功能性抗性基因Rps6和Rps7.a(Mla8)的
表达。
[0014] 图2是来自大麦种质CI 16147的从头组装转录组的NLR转录本丰度的图形表示。转录本丰度是根据以每百万转录本(TPM)测量的自比对RNAseq数据估算的。显示了针对小麦
条锈病(小麦条锈菌)的功能抗性基因Rps7.b(Mla7)的表达。
[0015] 图3是来自大麦种质CI 16153的从头组装转录组的NLR转录本丰度的图形表示。转录本丰度是根据以每百万转录本(TPM)测量的自比对RNAseq数据估算的。显示了针对小麦
条锈病(小麦条锈菌)的功能抗性基因Rps7.b(Mla7)的表达。
[0016] 图4是来自木豆(Cajanus cajan)种质G119‑99的从头组装转录组的NLR转录本丰度的图形表示。转录本丰度是根据以每百万转录本(TPM)测量的自比对RNAseq数据估算的。
显示了针对亚洲大豆锈病(大豆锈病菌(Phakopsora pachyrhizi))的功能性抗性基因Rpp1
的表达。
[0017] 图5是来自拟南芥(Arabidopsis thaliana)种质Col‑0的从头组装转录组的NLR的转录本丰度的图形表示。转录本丰度是根据以每百万转录本(TPM)测量的自比对RNAseq数
据估算的。显示了以下功能抗性基因的表达：针对拟南芥霜霉病(拟南芥霜霉菌
(Hyaloperonospora arabidopsidis))的RPP1、RPP4、RPP5、RPP7和RPP8，针对白锈病(白锈菌(Albugo candida))的WRR4和针对丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae)的ZAR1。
[0018] 图6是来自山羊草(Aegilops tauschii)种质KU2025的从头组装的转录组的NLR转录本丰度的图形表示。转录本丰度是根据以每百万转录本(TPM)测量的自比对RNAseq数据
估算的。显示了针对小麦秆锈病(小麦秆锈菌(Puccinia graminis f.sp.tritici))的功能
抗性基因Sr46的表达。
[0019] 图7是来自山羊草种质KU2075的从头组装的转录组的NLR转录本丰度的图形表示。转录本丰度是根据以每百万转录本(TPM)测量的自比对RNAseq数据估算的。显示了针对小
麦秆锈病(小麦秆锈菌)的功能抗性基因Sr46的表达。
[0020] 图8是来自山羊草种质KU2078的从头组装的转录组的NLR转录本丰度的图形表示。转录本丰度是根据以每百万转录本(TPM)测量的自比对RNAseq数据估算的。显示了针对小
麦秆锈病(小麦秆锈菌)的功能抗性基因Sr46和SrTA1662的表达。
[0021] 图9是来自山羊草种质KU2093的从头组装的转录组的NLR转录本丰度的图形表示。转录本丰度是根据以每百万转录本(TPM)测量的自比对RNAseq数据估算的。显示了针对小
麦秆锈病(小麦秆锈菌)的功能抗性基因Sr46的表达。
[0022] 图10是来自山羊草种质KU2124的从头组装的转录组的NLR转录本丰度的图形表示。转录本丰度是根据以每百万转录本(TPM)测量的自比对RNAseq数据估算的。显示了针对小麦秆锈病(小麦秆锈菌)的功能抗性基因Sr45的表达。
[0023] 图11是来自山羊草种质PI 499262的从头组装的转录组的NLR转录本丰度的图形表示。转录本丰度是根据以每百万转录本(TPM)测量的自比对RNAseq数据估算的。显示了针对小麦秆锈病(小麦秆锈菌)的功能抗性基因Sr46的表达。
[0024] 图12是来自拟南芥种质Ler‑0幼苗的从头组装的转录组的NLR的转录本丰度的图形表示。转录本丰度是根据以每百万转录本(TPM)测量的自比对RNAseq数据估算的。显示了以下功能性抗性基因的表达：针对晚疫病(拟南芥霜霉菌)的RPP1、RPP5、RPP7和RPP8以及针对白锈病(白锈菌)的WRR4、WRR8和WRR9。
[0025] 图13是来自拟南芥种质Sf‑2幼苗的从头组装的转录组的NLR的转录本丰度的图形表示。转录本丰度是根据以每百万转录本(TPM)测量的自比对RNAseq数据估算的。显示了以下功能性抗性基因的表达：针对晚疫病(拟南芥霜霉菌)的RPP1、RPP5、RPP7和RPP8，针对白锈病(白锈菌)的WRR8和WRR9，以及针对灰霉病(灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea))、甘蓝黑
叶斑(甘蓝链格孢(Alternaria brassicicola))和十字花科黑斑(芸薹链格孢(Alternaria 
brassicae))的RLM3的等位基因。
[0026] 图14是来自拟南芥种质Ws‑0幼苗的从头组装的转录组的NLR的转录本丰度的图形表示。转录本丰度是根据以每百万转录本(TPM)测量的自比对RNAseq数据估算的。显示了以下功能性抗性基因的表达：针对晚疫病(拟南芥霜霉菌)的RPP1、RPP5、RPP7和RPP8，针对白锈病(白锈菌)的WRR8和WRR9以及针对灰霉病(灰葡萄孢菌)、卷心菜黑叶斑(甘蓝链格孢)和
十字花科黑斑(芸薹链格孢)的RLM3的等位基因。
[0027] 图15是来自少花龙葵(Solanum americanum)种质2273的从头组装的转录组的NLR转录本丰度的图形表示。转录本丰度是根据以每百万转录本(TPM)测量的自比对RNAseq数
据估算的。显示了针对晚疫病(致病疫霉(Phytophthora infestans))的功能性抗性基因
Rpi‑amr1e的表达。
[0028] 图16是来自番茄(Solanum lycopersicum)Motelle栽培品种的叶组织的从头组装的转录组的NLR转录本丰度的图形表示。转录本丰度是根据以每百万转录本(TPM)测量的自
比对RNAseq数据估算的。显示了针对根结线虫(Meloidogyne spp.)、马铃薯蚜(大戟长管蚜(Macrosiphum euphorbiae))和甘薯粉虱(烟粉虱(Bemisia tabaci))的功能抗性基因Mi‑
1.2的表达。
[0029] 图17是来自番茄栽培品种Motelle的根组织的从头组装的转录组的NLR转录本丰度的图形表示。转录本丰度是根据以每百万转录本(TPM)测量的自比对RNAseq数据估算的。
显示了针对根结线虫(Meloidogyne spp.)、马铃薯蚜虫(大戟长管蚜)和甘薯粉虱(烟粉虱)
的功能抗性基因Mi‑1.2的表达。
[0030] 图18是来自番茄栽培品种VFNT Cherry的叶组织的从头组装的转录组的NLR转录本丰度的图形表示。转录本丰度是根据以每百万转录本(TPM)测量的自比对RNAseq数据估
算的。显示了针对烟草病毒(包含番茄花叶病毒(ToMV)和烟草花叶病毒(TMV))的功能性抗
性基因Tm‑2的表达，以及针对根结线虫(Meloidogyne spp.)、马铃薯蚜虫(大戟长管蚜)和甘薯粉虱(烟粉虱)的功能性抗性基因Mi‑1.2的表达。
[0031] 图19是来自番茄栽培品种VFNT Cherry的根组织的从头组装的转录组的NLR转录本丰度的图形表示。转录本丰度是根据以每百万转录本(TPM)测量的自比对RNAseq数据估
算的。显示了针对烟草病毒(包含番茄花叶病毒(ToMV)和烟草花叶病毒(TMV))的功能性抗
性基因Tm‑2的表达，以及针对根结线虫(Meloidogyne spp.)、马铃薯蚜虫(大戟长管蚜)和甘薯粉虱(烟粉虱)的功能性抗性基因Mi‑1.2的表达。
[0032] 序列表
[0033] 随附序列表中列出的核苷酸和氨基酸序列使用核苷酸碱基的标准字母缩写和氨基酸的三字母代码显示。核苷酸序列遵循从序列的5'端开始并向前(即每行从左到右)到3'
端的标准惯例。每个核苷酸序列仅显示一条链，但互补链被理解为包含在对所显示链的任
何引用中。氨基酸序列遵循从序列的氨基端开始并向前(即每行从左到右)到羧基端的标准
惯例。
[0034] SEQ ID NO:1列出了Dk_04_40(一种来自高大山羊草(Aegilops longissima)的NLR)的cDNA编码区的核苷酸序列。如果需要，终止密码子(例如TAA、TAG或TGA)可以可操作地连接到包含或由SEQ ID NO:1组成的核酸分子的3'端。该cDNA的天然终止密码子是TAA。
[0035] SEQ ID NO:2列出了由Dk_04_40(SEQ ID NO:1)编码的NLR蛋白的氨基酸序列。
[0036] SEQ ID NO:3列出了Dk_01_03(一种来自沙融山羊草(Aegilops sharonensis)的NLR)的cDNA编码区的核苷酸序列。如果需要，终止密码子(例如TAA、TAG或TGA)可以可操作地连接到包含或由序列SEQ ID NO:3组成的核酸分子的3'端。该cDNA的天然终止密码子是
TGA。
[0037] SEQ ID NO:4列出了由Dk_01_03(SEQ ID NO:3)编码的NLR蛋白的氨基酸序列。
[0038] SEQ ID NO:5列出了Dk_01_04(一种来自沙融山羊草的NLR)的cDNA编码区的核苷酸序列。如果需要，终止密码子(例如TAA、TAG或TGA)可以可操作地连接到包含或由SEQ ID NO:5组成的核酸分子的3'端。该cDNA的天然终止密码子是TGA。
[0039] SEQ ID NO:6列出了由Dk_01_04(SEQ ID NO:5)编码的NLR蛋白的氨基酸序列。
[0040] SEQ ID NO:7列出了Dk_01_06(一种来自沙融山羊草的NLR)的cDNA编码区的核苷酸序列。如果需要，终止密码子(例如TAA、TAG或TGA)可以可操作地连接到包含或由SEQ ID NO:7组成的核酸分子的3'末端。该cDNA的天然终止密码子是TAG。
[0041] SEQ ID NO:8列出了由Dk_01_06(SEQ ID NO:7)编码的NLR蛋白的氨基酸序列。
[0042] SEQ ID NO:9列出了Dk_01_31(一种来自沙融山羊草的NLR)的cDNA编码区的核苷酸序列。如果需要，终止密码子(例如TAA、TAG或TGA)可以可操作地连接到包含或由SEQ ID NO:9组成的核酸分子的3'端。该cDNA的天然终止密码子是TAA。
[0043] SEQ ID NO:10列出了由Dk_01_31(SEQ ID NO:9)编码的NLR蛋白的氨基酸序列。
[0044] SEQ ID NO:11列出了Dk_01_33(一种来自沙融山羊草的NLR)的cDNA编码区的核苷酸序列。如果需要，终止密码子(例如TAA、TAG或TGA)可以可操作地连接到包含或由SEQ ID NO:11组成的核酸分子的3'端。该cDNA的天然终止密码子是TGA。
[0045] SEQ ID NO:12列出了由Dk_01_33(SEQ ID NO:11)编码的NLR蛋白的氨基酸序列。
[0046] SEQ ID NO:13列出了Dk_01_34(一种来自沙融山羊草的NLR)的cDNA编码区的核苷酸序列。如果需要，终止密码子(例如TAA、TAG或TGA)可以可操作地连接到包含或由SEQ ID NO:13组成的核酸分子的3'端。该cDNA的天然终止密码子是TGA。
[0047] SEQ ID NO:14列出了由Dk_01_34(SEQ ID NO:13)编码的NLR蛋白的氨基酸序列。
[0048] SEQ ID NO:15列出了Dk_01_92(一种来自绒毛草(Holcus lanatus)的NLR)的cDNA编码区的核苷酸序列。如果需要，终止密码子(例如TAA、TAG或TGA)可以可操作地连接到包含或由SEQ ID NO:15组成的核酸分子的3'端。该cDNA的天然终止密码子是TAG。
[0049] SEQ ID NO:16列出了由Dk_01_92(SEQ ID NO:15)编码的NLR蛋白的氨基酸序列。
[0050] SEQ ID NO:17列出了Dk_02_27(一种来自 草(Koeleria macrantha)的NLR)的cDNA编码区的核苷酸序列。如果需要，终止密码子(例如TAA、TAG或TGA)可以可操作地连接到包含或由SEQ ID NO:17组成的核酸分子的3'端。该cDNA的天然终止密码子是TAA。
[0051] SEQ ID NO:18列出了由Dk_02_27(SEQ ID NO:17)编码的NLR蛋白的氨基酸序列。
[0052] SEQ ID NO:19列出了Dk_02_28(一种来自 草的NLR)的cDNA编码区的核苷酸序列。如果需要，终止密码子(例如TAA、TAG或TGA)可以可操作地连接到包含或由SEQ ID NO:
19组成的核酸分子的3'端。该cDNA的天然终止密码子是TAG。
[0053] SEQ ID NO:20列出了由Dk_02_28(SEQ ID NO:19)编码的NLR蛋白的氨基酸序列。
[0054] SEQ ID NO:21列出了Dk_02_49(一种来自 草的NLR)的cDNA编码区的核苷酸序列。如果需要，终止密码子(例如TAA、TAG或TGA)可以可操作地连接到包含或由SEQ ID NO:
21组成的核酸分子的3'端。该cDNA的天然终止密码子是TAA。
[0055] SEQ ID NO:22列出了由Dk_02_49(SEQ ID NO:21)编码的NLR蛋白的氨基酸序列。
[0056] SEQ ID NO:23列出了Dk_03_76(一种来自 草的NLR)的cDNA编码区的核苷酸序列。如果需要，终止密码子(例如TAA、TAG或TGA)可以可操作地连接到包含或由SEQ ID NO:
23组成的核酸分子的3'端。该cDNA的天然终止密码子是TGA。
[0057] SEQ ID NO:24列出了由Dk_03_76(SEQ ID NO:23)编码的NLR蛋白的氨基酸序列。
[0058] SEQ ID NO:25列出了Dk_01_19(一种来自沙融山羊草的NLR)的cDNA编码区的核苷酸序列。如果需要，终止密码子(例如TAA、TAG或TGA)可以可操作地连接到包含或由SEQ ID NO:25组成的核酸分子的3'端。该cDNA的天然终止密码子是TGA。
[0059] SEQ ID NO:26列出了由Dk_01_19(SEQ ID NO:25)编码的NLR蛋白的氨基酸序列。
[0060] SEQ ID NO:27列出了Gateway接头attB1的核苷酸序列。
[0061] SEQ ID NO:28列出了Gateway接头attB2的核苷酸序列。
[0062] SEQ ID NO:29列出了Dk_01_35(一种来自沙融山羊草的NLR)的cDNA编码区的核苷酸序列。如果需要，终止密码子(例如TAA、TAG或TGA)可以可操作地连接到包含或由该NLR序列组成的核酸分子的3'端。该cDNA的天然终止密码子是TGA。
[0063] SEQ ID NO:30列出了由SEQ ID NO:29编码的NLR蛋白的氨基酸序列。
[0064] SEQ ID NO:31列出了Dk_01_55(一种来自沙融山羊草的NLR)的cDNA编码区的核苷酸序列。如果需要，终止密码子(例如TAA、TAG或TGA)可以可操作地连接到包含或由该NLR序列组成的核酸分子的3'端。该cDNA的天然终止密码子是TGA。
[0065] SEQ ID NO:32列出了由SEQ ID NO:31编码的NLR蛋白的氨基酸序列。
[0066] SEQ ID NO:33列出了Dk_01_57(一种来自沙融山羊草的NLR)的cDNA编码区的核苷酸序列。如果需要，终止密码子(例如TAA、TAG或TGA)可以可操作地连接到包含或由该NLR序列组成的核酸分子的3'端。该cDNA的天然终止密码子是TGA。
[0067] SEQ ID NO:34列出了由SEQ ID NO:33编码的NLR蛋白的氨基酸序列。
[0068] SEQ ID NO:35列出了Dk_01_59(一种来自沙融山羊草的NLR)的cDNA编码区的核苷酸序列。如果需要，终止密码子(例如TAA、TAG或TGA)可以可操作地连接到包含或由该NLR序列组成的核酸分子的3'端。该cDNA的天然终止密码子是TAA。
[0069] SEQ ID NO:36列出了由SEQ ID NO:35编码的NLR蛋白的氨基酸序列。
[0070] SEQ ID NO:37列出了Dk_01_60(一种来自沙融山羊草的NLR)的cDNA编码区的核苷酸序列。如果需要，终止密码子(例如TAA、TAG或TGA)可以可操作地连接到包含或由该NLR序列组成的核酸分子的3'端。该cDNA的天然终止密码子是TAG。
[0071] SEQ ID NO:38列出了SEQ ID NO:37编码的NLR蛋白的氨基酸序列。
[0072] SEQ ID NO:39列出了Dk_01_61(一种来自洋狗尾草(Cynosurus cristatus)的NLR)的cDNA编码区的核苷酸序列。如果需要，终止密码子(例如TAA、TAG或TGA)可以可操作地连接到包含或由该NLR序列组成的核酸分子的3'端。该cDNA的天然终止密码子是TAA。
[0073] SEQ ID NO:40列出了由SEQ ID NO:39编码的NLR蛋白的氨基酸序列。
[0074] SEQ ID NO:41列出了Dk_01_62(一种来自洋狗尾草的NLR)的cDNA编码区的核苷酸序列。如果需要，终止密码子(例如TAA、TAG或TGA)可以可操作地连接到包含或由该NLR序列组成的核酸分子的3'端。该cDNA的天然终止密码子是TGA。
[0075] SEQ ID NO:42列出了由SEQ ID NO:41编码的NLR蛋白的氨基酸序列。
[0076] SEQ ID NO:43列出了Dk_01_64(一种来自洋狗尾草的NLR)的cDNA编码区的核苷酸序列。如果需要，终止密码子(例如TAA、TAG或TGA)可以可操作地连接到包含或由该NLR序列组成的核酸分子的3'端。该cDNA的天然终止密码子是TGA。
[0077] SEQ ID NO:44列出了由SEQ ID NO:43编码的NLR蛋白的氨基酸序列。
[0078] SEQ ID NO:45列出了Dk_01_68(一种来自洋狗尾草的NLR)的cDNA编码区的核苷酸序列。如果需要，终止密码子(例如TAA、TAG或TGA)可以可操作地连接到包含或由该NLR序列组成的核酸分子的3'端。该cDNA的天然终止密码子是TGA。
[0079] SEQ ID NO:46列出了由SEQ ID NO:45编码的NLR蛋白的氨基酸序列。
[0080] SEQ ID NO:47列出了Dk_02_02(一种来自 草的NLR)的cDNA编码区的核苷酸序列。如果需要，终止密码子(例如TAA、TAG或TGA)可以可操作地连接到包含或由该NLR序列组成的核酸分子的3'端。该cDNA的天然终止密码子是TAG。
[0081] SEQ ID NO:48列出了由SEQ ID NO:47编码的NLR蛋白的氨基酸序列。
[0082] SEQ ID NO:49列出了Dk_02_03(一种来自 草的NLR)的cDNA编码区的核苷酸序列。如果需要，终止密码子(例如TAA、TAG或TGA)可以可操作地连接到包含或由该NLR序列组成的核酸分子的3'端。该cDNA的天然终止密码子是TAA。
[0083] SEQ ID NO:50列出了由SEQ ID NO:49编码的NLR蛋白的氨基酸序列。
[0084] SEQ ID NO:51列出了Dk_02_06(一种来自 草的NLR)的cDNA编码区的核苷酸序列。如果需要，终止密码子(例如TAA、TAG或TGA)可以可操作地连接到包含或由该NLR序列组成的核酸分子的3'端。该cDNA的天然终止密码子是TAG。
[0085] SEQ ID NO:52列出了由SEQ ID NO:51编码的NLR蛋白的氨基酸序列。
[0086] SEQ ID NO:53列出了Dk_02_07(一种来自 草的NLR)的cDNA编码区的核苷酸序列。如果需要，终止密码子(例如TAA、TAG或TGA)可以可操作地连接到包含或由该NLR序列组成的核酸分子的3'端。该cDNA的天然终止密码子是TAA。
[0087] SEQ ID NO:54列出了由SEQ ID NO:53编码的NLR蛋白的氨基酸序列。
[0088] SEQ ID NO:55列出了Dk_02_08(一种来自 草的NLR)的cDNA编码区的核苷酸序列。如果需要，终止密码子(例如TAA、TAG或TGA)可以可操作地连接到包含或由该NLR序列组成的核酸分子的3'端。该cDNA的天然终止密码子是TAG。
[0089] SEQ ID NO:56列出了由SEQ ID NO:55编码的NLR蛋白的氨基酸序列。
[0090] SEQ ID NO:57列出了Dk_02_11(一种来自 草的NLR)的cDNA编码区的核苷酸序列。如果需要，终止密码子(例如TAA、TAG或TGA)可以可操作地连接到包含或由该NLR序列组成的核酸分子的3'端。该cDNA的天然终止密码子是TAA。
[0091] SEQ ID NO:58列出了由SEQ ID NO:57编码的NLR蛋白的氨基酸序列。
[0092] SEQ ID NO:59列出了Dk_02_13(一种来自 草的NLR)的cDNA编码区的核苷酸序列。如果需要，终止密码子(例如TAA、TAG或TGA)可以可操作地连接到包含或由该NLR序列组成的核酸分子的3'端。该cDNA的天然终止密码子是TGA。
[0093] SEQ ID NO:60列出了由SEQ ID NO:59编码的NLR蛋白的氨基酸序列。
[0094] SEQ ID NO:61列出了Dk_02_14(一种来自 草的NLR)的cDNA编码区的核苷酸序列。如果需要，终止密码子(例如TAA、TAG或TGA)可以可操作地连接到包含或由该NLR序列组成的核酸分子的3'端。该cDNA的天然终止密码子是TGA。
[0095] SEQ ID NO:62列出了由SEQ ID NO:61编码的NLR蛋白的氨基酸序列。
[0096] SEQ ID NO:63列出了Dk_02_19(一种来自 草的NLR)的cDNA编码区的核苷酸序列。如果需要，终止密码子(例如TAA、TAG或TGA)可以可操作地连接到包含或由该NLR序列组成的核酸分子的3'端。该cDNA的天然终止密码子是TAG。
[0097] SEQ ID NO:64列出了由SEQ ID NO:63编码的NLR蛋白的氨基酸序列。
[0098] SEQ ID NO:65列出了Dk_02_20(一种来自 草的NLR)的cDNA编码区的核苷酸序列。如果需要，终止密码子(例如TAA、TAG或TGA)可以可操作地连接到包含或由该NLR序列组成的核酸分子的3'端。该cDNA的天然终止密码子是TGA。
[0099] SEQ ID NO:66列出了由SEQ ID NO:65编码的NLR蛋白的氨基酸序列。
[0100] SEQ ID NO:67列出了Dk_02_25(一种来自 草的NLR)的cDNA编码区的核苷酸序列。如果需要，终止密码子(例如TAA、TAG或TGA)可以可操作地连接到包含或由该NLR序列组成的核酸分子的3'端。该cDNA的天然终止密码子是TGA。
[0101] SEQ ID NO:68列出了由SEQ ID NO:67编码的NLR蛋白的氨基酸序列。
[0102] SEQ ID NO:69列出了Dk_02_34(一种来自 草的NLR)的cDNA编码区的核苷酸序列。如果需要，终止密码子(例如TAA、TAG或TGA)可以可操作地连接到包含或由该NLR序列组成的核酸分子的3'端。该cDNA的天然终止密码子是TAG。
[0103] SEQ ID NO:70列出了由SEQ ID NO:69编码的NLR蛋白的氨基酸序列。
[0104] SEQ ID NO:71列出了Dk_02_35(一种来自 草的NLR)的cDNA编码区的核苷酸序列。如果需要，终止密码子(例如TAA、TAG或TGA)可以可操作地连接到包含或由该NLR序列组成的核酸分子的3'端。该cDNA的天然终止密码子是TGA。
[0105] SEQ ID NO:72列出了由SEQ ID NO:71编码的NLR蛋白的氨基酸序列。
[0106] SEQ ID NO:73列出了Dk_02_36(一种来自 草的NLR)的cDNA编码区的核苷酸序列。如果需要，终止密码子(例如TAA、TAG或TGA)可以可操作地连接到包含或由该NLR序列组成的核酸分子的3'端。该cDNA的天然终止密码子是TAA。
[0107] SEQ ID NO:74列出了由SEQ ID NO:73编码的NLR蛋白的氨基酸序列。
[0108] SEQ ID NO:75列出了Dk_02_38(一种来自 草的NLR)的cDNA编码区的核苷酸序列。如果需要，终止密码子(例如TAA、TAG或TGA)可以可操作地连接到包含或由该NLR序列组成的核酸分子的3'端。该cDNA的天然终止密码子是TGA，
[0109] SEQ ID NO:76列出了由SEQ ID NO:75编码的NLR蛋白的氨基酸序列。
[0110] SEQ ID NO:77列出了Dk_02_39(一种来自 草的NLR)的cDNA编码区的核苷酸序列。如果需要，终止密码子(例如TAA、TAG或TGA)可以可操作地连接到包含或由该NLR序列组成的核酸分子的3'端。该cDNA的天然终止密码子是TAA。
[0111] SEQ ID NO:78列出了由SEQ ID NO:77编码的NLR蛋白的氨基酸序列。
[0112] SEQ ID NO:79列出了Dk_02_42(一种来自的NLR)的cDNA编码区的核苷酸序列。如果需要，终止密码子(例如TAA、TAG或TGA)可以可操作地连接到包含或由该NLR序列组成的
核酸分子的3'端。该cDNA的天然终止密码子是TGA。
[0113] SEQ ID NO:80列出了由SEQ ID NO:79编码的NLR蛋白的氨基酸序列。
[0114] SEQ ID NO:81列出了Dk_02_44(一种来自 草的NLR)的cDNA编码区的核苷酸序列。如果需要，终止密码子(例如TAA、TAG或TGA)可以可操作地连接到包含或由该NLR序列组成的核酸分子的3'端。该cDNA的天然终止密码子是TAA。
[0115] SEQ ID NO:82列出了由SEQ ID NO:81编码的NLR蛋白的氨基酸序列。
[0116] SEQ ID NO:83列出了Dk_02_46(一种来自 草的NLR)的cDNA编码区的核苷酸序列。如果需要，终止密码子(例如TAA、TAG或TGA)可以可操作地连接到包含或由该NLR序列组成的核酸分子的3'端。该cDNA的天然终止密码子是TGA。
[0117] SEQ ID NO:84列出了由SEQ ID NO:83编码的NLR蛋白的氨基酸序列。
[0118] SEQ ID NO:85列出了Dk_03_13(一种来自洋狗尾草的NLR)的cDNA编码区的核苷酸序列。如果需要，终止密码子(例如TAA、TAG或TGA)可以可操作地连接到包含或由该NLR序列组成的核酸分子的3'端。该cDNA的天然终止密码子是TGA。
[0119] SEQ ID NO:86列出了由SEQ ID NO:85编码的NLR蛋白的氨基酸序列。
[0120] SEQ ID NO:87列出了Dk_03_16(一种来自洋狗尾草的NLR)的cDNA编码区的核苷酸序列。如果需要，终止密码子(例如TAA、TAG或TGA)可以可操作地连接到包含或由该NLR序列组成的核酸分子的3'端。该cDNA的天然终止密码子是TAA。
[0121] SEQ ID NO:88列出了由SEQ ID NO:87编码的NLR蛋白的氨基酸序列。
[0122] SEQ ID NO:89列出了Dk_03_19(一种来自洋狗尾草的NLR)的cDNA编码区的核苷酸序列。如果需要，终止密码子(例如TAA、TAG或TGA)可以可操作地连接到包含或由该NLR序列组成的核酸分子的3'端。该cDNA的天然终止密码子是TAG。
[0123] SEQ ID NO:90列出了由SEQ ID NO:89编码的NLR蛋白的氨基酸序列。
[0124] SEQ ID NO:91列出了Dk_03_48(一种来自绒毛草的NLR)的cDNA编码区的核苷酸序列。如果需要，终止密码子(例如TAA、TAG或TGA)可以可操作地连接到包含或由该NLR序列组成的核酸分子的3'端。该cDNA的天然终止密码子是TAA。
[0125] SEQ ID NO:92列出了由SEQ ID NO:91编码的NLR蛋白的氨基酸序列。
[0126] SEQ ID NO:93列出了Dk_03_58(一种来自 草的NLR)的cDNA编码区的核苷酸序列。如果需要，终止密码子(例如TAA、TAG或TGA)可以可操作地连接到包含或由该NLR序列组成的核酸分子的3'端。该cDNA的天然终止密码子是TAA。
[0127] SEQ ID NO:94列出了由SEQ ID NO:93编码的NLR蛋白的氨基酸序列。
[0128] SEQ ID NO:95列出了Dk_03_60(一种来自 草的NLR)的cDNA编码区的核苷酸序列。如果需要，终止密码子(例如TAA、TAG或TGA)可以可操作地连接到包含或由该NLR序列组成的核酸分子的3'端。该cDNA的天然终止密码子是TGA。
[0129] SEQ ID NO:96列出了由SEQ ID NO:95编码的NLR蛋白的氨基酸序列。
[0130] SEQ ID NO:97列出了Dk_04_34(一种来自大麦的NLR)的cDNA编码区的核苷酸序列。如果需要，终止密码子(例如TAA、TAG或TGA)可以可操作地连接到包含或由该NLR序列组成的核酸分子的3'端。该cDNA的天然终止密码子是TAG。
[0131] SEQ ID NO:98列出了由SEQ ID NO:97编码的NLR蛋白的氨基酸序列。
[0132] SEQ ID NO:99列出了Dk_04_44(一种来自双角山羊草(Aegilops bicornis)的NLR)的cDNA编码区的核苷酸序列。如果需要，终止密码子(例如TAA、TAG或TGA)可以可操作地连接到包含或由该NLR序列组成的核酸分子的3'端。该cDNA的天然终止密码子是TGA。
[0133] SEQ ID NO:100列出了由SEQ ID NO:99编码的NLR蛋白的氨基酸序列。
[0134] SEQ ID NO:101列出了Dk_04_85(一种来自双角山羊草的NLR)的cDNA编码区的核苷酸序列。如果需要，终止密码子(例如TAA、TAG或TGA)可以可操作地连接到包含或由该NLR序列组成的核酸分子的3'端。该cDNA的天然终止密码子是TAA。
[0135] SEQ ID NO:102列出了由SEQ ID NO:101编码的NLR蛋白的氨基酸序列。
[0136] SEQ ID NO:103列出了Dk_04_88(一种来自双角山羊草的NLR)的cDNA编码区的核苷酸序列。如果需要，终止密码子(例如TAA、TAG或TGA)可以可操作地连接到包含或由该NLR序列组成的核酸分子的3'端。该cDNA的天然终止密码子是TGA。
[0137] SEQ ID NO:104列出了由SEQ ID NO:103编码的NLR蛋白的氨基酸序列。
[0138] SEQ ID NO:105列出了Dk_04_92(一种来自双角山羊草的NLR)的cDNA编码区的核苷酸序列。如果需要，终止密码子(例如TAA、TAG或TGA)可以可操作地连接到包含或由该NLR序列组成的核酸分子的3'端。该cDNA的天然终止密码子是TGA。
[0139] SEQ ID NO:106列出了由SEQ ID NO:105编码的NLR蛋白的氨基酸序列。
[0140] SEQ ID NO:107列出了Dk_04_95(一种来自双角山羊草的NLR)的cDNA编码区的核苷酸序列。如果需要，终止密码子(例如TAA、TAG或TGA)可以可操作地连接到包含或由该NLR序列组成的核酸分子的3'端。该cDNA的天然终止密码子是TAA。
[0141] SEQ ID NO:108列出了由SEQ ID NO:107编码的NLR蛋白的氨基酸序列。
[0142] SEQ ID NO:109列出了Dk_04_96(一种来自双角山羊草的NLR)的cDNA编码区的核苷酸序列。如果需要，终止密码子(例如TAA、TAG或TGA)可以可操作地连接到包含或由该NLR序列组成的核酸分子的3'端。该cDNA的天然终止密码子是TGA。
[0143] SEQ ID NO:110列出了由SEQ ID NO:109编码的NLR蛋白的氨基酸序列。
[0144] SEQ ID NO:111列出了Dk_05_11(一种来自高大山羊草的NLR)的cDNA编码区的核苷酸序列。如果需要，终止密码子(例如TAA、TAG或TGA)可以可操作地连接到包含或由该NLR序列组成的核酸分子的3'端。该cDNA的天然终止密码子是TGA。
[0145] SEQ ID NO:112列出了由SEQ ID NO:111编码的NLR蛋白的氨基酸序列。
[0146] SEQ ID NO:113列出了Dk_05_14(一种来自高大山羊草的NLR)的cDNA编码区的核苷酸序列。如果需要，终止密码子(例如TAA、TAG或TGA)可以可操作地连接到包含或由该NLR序列组成的核酸分子的3'端。该cDNA的天然终止密码子是TAA。
[0147] SEQ ID NO:114列出了由SEQ ID NO:113编码的NLR蛋白的氨基酸序列。
[0148] SEQ ID NO:115列出了Dk_05_15(一种来自高大山羊草的NLR)的cDNA编码区的核苷酸序列。如果需要，终止密码子(例如TAA、TAG或TGA)可以可操作地连接到包含或由该NLR序列组成的核酸分子的3'端。该cDNA的天然终止密码子是TGA。
[0149] SEQ ID NO:116列出了由SEQ ID NO:115编码的NLR蛋白的氨基酸序列。
[0150] SEQ ID NO:117列出了Dk_05_16(一种来自高大山羊草的NLR)的cDNA编码区的核苷酸序列。如果需要，终止密码子(例如TAA、TAG或TGA)可以可操作地连接到包含或由该NLR序列组成的核酸分子的3'端。该cDNA的天然终止密码子是TGA。
[0151] SEQ ID NO:118列出了由SEQ ID NO:117编码的NLR蛋白的氨基酸序列。
[0152] SEQ ID NO:119列出了Dk_05_24(一种来自高大山羊草的NLR)的cDNA编码区的核苷酸序列。如果需要，终止密码子(例如TAA、TAG或TGA)可以可操作地连接到包含或由该NLR序列组成的核酸分子的3'端。该cDNA的天然终止密码子是TAA。
[0153] SEQ ID NO:120列出了由SEQ ID NO:119编码的NLR蛋白的氨基酸序列。
[0154] SEQ ID NO:121列出了Dk_05_29(一种来自高大山羊草的NLR)的cDNA编码区的核苷酸序列。如果需要，终止密码子(例如TAA、TAG或TGA)可以可操作地连接到包含或由该NLR序列组成的核酸分子的3'端。该cDNA的天然终止密码子是TAA。
[0155] SEQ ID NO:122列出了由SEQ ID NO:121编码的NLR蛋白的氨基酸序列。
[0156] SEQ ID NO:123列出了Dk_05_30(一种来自高大山羊草的NLR)的cDNA编码区的核苷酸序列。如果需要，终止密码子(例如TAA、TAG或TGA)可以可操作地连接到包含或由该NLR序列组成的核酸分子的3'端。该cDNA的天然终止密码子是TGA。
[0157] SEQ ID NO:124列出了由SEQ ID NO:123编码的NLR蛋白的氨基酸序列。
[0158] SEQ ID NO:125列出了Dk_05_33(一种来自高大山羊草的NLR)的cDNA编码区的核苷酸序列。如果需要，终止密码子(例如TAA、TAG或TGA)可以可操作地连接到包含或由该NLR序列组成的核酸分子的3'端。该cDNA的天然终止密码子是TAG。
[0159] SEQ ID NO:126列出了由SEQ ID NO:125编码的NLR蛋白的氨基酸序列。
[0160] SEQ ID NO:127列出了Dk_05_34(一种来自高大山羊草的NLR)的cDNA编码区的核苷酸序列。如果需要，终止密码子(例如TAA、TAG或TGA)可以可操作地连接到包含或由该NLR序列组成的核酸分子的3'端。该cDNA的天然终止密码子是TAG。
[0161] SEQ ID NO:128列出了由SEQ ID NO:127编码的NLR蛋白的氨基酸序列。
[0162] SEQ ID NO:129列出了Dk_05_35(一种来自高大山羊草的NLR)的cDNA编码区的核苷酸序列。如果需要，终止密码子(例如TAA、TAG或TGA)可以可操作地连接到包含或由该NLR序列组成的核酸分子的3'端。该cDNA的天然终止密码子是TAA。
[0163] SEQ ID NO:130列出了由SEQ ID NO:129编码的NLR蛋白的氨基酸序列。
[0164] SEQ ID NO:131列出了Dk_05_38(一种来自高大山羊草的NLR)的cDNA编码区的核苷酸序列。如果需要，终止密码子(例如TAA、TAG或TGA)可以可操作地连接到包含或由该NLR序列组成的核酸分子的3'端。该cDNA的天然终止密码子是TGA。
[0165] SEQ ID NO:132列出了由SEQ ID NO:131编码的NLR蛋白的氨基酸序列。
[0166] SEQ ID NO:133列出了Dk_05_42(一种来自高大山羊草的NLR)的cDNA编码区的核苷酸序列。如果需要，终止密码子(例如TAA、TAG或TGA)可以可操作地连接到包含或由该NLR序列组成的核酸分子的3'端。该cDNA的天然终止密码子是TGA。
[0167] SEQ ID NO:134列出了由SEQ ID NO:133编码的NLR蛋白的氨基酸序列。
[0168] SEQ ID NO:135列出了Dk_05_44(一种来自高大山羊草的NLR)的cDNA编码区的核苷酸序列。如果需要，终止密码子(例如TAA、TAG或TGA)可以可操作地连接到包含或由该NLR序列组成的核酸分子的3'端。该cDNA的天然终止密码子是TAA。
[0169] SEQ ID NO:136列出了由SEQ ID NO:135编码的NLR蛋白的氨基酸序列。
[0170] SEQ ID NO:137列出了Dk_05_47(一种来自高大山羊草的NLR)的cDNA编码区的核苷酸序列。如果需要，终止密码子(例如TAA、TAG或TGA)可以可操作地连接到包含或由该NLR序列组成的核酸分子的3'端。该cDNA的天然终止密码子是TGA。
[0171] SEQ ID NO:138列出了由SEQ ID NO:137编码的NLR蛋白的氨基酸序列。
[0172] SEQ ID NO:139列出了Dk_05_53(一种来自高大山羊草的NLR)的cDNA编码区的核苷酸序列。如果需要，终止密码子(例如TAA、TAG或TGA)可以可操作地连接到包含或由该NLR序列组成的核酸分子的3'端。该cDNA的天然终止密码子是TAA。
[0173] SEQ ID NO:140列出了由SEQ ID NO:139编码的NLR蛋白的氨基酸序列。
[0174] SEQ ID NO:141列出了Dk_05_56(一种来自高大山羊草的NLR)的cDNA编码区的核苷酸序列。如果需要，终止密码子(例如TAA、TAG或TGA)可以可操作地连接到包含或由该NLR序列组成的核酸分子的3'端。该cDNA的天然终止密码子是TGA。
[0175] SEQ ID NO:142列出了由SEQ ID NO:141编码的NLR蛋白的氨基酸序列。
[0176] SEQ ID  NO:143列出了Dk_06_01(一种来自二穗短柄草(Brachypodium distachyon)的NLR)的cDNA编码区的核苷酸序列。如果需要，终止密码子(例如TAA、TAG或
TGA)可以可操作地连接到包含或由该NLR序列组成的核酸分子的3'端。该cDNA的天然终止
密码子是TAA。
[0177] SEQ ID NO:144列出了由SEQ ID NO:143编码的NLR蛋白的氨基酸序列。
[0178] SEQ ID NO:145列出了Dk_06_03(一种来自高大山羊草的NLR)的cDNA编码区的核苷酸序列。如果需要，终止密码子(例如TAA、TAG或TGA)可以可操作地连接到包含或由该NLR序列组成的核酸分子的3'端。该cDNA的天然终止密码子是TAA。
[0179] SEQ ID NO:146列出了由SEQ ID NO:145编码的NLR蛋白的氨基酸序列。
[0180] SEQ ID NO:147列出了Dk_06_04(一种来自高大山羊草的NLR)的cDNA编码区的核苷酸序列。如果需要，终止密码子(例如TAA、TAG或TGA)可以可操作地连接到包含或由该NLR序列组成的核酸分子的3'端。该cDNA的天然终止密码子是TAA。
[0181] SEQ ID NO:148列出了由SEQ ID NO:147编码的NLR蛋白的氨基酸序列。
[0182] SEQ ID NO:149列出了Dk_06_05(一种来自高大山羊草的NLR)的cDNA编码区的核苷酸序列。如果需要，终止密码子(例如TAA、TAG或TGA)可以可操作地连接到包含或由该NLR序列组成的核酸分子的3'端。该cDNA的天然终止密码子是TAA。
[0183] SEQ ID NO:150列出了由SEQ ID NO:149编码的NLR蛋白的氨基酸序列。
[0184] SEQ ID NO:151列出了Dk_06_06(一种来自高大山羊草的NLR)的cDNA编码区的核苷酸序列。如果需要，终止密码子(例如TAA、TAG或TGA)可以可操作地连接到包含或由该NLR序列组成的核酸分子的3'端。该cDNA的天然终止密码子是TGA。
[0185] SEQ ID NO:152列出了由SEQ ID NO:151编码的NLR蛋白的氨基酸序列。
[0186] SEQ ID NO:153列出了Dk_06_52(一种来自西尔斯山羊草(Aegilops searsii)的NLR)的cDNA编码区的核苷酸序列。如果需要，终止密码子(例如TAA、TAG或TGA)可以可操作地连接到包含或由该NLR序列组成的核酸分子的3'端。该cDNA的天然终止密码子是TGA。
[0187] SEQ ID NO:154列出了由SEQ ID NO:153编码的NLR蛋白的氨基酸序列。
[0188] SEQ ID NO:155列出了Dk_06_53(一种来自西尔斯山羊草的NLR)的cDNA编码区的核苷酸序列。如果需要，终止密码子(例如TAA、TAG或TGA)可以可操作地连接到包含或由该NLR序列组成的核酸分子的3'端。该cDNA的天然终止密码子是TAG。
[0189] SEQ ID NO:156列出了由SEQ ID NO:155编码的NLR蛋白的氨基酸序列。
[0190] SEQ ID NO:157列出了Dk_01_21(一种来自沙融山羊草的NLR)的cDNA编码区的核苷酸序列。如果需要，终止密码子(例如TAA、TAG或TGA)可以可操作地连接到包含或由该NLR序列组成的核酸分子的3'端。该cDNA的天然终止密码子是TAA。
[0191] SEQ ID NO:158列出了由SEQ ID NO:157编码的NLR蛋白的氨基酸序列。
[0192] SEQ ID NO:159列出了Dk_01_48(一种来自沙融山羊草的NLR)的cDNA编码区的核苷酸序列。如果需要，终止密码子(例如TAA、TAG或TGA)可以可操作地连接到包含或由该NLR序列组成的核酸分子的3'端。该cDNA的天然终止密码子是TAG。
[0193] SEQ ID NO:160列出了由SEQ ID NO:159编码的NLR蛋白的氨基酸序列。
[0194] SEQ ID NO:161列出了Dk_03_15(一种来自洋狗尾草的NLR)的cDNA编码区的核苷酸序列。如果需要，终止密码子(例如TAA、TAG或TGA)可以可操作地连接到包含或由该NLR序列组成的核酸分子的3'端。该cDNA的天然终止密码子是TGA。
[0195] SEQ ID NO:162列出了由SEQ ID NO:161编码的NLR蛋白的氨基酸序列。
[0196] SEQ ID NO:163列出了Dk_03_49(一种来自绒毛草的NLR)的cDNA编码区的核苷酸序列。如果需要，终止密码子(例如TAA、TAG或TGA)可以可操作地连接到包含或由该NLR序列组成的核酸分子的3'端。该cDNA的天然终止密码子是TGA。
[0197] SEQ ID NO:164列出了由SEQ ID NO:163编码的NLR蛋白的氨基酸序列。
[0198] SEQ ID NO:165列出了Dk_03_68(一种来自沙融山羊草的NLR)的cDNA编码区的核苷酸序列。如果需要，终止密码子(例如TAA、TAG或TGA)可以可操作地连接到包含或由该NLR序列组成的核酸分子的3'端。该cDNA的天然终止密码子是TAG。
[0199] SEQ ID NO:166列出了由SEQ ID NO:165编码的NLR蛋白的氨基酸序列。
[0200] SEQ ID NO:167列出了Dk_04_67(一种来自双角山羊草的NLR)的cDNA编码区的核苷酸序列。如果需要，终止密码子(例如TAA、TAG或TGA)可以可操作地连接到包含或由该NLR序列组成的核酸分子的3'端。该cDNA的天然终止密码子是TGA。
[0201] SEQ ID NO:168列出了由SEQ ID NO:167编码的NLR蛋白的氨基酸序列。
[0202] SEQ ID NO:169列出了Dk_04_71(一种来自双角山羊草的NLR)的cDNA编码区的核苷酸序列。如果需要，终止密码子(例如TAA、TAG或TGA)可以可操作地连接到包含或由该NLR序列组成的核酸分子的3'端。该cDNA的天然终止密码子是TAG。
[0203] SEQ ID NO:170列出了由SEQ ID NO:169编码的NLR蛋白的氨基酸序列。
[0204] SEQ ID NO:171列出了Dk_04_91(一种来自双角山羊草的NLR)的cDNA编码区的核苷酸序列。如果需要，终止密码子(例如TAA、TAG或TGA)可以可操作地连接到包含或由该NLR序列组成的核酸分子的3'端。该cDNA的天然终止密码子是TAG。
[0205] SEQ ID NO:172列出了由SEQ ID NO:171编码的NLR蛋白的氨基酸序列。
[0206] SEQ ID NO:173列出了Dk_05_75(一种来自双角山羊草的NLR)的cDNA编码区的核苷酸序列。如果需要，终止密码子(例如TAA、TAG或TGA)可以可操作地连接到包含或由该NLR序列组成的核酸分子的3'端。该cDNA的天然终止密码子是TGA。
[0207] SEQ ID NO:174列出了由SEQ ID NO:173编码的NLR蛋白的氨基酸序列。
[0208] SEQ ID NO:175列出了Dk_05_92(一种来自双角山羊草的NLR)的cDNA编码区的核苷酸序列。如果需要，终止密码子(例如TAA、TAG或TGA)可以可操作地连接到包含或由该NLR序列组成的核酸分子的3'端。该cDNA的天然终止密码子是TAG。
[0209] SEQ ID NO:176列出了由SEQ ID NO:175编码的NLR蛋白的氨基酸序列。
[0210] SEQ ID NO:177列出了Dk_06_02(一种来自高大山羊草的NLR)的cDNA编码区的核苷酸序列。如果需要，终止密码子(例如TAA、TAG或TGA)可以可操作地连接到包含或由该NLR序列组成的核酸分子的3'端。该cDNA的天然终止密码子是TAG。
[0211] SEQ ID NO:178列出了由SEQ ID NO:177编码的NLR蛋白的氨基酸序列。
[0212] SEQ ID NO:179列出了Dk_06_10(一种来自双角山羊草的NLR)的cDNA编码区的核苷酸序列。如果需要，终止密码子(例如TAA、TAG或TGA)可以可操作地连接到包含或由该NLR序列组成的核酸分子的3'端。该cDNA的天然终止密码子是TAG。
[0213] SEQ ID NO:180列出了由SEQ ID NO:179编码的NLR蛋白的氨基酸序列。
[0214] SEQ ID NO:181列出了Dk_06_36(一种来自西尔斯山羊草的NLR)的cDNA编码区的核苷酸序列。如果需要，终止密码子(例如TAA、TAG或TGA)可以可操作地连接到包含或由该NLR序列组成的核酸分子的3'端。该cDNA的天然终止密码子是TGA。
[0215] SEQ ID NO:182列出了由SEQ ID NO:181编码的NLR蛋白的氨基酸序列。
[0216] SEQ ID NO:183列出了Dk_08_16(一种来自沙融山羊草的NLR)的cDNA编码区的核苷酸序列。如果需要，终止密码子(例如TAA、TAG或TGA)可以可操作地连接到包含或由该NLR序列组成的核酸分子的3'端。该cDNA的天然终止密码子是TGA。
[0217] SEQ ID NO:184列出了由SEQ ID NO:183编码的NLR蛋白的氨基酸序列。
[0218] SEQ ID NO:185列出了Dk_08_79(一种来自埃塞俄比亚燕麦(Avena abyssinica)的NLR)的cDNA编码区的核苷酸序列。如果需要，终止密码子(例如TAA、TAG或TGA)可以可操作地连接到包含或由该NLR序列组成的核酸分子的3'端。该cDNA的天然终止密码子是TAG。
[0219] SEQ ID NO:186列出了由SEQ ID NO:185编码的NLR蛋白的氨基酸序列。
[0220] SEQ ID NO:187列出了Dk_09_55(一种来自凌风草(Briza media)的NLR)的cDNA编码区的核苷酸序列。如果需要，终止密码子(例如TAA、TAG或TGA)可以可操作地连接到包含或由该NLR序列组成的核酸分子的3'端。该cDNA的天然终止密码子是TGA。
[0221] SEQ ID NO:188列出了由SEQ ID NO:187编码的NLR蛋白的氨基酸序列。

具体实施方式

[0222] 下面将参考附图更全面地描述本发明，附图中示出了本发明的一些但不是全部实施方案。实际上，这些发明可以以许多不同的形式体现，且不应被解释为限于本文所述的实施方案；相反，提供这些实施方案使得本发明将满足适用的法律要求。在整个说明书中，相似的数字指的是相似要素。
[0223] 对于这些发明所属领域的技术人员来说，会想到本文所述的发明的许多修改和其它实施方案，这些修改和其它实施方案具有在前述描述和相关附图中呈现的教导的益处。
因此，应当理解，本发明不限于所公开的特定实施方案，并且修改和其它实施方案旨在包含在所附权利要求的范围内。尽管本文中采用了特定术语，但是它们仅在一般和描述性意义
上使用，而不是出于限制的目的。
[0224] 在一个方面，本发明涉及制备候选植物抗病(NLR)基因的文库的方法。这种候选NLR基因的文库可用于提高植物中NLR基因鉴定方法的效率，该NLR基因能够赋予易感宿主
植物对感兴趣的植物病原体的抗性。由于植物基因组通常包含数百个NLR，因此在植物中鉴定那些对感兴趣的植物病原体引起的植物病害具有抗性的NLR基因是一项艰巨的任务。本
发明的方法可用于减少候选NLR基因的数量，使用需要在易感宿主植物中测试的新特征来
确定特定候选NLR基因是否能够赋予易感宿主植物对感兴趣的植物病原体的抗性。本发明
的方法涉及选择在未受攻击的植物组织中显示高度表达的特征的NLR。以前忽视了这种特
征，因为NLR通常被认为是低表达的基因，有时会导致产量下降。参见Lai&Eulgem,2018,
Mol.Plant Pathol.19(5):1267‑1281；Tian等人，2003,Nature 423(6935):74‑77；
Fitzgerald等人，2004,MPMI 17(2):140‑151；Chern等人，2005,MPMI 18(6):511‑520；
Karasov等人，2017,Plant Cell 29(4):666‑680；Jones&Dangl,2006,Nature 444(7117):
323‑329；Richard等人，2018,Mol.Plant Pathol.19(11):2516‑2523；和Baggs等人，2017,Currr.Opin.Plant Biol.38:59‑67。
[0225] 在第二方面，本发明涉及使用根据本发明方法制备的候选NLR基因的文库鉴定针对感兴趣的植物病原体的NLR基因的改进的方法。这些方法可用于鉴定新的NLR基因，这些
基因可以并入农作物中，以赋予其对感兴趣的植物病害的抗性。植物育种者需要这类新的
NLR基因，以帮助开发对一种或多种植物病害具有增强的抗性的新作物品种。
[0226] 本发明的方法可用于鉴定针对多种病原体的NLR基因，所述病原体包括但不限于真菌、细菌、卵菌、线虫和病毒性植物病原体。感兴趣的植物病原体是那些能够在感兴趣的宿主植物上引起植物病害症状的植物病原体，宿主植物尤其是农作物或人类作为食物、纤
维或者动物饲料而种植的其它植物，更尤其是已知的由感兴趣的植物病原体引起的植物病
害而遭受农业产量下滑的农作物或其它植物。
[0227] 本发明部分基于本发明人的某些观察或发现。首先，针对叶片病原体的所有表征的NLR基因都在单子叶植物和双子叶植物未受染的叶片组织中表达。已发表的例子包括
Pm3b、Rpg5、Sr33和CcRpp1(Kawashima等人，2016,Nature Biotechnol.2016 34(6):661‑
665；美国专利号10,842,097)。其次，对于不同的草种，叶片转录组中表达的NLR的平均数量为100至200，所述草种包括但不限于小麦、大麦、沙融山羊草、印度落芒草(Achnatherum hymenoides)、双角山羊草、高大山羊草、西尔斯山羊草、沙融山羊草、冰草(Agropyron 
cristatum)、埃塞俄比亚燕麦、二穗短柄草、凌风草、洋狗尾草、Echinaria capitata、绒毛草、大麦、 草、黑麦草(Lolium perenne)、小穗臭草(Melica ciliate)、天蓝虉草
(Phalaris coerulescens)和普通早熟禾(Poa trivialis)。这是基因组中NLR总数的一小
部分。例如，大麦/小麦基因组上编码的所有NLR中只有约10％在叶组织中表达(图1‑3)。关键的是，在叶片转录组中表达的NLR组中，高度表达的NLR的亚组对于功能性R基因是饱和的(图1‑11)。这一发现是基于对模型物种拟南芥种质Columbia‑0(Col‑0)中表达水平进行的生物信息学分析，其中克隆和表征了许多R基因。在这个经过充分研究的物种中的观察结果证实了我们最初的观察结果；在描述为传递抗性的10个NLR中，9个存在于叶组织中表达的
NLR的前25％(图5)。由于早期的出版物表明NLR对产量有负面影响，因此这种特征以前被忽视了，导致人们普遍认为这类蛋白质中的功能性NLR必须以低水平存在。表达最高的NLR是
那些对拟南芥霜霉菌(Hyaloperonospora arabidopsis)和白锈菌有效的NLR，已知拟南芥
霜霉菌和白锈菌是与拟南芥共同进化的病原体。公开的可用数据(Kawashima等人，2016，
Nature Biotechnol.2016 34(6)：661‑665)用于确定是否可以使用上述标准鉴定经由图位克隆鉴定的NLR基因(CcRpp1)。实际上，CcRpp1被确定为高度表达的NLR的前10％(图4)。
[0228] 本发明提供了用于制备针对一种或多种感兴趣的植物病原体的候选NLR基因的文库的方法。这些方法包括从一种或多种感兴趣的植物中的每一种中在一种或多种植物的器
官或其它部分中组成性表达的NLR群体中选择高度表达的NLR的亚群，以产生候选R基因的
文库。高度表达的NLR的亚群包括在没有植物或其任何器官或其它部分与一种或多种感兴
趣的植物病原体接触或以其它方式暴露于一种或多种感兴趣的植物病原体的情况下在所
述植物的器官或其它部分组成性高度表达的NLR。这种植物组织在本文中被称为“未受染
的”植物组织，因为植物组织或该组织所来源的植物的任何部分都不是故意与任何感兴趣
的植物病原体接触或者已知被植物病原体感染或受到任何其它植物有害生物(例如昆虫和
螨虫)的侵害。
[0229] 这种未受染的植物组织可以是植物器官(例如叶、茎或根)或未接触或未暴露于感兴趣病原体的植物的任何其它部分。优选地，未受染的植物组织或植物的任何其它部分都
没有暴露于感兴趣的植物病原体，并且植物健康良好且没有表现出任何植物病害症状或被
其它植物有害生物(例如昆虫)侵害的迹象。
[0230] 在一种或多种植物的植物器官或其它部分中表达的NLR亚群可以通过检测单个NLR的mRNA来确定，优选通过转录组分析方法，例如RNA测序(RNAseq)，其不仅可以用于鉴定在一种或多种植物的植物器官或其它部分中表达的单个NLR基因，还可以评估多种表达的
NLR基因的相对表达水平。因此，RNAseq可用于确定植物器官或其它植物组织中表达的NLR
的亚群以及表达的NLR中作为高度表达的候选R基因的部分，以产生候选R基因的文库。鉴定高度表达的NLR的其它方法是可以在本发明的方法中用于量化转录本中差异水平的方法，
包括例如微阵列技术，例如Affymetrix阵列和点cDNA阵列。备选地，由于高度表达的NLR可以通过其各自的NLR编码的NLR蛋白的较高平均蛋白水平来鉴定，因此可以使用蛋白质定量
的方法，包括但不限于LC‑MS、LC‑MS/MS、MassSpec、Q‑TOF等。
[0231] 典型地，高度表达的NLR包含的在植物的器官或其它部分中的相对表达水平大于至少约65％表达的NLR在植物的相同器官或相同部分中的相对表达水平。优选地，高度表达的NLR包含的在植物的器官或其它部分中的表达水平大于至少约65％、70％、75％、80％、
85％、90％或95％表达的NLR在植物的相同器官或相同部分中的相对表达水平。换句话说，在感兴趣的植物的特定器官或其它部分中高度表达的NLR是那些表达的NLR：与感兴趣的植
物的特定器官或其它部分中所有表达的NLR的表达水平相比，其表达水平至少约为前35％、
30％、25％、20％、15％、10％、5％、4％或3％。优选地，在感兴趣的植物的特定器官或其它部分中高度表达的NLR是那些表达的NLR：与感兴趣的植物的特定器官或其它部分中所有表达
的NLR的表达水平相比，其表达水平至少约为前25％、20％、15％、10％、5％、4％或3％。更优选地，在感兴趣的植物的特定器官或其它部分中高度表达的NLR是那些表达的NLR：与感兴
趣的植物的特定器官或其它部分中所有表达的NLR的表达水平相比，其表达水平至少约为
前20％、15％、10％、5％、4％或3％。最优选地，在感兴趣的植物的特定器官或其它部分中高度表达的NLR是那些表达的NLR：与感兴趣的植物的特定器官或其它部分中所有表达的NLR
的表达水平相比，其表达水平至少约为前20％、15％、10％、5％、4％或3％。
[0232] 人们认识到，选择任何合适的相对表达水平来确定高度表达的NLR将取决于许多因素，包括例如植物物种、植物器官或用作mRNA来源的植物的其它部分、感兴趣的植物中表达的NLR基因的总数、植物基因组中总NLR中在植物器官或其它植物部分表达的部分以及从
中分离mRNA的植物的生长条件。
[0233] 在涉及RNAseq的本发明的某些实施方案中，TransDecoder(v4.1.0；可在万维网github.com/TransDecoder/TransDecoder/releases上获得)LongORF可用于预测从头组装
的转录组中的所有开放阅读框。为了鉴定编码推定的NLR蛋白的转录本，可以使用使用
InterProScan(v5.27‑66.0)(Jones等人，(2014)Bioinformatics 30(9):1236‑1240；doi:
10.1093/bioinformatics/btu031)，例如，以使用Coils和Pfam、Superfamily和ProSite数据库来注释结构域。任何编码包含核苷酸结合(NB)结构域和富含亮氨酸重复序列(LRR)结
构域的蛋白质的NLR基因都能够被鉴定为NLR蛋白，并在分析中优化。从FAT‑CAT开发的自定义脚本(Afrasiabi等人，(2013)Nucleic Acids Res.41:W242‑W248，doi.org/10.1093/
nar/gkt399)可以用于根据从源自NLR的水稻、二穗短柄草和大麦的核苷酸结合结构域开发
的系统发育树对核苷酸结合结构域进行分类。例如，可以基于以下要求对NLR编码基因进行优化：转录本包含完整或5'部分开放阅读框；该基因是植物器官或其它植物部分中前25％
表达的NLR之一；并且该基因不属于已知需要额外的NLR的NLR家族(例如，参见Bailey等人，(2018)Genome Biol.19:23)。在候选NLR中，使用需要100％同一性(‑c 1.0)的CD‑HIT
(v4.7)去除冗余。使用Gateway接头attB1(SEQ ID NO:27)和attB2(SEQ ID NO:28)开发PCR
引物，attB1和attB2分别融合到编码序列起始点或终止点的前20个核苷酸。参见Katzen，
(2007)Expert Opin.Drug Discov.2(4)：571‑589，以了解Gateway克隆技术的概述。
[0234] 在本发明的该实施方案中，鉴定的NLR蛋白包含至少一个NB结构域和至少一个LRR结构域。这种鉴定的NLR蛋白可以进一步包含一个或多个额外的结构域，特别是已知存在于NLR蛋白中的结构域，包括但不限于卷曲螺旋(CC)结构域、Toll/白细胞介素‑1受体(TIR)结构域、额外的NB结构域和额外的LRR结构域。本发明鉴定的NLR蛋白的实例在下文的实施例2中进一步描述。
[0235] 虽然已知NLR蛋白在N端到C端方向上的结构域的典型顺序是CC‑NB‑LRR、TIR‑NB‑LRR或NB‑LRR，但本发明的方法不依赖于具有特定结构的NLR蛋白，并且能够容纳已知NLR蛋白的非典型的结构域结构。
[0236] 在本发明的某些实施方案中，用于制备针对至少一种感兴趣的植物病原体的候选NLR基因的文库的方法可以包括对包含至少一个额外的感兴趣的特征的NLR的进一步选择，
其中候选NLR基因的文库包含那些高度表达的并包含一个或多个额外的感兴趣的特征的
NLR。先前的工作已经建立了NLR的分子和进化特征，这些特征有助于植物免疫，例如基因家族和快速进化(Yang等人，2013，PNAS110:18572‑18577)。这些感兴趣的特征包括但不限于：
[0237] (i)NLR编码的氨基酸序列中存在种内变异；
[0238] (ii)NLR编码的氨基酸序列中不存在种内变异；
[0239] (iii)NLR编码的氨基酸序列中存在种间变异；
[0240] (iv)NLR编码的氨基酸序列中不存在种间变异；和
[0241] (v)NLR编码的氨基酸序列中的大量种间等位基因变异。
[0242] 除非另有说明或从本发明的“大量种内和种间变异”的使用背景来看是明显的，否则意味着存在维持的序列多态性、多样化选择以及与群体中个体间维持的等位基因中存在的同义取代相比，非同义取代的过度表达。具有大量种内等位基因变异的NLR的例子包括大麦中的Mla等位基因( 1994，Plant Sci.13:97‑119；Seeholzer等人，2010，MPMI 
23:497‑509)和小麦中的Pm3等位基因(Bourras等人，2018，Curr.Opin.Microbiol.46:26‑
33；Bourras等人，2015，Bourras等人，2015，Plant Cell 27:2991‑3012)。
[0243] 本发明的方法包括选择在感兴趣的植物的器官或其它部分中高度表达的NLR，以产生候选NLR基因的文库。感兴趣的植物包括例如农作物以及农作物的驯化和未驯化的近
缘种。这些近缘种包括与农作物来自同一物种的植物或与农作物不同物种但与农作物来自
同一科、亚科和/或群的近缘种。在本发明的一些实施方案中，候选NLR基因的文库所来源的植物是作为作物的宿主植物的未驯化的近缘种，并且候选NLR基因旨在用于农作物。优选
地，宿主植物的这种近缘种与候选NLR基因的文库所来源的植物处于相同的科、亚科、群和/或属中。在一些其它实施方案中，宿主植物和候选NLR基因的文库所源自的植物来自同一物种。
[0244] 候选NLR基因的文库所来源的一种或多种感兴趣的植物可以是不支持感兴趣病原体完成生长或生命周期的任何植物种质(accession)、品种或物种。实际上，源自第一物种的感兴趣的植物的R基因可以转移到第二物种的植物中，第二物种是感兴趣的植物病原体
的宿主，由此产生第二物种的抗性植物。来自一个物种并转移到第二个物种的R基因的例子包括但不限于来自辣椒(Capsisum annuum)的NLR Bs2(Tai等人，1999，PNAS 96(24)：
14153‑14158；转移到番茄(即Solanum lycopersicum))和来自木豆(Cajanus cajan)的
CcRpp1(Kawashima等人，2016，Nature Biotechnol。2016 34(6)：661‑665；转移到大豆(即Glycine max))。优选地，对于本发明，第一和第二物种属于同一科。在某些实施方案中，第一和第二物种属于同一科，但属于不同的亚科、群和/或属。
[0245] 在某些优选实施方案中，预期包含针对一种或多种感兴趣病原体的一种或多种有效的NLR抗性基因的植物被用作NLR基因的文库所来源的植物。预期这些植物包含针对一种
或多种感兴趣的病原体的有效NLR抗性基因，因为这些植物不支持一种或多种感兴趣的植
物病原体的生长。例如，对一种或多种小麦病原体具有有效抗性的面包小麦(普通小麦)的
近缘种是禾本科(Poaceae)的物种，包括但不限于以下属的物种：芨芨草属(Achnatherum)，山羊草属(Aegilops)，冰草属(Agropyron)，燕麦属(Avena)，短柄草属(Brachypodium)，凌风草属(Briza)，洋狗尾草属(Cynosurus)，猬禾属(Echinaria)，绒毛草属(Holcus)，大麦属(Hordeum)， 草属(Koeleria)，黑麦草属(Lolium)，臭草属(Melica)，虉草属(Phalaris)和早熟禾属(Poa)。这些物种包括：例如，印度落芒草，双角山羊草，高大山羊草，西尔斯山羊草、沙融山羊草，冰草，埃塞俄比亚燕麦，二穗短柄草，凌风草，洋狗尾草，Echinaria 
capitata，绒毛草，大麦， 草，黑麦草，小穗臭草(Melica ciliata)，天蓝虉草和普通早熟禾。
[0246] 本发明的候选R基因的文库可以使用一种或多种感兴趣的植物制备，其中每种植物在遗传上彼此不同。例如，如果可以使用来自同一物种的两种、三种、四种或更多种感兴趣的植物制备候选R基因的文库，则所述两种、三种、四种或更多种感兴趣的植物可以具有相同的基因型或两种、三种、四种或更多种不同的基因型。人们认识到，用于产生候选R基因的文库的感兴趣的植物的数量能够根据许多因素而变化，包括例如宿主植物、感兴趣的一
种或多种病原体、以及遗传上不同的感兴趣的植物的可用性，预期这些植物包含针对一种
或多种植物病原体的有效NLR基因。因此，使用本发明的方法，可以使用至少1、2、3、4、5、10、
15、20、25、30、40、50、60、70、80、90、100、125、150、200、250、300、400、500、600、700、800、
900、1000、1250、1500、1750、2000或更多种感兴趣的遗传上不同的植物来制备候选R基因的文库。
[0247] 本发明的方法不依赖于特定植物器官或植物部分的使用。处于任何发育阶段和/或在任何环境条件下生长的任何植物器官或植物部分，尽管该植物器官或植物部分是来自
未受染的植物。植物器官包括但不限于叶、茎、花、根、果实、荚、种子、子叶、下胚轴、上胚轴、胚根等。植物部分包括例如叶中脉、叶片、花瓣、萼片、蒂，花梗和节间。在下面详细描述的本发明的某些实施方案中，植物器官是叶。
[0248] 本发明进一步提供包含根据上述方制备的候选NLR基因的文库的组合物。这样的文库包含至少两个候选NLR基因，但典型地包含至少约10、20、30、40、50、75、100、125、150、
175、200、225、250、300、400、500、600、700、800、900、1000、1250、1500、1750、2000或更多候选NLR基因。这些组合物可用于鉴定针对感兴趣的植物病原体的植物抗病(NLR)基因的方
法。
[0249] 进一步提供了包含转基因植物集合的组合物，其中每个转基因植物是通过用根据上述方法制备的候选NLR基因的文库中的候选NLR基因转化宿主植物而产生的。这些组合物
还可用于鉴定针对感兴趣的植物病原体的植物抗病(NLR)基因的方法。本发明的转基因植
物集合包含至少两种转基因植物，但典型地包含至少约10、20、30、40、50、75、100、125、150、
175、200、225、250、300、400、500、600、700、800、900、1000、1250、1500、1750、2000或更多种植物，其中每种转基因植物包含不同的候选R基因。优选地，转基因植物集合包含代表候选NLR基因的文库中至少约50％、60％、70％或80％的NLR基因的转基因植物。更优选地，转基因植物集合包含代表候选NLR基因的文库中至少约90％、95％、96％、97％、98％、99％或
100％的NLR基因的转基因植物。例如，如果候选NLR基因的文库包含99个不同的NLR基因，则代表文库中所有NLR基因的转基因植物集合将包含至少99种植物，其中99种植物中的每一
种都包含不同的NLR基因。公认的是，转基因植物集合可以包含每个不同NLR基因的两种或
更多种转基因植物。包含相同NLR基因的两种或更多种转基因植物可以在其各自的基因组
中包含NLR基因位于其各自基因组中相同位置的相同转基因事件。备选地，包含相同NLR基
因的两种或更多种转基因植物可以在其各自的基因组中包含独立的转基因事件，其中NLR
基因不位于其各自基因组中的相同位置。
[0250] 本发明进一步提供用于鉴定针对感兴趣的植物病原体的NLR基因的组合物，所述鉴定涉及候选NLR基因的文库的使用。这些方法包括产生用从根据本发明方法制备的NLR基
因的文库中选择的候选NLR基因转化的宿主植物。宿主植物是感兴趣的植物病原体的宿主，并且植物病原体能够在适当的环境条件下在宿主植物上引起植物病害症状以发展病害症
状。这些方法还包括在适合病害症状发展的环境条件下，使转化的宿主植物接触感兴趣的
植物病原体，或以其它方式将转化的宿主植物暴露于感兴趣的植物病原体，然后在足以发
展病害症状的一段时间后，确定与不包含候选NLR基因的对照宿主植物相比，转化的宿主植物是否对感兴趣的植物病原体表现出增强的抗性，其中，当转化的宿主植物对由感兴趣的
植物病原体引起的植物病害症状表现出增强的抗性时，该候选NLR基因是针对感兴趣的植
物病原体的NLR基因。
[0251] 人们认识到，这种适合病害症状发展的环境条件取决于宿主植物‑病原体的组合，并且在本领域中是已知的，或者可以使用本领域可用的常规方法来确定。进一步认识到，接种后(即在宿主植物与病原体接触后)足以让病害症状发展的一段时间也取决于宿主植物‑植物病原体的组合，并且在本领域中是已知的，或者可以使用本领域中可用的常规方法来
确定。
[0252] 本发明进一步提供了用于鉴定针对感兴趣的植物病原体的NLR基因的方法，所述方法涉及使用转基因植物或所述转基因植物的集合，所述转基因植物包含来自根据上述方
法制备的候选NLR基因的文库的候选NLR基因。这些方法包括在适合病害症状发展的环境条
件下将转基因植物或转基因植物的集合与感兴趣的植物病原体接触。转基因植物是感兴趣
的植物病原体的宿主植物，并且植物病原体能够在宿主植物上引起植物病害症状。这些方
法还包括在成员与植物病原体接触后，在足以发展病害症状的一段时间后评估一种或多种
转基因植物上的病害症状。与不包含候选NLR基因的对照植物相比，当转基因植物对由感兴趣的植物病原体引起的植物病害表现出增强的抗性时，鉴定出包含针对感兴趣的植物病原
体的NLR基因的转基因植物。
[0253] 本发明的转基因植物的集合不限于与单一病原体一起使用。如下文在实施例中详细描述的，可以分别筛查转基因植物集合对能够在宿主植物上引起植物病害症状的一种、
两种、三种、四种、五种或更多种感兴趣的植物病原体的抗性，以从转基因植物集合中代表的候选NLR基因中鉴定功能性NLR基因。这种功能性NLR基因是能够赋予包含所述NLR基因的
宿主植物针对一种或多种感兴趣病原体的抗性。
[0254] 本发明还涉及包含本发明分离的NLR基因的核酸分子组合物和编码由这些NLR基因编码的NLR蛋白的其它核酸分子，以及涉及包含本发明NLR蛋白的蛋白质组合物。此类组
合物包括但不限于包含一种或多种此类NLR蛋白和/或一种或多种核酸分子以及包含一种
或多种此类核酸分子的表达盒和载体的植物、植物细胞和其它宿主细胞。
[0255] 本发明包含核酸分子，所述核酸分子包含一个或多个编码本文或随附序列表和/或附图中公开的NLR蛋白的核苷酸序列。此类核酸分子包括但不限于包含至少一个核苷酸
序列的核酸分子，该核苷酸序列选自由以下组成的组：SEQ ID NO:1、3、5、7、9、11、13、15、
17、19、21、23、25、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、
69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、
115、117、119、121、123、125、127、129、131、133、135、137、139、141、143、145、147、149、151、
153、155、157、159、161、163、165、167、169、171、173、175、177、179、181、183、185或187所示的核苷酸序列；编码多肽的核苷酸序列，所述多肽包含SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、16、
18、20、22、24、26、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、
70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、
116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、
154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186或188所示的氨基酸序列；序列表中列出的核苷酸序列；编码序列表中所列出的氨基酸序列的核苷酸
序列；及其变体。优选地，这种核酸分子能够赋予植物，特别是赋予小麦植物、大麦植物、黑小麦植物和/或燕麦植物对一种或多种感兴趣的植物病原体增强的抗性，所述植物病原体
包括例如：小麦秆锈病(小麦秆锈菌)，小麦条锈病(小麦条锈菌)，小麦叶锈病(小麦叶锈菌(Puccinia triticina))，小麦瘟病(小麦型稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae Triticum))和
小麦白粉病(布氏白粉菌(Blumeria graminis f.sp.tritici))。
[0256] 本发明还包括包含至少一种此类核酸分子的植物、植物细胞、宿主细胞、表达盒、多核苷酸构建体和载体，以及由此类植物生产的食品。本发明还包括包含至少一种这样的核酸分子的植物在本文其它地方公开的方法中的用途，例如，在农作物生产中限制植物病
害的方法中的用途。
[0257] 在本发明的某些实施方案中，本发明的植物和植物细胞包含至少一种异源多核苷酸构建体，所述异源多核苷酸构建体包含本发明的核酸。这种异源多核苷酸可以通过本文
其它地方公开的或本领域其它已知的稳定或瞬时植物转化方法引入植物或其细胞。
[0258] 本发明还提供了增强植物对植物病原体的抗性的方法，尤其是包括对植物病原体的部分抗性的植物。如本文所用，完全或完整抗性定义为病原体不能在宿主植物基因型内
传播。在完全抗性的情况下，在被病原体接触后，在植物上观察到局部细胞死亡，但没有扩散性病变。与此相反，关于部分抗性，病原体可能仍然能够感染宿主植物并引起扩散性病
变，但与易感植物相比，病变的扩散受到局限或限制。
[0259] 用于增强植物抗性的此类方法包括修饰植物细胞以能够表达NLR蛋白。所述方法任选地还包括将修饰的植物细胞再生成修饰的植物，所述修饰的植物包括增强的对植物病
原体的抗性。
[0260] 在一些实施方案中，所述方法包括将包含本发明的NLR基因及其天然启动子的多核苷酸构建体引入至少一个植物细胞。在其它实施方案中，这些方法包括使用本文其它地
方描述的或本领域其它已知的植物转化方法，将多核苷酸构建体引入至少一个植物细胞
中，所述多核苷酸构建体包含驱动在植物中表达的启动子和可操作地连接的编码NLR蛋白
的核酸分子。用于增强植物对植物病原体的抗性的优选启动子是已知驱动高水平基因表达
的启动子，例如CaMV 35S启动子和玉米泛素启动子。下文描述了适用于本发明方法的其它
启动子。
[0261] 本发明的方法可用于产生对由植物病原体引起的植物病害具有增强的抗性的植物。典型地，与对照植物对植物病原体的一个或多个相同株系的抗性相比，本发明的方法将使受试植物对一种植物病原体株系或两种或更多种植物病原体株系中的每一种的抗性增
强或增加至少25％、50％、75％、100％、150％、200％、250％、500％或更多。除非另有说明或从用途的角度来看很明显，否则本发明的对照植物是不包含本发明的多核苷酸构建体的植
物。优选地，除了对照物不包含多核苷酸构建体之外，对照植物与包含本发明多核苷酸构建体的植物基本相同(例如相同的物种、亚种和品种)。在一些实施方案中，对照植物将包含多核苷酸构建体，但不包含候选NLR基因或本发明的NLR基因或编码由这种候选NLR基因或NLR
基因编码的蛋白质的核苷酸序列。在其它实施方案中，对照植物不包含多核苷酸构建体。
[0262] 包含本文公开的NLR基因的本发明的植物可用于限制农作物生产中由至少一种植物病原体引起的植物病害的方法，尤其是在这种植物病害普遍存在且已知会对农业产量产
生负面影响或至少有可能产生负面影响的地区。本发明的方法包括种植本发明的植物(例
如幼苗)、种子或块茎，其中所述植物、种子或块茎包含至少一个本发明的NLR基因。所述方法还包括在有利于植物生长和发育的环境条件下生长源自幼苗、种子或块茎的植物，并任
选地，从植物中收获至少一个果实、块茎、叶或种子。这些环境条件可以包括例如气温、土壤温度、土壤含水量、光周期、光照强度、土壤pH和土壤肥力。人们认识到，有利于感兴趣的植物生长和发育的环境条件将根据例如植物物种或甚至感兴趣的植物的特定品种(例如栽培
品种)或基因型而变化。进一步认识到，有利于本发明感兴趣的植物生长和发育的环境条件的是本领域已知的。
[0263] 另外，本发明提供了通过本发明的方法产生的和/或包含本发明的多核苷酸构建体的植物、种子和植物细胞。还提供了包含本发明的多核苷酸构建体的后代植物及其种子。
本发明还提供了由本发明的转化植物和/或后代植物产生的种子、营养部分和其它植物部
分，以及由这些植物部分生产的意在供人类和其它动物食用或使用的食品和其它农产品，
所述其它动物包括但不限于宠物(如狗和猫)和牲畜(如猪、牛、鸡、火鸡和鸭子)。
[0264] 本发明包括分离的或基本纯化的多核苷酸(在本文中也称为“核酸分子”、“核酸”等)或蛋白质(在本文中也称为“多肽”)组合物，包括例如，包含随附序列列表中所述序列的多核苷酸和蛋白质，以及此类多核苷酸和蛋白质的变体和片段。“分离的”或“纯化的”多核苷酸或蛋白质或其生物活性部分基本上或本质上不含在其天然存在的环境中通常伴随或与多核苷酸或蛋白质相互作用的成分。因此，当通过重组技术产生时，分离的或纯化的多核苷酸或蛋白质基本上不含其它细胞材料或培养基，或者当通过化学合成时，基本上不含化
学前体或其它化学物质。最佳情况下，“分离的”多核苷酸不含该多核苷酸所来源的生物体基因组DNA中天然地位于多核苷酸侧翼的序列(即位于多核苷酸5'和3'端的序列)(最佳地，
蛋白质编码序列)。例如，在各种实施方案中，分离的多核苷酸可以包含少于约5kb、4kb、
3kb、2kb、1kb、0.5kb或0.1kb的核苷酸序列，这些核苷酸序列在多核苷酸所来源的细胞基因组DNA中天然地位于多核苷酸的侧翼。基本上不含细胞物质的蛋白质包括具有少于约30％、
20％、10％、5％或1％(按干重计)的污染蛋白质的蛋白质制剂。当重组性地生产本发明的蛋白质或其生物活性部分时，最佳培养基代表少于约30％、20％、10％、5％或1％(以干重计)的化学前体或非目标蛋白质化学物质。
[0265] 本发明还包括公开的多核苷酸的片段和变体以及由此编码的蛋白质。“片段”是指多核苷酸的一部分或氨基酸序列(因此也是由其编码的蛋白质)的一部分。包含编码序列的多核苷酸片段可以编码保留全长或天然蛋白质的生物活性的蛋白质片段。备选地，可用作
杂交探针的多核苷酸片段通常不编码保留生物活性或不保留启动子活性的蛋白质。因此，
核苷酸序列的片段可以从至少约20个核苷酸、约50个核苷酸、约100个核苷酸至本发明的全长多核苷酸。
[0266] “变体”是指基本相似的序列。对于多核苷酸，变体包含这样的多核苷酸：在5'和/或3'端具有缺失(即截短的)；在天然多核苷酸的一个或多个内部位点缺失和/或添加一个或多个核苷酸；和/或在天然多核苷酸的一个或多个位点取代一个或多个核苷酸。如本文所用，“天然”多核苷酸或多肽分别包含天然存在的核苷酸序列或氨基酸序列。对于多核苷酸，保守变体包括那些由于遗传密码的简并性而编码本发明NLR基因的蛋白质氨基酸序列的序
列。变体多核苷酸包括合成来源的多核苷酸，例如通过使用定点诱变产生但仍编码本发明
的功能性NLR蛋白的多核苷酸。一般而言，本发明多核苷酸的变体将与该多核苷酸具有至少约80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多的序列同一性，如通过本文其它地方所述的序列比对程序和参数所确定的。
[0267] 本发明多核苷酸(即参考多核苷酸)的变体也可以通过比较变体多核苷酸编码的多肽与参考多核苷酸编码的多肽之间的序列同一性百分比来评估。可以使用本文其它地方
描述的序列比对程序和参数计算任何两种多肽之间或任何两种肽的相应部分(例如结构
域)之间的序列同一性百分比。如果通过比较它们编码的两种多肽共享的序列同一性百分
比来评估本发明的任何给定多核苷酸对或其相应部分，则两种编码多肽之间的序列同一性
百分比至少为约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、
90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多的序列同一性。
[0268] “变体”蛋白质是指通过下述从天然蛋白质衍生的蛋白质：在天然蛋白质的N末端和/或C末端缺失(所谓的截短)一个或多个氨基酸；在天然蛋白质的一个或多个内部位点缺
失和/或添加一个或多个氨基酸；或在天然蛋白质的一个或多个位点取代一个或多个氨基
酸。本发明蛋白质的生物活性变体可以与该蛋白质差异在于少至1‑15个氨基酸残基，少至
1‑10个，例如6‑10个，少至5个、少至4个、3个、2个甚至1个氨基酸残基。本发明NLR蛋白的生物活性变体将与本发明的NLR蛋白的氨基酸序列具有至少约80％、85％、86％、87％、88％、
89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多的序列同一性，其通过如本文别处描述的序列比对程序和参数所确定。本发明的NLR蛋白或其结构域的生物活
性变体可以与该蛋白或结构域差异在于少至1‑15个氨基酸残基、少至1‑10个、例如6‑10个、少至5个、少至4、3、2个甚至1个氨基酸残基。
[0269] 本发明的蛋白质可以以各种方式改变，包括氨基酸取代、缺失、截短和插入。此类操作的方法在本领域一般是众所周知的。诱变和多核苷酸改变的方法在本领域中是众所周知的。例如，参见Kunkel(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82:488‑492；Kunkel等人，(1987)Methods in Enzymol.154:367‑382；美国专利号4,873,192；Walker和Gaastra编(1983)
Techniques in Molecular Biology(MacMillan Publishing Company，New York)以及其
中引用的参考文献。关于不影响目标蛋白质生物活性的适当氨基酸取代的指导可以在
Dayhoff等人，(1978)Atlas  of  Protein  Sequence  and  Structure
(Natl.Biomed.Res.Found.，Washington，D.C.)的模型中找到，该文献通过引用并入本文。
保守取代，例如将一个氨基酸与另一个具有相似性质的氨基酸交换，可能是最佳的。
[0270] 本文所涵盖的蛋白质序列的缺失、插入和取代预计不会对蛋白质的特性产生根本变化。然而，当难以在这样做之前预测取代、缺失或插入的确切效果时，本领域技术人员理解，将通过常规筛查测定评估效果。也就是说，可以通过例如如本文其它地方公开的或本领域其它已知的针对感兴趣的植物病原体的抗病性测定来评估其活性。
[0271] 例如，对感兴趣的植物病原体引起的植物病害敏感的植物可以用包含本发明NLR基因的多核苷酸构建体转化，再生成包含多核苷酸构建体的转化或转基因植物，并使用本
领域已知或本文其它地方描述的标准抗病性测定测试抗性。
[0272] 变体多核苷酸和蛋白质还包括源自诱变和重组程序(例如DNA改组)的序列和蛋白质。这种DNA改组的策略在本领域是已知的。例如，参见Stemmer(1994)
Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91:10747‑10751；Stemmer(1994)Nature 370:389‑391；Crameri等人，(1997)Nature Biotech.15:436‑438；Moore等人，(1997)J.Mol.Biol.272:336‑347；
Zhang等人，(1997)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94:4504‑4509；Crameri等人，(1998)Nature 
391:288‑291；和美国专利号5,605,793和5,837,458。
[0273] 优选地，本发明的NLR基因和编码它们的多核苷酸赋予或能够赋予包含这种NLR基因的植物对至少一种植物病原体的增强的抗性，但优选地，对两种、三种、四种、五种或更多种植物病原体的增强的抗性。
[0274] PCR扩增可用于本发明方法的某些实施方案中。设计PCR引物和PCR扩增的方法在本领域中是众所周知的，并且公开在Sambrook等人，(1989)Molecular Cloning:A 
Laboratory Manual(第2版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Plainview，New 
York)中。也参见Innis等人编，(1990)PCR Protocols:A Guide to Methods and 
Applications(Academic Press，New York)；Innis和Gelfand编，(1995)PCR Strategies
(Academic Press，New York)；以及Innis和Gelfand编，(1999)PCR Methods Manual
(Academic Press，New York)。已知的PCR扩增方法包括但不限于使用配对引物、巢式引物、单特异性引物、简并引物、基因特异性引物、载体特异性引物和部分错配引物等的方法。
[0275] 公认的是，本发明NLR基因的核酸分子涵盖包含与本发明NLR基因的核苷酸序列足够相同的变体核苷酸序列的核酸分子。在本文中使用的术语“足够相同”是指第一氨基酸或核苷酸序列包含足够或最少数量的与第二氨基酸或核苷酸序列相同或等同(例如，具有相
似侧链)的氨基酸残基或核苷酸，使得第一和第二氨基酸或核苷酸序列具有共同的结构结
构域和/或共同的功能活性，例如抗病性。例如，含有共同结构结构域和/或具有至少约
45％、55％或65％同一性，优选75％同一性，更优选85％、86％、87％、88％、89％、90％、
95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列的氨基酸或核苷酸序列是足够相同的。
[0276] 为了确定两个氨基酸序列或两个核酸的同一性百分比，对序列进行比对以达到最佳比较目的。两个序列之间的同一性百分比是序列共享的相同位置数量的函数(即，同一性百分比＝相同位置数量/位置总数(例如，重叠位置)x 100)。在一个实施方案中，两个序列长度相同。两个序列之间的同一性百分比可以使用类似于下文描述的技术来确定，无论是
否允许间隙的存在。在计算同一性百分比时，典型地，会计数精确匹配。
[0277] 可以使用数学算法确定两个序列之间的同一性百分比。用于比较两个序列的数学算法的优选的非限制性例子是Karlin和Altschul(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:
2264的算法，该算法在Karlin和Altschul(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:5873‑5877
中修改。这种算法被纳入Altschul等人，(1990)J.Mol.Biol.215:403的NBLAST和XBLAST程
序中。可以使用NBLAST程序(评分＝100，字长＝12)进行BLAST核苷酸检索，以获得与本发明多核苷酸分子同源的核苷酸序列。可以使用XBLAST程序(评分＝50，字长＝3)进行BLAST蛋
白质检索，以获得与本发明蛋白质分子同源的氨基酸序列。为了获得用于比较目的的间隙
比对，可以如Altschul等人，(1997)Nucleic Acids Res.25:3389中所述使用间隙BLAST。备选地，PSI‑Blast可用于执行迭代检索，以检测分子之间的远距离关系。参见Altschul等人，(1997)，出处同上文。当使用BLAST、间隙BLAST和PSI‑BLAST程序时，使用各个程序的默认参数(例如XBLAST和NBLAST；可在万维网ncbi.nlm.nih.gov上获得)。用于序列比较的数学算
法的另一个优选的非限制性例子是Myers和Miller(1988)CABIOS 4:11‑17的算法。这种算
法被并入ALIGN程序(版本2.0)中，该程序是GCG序列比对软件包的一部分。当使用ALIGN程
序比较氨基酸序列时，可以使用PAM120权重残基表，间隙长度罚分为12，间隙罚分为4。也可以通过检查手动进行比对。
[0278] 除非另有说明，本文提供的序列同一性/相似性值是指使用本发明的全长序列并利用通过下述的多重比对获得的值：使用算法Clustal W(Nucleic Acid Research，22
(22):4673‑4680，1994)使用默认参数，使用软件包Vector NTI Suite版本7(InforMax，
Inc.，Bethesda，MD，USA)中包含的程序AlignX；或其任何等同程序。“等同程序”是指对于所讨论的任何两个序列，与CLUSTALW(版本1.83)使用默认参数(可在万维网上的欧洲生物信
息学研究所网站获得：ebi.ac.uk/Tools/CLUSTALW/index.html)生成的相应比对相比，生
成具有相同核苷酸或氨基酸残基匹配和相同序列同一性百分比的比对的任何序列比较程
序。
[0279] 术语“多核苷酸”的使用不旨在将本发明限制于包含DNA的多核苷酸。本领域普通技术人员将认识到，多核苷酸可以包含核糖核苷酸以及核糖核苷酸和脱氧核糖核苷酸的组
合。这种脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸包括天然存在的分子和合成的类似物。本发明的多
核苷酸还涵盖所有形式的序列，包括但不限于单链形式、双链形式、发夹、茎‑环结构等。
[0280] 包含NLR蛋白编码区的多核苷酸构建体可以在表达盒中提供，以在植物或其它生物体或感兴趣的宿主细胞中表达。该表达盒将包括与蛋白质编码区可操作地连接的5'和3'
调控序列。“可操作地连接”意指两个或更多个元件之间的功能性连接。例如，目标多核苷酸或基因与调控序列(即启动子)之间的可操作地连接是允许表达目标多核苷酸的功能连接。
可操作地连接的元件可以是连续的或不连续的。当用于指两个蛋白质编码区的连接时，通
过可操作地连接旨在使编码区位于同一阅读框中。该盒可以另外含有至少一个额外的基因
以共转化到生物体中。备选地，可以在多个表达盒上提供一个或多个额外的基因。这种表达盒具有多个限制性位点和/或重组位点，用于插入蛋白质编码区以受调控区的转录调控。表达盒可以另外包含选择性标志基因。
[0281] 表达盒将在转录的5'‑3'方向上包括转录和翻译起始区(即启动子)、本发明的NLR蛋白编码区以及在植物或其它生物体或非人宿主细胞中起作用的转录和翻译终止区(即终
止区)。本发明的调控区(即启动子、转录调控区和翻译终止区)和/或NLR蛋白编码区可以是天然的/类似于宿主细胞的或彼此类似。备选地，本发明的NLR基因、调控区和/或NLR蛋白编码区可以与宿主细胞异源或彼此异源。
[0282] 如本文所用，“异源”是指存在于感兴趣物种中的核酸分子或核苷酸序列是源自与感兴趣的物种不同的物种的核酸分子或核苷酸序列，并且不是通过基因渗入或涉及有性生殖的其它方法引入的，或者如果来自同一物种，存在于感兴趣物种中的核酸分子或核苷酸
序列通过有意的人类干预从其组成和/或基因组位点的天然形式中进行修饰。例如，可操作地连接到异源多核苷酸的启动子来自与多核苷酸来源不同的物种，或者如果来自相同/类
似物种，则一个或两个从其原始形式和/或基因组位点基本上进行了修饰，或者启动子不是可操作地连接的多核苷酸的天然启动子。如本文所用，嵌合基因或嵌合多核苷酸构建体包
含可操作地连接到与编码序列异源的转录起始区的编码序列。
[0283] 本发明提供了至少包含本发明的核酸分子、表达盒和载体的宿主细胞。在本发明的优选实施方案中，宿主细胞是植物细胞。在其它实施方案中，宿主细胞选自由细菌、真菌细胞和动物细胞组成的组。在某些实施方案中，宿主细胞是非人动物细胞。然而，在一些其它实施方案中，宿主细胞是体外培养的人细胞。
[0284] 终止区可以与转录起始区天然存在，可以与可操作地连接的感兴趣的NLR蛋白编码区天然存在，可以与植物宿主天然存在或者可以源自另一个来源(即对启动子、目标蛋白和/或植物宿主来说是外源或异源的)，或其任何组合。方便的终止区可从根癌农杆菌
(A.tumefaciens)的Ti质粒中获得，例如章鱼碱合酶和胭脂碱合酶终止区。另见Guerineau
等人，(1991)Mol.Gen.Genet.262:141‑144；Proudfoot(1991)Cell 64:671‑674；Sanfacon等人，(1991)Genes Dev.5:141‑149；Mogen等人，(1990)Plant Cell 2:1261‑1272；Munroe等人，(1990)Gene 91:151‑158；Ballas等人，(1989)Nucleic Acids Res.17:7891‑7903；和Joshi等人，(1987)Nucleic Acids Res.15:9627‑9639。
[0285] 在适当的情况下，可以优化多核苷酸以增加在转化植物中的表达。也就是说，可以使用植物偏好密码子合成多核苷酸以改善表达。例如，参见Campbell和Gowri(1990)Plant Physiol.92:1‑11讨论宿主偏好密码子的使用。本领域存在可用于合成植物偏好基因的方法。例如，参见美国专利号5,380,831和5,436,391，和Murray等人，(1989)Nucleic Acids Res.17:477‑498，这些参考文献通过引用并入本文。
[0286] 已知其它序列修饰可增强细胞宿主中的基因表达。这些包括消除编码假聚腺苷酸化信号的序列、外显子‑内含子剪接位点信号序列、转座子样重复序列以及其它可能对基因表达有害的表征明确的序列。通过参考宿主细胞中表达的已知基因计算，可以将序列的G‑C含量调整至给定细胞宿主的平均水平。在可能的时候，修饰序列以避免预测的发夹二级
mRNA结构。
[0287] 另外，可以修饰多核苷酸以改变NLR蛋白的氨基酸序列，例如，以提高翻译效率、蛋白质稳定性和/或任何其它期望的性质，和/或减少任何一种或多种不期望的性质，同时改善或至少不显著降低NLR蛋白的生物活性。例如，可以修饰多核苷酸以去除由其编码的蛋白质中潜在的过敏原区域。参见AllergenOnline数据库，了解已知的和推定的过敏原综合列
表(Goodman等人，(2016)Mol.Nutr.Food Res.60(5):1183‑1198；可在万维网上获得：
allergenonline.org)。
[0288] 表达盒可以另外包含5'前导序列。这样的前导序列可以起到增强翻译的作用。翻译前导序列在本领域是众所周知的，包括：小核糖核酸病毒前导序列，例如EMCV前导序列
(脑心肌炎5'非编码区)(Elroy‑Stein等人，(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:6126‑
6130)；马铃薯Y病毒前导序列，例如TEV前导序列(烟草蚀纹病毒)((Gallie等人，(1995)
Gene 165(2):233‑238)，MDMV前导序列(玉米矮花叶病毒)(Virology 154:9‑20)和人免疫球蛋白重链结合蛋白(BiP)(Macejak等人，(1991)Nature 353:90‑94)；苜蓿花叶病毒外壳蛋白mRNA(AMV RNA 4)的非翻译前导序列(Jobling等人，(1987)Nature 325:622‑625)；烟草花叶病毒前导序列(TMV)(Gallie等人，(1989)在Molecular Biology of RNA，Cech编
(Liss，New York)，pp.237‑256)；和玉米褪绿斑驳病毒前导序列(MCMV)(Lommel等人，
(1991)Virology81:382‑385)。另见Della‑Cioppa等人，(1987)Plant Physiol.84:965‑
968。
[0289] 在制备表达盒时，可以操控各种DNA片段，以便以正确的方向和在适当的阅读框中提供DNA序列。为此，可以使用连接物(也称为“衔接物”)或接头连接DNA片段，或者可以涉及其它操作以提供方便的限制性位点、去除多余的DNA、去除限制性位点等。为此，可能涉及体外诱变、引物修复、限制性消化、退火、重置换，例如转换和颠换。
[0290] 许多启动子可用于本发明的实践中。可以根据所需的结果选择启动子。核酸可以与组成性、组织偏好的或其它启动子组合以在植物中表达。这种组成性启动子包括例如
CaMV 35S核心启动子(Odell等人，(1985)Nature313:810‑812)；水稻肌动蛋白(McElroy等人，(1990)Plant Cell 2:163‑171)；泛素(Christensen等人，(1989)Plant Mol.Biol.12:
619‑632和Christensen等人，(1992)Plant Mol.Biol.18:675‑689)；pEMU(Last等人，
(1991)Theor.Appl.Genet.81:581‑588)；MAS(Velten等人，(1984)EMBO J.3:2723‑2730)；
ALS启动子(美国专利号5,659,026)等。其它组成性启动子包括，例如，美国专利号5,608,
149；5,608,144；5,604,121；5,569,597；5,466,785；5,399,680；5,268,463；5,608,142；和
6,177,611。
[0291] 组织偏好的启动子可用于靶向特定植物组织内R蛋白编码序列的增强的表达。这种组织偏好的启动子包括但不限于叶偏好的启动子、根偏好的启动子、种子偏好的启动子
和茎偏好的启动子。组织偏好的启动子包括Yamamoto等人，(1997)Plant J.12(2)：255‑
265；Kawamata等人，(1997)Plant Cell Physiol.38(7):792‑803；Hansen等人，(1997)
Mol.Gen Genet.254(3):337‑343；Russell等人，(1997)Transgenic Res.6(2):157‑168；
Rinehart等人，(1996)Plant Physiol.112(3):1331‑1341；Van Camp等人，(1996)Plant Physiol.112(2):525‑535；Canevascini等人，(1996)Plant Physiol.112(2):513‑524；
Yamamoto等人，(1994)Plant Cell Physiol.35(5):773‑778；Lam(1994)Results 
Probl.Cell Differ.20:181‑196；Orozco等人，(1993)Plant Mol Biol.23(6):1129‑1138；
Matsuoka等人，(1993)Proc Natl.Acad.Sci.USA 90(20):9586‑9590；和Guevara‑Garcia等人，(1993)Plant J.4(3):495‑505。如有必要，可以修饰此类启动子以实现弱表达。
[0292] 转基因可以使用诱导型启动子表达，例如病原体诱导型启动子。这些启动子包括来自病原体感染后诱导的病程相关蛋白(PR蛋白)的启动子；例如，PR蛋白、SAR蛋白、β‑1,3‑葡聚糖酶、几丁质酶等。参见Redolfi等人，(1983)Neth.J.Plant Pathol.89:245‑254；
Uknes等人，(1992)Plant Cell 4:645‑656；和Van Loon(1985)Plant Mol.Virol.4:111‑
116。也参见WO 99/43819，这些参考文献通过引用并入本文。
[0293] 感兴趣的是在病原体感染部位或附近局部表达的启动子。例如，参见Marineau等人，(1987)Plant Mol.Biol.9:335‑342；Matton等人，(1989)Molecular Plant‑Microbe Interactions 2:325‑331；Somsisch等人，(1986)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83:2427‑
2430；Somsisch等人，(1988)Mol.Gen.Genet.2:93‑98；和Yang(1996)
Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93:14972‑14977。也参见Chen等人，(1996)Plant J.10:955‑
966；Zhang等人，(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91:2507‑2511；Warner等人，(1993)
Plant J.3:191‑201；Siebertz等人，(1989)Plant Cell 1:961‑968；美国专利号5,750,386(线虫诱导型)；以及其中引用的参考文献。特别令人感兴趣的是玉米PRms基因的诱导型启
动子，其表达由病原体串珠镰刀菌(Fusarium moniliforme)诱导(参见例如Cordero等人，
(1992)Physiol.Mol.Plant Path.41:189‑200)。
[0294] 另外，当病原体通过伤口或昆虫损伤进入植物时，伤害诱导型启动子可用于本发明的构建中。这种伤害诱导型启动子包括马铃薯蛋白酶抑制剂(pin II)基因(Ryan(1990)
Ann.Rev.Phytopath.28:425‑449；Duan等人，(1996)Nature Biotechnology 14:494‑498)；
wun1和wun2，美国专利号5,428,148；win1和win2(Stanford等人，(1989)
Mol.Gen.Genet.215:200‑208)；系统素(McGurl等人，(1992)Science 225:1570‑1573)；
WIP1(Rohmeier等人，(1993)Plant Mol.Biol.22:783‑792；Eckelkamp等人，(1993)FEBS Letters 323:73‑76)；MPI gene(Corderok等人，(1994)Plant J.6(2):141‑150)；等，这些参考文献通过引用并入本文。
[0295] 化学物质调控的启动子可用于通过应用外源化学调控剂来调控植物中基因的表达。根据目的，启动子可以是化学物质诱导型启动子，其中化学物质的应用诱导基因表达，或者是化学物质抑制型启动子，其中化学物质的应用抑制基因表达。化学物质诱导型启动
子是本领域已知的，包括但不限于由苯磺酰胺除草剂安全剂激活的玉米In2‑2启动子、由用作芽前除草剂的疏水亲电子化合物激活的玉米GST启动子以及由水杨酸激活的烟草PR‑1a
启动子。其它感兴趣的化学物质调控启动子包括类固醇反应性启动子(例如，糖皮质激素诱导型启动子，参见Schena等人，(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:10421‑10425以及
McNellis等人，(1998)Plant J.14(2):247‑257)和四环素诱导型和四环素抑制型启动子
(例如，参见Gatz等人，(1991)Mol.Gen.Genet.227:229‑237，和美国专利号5,814,618和5,
789,156)，这些参考文献通过引用并入本文。
[0296] 表达盒还可以包含用于选择转化细胞的选择性标志基因。选择性标志基因用于选择转化的细胞或组织。标志基因包括编码抗生素抗性的基因，例如编码新霉素磷酸转移酶
II(NEO)和潮霉素磷酸转移酶(HPT)的基因，以及赋予对除草化合物抗性的基因，所述除草
化合物例如草铵膦、溴苯腈、咪唑啉酮和2,4‑二氯苯氧基乙酸酯(2,4‑D)。其它选择性标志物包括表型标志物，如β‑半乳糖苷酶和荧光蛋白，如绿荧光蛋白(GFP)(Su等人，(2004)
Biotechnol Bioeng 85:610‑9和Fetter等人，(2004)Plant Cell 16:215‑28)，青色荧光蛋白(CYP)(Bolte等人，(2004)J.Cell Science 117:943‑54和Kato等人，(2002)Plant 
TM
Physiol 129:913‑42)，和黄色荧光蛋白(获自Evrogen的PhiYFP ，参见Bolte等人，(2004)J.Cell Science 117:943‑54)。关于其它选择性标志物，通常参见Yarranton(1992)
Curr.Opin.Biotech.3:506‑511；Christopherson等人，(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 
89:6314‑6318；Yao等人，(1992)Cell 71:63‑72；Reznikoff(1992)Mol.Microbiol.6:2419‑
2422；Barkley等人，(1980)在The Operon，pp.177‑220；Hu等人，(1987)Cell48:555‑566；
Brown等人，(1987)Cell 49:603‑612；Figge等人，(1988)Cell52:713‑722；Deuschle等人，(1989)Proc.Natl.Acad.Aci.USA  86:5400‑5404；Fuerst等人，(1989)
Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:2549‑2553；Deuschle等人，(1990)Science 248:480‑483；
Gossen(1993)Ph.D.Thesis，University of Heidelberg；Reines等人，(1993)
Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:1917‑1921；Labow等人，(1990)Mol.Cell.Biol.10:3343‑
3356；Zambretti等人，(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:3952‑3956；Baim等人，(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:5072‑5076；Wyborski等人，(1991)Nucleic Acids Res.19:
4647‑4653；Hillenand‑Wissman(1989)Topics Mol.Struc.Biol.10:143‑162；Degenkolb等人，(1991)Antimicrob.Agents Chemother.35:1591‑1595；Kleinschnidt等人，(1988)
Biochemistry 27:1094‑1104；Bonin(1993)Ph.D.Thesis，University of Heidelberg；
Gossen等人，(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:5547‑5551；Oliva等人，(1992)
Antimicrob.Agents Chemother.36:913‑919；Hlavka等人，(1985)Handbook of 
Experimental Pharmacology，Vol.78(Springer‑Verlag，Berlin)；Gill等人，(1988)
Nature 334:721‑724。此类公开通过引用并入本文。
[0297] 上述选择性标志基因列表并非旨在限制。任何选择性标志基因都可以用于本发明。
[0298] 许多植物转化载体和转化植物的方法都是可用的。例如，参见An，G.等人，(1986)Plant Pysiol.，81:301‑305；Fry，J.，等人，(1987)Plant Cell Rep.6:321‑325；Block，M.(1988)Theor .Appl  Genet .76:767‑774；Hinchee，等人，(1990)Stadler.Genet.Symp.203212.203‑212；Cousins，等人，(1991)Aust.J.Plant Physiol.18:
481‑494；Chee，P.P.和Slightom，J.L.(1992)Gene.118:255‑260；Christou，等人，(1992)Trends.Biotechnol.10:239‑246；D’Halluin，等人，(1992)Bio/Technol.10:309‑314；
Dhir，等人，(1992)Plant Physiol.99:81‑88；Casas等人，(1993)Proc.Nat.Acad Sci.USA 
90:11212‑11216；Christou，P.(1993)In Vitro Cell.Dev.Biol.‑Plant；29P:119‑124；
Davies，等人，(1993)Plant Cell Rep.12:180‑183；Dong，J.A.和Mchughen，A.(1993)Plant Sci.91:139‑148；Franklin，C.I.和Trieu，T.N.(1993)Plant.Physiol.102:167；Golovkin，等人，(1993)Plant Sci.90:41‑52；Guo Chin Sci.Bull.38:2072‑2078；Asano，等人，(1994)Plant Cell Rep.13；Ayeres N.M.和Park，W.D.(1994)Crit.Rev.Plant.Sci.13:
219‑239；Barcelo，等人，(1994)Plant.J.5:583‑592；Becker，等人，(1994)Plant.J.5:299‑
307；Borkowska等人，(1994)Acta.Physiol Plant.16:225‑230；Christou，P.(1994)
Agro.Food.Ind.Hi Tech.5:17‑27；Eapen等人，(1994)Plant Cell Rep.13:582‑586；
Hartman，等人，(1994)Bio‑Technology  12:919923；Ritala，等人，(1994)
Plant.Mol.Biol.24:317‑325；和Wan，Y.C.和Lemaux，P.G.(1994)Plant Physiol.104:
3748.
[0299] 在本发明中使用的植物转化载体包括例如T‑DNA载体或质粒，其适用于本文其它地方公开的或本领域其它已知的农杆菌(Agrobacterium)介导的转化方法。
[0300] 本发明的方法涉及将多核苷酸构建体引入植物中。“引入”旨在以使构建体获得进入植物细胞内部的途径的方式向植物呈递多核苷酸构建体。本发明的方法不依赖于将多核苷酸构建体引入植物的特定方法，仅取决于多核苷酸构建体获得进入植物的至少一个细胞
内部的途径。本领域已知将多核苷酸构建体引入植物的方法，包括但不限于稳定转化方法、瞬时转化方法和病毒介导的方法。
[0301] “稳定转化”旨在将引入植物的多核苷酸构建体整合到植物的基因组中，并能够被其后代遗传。“瞬时转化”旨在使引入植物的多核苷酸构建体不整合到植物的基因组中。
[0302] 为了转化植物和植物细胞，使用标准技术将本发明的核苷酸序列插入本领域已知的任何适合在植物或植物细胞中表达核苷酸序列的载体中。载体的选择取决于优选的转化
技术和要转化的目标植物物种。
[0303] 构建植物表达盒和将外源核酸引入植物的方法在本领域中是众所周知的，并且已经在之前描述过。例如，可以使用肿瘤诱导性(Ti)质粒载体将外源DNA引入植物中。用于外源DNA递送的其它方法包括使用PEG介导的原生质体转化、电穿孔、显微注射晶须
(microinjection whiskers)以及用于直接DNA摄取的基因枪法或微粒轰击法。这类方法在
本领域是已知的。(Vasil等人的美国专利号5,405,765；Bilang等人，(1991)Gene 100:247‑
250；Scheid等人，(1991)Mol.Gen.Genet.，228:104‑112；Guerche等人，(1987)Plant 
Science 52:111‑116；Neuhause等人，(1987)Theor.Appl Genet.75:30‑36；Klein等人，(1987)Nature 327:70‑73；Howell等人，(1980)Science 208:1265；Horsch等人，(1985)Science 227:1229‑1231；DeBlock等人，(1989)Plant Physiology91:694‑701；Methods for Plant Molecular Biology(Weissbach和Weissbach编)Academic Press，Inc.(1988)
以及Methods in Plant Molecular Biology(Schuler和Zielinski编)Academic Press，
Inc.(1989))。转化方法取决于要转化的植物细胞、所用载体的稳定性、基因产物的表达水平和其它参数。
[0304] 将核苷酸序列引入植物细胞并随后插入植物基因组的其它合适的方法包括显微注射(记述在Crossway等人，(1986)Biotechniques 4:320‑334)，电穿孔(记述在Riggs等
人，(1986)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83:5602‑5606)，农杆菌介导的转化(记述在Townsend等人，美国专利号5,563,055，Zhao等人，美国专利号5,981,840)，直接基因转移技术(记述在Paszkowski等人，(1984)EMBO J.3:2717‑2722)，和弹道粒子加速(ballistic particle acceleration)(例如，记述在Sanford等人，美国专利号4,945,050；Tomes等人，美国专利号
5,879,918；Tomes等人，美国专利号5,886,244；Bidney等人，美国专利号5,932,782；Tomes等人，(1995)“Direct DNA Transfer into Intact Plant Cells via Microprojectile 
Bombardment,”在Plant Cell，Tissue，and Organ Culture:Fundamental Methods，
Gamborg和Phillips编(Springer‑Verlag，Berlin)；McCabe等人，(1988)Biotechnology 6:
923‑926))；和Lec1转化(WO  00/28058)。也参见Weissinger等人，(1988)
Ann.Rev.Genet.22:421‑477；Sanford等人，(1987)Particulate Science and Technology 
5:27‑37(洋葱)；Christou等人，(1988)Plant Physiol.87:671‑674(大豆)；McCabe等人，(1988)Bio/Technology6:923‑926(大豆)；Finer和McMullen(1991)In Vitro Cell 
Dev.Biol.27P:175‑182(大豆)；Singh等人，(1998)Theor.Appl.Genet.96:319‑324(大豆)；
Datta等人，(1990)Biotechnology  8:736‑740(水稻)；Klein等人，(1988)
Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:4305‑4309(玉米)；Klein等人，(1988)Biotechnology 6:
559‑563(玉米)；Tomes，美国专利号5,240,855；Buising等人，美国专利号5,322,783和5,
324,646；Tomes等人，(1995)“Direct DNA Transfer into Intact Plant Cells via 
Microprojectile Bombardment,”在Plant Cell,Tissue,and Organ Culture:
Fundamental Methods，Gamborg编(Springer‑Verlag，Berlin)(玉米)；Klein等人，(1988)Plant Physiol.91:440‑444(玉米)；Fromm等人，(1990)Biotechnology 8:833‑839(玉米)；
Hooykaas‑Van Slogteren等人，(1984)Nature(London)311:763‑764；Bowen等人，美国专利号5,736,369(谷物)；Bytebier等人，(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84:5345‑5349(百合科)；De Wet等人，(1985)在The Experimental Manipulation of Ovule Tissues，Chapman等人编，(Longman，New York)，pp.197‑209(花粉)；Kaeppler等人，(1990)Plant Cell Reports 9:415‑418和Kaeppler等人，(1992)Theor.Appl.Genet.84:560‑566(晶须介导的转化)；D’Halluin等人，(1992)Plant Cell 4:1495‑1505(电穿孔)；Li等人，(1993)Plant Cell Reports 12:250‑255以及Christou和Ford(1995)Annals of Botany 75:407‑413(水稻)；Osjoda等人，(1996)Nature Biotechnology 14:745‑750(玉米，通过根癌农杆菌)；所有这些都通过引用并入本文。
[0305] 本发明的多核苷酸可以通过将植物与病毒或病毒核酸接触而引入植物中。一般地，这些方法涉及将本发明的多核苷酸构建体并入病毒DNA或RNA分子中。此外，认识到本发明的启动子还包括用于通过病毒RNA聚合酶转录的启动子。本领域已知将多核苷酸构建体
引入植物并在其中表达所编码的蛋白质(涉及病毒DNA或RNA分子)的方法。例如，参见美国
专利号5,889,191、5,889,190、5,866,785、5,589,367和5,316,931；它们通过引用合并。
[0306] 如果需要，可以在制剂中制备修饰的病毒或修饰的病毒核酸。这些制剂是以已知的方式制备的(例如，综述参见US 3,060,084，EP‑A 707 445(关于液体浓缩物)，Browning，“Agglomeration”，Chemical Engineering，Dec.4，1967，147‑48，Perry’s Chemical Engineer’s Handbook，第4版McGraw‑Hill，New York，1963，pages 8‑57等等，WO 91/
13546，US 4,172,714，US 4,144,050，US 3,920,442，US 5,180,587，US 5,232,701，US 5,
208,030，GB 2,095,558，US 3,299,566，Klingman，Weed Control as a Science，John Wiley and Sons，Inc.，New York，1961，Hance等人，Weed Control Handbook，第8版，Blackwell Scientific Publications，Oxford，1989，以及Mollet，H.，Grubemann，A.，Formulation technology，Wiley VCH Verlag GmbH，Weinheim(Germany)，2001，
2.D.A.Knowles，Chemistry and Technology of Agrochemical Formulations，Kluwer 
Academic Publishers，Dordrecht，1998(ISBN0‑7514‑0443‑8)，例如，通过使用适用于农药配制的助剂(如溶剂和/或载剂)扩展活性化合物，如果需要的话，可以使用乳化剂、表面活性剂和分散剂、防腐剂、消泡剂、防冻剂，对于种子处理制剂，还任选地使用着色剂和/或粘合剂和/或胶凝剂。
[0307] 在具体的实施方案中，本发明的多核苷酸构建体和表达盒可以使用本领域已知的各种瞬时转化方法提供给植物。这些方法包括例如显微注射或微粒轰击法。例如，参见
Crossway等人，(1986)Mol Gen.Genet.202:179‑185；Nomura等人，(1986)Plant Sci.44:
53‑58；Hepler等人，(1994)PNAS Sci.91:2176‑2180以及Hush等人，(1994)J.Cell Science 
107:775‑784，所有这些都通过引用并入本文。备选地，可以使用本领域已知的技术将多核苷酸瞬时转化到植物中。这些技术包括病毒载体系统和根癌农杆菌介导的瞬时表达，如本
文其它地方所述。
[0308] 已经转化的细胞可以按照常规方式生长成植物。例如，参见McCormick等人，(1986)Plant Cell Reports 5:81‑84。然后可以生长出这些植物，并用相同的转化植株或不同的植株授粉，并且鉴定出具有所需表型特征的组成性表达的所得杂种。可以生长出两
代或更多代以确保稳定维持和遗传所需表型特征的表达，然后收获种子以确保实现所需表
型特征的表达。以这种方式，本发明提供了转化的种子(也称为“转基因种子”)，在种子的基因组中稳定并入本发明的多核苷酸构建体，例如本发明的表达盒。
[0309] 本领域已知的用于修饰植物基因组中DNA的此类方法包括例如突变育种和基因组编辑技术，例如涉及靶向诱变、定点整合(SDI)和同源重组的方法。美国专利号5,565,350、
5,731,181、5,756,325、5,760,012、5,795,972、5,871,984和8,106,259中公开了靶向诱变或类似技术；所有这些都通过引用完整地并入本文。包含同源重组的基因修饰或基因置换
方法可能涉及使用锌指核酸酶(ZFN)、TAL(转录激活因子样)效应物核酸酶(TALEN)、规律间隔成簇短回文重复序列/CRISPR相关核酸酶(CRISPR/Cas核酸酶)或归巢核酸内切酶诱导
DNA中的单链或双链断裂，归巢核酸内切酶是已被改造的核酸内切酶，在植物、其它生物体或宿主细胞的基因组中的特定识别序列上产生双链断裂。例如，参见Durai等人，(2005)
Nucleic Acids Res.33:5978‑90；Mani等人，(2005)Biochem.Biophys.Res.Comm 335:447‑
57；美国专利号7,163,824、7,001,768和6,453,242；Arnould等人，(2006)J Mol.Biol.355:
443‑58；Ashworth等人，(2006)Nature 441:656‑9；Doyon等人，(2006)J Am Chem Soc 128:
2477‑84；Rosen等人，(2006)Nucleic Acids Res.34:4791‑800；和Smith等人，(2006)
Nucleic Acids Res.34:e149；美国专利申请公开号2009/0133152；和美国专利申请公开号
2007/0117128；所有这些都通过引用完整地并入本文。
[0310] TAL效应物核酸酶(TALEN)可用于在植物基因组中的特定识别序列上制造双链断裂，以通过同源重组进行基因修饰或基因置换。TAL效应物核酸酶是一类序列特异性核酸
酶，可用于在植物或其它生物体基因组中的特定靶序列处制造双链断裂。TAL效应物核酸酶是通过将天然或改造的转录激活因子样(TAL)效应物或其功能部分融合到核酸内切酶(例
如FokI)的催化结构域而产生。独特的模块化TAL效应物DNA结合结构域允许设计具有潜在
任何给定DNA识别特异性的蛋白质。因此，可以改造TAL效应核酸酶的DNA结合结构域以识别特定的DNA靶位点，从而用于在所需的靶序列上进行双链断裂。参见WO 2010/079430；
Morbitzer等人，(2010)PNAS 10.1073/pnas.1013133107；Scholze和Boch(2010)Virulence 
1:428‑432；Christian等人，Genetics(2010)186:757‑761；Li等人，(2010)Nuc.Acids Res.(2010)doi:10.1093/nar/gkq704；和Miller等人，(2011)Nature Biotechnology29:143‑
148；所有这些都通过引用并入本文。
[0311] CRISPR/Cas核酸酶系统还可用于在植物基因组中的特定识别序列处制造单链或双链断裂，以通过同源重组进行基因修饰或基因置换。CRISPR/Cas核酸酶是一种RNA引导的(简单指导RNA，简称sgRNA)DNA核酸内切酶系统，在与设计的RNA同源的DNA区段中制造序列特异性双链断裂。可以设计序列的特异性(Cho S.W.等人，Nat.Biotechnol.31:230‑232，
2013；Cong L.等人，Science 339:819‑823，2013；Mali P.等人，Science 339:823‑826，
2013；Feng Z.等人，Cell Research:1‑4，2013)。
[0312] 此外，ZFN可用于在植物基因组中的特定识别序列上制造双链断裂，以通过同源重组进行基因修饰或基因置换。锌指核酸酶(ZFN)是一种融合蛋白，其包含负责DNA切割的
FokI限制性核酸内切酶蛋白和锌指蛋白，所述锌指核酸酶(ZFN)识别特定的设计的基因组
序列，并在这些序列上切割双链DNA，从而产生游离的DNA末端(Urnov F.D.等人，Nat Rev Genet.11:636‑46，2010；Carroll D.，Genetics.188:773‑82，2011)。
[0313] 使用位点特异性核酸酶(例如上文所述的核酸酶)断裂DNA可以增加断裂区域中的同源重组率。因此，如上所述的这种效应子与核酸酶的偶联使得能够在基因组中产生靶向
的变化，包括添加、缺失和其它修饰。
[0314] 除非从使用的上下文中明确说明或显而易见，否则本发明的方法和组合物可用于任何植物物种，包括例如单子叶的植物(“单子叶植物”)、双子叶的植物(“双子叶植物”)和针叶树。感兴趣的植物物种的例子包括但不限于：玉米(玉蜀黍(Zea mays))，芸薹属
(Brassica sp.)(例如，甘蓝型油菜(B.napus)，白菜(B.rapa)，芥菜(B.juncea))，尤其是那些可用作种子油来源的芸薹属物种：苜蓿(紫花苜蓿(Medicago sativa))、水稻(稻(Oryza sativa))、黑麦(Secale cereale)、黑小麦(×黑小麦(Triticosecale)或小麦(Triticum)
×黑麦(Secale))，高粱(Sorghum bicolor，Sorghum vulgare)，苔麸(teff，Eragrostis 
tef)，小米(例如，珍珠粟(御谷(Pennisetum glaucum)，黍(稷(Panicum miliaceum)、粟(谷子(Setaria italica))，龙爪稷(穇(Eleusine coracana))，柳枝稷(Panicum virgatum)，向日葵(Helianthus annuus)，红花(Carthamus tinctorius)，小麦(Triticum aestivum)，大豆(Glycine max)，烟草(Nicotiana tabacum)，马铃薯(Solanum tuberosum)，花生(落花生(Arachis hypogaea)，棉花(海岛棉(Gossypium barbadense)，陆地棉(Gossypium 
hirsutum))，草莓(例如，Fragaria×ananassa，野草莓(Fragaria vesca)，麝香草莓
(Fragaria  moschata)，弗州草莓(Fragaria  virginiana)，智利草莓(Fragaria 
chiloensis))，甘薯((番薯(Ipomoea batatus))，山药(薯蓣(Dioscorea spp.)，几内亚薯蓣(D.rotundata)，D.cayenensis，参薯(D.alata)，薯蓣(D.polystachya)，黄独
(D.bulbifera)，甜薯(D.esculenta)，杜氏薯蓣(D.dumetorum)，三浅裂薯蓣(D.trifida))，木薯(Manihot esculenta)，咖啡树(Coffea spp.)，椰子(Cocos nucifera)，油棕木(例如，油棕(Elaeis guineensis)，美洲油棕(Elaeis oleifera))，菠萝(凤梨(Ananas 
comosus))，柑橘树(柑橘(Citrus spp.))，可可树(可可(Theobroma cacao))，茶树
(Camellia sinensis)，香蕉(芭蕉(Musa spp.))，鳄梨(Persea americana)，无花果(Ficus casica)，番石榴(Psidium guajava)，芒果(杧果(Mangifera indica))，橄榄(木樨榄(Olea europaea))，番木瓜(Carica papaya)，腰果树(Anacardium occidentale))，澳洲坚果
(Macadamia integrifolia))，杏树(扁桃(Prunus amygdalus))，海枣(Phoenix 
dactylifera)，甜菜栽培形式(糖用甜菜，菜用甜菜，莙荙菜(chard or spinach beet)，饲用甜菜(mangelwurzel beet或fodder beet)，甘蔗(Saccharum spp.)，燕麦(Avena 
sativa)，大麦(Hordeum vulgare)，大麻(Cannabis sativa，C.indica，C.ruderalis)，杨树(Populus spp.)，桉树(Eucalyptus spp.)，拟南芥，Arabidopsis rhizogenes，本氏烟草(Nicotiana benthamiana)，二穗短柄草，观赏性植物，针叶树以及其它树。在具体的实施方案中，本发明的植物是农作物(例如，玉米、高粱、小麦、小米、水稻、大麦、燕麦、甘蔗、苜蓿、大豆、花生、向日葵、棉花、红花、芸薹属、生菜、草莓、苹果、柑橘类等)。
[0315] 蔬菜包括：番茄(Lycopersicon esculentum)，茄子(也称为“aubergine”或“brinjal”)(茄(Solanum melongena))，辣椒，生菜(例如，莴苣(Lactuca sativa))，四季豆(菜豆(Phaseolus vulgaris))，利马豆(棉豆(Phaseolus limensis))，豌豆(山黧豆
(Lathyrus spp.))，鹰嘴豆(Cicer arietinum)，和黄瓜属的成员，例如：黄瓜(C.sativus)，哈密瓜(甜瓜(C.cantalupensis))和香瓜(C.melo)。观赏性植物包括：映山红(杜鹃花
(Rhododendron spp.))，绣球花(Macrophylla hydrangea)，木槿(朱槿(hibiscus 
rosasanensis))，玫瑰(Rosa spp.)，郁金香(Tulipa spp.)，黄水仙(水仙(Narcissus 
spp.))，矮牵牛(Petunia hybrida)，康乃馨(香石竹(Dianthus caryophyllus))，一品红
(Euphorbia pulcherrima)以及菊花。果树和相关植物包括，例如：苹果，梨，桃，梅子，橙子，葡萄柚，酸橙，柚子，棕榈和香蕉。坚果树和相关植物包括，例如：杏树，腰果树，核桃树，开心果树，澳洲坚果，欧洲榛，榛子和美洲山核桃。
[0316] 在具体的实施方案中，本发明的植物是农作物，例如：玉蜀黍(玉米)，大豆，小麦，水稻，棉花，苜蓿，向日葵，油菜(芸薹属，尤其是油菜(Brassica napus)、白菜(Brassica rapa)、芥菜(Brassica juncea))，菜籽油菜(欧洲油菜(Brassica napus))，高粱，小米，大麦，黑小麦，红花，花生，甘蔗，烟草，马铃薯，番茄和辣椒。
[0317] 在一些优选的实施方案中，本发明的方法和组合物可用于增强农作物(尤其是驯化的小麦植物)对以下一种或多种小麦病害的抗性：小麦秆锈菌引起的小麦秆锈病，小麦条锈菌引起的小麦条锈病，小麦叶锈菌引起的小麦叶锈病和小麦型稻瘟病菌引起的小麦瘟
病。培育的小麦植物包括但不限于：普通小麦或面包小麦(Triticum aestivum)，硬粒小麦(杜兰小麦(Triticum durum或Triticum turgidum subsp.durum))，单粒小麦(一粒小麦
(Triticummonococcum))，斯佩耳特小麦(Triticum Triticum spelta)，二粒小麦
(Triticum turgidum subsp.Dicoccum；Triticum turgidum conv.durum)和东方小麦
(Triticum turgidum ssp.Turanicum或Triticum turanicum)。
[0318] 术语“植物”意指处于任何成熟或发育阶段的植物，以及从任何此类植物获得或衍生的任何细胞、组织或器官(植物部分)，除非上下文另有明确说明。植物部分包括但不限于果实、茎、块茎、根、花、胚珠、雄蕊、花瓣、叶、下胚轴、上胚轴、子叶、胚、分生组织区域、愈伤组织、花药培养物、配子体、孢子体、花粉、小孢子、原生质体、种子等。公认的是，本发明的植物原生质体可以由上述植物部分中的任何一个或多个以及在发育和/或成熟的任何阶段制备。
[0319] 同样，术语“植物细胞”旨在涵盖在成熟或发育的任何阶段从植物或在植物中获得的植物细胞，除非上下文另有明确说明。植物细胞可以来自或位于植物部分，包括但不限于果实、茎、块茎、根、花、胚珠、雄蕊、叶、胚、分生组织区域、愈伤组织、花药培养物、配子体、孢子体、花粉、小孢子、体外培养的组织、器官或细胞等。
[0320] 再生植物的后代、变种和突变体也包括在本发明的范围内，前提是这些部分包含引入的多核苷酸。如本文所用，“后代”和“后代植物”包括植物的任何后续世代，无论是由有性繁殖和/或无性繁殖产生的，除非另有明确说明或从使用的上下文来看是显而易见的。
[0321] 本文使用的术语“表达”是指基因产物的生物合成，包括所述基因产物的转录和/或翻译。由DNA分子“表达”或“产生”蛋白质或多肽是指编码序列的转录和翻译以产生蛋白质或多肽，而由RNA分子“表达”或“产生”蛋白质或多肽是指RNA编码序列的翻译以产生蛋白质或多肽。优选地，对于本发明的方法，除非另有说明或从使用上下文来看显而易见，否则如果在植物、植物器官或其它植物部分中检测到NLR的mRNA(即转录本)，则该NLR是在植物、植物器官或其它植物部分中表达的NLR。
[0322] 本文中术语“DNA”或“RNA”的使用并非旨在将本发明限制于包含DNA或RNA的多核苷酸分子。本领域普通技术人员将认识到，本发明的方法和组合物涵盖核酸分子、多核苷酸、多核苷酸构建体、表达盒和由脱氧核糖核苷酸(即DNA)、核糖核苷酸(即RNA)或核糖核苷酸和脱氧核糖核苷酸的组合组成的载体。这种脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸包括天然存在
的分子和合成类似物，包括但不限于核苷酸类似物或修饰的骨架残基或连接，其是合成的、天然存在的和非天然存在的，其具有与参考核酸类似的结合特性，并且其以类似于参考核
苷酸的方式代谢。此类类似物的例子包括但不限于硫代磷酸酯、磷酰胺、甲基膦酸酯、手性甲基膦酸酯、2‑O‑甲基核糖核苷酸、肽核酸(PNA)。本发明的多核苷酸分子还包括所有形式的多核苷酸分子，包括但不限于单链形式、双链形式、发夹、茎‑环结构等。此外，本领域普通技术人员理解，本文公开的核苷酸序列还涵盖该示例性核苷酸序列的互补物。
[0323] 本发明涉及用于产生对由一种、两种、三种、四种或更多种植物病原体引起的植物病害具有增强的抗性的植物的组合物和方法。“对植物病害的抗性”或“抗病性”旨在植物避免植物‑病原体相互作用产生的病害症状。也就是说，防止一种或多种病原体引起一种或多种植物病害以及相关的病害症状，或者备选地，最小化或减轻由一种或多种病原体引起的病害症状。
[0324] 虽然制备候选R基因的文库的方法和鉴定R基因的方法已经在很大程度上描述了针对植物病原体的R基因，这些植物病原体会导致感兴趣的植物的植物病害，但本发明的方法广泛适用于针对任何植物有害生物的R基因，包括但不限于，植物病原体(例如真菌、卵
菌、细菌、病毒和线虫)以及对植物造成损害的昆虫和螨虫。因此，除非明确说明或从使用背景中显而易见，否则本文使用的术语“植物病原体”包括任何植物有害生物。类似地，本文中使用的术语“植物病害”或“病害”包括植物有害生物对植物造成的任何损害，除非明确说明或从使用上下文中明显说明。
[0325] 植物病原体包括例如细菌、真菌、卵菌、病毒、线虫等。主要作物的特定病原体包括：大豆：大豆疫霉(Phytophthora megasperma fsp.glycinea)，菜豆壳球孢菌(Macrophomina phaseolina)，立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)，核盘菌(Sclerotinia 
sclerotiorum)，尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)，菜豆间座壳大豆变种(Diaporthe 
phaseolorum var.sojae，大豆拟茎点霉(Phomopsis sojae))，大豆北方茎溃疡病菌
(Diaporthe phaseolorum var.caulivora)，白绢病菌(Sclerotium rolfsii)，大豆紫斑病菌(Cercospora kikuchii)，大豆灰斑病菌(Cercospora sojina)，大豆霜霉病菌
(Peronospora manshurica)，束状刺盘孢(Colletotrichtum dematium，平头炭疽菌
(Colletotichtum truncatum))，多主棒孢(Corynespora cassiicola)，大豆壳针孢
(Septoria glycines)，Phyllosticta sojicola，,链格孢(Alternaria alternata)，丁香假单胞菌大豆致病变种(Pseudomonas syringae p.v.glycinea)，野油菜黄单胞菌菜豆致
病变种(Xanthomonas campestris p.v.phaseoli)，大豆白粉病菌(Microsphaera 
diffusa)，半裸镰刀菌(Fusarium semitectum)，大豆茎褐腐病菌(Phialophora gregata)，大豆花叶病毒，大豆丛壳菌(Glomerella glycines)，烟草环斑病毒，烟草线条病毒，豆薯层锈菌(Phakopsora pachyrhizi)，瓜果腐霉(Pythium aphanidermatum)，终极腐霉(Pythium ultimum)，德巴利腐霉(Pythium debaryanum)，番茄斑萎病毒，大豆孢囊镰刀菌
(Heterodera glycines Fusarium solani)；油菜：白锈菌(Albugo candida)，白菜黑斑病菌(Alternaria brassicae)，油菜茎基溃疡病菌(Leptosphaeria maculans)，立枯丝核菌
(Rhizoctonia  solani)，核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)，芸苔生球腔菌
(Mycosphaerella brassicicola)，终极腐霉(Pythium ultimum)，寄生霜霉(Peronospora parasitica)，粉红镰刀菌(Fusarium roseum)，链格孢(Alternaria alternata)；苜蓿：苜蓿黄萎病菌(Clavibacter michiganese subsp.Insidiosum)，终极腐霉(Pythium 
ultimum)，畸雌腐霉(Pythium irregulare)，华丽腐霉(Pythium splendens)，德巴利腐霉(Pythium debaryanum)，瓜果腐霉(Pythium aphanidermatum)，大豆疫霉(Phytophthora 
megasperma)，三叶草霜霉(Peronospora trifoliorum)，茎点霉苜蓿medicaginis变种
(Phoma medicaginis var.medicaginis)，苜蓿尾孢(Cercospora medicaginis)，苜蓿假盘菌(Pseudopeziza medicaginis)，苜蓿黄斑病菌(Leptotrochila medicaginis)，尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)，黑白轮枝菌(Verticillium albo‑atrum)，野油菜黄单胞菌苜蓿致病变种(Xanthomonas campestris p.v.alfalfae)，豌豆根腐丝囊霉(Aphanomyces 
euteiches)，草色匍柄霉(Stemphylium herbarum)，苜蓿匍柄霉(Stemphylium alfalfae)，三叶草刺盘孢(Colletotrichum trifolii)，苜蓿小光壳(Leptosphaerulina briosiana)，条纹尾孢霉(Uromyces striatus)，三叶草核盘菌(Sclerotinia trifoliorum)，苜蓿担孢
子菌(Stagonospora meliloti)，葱叶枯病菌(Stemphylium botryosum)，Leptotrichila 
medicaginis；小麦：丁香假单胞菌暗黑致病变种(Pseudomonas  syringae 
p.v.atrofaciens)，秆黑粉病菌(Urocystis agropyri)，野油菜黄单胞菌小麦致病变种
(Xanthomonas campestris p.v.translucens)，丁香假单胞菌丁香致病变种(Pseudomonas syringae p.v.syringae)，链格孢(Alternaria alternata)，腊叶芽枝霉(Cladosporium 
herbarum)，禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)，燕麦镰刀菌(Fusarium avenaceum)，大刀镰刀菌(Fusarium culmorum)，小麦散黑粉病菌(Ustilago tritici)，小麦囊二孢菌
(Ascochyta tritici)，禾条斑头孢霉(Cephalosporium gramineum)，玉米炭疽菌
(Collotetrichum graminicola)，小麦白粉菌(Erysiphe graminis f.sp.tritici)，小麦
秆锈菌(Puccinia graminis f.sp.tritici)，布氏大麦白粉病菌(Puccinia graminis 
f.sp.hordei)，Puccinia graminis f.sp.avenae，Puccinia graminis f.sp.secalis，小麦叶锈病菌(Puccinia recondita f.sp.tritici)，小麦条锈菌(Puccinia striiformis)，小麦黄斑病真菌(Pyrenophora tritici‑repentis)，小麦颖枯病菌(Septoria nodorum)，小麦壳针孢(Septoria tritici)，燕麦壳针孢(Septoria avenae)，小麦基腐病菌
(Pseudocercosporella herpotrichoides)，立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)，禾谷丝核菌(Rhizoctonia cerealis)，小麦全蚀病菌(Gaeumannomyces graminis var.tritici)，瓜果腐霉(Pythium aphanidermatum)，多雄腐霉(Pythium arrhenomanes)，终极腐霉
(Pythium ultimum)，小麦根腐病(Bipolaris sorokiniana)，大麦黄矮病毒，雀麦草花叶病毒，土壤传播小麦花叶病毒，小麦条纹花叶病毒，小麦梭条斑花叶病毒，小麦美利坚条纹花叶病毒，麦角菌(Claviceps purpurea)，小麦腥黑粉菌(Tilletia tritici)，小麦光腥黑粉菌(Tilletia laevis)，小麦散黑粉病菌(Ustilago tritici)，小麦印度腥黑穗病菌
(Tilletia indica)，立枯丝核菌(Rhizoctonia  solani)，强雄腐霉(pythium 
arrhenomannes)，禾生腐霉(Pythium gramicola)，瓜果腐霉(Pythium aphanidermatum)，高原病毒，欧小麦条纹病毒；向日葵：霍尔斯单轴霉(Plasmopora halstedii)，核盘菌
(Sclerotinia sclerotiorum)，翠菊黄化病菌(Aster Yellows)，向日葵壳针孢菌
(Septoria helianthi)，褐色茎腐病菌(Phomopsis helianthi)，向日葵黑斑病菌
(Alternaria helianthi)，百日草链格孢菌(Alternaria zinniae)，灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea)，茎点霉黑茎病菌(Phoma macdonaldii)，菜豆壳球孢菌(Macrophomina 
phaseolina)，黄瓜白粉病菌(Erysiphe cichoracearum)，米根霉(Rhizopus oryzae)，少根根霉(Rhizopus arrhizus)，匍枝根霉菌(Rhizopus stolonifer)，向日葵锈病菌(Puccinia helianthi)，大丽轮枝菌(Verticillium dahliae)，Erwinia carotovorum 
pv.carotovora，顶头孢霉菌(Cephalosporium acremonium)，隐地疫霉(Phytophthora 
cryptogea)，白锈菌(Albugo tragopogonis)；玉米：禾生炭疽菌(Colletotrichum 
graminicola)，串珠镰刀菌胶孢变种(Fusarium moniliforme var.subglutinans)，玉米细菌性枯萎病菌(Erwinia stewartii)，玉米赤霉(Gibberella zeae，禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum))，拟轮生镰孢菌(Fusarium verticilloides)，Stenocarpella maydi(玉蜀
黍壳色单隔孢菌(Diplodia maydis))，畸雌腐霉，德巴利腐霉菌，禾生腐霉菌(Pythium 
graminicola)，华丽腐霉，终极腐霉，瓜果腐霉，黄曲霉(Aspergillus flavus)，玉米小斑病菌O种、T种(Bipolaris maydis O,T，Cochliobolus heterostrophus)，玉米圆斑病菌
(Helminthosporium carbonum)I、II和III(Cochliobolus carbonum)，玉米大斑病菌
(Exserohilum turcicum)I、II和III，小柄长蠕孢(Helminthosporium pedicellatum)，玉米褐斑病菌(Physoderma maydis)，玉米黄叶枯病菌(Phyllosticta maydis)，玉蜀黍球梗
孢菌(Kabatiella maydis)，高粱尾孢(Cercospora sorghi)，玉米黑粉菌(Ustilago 
maydis)，玉米锈病菌(Puccinia sorghi)，多堆柄锈菌菌(Puccinia polysora)，菜豆壳球孢菌(Macrophomina phaseolina)，草酸青霉(Penicillium oxalicum)，稻黑孢
(Nigrospora oryzae)，腊叶芽枝霉，新月弯孢菌(Curvularia lunata)，不等弯孢菌
(Curvularia inaequalis)，苍白弯孢霉(Curvularia pallescens)，Clavibacter 
michiganense subsp.nebraskense，绿色木霉(Trichoderma viride)，玉米矮花叶病毒A和B，小麦条纹花叶病毒，玉米褪绿矮缩病毒，高粱麦角菌(Claviceps sorghi)，燕麦假单胞菌(Pseudonomas avenae)，菊欧文氏菌玉米致病变种(Erwinia chrysanthemi pv.zea)，胡萝卜软腐欧文氏菌(Erwinia carotovora)，玉米矮小螺原体(Corn stunt spiroplasma)，大
孢色二孢(Diplodia macrospora)，大孢指疫霉(Sclerophthora macrospora)，高粱指霜霉菌(Peronosclerospora  sorghi)，非律宾指霜霉菌(Peronosclerospora 
philippinensis)，玉蜀黍指霜霉(Peronosclerospora  maydis)，甘蔗指霜霉
(Peronosclerospora sacchari)，玉米丝黑穗病菌(Sphacelotheca reiliana)，玉米壳锈
菌(Physopella  zeae)，玉米头孢霉(Cephalosporium  maydis)，顶头孢霉菌
(Cephalosporium acremonium)，玉米枯黄斑点病毒，高原病毒(High Plains Virus)，玉米花叶病毒，玉米雷亚多非纳病毒，玉米条纹病毒，玉米斑纹病毒，玉米粗矮缩病毒；高粱：玉米大斑病菌(Exserohilum turcicum)，高粱炭疽病菌(C.sublineolum)，高粱紫斑病菌
(Cercospora sorghi)，高粱胶尾孢(Gloeocercospora sorghi)，高粱生壳二孢(Ascochyta sorghina)，丁香假单胞菌丁香致病变种(Pseudomonas syringae p.v.syringae)，野油菜
黄单胞菌栖绒毛草致病变种(Xanthomonas campestris p.v.holcicola)，须芒草假单胞杆
状细菌(Pseudomonas andropogonis)，紫柄锈菌(Puccinia purpurea)，菜豆壳球孢菌
(Macrophomina phaseolina)，Perconia  circinata，串珠镰刀菌(Fusarium 
moniliforme)，链格孢，高粱靶斑病菌(Bipolaris sorghicola)，Helminthosporium 
sorghicola，新月弯孢霉(Curvularia lunata)，高粱茎点霉(Phoma insidiosa)，燕麦假单胞菌(Pseudomonas avenae)，金狗尾草叶斑病假单胞菌(Pseudomonas alboprecipitans)，高粱座枝孢菌(Ramulispora sorghi)，蜀黍生座枝孢(Ramulispora sorghicola)，
Phyllachara sacchari，丝轴黑粉菌(Sporisorium reilianum)(玉米丝黑穗病菌
(Sphacelotheca reiliana))，高粱轴黑粉菌(Sphacelotheca cruenta)，高粱坚孢堆黑粉
菌(Sporisorium sorghi)，甘蔗花叶病毒H，玉米矮小花叶病毒A和B，高粱麦角菌
(Claviceps sorghi)，立枯丝核菌，枝顶孢霉(Acremonium strictum)，小麦霜霉病菌
(Sclerophthona macrospora)，高粱指霜霉菌(Peronosclerospora sorghi)，非律宾指霜
霉菌(Peronosclerospora philippinensis)，禾生指梗霉(Sclerospora graminicola)，禾谷镰刀菌，拟轮生镰孢菌(F.verticillioides)，尖孢镰刀菌，多雄腐霉(Pythium 
arrhenomanes)，禾生腐霉菌(Pythium graminicola)等；番茄：密执安棒杆菌番茄溃疡致病变种(Corynebacterium michiganense pv.michiganense)，丁香假单胞菌番茄致病变种
(Pseudomonas syringae pv.tomato)，青枯雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum)，辣椒疮
痂病菌(Xanthomonas vesicatoria)，疮痂病菌(Xanthomonas perforans)，番茄早疫病菌
(Alternaria solani)，葱链格孢菌(Alternaria porri)，刺盘孢属(Collectotrichum 
spp.)，番茄叶霉病菌(Fulvia fulva Syn.Cladosporium fulvum)，尖孢镰刀菌番茄专化型(Fusarium oxysporum f.lycopersici)，鞑靼内丝白粉菌(Leveillula taurica)/辣椒拟
粉孢(Oidiopsis  taurica)，致病疫霉(Phytophthora infestans)，疫霉菌属
(Phytophthora spp.)其它种，番茄煤污假尾孢(Pseudocercospora fuligena 
Syn.Cercospora fuligena)，齐整小核菌(Sclerotium rolfsii)，茄壳针孢菌(Septoria 
lycopersici)，根结线虫属(Meloidogyne spp.)；马铃薯：青枯雷尔氏菌(Ralstonia 
solanacearum)，青枯假单胞菌(Pseudomonas solanacearum)，胡萝卜软腐欧文氏菌马铃薯黑胫病亚种(Erwinia carotovora subsp.Atroseptica)，胡萝卜软腐欧文氏菌胡萝卜亚种
(Erwinia carotovora subsp.Carotovora)，果胶杆菌亚种(Pectobacterium carotovorum subsp.Atrosepticum)，荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)，密执克杆菌亚种
(Clavibacter michiganensis subsp.Sepedonicus)，马铃薯环腐病菌(Corynebacterium 
sepedonicum)，疮茄病链霉菌(Streptomyces scabiei)，果腐刺盘孢菌(Colletotrichum 
coccodes)，链格孢(Alternaria alternate)，马铃薯菌绒孢(Mycovellosiella concors)，马铃薯灰斑病菌(Cercospora solani)，菜豆壳球孢菌(Macrophomina phaseolina)，甘薯
小菌核菌(Sclerotium bataticola)，瓜笄霉(Choanephora cucurbitarum)，马铃薯锈病菌(Puccinia pittieriana)，畸形锈菌(Aecidium cantensis)，番茄早疫病菌(Alternaria 
solani)，镰刀菌属(Fusarium spp.)，茄生茎点霉(Phoma solanicola f.foveata)，灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea)，富氏葡萄孢盘菌(Botryotinia fuckeliana)，致病疫霉
(Phytophthora infestans)，腐霉属(Pythium spp.)，安迪戈纳茎点霉安迪纳变种(Phoma andigena var.andina)，枯叶格孢腔菌(Pleospora herbarum)，草绿匍柄霉(Stemphylium herbarum)，菊科白粉菌(Erysiphe cichoracearum)，马铃薯粉痂菌(Spongospora 
subterranean)，立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)，水稻纹枯病菌(Thanatephorus 
cucumeris)，座坚壳属(Rosellinia sp.)，Dematophora sp.，茄壳针孢菌(Septoria 
lycopersici)，茄长蠕孢(Helminthosporium solani)，马铃薯皮斑病菌(Polyscytalum 
pustulans)，齐整小核菌(Sclerotium rolfsii)，罗耳阿太菌(Athelia rolfsii)，马铃薯黑粉病菌(Angiosorus solani)，Ulocladium atrum，黑白轮枝菌(Verticillium albo‑
atrum)，大丽轮枝菌(V.dahlia)，内生集壶菌(Synchytrium endobioticum)，核盘菌
(Sclerotinia sclerotiorum)；香蕉：香蕉炭疽病菌(Colletotrichum musae)，蜜环菌
(Armillaria mellea)，假蜜环菌(Armillaria tabescens)，青枯假单胞菌(Pseudomonas 
solanacearum)，香蕉生黑痣菌(Phyllachora musicola)，香蕉黑条叶斑病菌
(Mycosphaerella fijiensis)，Rosellinia bunodes，假单胞菌属(Pseudomas spp.)，
Pestalotiopsis leprogena，Cercospora hayi，青枯假单胞菌(Pseudomonas 
solanacearum)，奇异长喙壳菌(Ceratocystis paradoxa)，可可轮刺孢菌(Verticillium 
theobromae)，Trachysphaera fructigena，香蕉枝孢霉(Cladosporium musae)，
Junghuhnia vincta，Cordana johnstonii，香蕉暗双孢菌(Cordana musae)，苍白镰刀菌
(Fusarium pallidoroseum)，香蕉炭疽病菌(Colletotrichum musae)，可可轮刺孢菌，镰刀菌属(Fusarium spp.)，枝顶孢霉属(Acremonium spp.)，柱枝双孢菌属(Cylindrocladium spp.)，香蕉叶斑小窦氏霉(Deightoniella torulosa)，芒果那特斯拉菌(Nattrassia 
mangiferae)，Dreschslera gigantean，Guignardia musae，茶藨子葡萄座腔菌
(Botryosphaeria ribis)，茄病镰刀菌(Fusarium solani)，血红丛赤壳(Nectria 
haematococca)，尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)，丝核菌属(Rhizoctonia spp.)，香蕉炭疽病菌(Colletotrichum musae)，Uredo musae，Uromyces musae，Acrodontium 
simplex，画眉草弯孢霉(Curvularia eragrostidis)，Drechslera musae‑sapientum，
Leptosphaeria musarum，广布拟盘多毛孢(Pestalotiopsis disseminate)，奇异长喙壳菌(Ceratocystis paradoxa)，Haplobasidion musae，Marasmiellus inoderma，青枯假单胞菌(Pseudomonas solanacearum)，香蕉穿孔线虫(Radopholus similis)，可可球二孢
(Lasiodiplodia theobromae)，Fusarium pallidoroseum，可可轮枝孢(Verticillium 
theobromae)，掌状拟盘多毛孢(Pestalotiopsis palmarum)，Phaeoseptoria musae，稻瘟病菌(Pyricularia grisea)，串珠镰刀菌(Fusarium moniliforme)，藤仓赤霉菌
(Gibberella fujikuroi)，胡萝卜软腐欧文氏菌(Erwinia carotovora)，菊欧文氏菌
(Erwinia chrysanthemi)，香蕉柱孢(Cylindrocarpon  musae)，花生根结线虫
(Meloidogyne arenaria)，黄瓜根结线虫(Meloidogyne incognita)，爪哇根结线虫
(Meloidogyne javanica)，咖啡短体线虫(Pratylenchus coffeae)，Pratylenchus 
goodeyi，伤残短体线虫(Pratylenchus brachyurus)，Pratylenchus reniformia，核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)，Nectria foliicola，Mycosphaerella musicola，香蕉假尾孢菌(Pseudocercospora musae)，Limacinula tenuis，Mycosphaerella musae，
Helicotylenchus multicinctus，双宫螺旋线虫(Helicotylenchus dihystera)，球黑孢菌(Nigrospora sphaerica)，Trachysphaera frutigena，(Ramichloridium musae)，可可轮枝孢(Verticillium theobromae)，致病疫霉，寄生疫霉(Phytophthora parasitica)，橡树疫霉(Phytophthora ramorum)，番薯疫霉(Phytophthoraipomoeae)，紫茉莉疫霉
(Phytophthora mirabilis)，辣椒疫霉(Phytophthoracapsici)，韭葱疫霉(Phytophthora porri)，大豆疫霉(Phytophthora sojae)，棕榈疫霉(Phytophthora palmivora)和菜豆疫
霉(Phytophthora phaseoli)。
[0326] 细菌病原体包括但不限于：根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)，亚洲假丝酵母(Candidatus  Liberibacter  asiaticus)，马铃薯斑纹片病菌
(CandidatusLiberibacter solanacearum)，番茄溃疡病菌(Clavibacter 
michiganensis)，马铃薯环腐病(Clavibacter sepedonicus)，甘薯茎腐病菌(Dickeya 
dadantii)，黑胫病菌(Dickeya solani)，梨火疫病菌(Erwinia amylovora)，黑胫病果胶杆菌(Pectobacterium atrosepticum)，胡萝卜坚固杆菌(Pectobacteriumcarotovorum)，须
芒草假单胞杆状细菌(Pseudomonas andropogonis)，燕麦假单胞菌(Pseudomonas 
avenae)，金狗尾草叶斑病假单胞菌(Pseudomonasalboprecipitans)，荧光假单胞菌
(Pseudomonas fluorescens)，萨氏假单胞菌(Pseudomonas savastanoi)，青枯假单孢菌
(Pseudomona solanacearum)，丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae)，青枯雷尔氏菌
(Ralstonia solanacearum)，地毯草黄单胞菌(Xanthomonas axonopodis)，野油菜黄单胞
菌(Xanthomonascampestris)，柑橘黄单胞菌(Xanthomonas citri)，Xanthomonas 
perforans，辣椒疮痂病菌(Xanthomonas vesicatoria)，水稻黄单胞菌(Xanthomonas 
oryzae)和苛养木杆菌(Xylella fastidiosa)。
[0327] 卵菌病原体包括但不限于：致病疫霉，番薯疫霉，紫茉莉疫霉，菜豆疫霉，大豆疫霉(Phytophthora megasperma fsp.Glycinea)，大豆疫病菌，隐地疫霉，霜霉菌属(Peronospora spp.)和腐霉。
[0328] 线虫病原体包括但不限于：小麦线虫(Anguina tritici)，水稻干尖线虫(Aphelenchoides besseyi)，松材线虫(Bursaphelenchus xylophilus)，甘薯茎线虫
(Ditylenchus dipsaci)，胞囊线虫属(Globodera spp.)，马铃薯白线虫(Globodera 
pallida)，马铃薯金线虫(Globodera rostochiensis)，异皮线虫属(Heterodera spp.)，禾谷异皮线虫(Heterodera avenae)，菲利普异皮线虫(Heteroderafilipjevi)，大豆异皮线
虫，根结线虫属(Meloidogyne spp.)，拟禾本科根结线虫(Meloidogyne graminicola)，致麦种球线虫(Meloidogynehapla)，Meloidogyneincógnita，象耳豆根结线虫(Meloidogyne enterolobii)，默林线虫属(Merlinius spp.)，异常珍珠线虫(Nacobbus aberrans)，针线虫属(Paratylenchus spp.)，咖啡短体线虫(Pratylenchus coffeae)，落选短体线虫
(Pratylenchusneglectus)，穿刺短体线虫(Pratylenchus penetrans)，穿刺短体线虫
(Pratylenchuspenetrans)，索氏短体线虫(Pratylenchusthornei)，Pratylenchusvulnus，玉米短体线虫(Pratylenchus zeae)，香蕉穿孔线虫(Radopholus similis)，肾形肾状线虫(Rotylenchulus reniformis)，矮化线虫属(Tylenchorhynchus spp.)和剑线虫属
(Xiphinema index)。
[0329] 昆虫害虫包括但不限于选自以下目的昆虫：鞘翅目(Coleoptera)，双翅目(Diptera)，膜翅目(Hymenoptera)，鳞翅目(Lepidoptera)，食毛目(Mallophaga)，同翅目(Homoptera)，半翅目(Hemiptera)，直翅目(Orthoptera)，革翅目(Dermaptera)，等翅目
(Isoptera)，虱目(Anoplura)，蚤目(Siphonaptera)，缨翅目(Thysanoptera)，毛翅目
(Trichoptera)等，尤其是鞘翅目和鳞翅目。
[0330] 鳞翅目昆虫包括但不限于：夜蛾科(Noctuidae)中的粘虫、切根虫、尺蠖和heliothines：黑地老虎(小地老虎(Agrotis ipsilon Hufnagel))；地老虎(A.orthogonia Morrison)(西方地老虎)；黄地老虎(A.segetum Denis&Schiffermüller，turnip moth)；颗粒状地老虎(A.subterranea Fabricius，granulate cutworm)；棉叶波纹夜蛾(Alabama 
argillacea Hübner)(棉叶虫)；黎豆夜蛾(Anticarsia gemmatalis Hübner，velvetbean 
caterpillar)；粗皮地老虎(Athetis mindara Barnes and Mcdunnough，rough skinned 
cutworm)；棉斑实蛾(Earias insulana Boisduval)(多刺螟蛉)；翠纹钻夜蛾(E.vittella Fabricius)(斑点螟蛉)；柑橘夜蛾(Egira(Xylomyges)curialis Grote)(柑橘地老虎)；暗
缘地老虎(Euxoa messoria Harris)(暗缘切根虫)；棉铃虫(Helicoverpa armigera Hü
ibner)(美洲螟蛉(American bollworm))；谷实夜蛾(H.zea Boddie)(玉米穗蛾(corn 
earworm)或棉螟蛉(cotton bollworm))；烟芽夜蛾(Heliothis virescens Fabricius)(烟
草夜蛾(tobacco budworm))；粗长须夜蛾(Hypena scabra Fabricius)(苜蓿绿夜蛾(green cloverworm))；Hyponeuma taltula Schaus；蓓带夜蛾(Mamestra configurata Walker)
(披肩粘虫(bertha armyworm))；甘蓝夜蛾(M.brassicae Linnaeus，cabbage moth)；斑马纹夜蛾(Melanchra picta Harris)(斑马毛虫(zebra caterpillar))；Mocis latipes 
Guenée(small mocis moth)；一星粘虫(Pseudaletia unipuncta Haworth)(粘虫
(armyworm))；大豆尺夜蛾(Pseudoplusia includens Walker)(大豆夜蛾(soybean 
looper))；西部豆夜蛾(Richia albicosta Smith，Western bean cutworm)；草地贪夜蛾
(Spodoptera frugiperda JE Smith)(秋粘虫(fall armyworm))；甜菜夜蛾(S.exigua Hü
bner，beet armyworm)；斜纹夜蛾(S.litura Fabricius，tobacco cutworm，cluster 
caterpillar)；粉纹夜蛾(Trichoplusia ni Hübner，cabbage looper)；来自螟蛾科
(Pyralidae)和草螟科(Crambidae)的螟虫、鞘蛾、结网虫、锥形虫(coneworms)和雕叶虫
(skeletonizers)：例如，小蜡螟(Achroia grisella Fabricius)(小蜡蛾(lesser wax 
moth))；脐橙螟蛾(Amyelois transitella Walker)(脐橙螟(naval orangeworm))；地中海粉螟(Anagasta kuehniella Zeller)(地中海粉斑螟(Mediterranean flour moth))；干果
斑螟(Cadra cautella Walker)(粉斑螟(almond moth))；粉红禾草螟(Chilo partellus 
Swinhoe)(斑点蛀茎虫(spotted stalk borer))；二化螟(C.suppressalis Walker)(水稻
螟虫(rice stem/rice borer))；甘蔗二点螟(C.terrenellus Pagenstecher(sugarcane 
stemp borer)；米螟(Corcyra cephalonica Stainton)(米蛾(rice moth))；玉米根草螟
(Crambus caliginosellus Clemens)(玉米根结网虫(corn root webworm))；早熟禾草螟
(Crambus teterrellus Zincken)(早熟禾结网虫(bluegrass webworm))；稻纵卷叶螟
(Cnaphalocrocis medinalis Guenée，rice leaf roller)；葡萄野螟(Desmia funeralis Hübner)(葡萄甘薯麦蛾(grape leaffolder))；绢野螟(Diaphania hyalinata Linnaeus)
(瓜虫(melon worm))；黄瓜绢野螟((D.nitidalis Stoll)泡菜虫(pickleworm))；Diatraea flavipennella Box；巨座玉米螟(D.grandiosella Dyar)(西南玉米秆草螟(southwestern corn borer))，蔗螟(D.saccharalis Fabricius)(甘蔗螟虫(surgarcane borer))；南美玉米苗斑螟(Elasmopalpus lignosellus Zeller)(小玉米茎蛀虫(lesser cornstalk 
borer))；Papaipema nebris(stalk borer)；墨西哥稻螟(Eoreuma loftini Dyar，Mexican rice borer)；烟草粉斑螟(Ephestia elutella Hübner)(烟草飞蛾(tobacco(cacao)
moth))；大蜡螟(Galleria mellonella Linnaeus)(大蜡蛾(greater wax moth))；甘蔗卷
叶蛾(Hedylepta accepta  Butler(sugarcane  leafroller))；水稻切叶野螟
(Herpetogramma licarsisalis Walker)(草地螟(sod webworm))；向日葵同斑螟
(Homoeosoma electellum Hulst)(向日葵螟(sunflower moth))；草地螟(Loxostege 
sticticalis Linnaeus，beet webworm)；豆荚野螟(Maruca testulalis Geyer)(豆荚蛀螟(bean pod borer))；茶树螟(Orthaga thyrisalis Walker)(茶树结网蛾(tea tree web 
moth))；螟蛾科玉米螟(Ostrinia nubilalis Hübner，欧洲玉米螟(European corn 
borer))；亚洲玉米螟(Ostrinia furnacalis，Asian corn borer)；印度谷螟(Plodia 
interpunctella Hübner，Indian meal moth)；三化螟(Scirpophaga incertulas Walker，yellow stem borer)；温室螟(Udea  rubigalis  Guenée)(芹菜卷叶螟(celery 
leaftier))；和卷蛾科(Tortricidae)中的卷叶虫、蚜虫、种实虫以及果实虫，西部黑头长翅卷蛾(Acleris gloverana Walsingham)(西部黑头蚜虫(Western blackheaded 
budworm))；东部黑头长翅卷蛾(A.variana Fernald)(东部黑头蚜虫(Eastern 
blackheaded budworm))；Hellula phidilealis(cabbage budworm moth)；苹小卷叶蛾
(Adoxophyes orana Fischer von )(苹果小卷蛾(summer fruit tortrix 
moth))；黄卷蛾属(Archips spp.)包括果树黄卷蛾(A.argyrospila Walker，fruit tree 
leafroller)和罗萨娜黄卷蛾(A.rosana Linnaeus)(欧洲卷叶蛾(European leaf 
roller))；带卷蛾属物种(Argyrotaenia spp.)；巴西苹果卷叶虫(Bonagota salubricola Meyrick)(巴西苹果小卷叶蛾(Brazilian apple leafroller))；卷叶蛾属物种
(Choristoneura spp.)；条纹向日葵螟(Cochylis hospes Walsingham)(带状向日葵斑蛾
(banded  sunflower moth))；榛小卷蛾(Cydia latiferreana Walsingham)
(filbertworm)；苹果蠹蛾(C.pomonella Linnaeus)(苹果蚕蛾(codling moth))；萄果实虫主虫(Endopiza viteana Clemens)(葡萄小卷叶蛾(grape berry moth))；女贞细卷蛾
(Eupoecilia ambiguella Hübner)(葡萄果蠹蛾(vine moth))；东方果实蛾(Grapholita 
molesta Busck)(梨小食心虫(oriental fruit moth))；鲜食葡萄小卷蛾(Lobesia 
botrana Denis&Schiffermüller)(欧洲葡萄蛾(European grape vine moth))；杂色卷叶
蛾(Platynota flavedana Clemens)(色稻纵卷叶螟(variegated leafroller))；荷兰石竹
小卷蛾(P.stultana Walsingham)(杂食卷叶蛾(omnivorous leafroller))；苹白小卷蛾
(Spilonota ocellana Denis&Schiffermüller)(苹果芽小卷叶蛾(eyespotted bud 
moth))；和向日葵芽蛾(Suleima helianthana Riley，sunflower bud moth)。
[0331] 在鳞翅目中选择的其它农艺学有害生物包括但不限于:秋星尺蠖(Alsophila pometaria Harris，fall cankerworm)；桃蚜蛾(Anarsia lineatella Zeller)(桃条麦蛾
(peach twig borer))；栎橙纹犀额蛾(Anisota senatoria J.E.Smith)(橙色斑纹橡木虫
(orange striped oakworm))；柞蚕(Antheraea pernyi Guérin‑Méneville)(中国橡树柞
蛾(Chinese Oak Tussah Moth))；家蚕(Bombyx mori Linnaeus)(桑蚕(Silkworm))；棉潜
蛾(Bucculatrix thurberiella Busck)(棉叶潜蛾(cotton leaf perforator))；纹黄豆粉
蝶(Colias eurytheme Boisduval)(苜蓿粉蝶(alfalfa caterpillar))；核桃舟蛾(Datana integerrima Grote&Robinson)(胡桃毛虫(walnut caterpillar))；西伯利亚松毛虫
(Dendrolimus sibirieus Tschetwerikov)(西伯利亚丝蛾(Siberian silk moth))，
Ennomos subsignaria Hübner(榆树尺蠖(elm spanworm))；菩提尺蠖(Erannis tiliaria 
Harris)(椴尺蠖(linden looper))；Erechthias flavistriata Walsingham(sugarcane 
bud moth)；黄毒蛾(Euproctis chrysorrhoea Linnaeus)(棕尾毒蛾(browntail moth))；
黑拟蛉蛾(Harrisina americana Guérin‑Méneville)(野棉花夜蛾(grapeleaf 
skeletonizer))；行列半白大蚕蛾(Hemileuca oliviae Cockrell)(山脉毛虫(range 
caterpillar))；美国白蛾(Hyphantria cunea Drury，fall webworm)；番茄茎麦蛾
(Keiferia lycopersicella Walsingham)(番茄蛲虫(tomato pinworm))；铁杉尺蠖
(Lambdina fiscellaria fiscellaria Hulst)(东部铁杉尺蠖(Eastern hemlock 
looper))；西部铁杉尺蠖(L.fiscellaria lugubrosa Hulst)((西方铁杉尺蠖(Western 
hemlock looper))；毒蛾(Leucoma salicis Linnaeus)(柳毒蛾(satin moth))；舞毒蛾
(Lymantria dispar Linnaeus，gypsy moth)；天幕毛虫属物种(Malacosoma spp.)；番茄天蛾(Manduca quinquemaculata Haworth)(五点天蛾(five spotted hawk moth)，番茄天蛾
(tomato hornworm))；烟草天蛾(M.sexta Haworth)(番茄天蛾(tomato hornworm)，烟草天蛾(tobacco hornworm))；冬尺蠖蛾(Operophtera brumata Linnaeus，winter moth)；古毒蛾属(Orgyia)物种；春尺蠖(Paleacrita vernata Peck，spring cankerworm)；美洲大芷凤蝶(Papilio cresphontes Cramer)(大黄带凤蝶(giant swallowtail)，柑桔凤蝶(orange 
dog))；加州木角斗蛾(Phryganidia californica Packard)(加州槲蛾(California 
oakworm))；柑桔潜蛾(Phyllocnistis citrella Stainton)(柑桔潜叶蛾(citrus 
leafminer))；斑幕潜叶蛾(Phyllonorycter blancardella Fabricius)(斑点幕型潜叶虫
(spotted tentiform leafminer))；欧洲粉蝶(Pieris brassicae Linnaeus)(大白粉蝶
(large white butterfly))；菜青虫(P.rapae Linnaeus)(小菜粉蝶(small white 
butterfly))；暗脉菜粉蝶(P.napi Linnaeus)(绿色纹理粉蝶(green veined white 
butterfly))；洋蓟葱羽蛾(Platyptilia carduidactyla Riley)(洋蓟羽蛾(artichoke 
plume moth))；小菜蛾(Plutella xylostella Linnaeus，diamondback moth)；红铃麦蛾
(Pectinophora gossypiella Saunders)(棉红铃虫(pink bollworm))；多形云粉蝶
(Pontia protodice Boisduval and Leconte)(南方菜青虫(Southern cabbageworm))；杂
食尺蠖(Sabulodes aegrotata Guenée，omnivorous looper)；红抚天社蛾(Schizura 
concinna J.E.Smith)(红疣天社蛾(red humped caterpillar))；麦蛾(Sitotroga 
cerealella Olivier，Angoumois grain moth)；松异带蛾(Thaumetopoea pityocampa 
Schiffermuller)(松树列队毛虫(pine processionary caterpillar))；幕谷蛾(Tineola 
bisselliella Hummel)(织带衣蛾(webbing clothesmoth))；番茄斑潜蝇(Tuta absoluta 
Meyrick)(番茄潜叶虫(tomato leafminer))；苹果巢蛾(Yponomeuta padella Linnaeus)
(巢蛾(ermine moth))。
[0332] 感兴趣的是鞘翅目的幼虫和成虫，包括来自长角象虫科、叶甲科(Chrysomelidae)和象甲科的象鼻虫，包括但不限于：墨西哥棉铃象(Anthonomus grandis Boheman)(棉铃象甲(boll weevil))，四纹豆象(Callosobruchus maculatus(cowpea weevil))，墨西哥棉铃象(Anthonomus grandis  Boheman)(棉铃象甲(boll  weevil))；密点细枝象
(Cronrocopturus adspersus LeConte)(向日葵茎象鼻虫(sunflower stem weevil))；蔗
根非耳象(Diaprepes abbreviatus Linnaeus，Diaprepes root weevil)；三叶草叶象
(Hypera punctata Fabricius)(车轴草叶象虫(clover leaf weevil))；稻水象甲
(Lissorhoptrus oryzophilus Kuschel，rice water weevil)；西印度蔗象甲(Metamasius hemipterus hemipterus Linnaeus)(West Indian cane weevi)；丝光蔗象甲
(M.hemipterus sericeus Olivier)(silky cane weevi)；玉米象(Sitophilus zeamais
(maize weevil)；谷象鼻虫(Sitophilus granarius Linnaeus)(谷象(granary weevil))；
稻象虫(S.oryzae Linnaeus，rice weevil)；黄褐小爪象(Smicronyx fulvus LeConte)(红色葵花籽象鼻虫(red sunflower seed weevil))；灰色小爪象(S.sordidus LeConte)(灰
葵花籽象甲(gray sunflower seed weevil))；玉米蚜(Rhopalosiphum maidis Fitch，
corn leafaphid)；S.livis Vaurie(甘蔗weevil)；新几内亚蔗象甲(Rhabdoscelus 
obscurus Boisduval)(New Guinea sugarcane weevi)；叶甲科(Chrysomelidae)的跳甲、
黄瓜叶甲、根虫、叶甲、马铃薯叶甲以及潜叶虫，包括但不限于：大豆叶甲(Cerotoma 
trifurcata，bean leaf beetle)，荒地玉米跳甲(Chaetocnema ectypa Horn，desert corn flea beetle)；玉米跳甲(C.pulicaria Melsheimer，corn flea beetle)；肖叶甲褐斑
(Colaspis brunnea Fabricius)(葡萄肖叶甲(grape colaspis))；巴氏根叶甲
(Diabrotica barberi  Smith and  Lawrence，北方玉米根虫)；斑点黄瓜甲虫
(D.undecimpunctata howardi Barber)(南方玉米根虫(southern corn rootworm))；玉米
根萤叶甲(D.virgifera virgifera LeConte)(西方玉米根虫(western corn rootworm))；
马铃薯叶甲(Leptinotarsa decemlineata Say)(科罗拉多马铃薯甲虫)；橙足负泥虫
(Oulema melanopus Linnaeus)(谷物叶甲(cereal leafbeetle))；十字花科条跳甲
(Phyllotreta cruciferae Goeze)(玉米跳甲)；向日葵叶甲(Zygogramma exclamationis 
Fabricius，sunflower beetle)；来自瓢虫科(Coccinellidae)的甲虫(包括但不限于：墨西哥豆瓢虫(Epilachna varivestis Mulsant，Mexican bean beetle)；金龟子和来自金龟子科(Scarabaeidae)的其它甲虫，包括但不限于：牧草金龟(Antitrogus parvulus Britton，Childers cane grub)；北方圆头犀金龟(Cyclocephala borealis Arrow)(北方独角仙
(northern masked chafer)，白蛴螬(white grub))；南方圆头犀金龟(C.immaculata 
Olivier)(南方独角仙(southern masked chafer)，白蛴螬(white grub))；白毛革鳞鳃金
龟(Dermolepida albohirtum Waterhouse，Greyback cane beetle)；蔗犀金龟(Euetheola humilis rugiceps LeConte，sugarcane beetle)；法国蔗蚧螬(Lepidiota frenchi 
Blackburn，French’s cane grub)；胡萝卜甲虫(Tomarus gibbosus De Geer，carrot 
beetle)；甘蔗蛴螬(T.subtropicus Blatchley，sugarcane grub)；具毛鳃角金龟
(Phyllophaga crinita Burmeister)(蛴螬(white grub))；六月鳃金龟(P.latifrons 
LeConte，June beetle)；日本丽金龟(Popillia japonica Newman)(日本甲虫)；欧洲切根鳃金龟(Rhizotrogus majalis Razoumowsky)(欧洲金龟子(European chafer))；来自皮蠹
科(Dermestidae)的红缘皮蠹(carpet beetle)；包括来自叩甲科(Elateridae)、伪金针虫
属物种(Eleodes spp.)、梳爪叩头虫属物种(Melanotus spp.)的金针虫(M.communis 
Gyllenhal，wireworm)；宽胸金针虫属物种(Conoderus spp.)；叩甲属物种(Limonius 
spp.)；缺隆叩甲属(Agriotes spp.)；特尼塞拉属(Ctenicera spp.)；埃俄罗斯属(Aeolus spp.)；来自小蠹科(Scolytidae)的树皮甲虫；来自拟步甲科(Tenebrionidae)的甲虫例如，但不限于：长角甲虫(Migdolus fryanus Westwood，longhorn beetle)；和来自吉丁虫科的甲虫包括，但不限于潜叶吉丁虫(Aphanisticus cochinchinae seminulum Obenberger，
leaf‑mining buprestid beetle)。
[0333] 感兴趣的是双翅目的成虫和未成熟的虫，包括：潜叶虫玉米斑潜蝇(Agromyza parvicornis Loew)(玉米斑潜蝇(corn blotch leafminer))；摇蚊科，包括但不限于：高粱瘿蚊(Contarinia sorghicola Coquillett)(高梁瘿蚊(sorghummidge))；黑森瘿蚊
(Mayetiola destructor Say)(黑森蝇(Hessian fly))；葵花籽蚊(Neolasioptera 
murtfeldtiana Felt)，(向日葵籽瘿蚊(sunflower seed midge))；麦红吸浆虫
(Sitodiplosis mosellana Géhin)(小麦吸浆虫(wheat midge))；果蝇(实蝇科
(Tephritidae))，橄榄实蝇(Bactrocera oleae，olive fruit fly)，地中海实蝇
(Ceratitis capitata，Mediterranean fruit fly)，瑞典麦秆蝇(Oscinella frit 
Linnaeus)(果蝇(frit fllies))；蛆虫，包括但不限于：灰地种蝇(Delia platura Meigen)(种蝇(seedcorn maggot))；麦地种蝇(D.coarctata Fallen)(麦种蝇(wheat bulb fly)；
夏厕蝇(Fannia canicularis Linnaeus)，小舍蝇(F.femoralis Stein)(小家蝇(lesser 
houseflies))；美洲麦秆蝇(Meromyza americana Fitch)(美洲麦秆蝇(wheat stem 
maggot))；家蝇(Musca domestica Linnaeus，house flies)；厩螫蝇(Stomoxys 
calcitrans Linnaeus)(螫蝇(stable flies))；秋家蝇(face flies)，角蝇(horn flies)，丽蝇(blow flies)，金蝇属物种(Chrysomya spp.)；伏蝇属物种(Phormia spp.)；和其它蝇状的蝇类害虫，马蝇(horse flies)，虻属物种(Tabanus spp.)；肤蝇(bot flies)，胃蝇属物种(Gastrophilus spp.)；纹皮蝇(cattle grubs)，皮蝇属物种(Hypoderma spp.)；鹿虻(deer flies)，斑虻属物种(Chrysops spp.)；绵羊虱蝇(Melophagus ovinus Linnaeus)
(羊蜱蝇(keds))和其它短角亚目(Brachycera)，蚊子伊蚊属物种(Aedes spp.)；疟蚊属物
种(Anopheles spp.)；家蚊属物种(Culex spp.)；黑蝇(black flies)，原蚋属物种
(Prosimulium spp.)；蚋属(Simulium spp.)；蠓、沙蝇、眼菌蚊和长角亚目。
[0334] 半翅目(Hemiptera)的农艺上重要的成员包括但不限于：拟绿蝽(Acrosternum hilare Say)(稻绿蝽(green stink bug))；豌豆蚜(Acyrthisiphon pisum Harris)(豌豆
蚜虫(pea aphid))；球蚜属物种(Adelges spp.)(球蚜(adelgids))；苜蓿褐盲蝽
(Adelphocoris rapidus Say)(快速植食蝽(rapid plant bug))；南瓜缘蝽(Anasa 
tristis De Geer)(南瓜虫(squash bug))；黑豆蚜(Aphis craccivora Koch)(豇豆蚜
(cowpea aphid))；甜菜蚜(A.fabae Scopoli)(黑豆蚜(black bean aphid))；棉蚜
(A.gossypii Glover)(棉蚜虫(cotton aphid，melon aphid))；槐蚜(A.maidiradicis 
Forbes)(玉米根蚜(corn root aphid))；苹果蚜(A.pomi De Geer，apple aphid)；绣线菊蚜(A.spiraecola Parch，spirea aphid)；印尼轮盾介壳虫(Aulacaspis tegalensis 
Zehntner，sugarcane scale)；茄沟无网蚜(Aulacorthum solani Kaltenbach)(毛地黄蚜
虫(foxglove aphid))；银叶粉虱(B.argentifolii，silverleaf whitefly)；烟粉虱
(Bemisia tabaci Gennadius)(烟草粉虱(tobacco whitefly)，甘薯粉虱(sweetpotato 
whitefly))；银叶粉虱(B.argentifolii Bellows&Perring，silverleaf whitefly)；美洲谷长蝽(Blissus leucopterus leucopterus Say)(麦长蝽(chinch bug))；负子蝽科物种
(Blostomatidae)；甘蓝蚜(Brevicoryne brassicae Linnaeus)(菜蚜(cabbage aphid))；
梨木虱(Cacopsylla pyricola Foerster，pear psylla)；马铃薯衣壳蝽(Calocoris 
norvegicus Gmelin，potato capsid bug)；Chaetosiphon fragaefolii Cockerell(草莓
蚜)；臭虫科属物种(Cimicidae spp.)；缘蝽属物种(Coreidae spp.)；方翅网蝽(Corythuca gossypii Fabricius)(棉花网蝽)；Cyrtopeltis modesta Distant(番茄蝽)；烟草小盲蝽
(C.notatus Distant)(suckfly)；沫蝉(Deois flavopicta，spittlebug)；Dialeurodes 
citri Ashmead(柑桔白粉虱)；皂荚蝽(Diaphnocoris chlorionis Say，honeylocust 
plant bug)；Diuraphis noxia Kurdjumov/Mordvilko(俄罗斯小麦蚜)；竹禾盾介壳虫
(Duplachionaspis divergens Green，armored scale)；玫瑰苹果蚜(Dysaphis 
plantaginea Paaserini，rosy apple aphid)；棉蝽(Dysdercus suturellus Herrich‑)
(污棉虫)；甘蔗灰粉蚧(Dysmicoccus boninsis Kuwana)，gray sugarcane mealybug)；蚕豆微叶蝉(Empoasca fabae Harris)(马铃薯小绿叶蝉)；Eriosoma lanigerum Hausmann
(苹果绵蚜)；Erythroneoura spp.(葡萄小叶蝉)；Eumetopina flavipes Muir(岛屿甘蔗飞虱)；扁盾蝽属物种(Eurygaster spp.)；褐臭椿(Euschistus servus Say，brown stink 
bug)；一斑臭蝽(E.variolarius Palisot de Beauvois，one‑spotted stink bug)；长蝽属物种(Graptostethus spp.)(长蝽科复合体(complex of seed bugs))；和Hyalopterus 
pruni Geoffroy(桃大尾蚜)；Icerya purchasi Maskell(吹绵介壳虫)；Labopidicola 
allii Knight(洋葱蝽)；Laodelphax striatellus Fallen(灰飞虱)；Leptoglossus 
corculus Say(松叶根蝽)；甘蔗花边虫(Leptodictya tabida Herrich‑Schaeffer，
sugarcane lace bug)；Lipaphis erysimi Kaltenbach(萝卜蚜)；长绿盲蝽(Lygocoris 
pabulinus Linnaeus，common green capsid)；Lygus lineolaris Palisot de Beauvois
(牧草盲蝽)；L.Hesperus Knight(西部牧草盲蝽)；牧草盲蝽(L.pratensis Linnaeus，
common meadow bug)；长毛草盲蝽(L.rugulipennis Poppius)(欧洲牧草盲蝽)；
Macrosiphum euphorbiae Thomas(马铃薯蚜)；二点叶蝉(Macrolestes quadrilineatus 
Forbes)(紫菀叶蝉(aster leafhopper))；十七年蝉(Magicicada septendecimLinnaeus)
(晚秀蝉(periodical cicada))；Mahanarva fimbriolata (甘蔗沫蝉)；M.posticata
(little cicada of sugarcane)；高粱蚜(Melanaphis sacchari Zehntner，
sugarcane aphid)；粉蚧(Melanaspis glomerata Green，black scale)；麦无网长管蚜
(Metopolophium dirhodum Walker，rose grain aphid)；桃蚜(Myzus persicae Sulzer)
(桃‑马铃薯蚜虫，绿桃蚜虫)；莴苣蚜(Nasonovia ribisnigri Mosley，lettuce aphid)；黑尾叶蝉(Nephotettix cinticeps Uhler)(青大叶蝉(green leafhopper))；二条斑黑尾叶
蝉(N.nigropictus)(稻叶蝉(rice leafhopper))；南方绿椿象(Nezara viridula 
Linnaeus)(南方喜绿蝽(southern green stink bug))；褐飞虱(Nilaparvata lugens
brown planthopper)；拟麦长蝽(Nysius ericae Schilling，false chinch bug)茶
黄蓟马(Nysius raphanus Howard)(假麦长蝽)；稻蝽(Oebalus pugnax Fabricius)(稻褐
蝽)；Oncopeltus fasciatus Dallas(大马利筋长蝽)；Orthops campestris Linnaeus；瘿绵蚜属物种(Pemphigus spp.)(根蚜和瘿蚜)；Peregrinus maidis Ashmead(玉米飞虱)；甘蔗扁角飞虱(Perkinsiella saccharicida Kirkaldy，sugarcane delphacid)；长山核桃根瘤蚜(Phylloxera devastatrix  Pergande)(美洲山核桃根瘤蚜)；桔臀纹粉蚧
(Planococcus citri Risso)(柑桔粉蚧)；苹盲蝽(Plesiocoris rugicollis Fallen，
apple capsid)；四线盲蝽(Poecilocapsus lineatus Fabricius)(four‑lined plant 
bug)；Pseudatomoscelis seriatus Reuter(棉盲蝽)；粉蚧属物种(Pseudococcus spp.)
(其它粉蚧复合体)；棉草介壳虫(Pulvinaria elongata Newstead(棉草介壳虫)；蔗短足蜡蝉(Pyrilla perpusilla Walker，sugarcane leafhopper)；红蝽属物种(Pyrrhocoridae 
spp.)；梨园蚧(Quadraspidiotus perniciosus Comstock)(圣约瑟虫)；猎蝽属物种
(Reduviidae spp.)；玉米缢管蚜(Rhopalosiphum maidis Fitch)(玉米叶蚜)；R.padi 
Linnaeus(禾谷缢管蚜)；甘蔗红粉蚧(Saccharicoccus sacchari Cockerell，pink 
sugarcane mealybug)；Schizaphis graminum Rondani(麦二叉蚜)；Sipha flava Forbes
(yellow sugarcane aphid)；Sitobion avenae Fabricius(麦长管蚜)；Sogatella 
furcifera Horvath(白背飞虱)；稻条背飞虱(Sogatodes oryzicola Muir)(稻飞虱)；
Spanagonicus albofasciatus Reuter(白斑盲蝽)；斑点苜蓿蚜(Therioaphis maculata 
Buckton)(苜蓿斑蚜)；谷蛾属物种(Tinidae spp.)；Toxoptera aurantii Boyer de 
Fonscolombe(桔二叉蚜)；和T.citricida Kirkaldy(褐色橘蚜)；Trialeurodes 
vaporariorum Westwood(温室白粉虱)；Trialeurodes abutiloneus(纹翅粉虱)和
T.vaporariorum Westwood(温室白粉虱)；Trioza diospyri Ashmead(柿木虱)；
Typhlocybapomaria McAtee(白色苹果叶蝉)；玻璃翅叶蝉(Homalodisca vitripennis，
glassy winged sharpshooter)；玉米叶蝉(Cicadulina mbila，maize leafhopper)；甜菜叶蝉(Circulifer tenellus，beet leafhopper)；葡萄根瘤蚜虫(Daktulosphaira 
vitifoliae，grape phylloxera)；橘软蚧(Coccus pseudomagnoliarum，citricola 
scale)；褐软蚧(Coccus hesperidum，soft brown scale)；Pulvinaria regalis(horse 
chestnut scale)；Pulvinaria psidii(green shield scale)；橘红肾圆盾介壳虫
(Aonidiella aurantii，California citrus scale)；罗汉松红圆蚧(Aonidiella taxus，Asiatic red scale)；飞蓬圆盾蚧(Aspidiotus excisus，Cyanotis scale)；常春藤薄圆盾介壳虫(Aspidiotus nerii，oleander scale)；樟白轮蚧(Aulacaspis rosarum，Asiatic玫瑰scale)；芒果白轮蚧(Aulacaspis tubercularis，white mango scale)；Chionaspis 
lepineyi(oak scurfy scale)；棕榈栉圆盾蚧(Hemiberlesia lataniae，latania scale)；
竹拟白须盾蚧(Kuwanaspis pseudoleucaspis，bamboo diaspidid scale)；松牡蛎蚧
(Lepidosaphes pini，pine oystershell scale)；茶树长白盾蚧(Lopholeucaspis 
japonica，Japanese maple scale)；Oceanaspidiotus spinosus(spined scale insect)；
黑片盾蚧(Parlatoria ziziphi，black parlatoria scale)；樟盾蚧(Pseudaonidia 
duplex，camphor scale)；矢尖盾蚧(Unaspis yanonensis，arrowhead scale)；石蒜绵粉蚧(Phenacoccus solani，Solanum mealybug)；桔臀纹粉介壳虫(Planococcus citri，citrus mealybug)；臀纹粉介壳虫属(Planococcus，ficus vine mealybug)；拟长尾粉蚧
(Pseudococcus longispinus，long‑tailed mealybug)；拟长尾粉蚧(Pseudococcus 
affinis，glasshouse mealybug；柑橘木虱(Diaphorina citri，亚洲柑橘木虱(Asian 
citrus psyllid))；马铃薯木虱(Bactericera cockerelli，potato psyllid)。
[0335] 来自缨翅目(Thysanoptera)的昆虫包括，但不限于：葱蓟马(Thrips tabaci(马铃薯thrips))和苜蓿蓟马(Frankliniella occidentalis，western flower thrips)。
[0336] 其它感兴趣的昆虫包括但不限于：蝗虫(例如，美洲沙漠蝗(Schistocerca american)和蟋蟀(例如，Teleogryllus taiwanemma，黄脸油葫芦(Teleogryllus emma))。
[0337] 尘螨是蛛形纲(Arachnida)，是由螨和蜱组成的蛛形(Arci)亚类的成员。虽然螨虫不是真正的昆虫，但由于螨虫和昆虫都是节肢动物门的成员，因此螨虫通常与植物的昆虫
害虫分组在一起。如本文所用，术语“昆虫”包括真正的昆虫和螨虫，除非另有说明或从使用背景来看很明显。感兴趣的螨虫包括但不限于：小麦瘤瘿螨(Aceria tosichella Keifer)
(小麦卷叶螨(wheat curl mite))；苹果全爪螨(Panonychus ulmi Koch)(欧洲红螨
(European red mite))；麦岩螨(Petrobia latens Müller)(棕色小麦螨(brown wheat 
mite))；班氏细螨(Steneotarsonemus bancrofti Michael)(甘蔗细螨)叶螨科
(Tetranychidae)的叶螨和红螨，Oligonychus grypus Baker&Pritchard，O.indicus 
Hirst(甘蔗叶螨(sugarcane leaf mite))，O.pratensis Banks(草地小爪螨)、
O.stickneyi McGregor(甘蔗叶螨)，O.stickneyi McGregor(甘蔗叶螨)；二斑叶螨
(Tetranychus urticae Koch)(二点叶螨(two spotted spider mite))；迈叶螨
(T.mcdanieli McGregor)(McDaniel mite)；朱砂虫螨(T.cinnabarinus Boisduval)(胭脂
红蜘蛛螨(carmine spider mite))；土耳其斯坦叶螨(T.turkestani Ugarov&Nikolski)
(草莓蜘蛛螨(strawberry spider mite))细须螨科(Tenuipalpidae)的葡萄短须螨类、
Brevipalpus lewisi McGregor(柑橘红蜘蛛)；瘿螨科(Eriophyidae)中的锈螨和芽蜱。
[0338] 本发明的方法和组合物的其它实施方案在本文其它地方描述。
[0339] 下面的实施例是为了说明而不是为了限制。
[0340] 实施例
[0341] 实施例1：制备候选NLR基因的文库
[0342] 根据本发明人的观察，单子叶植物和双子叶植物中所有表征的叶片病原体NLR抗性基因均在未受染的叶片组织中表达，本发明人试图从草种集合中未受染的叶片组织中制
备候选NLR抗性基因的文库，以鉴定针对感兴趣的植物病原体的R基因。在未受染的叶组织
中表达的这种NLR基因的公开例子包括例如CcRpp1、Pm3b、Rpg1、Rpg5和Sr33(Bruggeman等人，(2002)PNAS 99(14)9328‑9333，doi:10.1073/pnas.142284999；Bruggeman等人，(2008)PNAS 105(39):14970‑5，doi:10.1073/pnas.0807270105；Kawashima等人，2016，Nature Biotechnol.2016 34(6):661‑665；美国专利号10,842,097；Yahiaoui等人，(2004)Plant J.37:528‑538，doi:10.1046/j.1365‑313X.2003.01977.x)。此类NLR基因的未发表例子包括rps2、Rps6、Rps8、Yrr1、Yrr2和Yrr3的候选NLR基因。有趣的是，本发明人发现在叶片转录组中表达的NLR的平均数量相对较低(约125)，并且迄今为止鉴定的编码有效NLR的NLR基因
在未受染的叶片组织中表达。此外，在叶组织中表达的前25％的NLR似乎高度富集了有效的NLR。我们将这一关键见解与快速将基因转化至小麦的能力相结合，并生成了一个稳定转化的文库，该文库由小麦中1000多种不同的草NLR构建而成。
[0343] 先前的工作已经建立了NLR的分子和进化特征，这些特征有助于植物免疫，例如基因家族和快速进化(Yang等人，2013，PNAS110:18572‑18577)。这些特征以前的工作已经建立了NLR的分子和进化特征，这些特征有助于植物免疫，例如基因家族和快速进化(Yang等
人，2013，PNAS 110:18572‑18577)。这些感兴趣的特征包括但不限于：
[0344] ·NLR编码的氨基酸序列中存在种内变异；
[0345] ·NLR编码的氨基酸序列中不存在种内变异；
[0346] ·NLR编码的氨基酸序列中存在种间变异；
[0347] ·NLR编码的氨基酸序列中不存在种间变异；和
[0348] ·NLR编码的氨基酸序列中存在大量的种内等位基因变异。
[0349] 如在本文的实施例中所使用的，“构建体”是已经克隆到入门载体或目的载体中的特异性NLR：T1家族是源自单个T0植物的种子，T2家族是源自单个T1植物的种子。
[0350] 材料和方法
[0351] 植物材料和生长条件
[0352] 以下草种的种子用于制备候选NLR基因的文库：印度落芒草，双角山羊草，高大山羊草，西尔斯山羊草，沙融山羊草，冰草，埃塞俄比亚燕麦，二穗短柄草，凌风草，洋狗尾草，Echinaria capitata，绒毛草，大麦， 草，黑麦草，小穗臭草，天蓝虉草和普通早熟禾。
[0353] 让种子在培养皿上的潮湿滤纸上发芽，并在4℃下放置6‑7天以打破种子休眠。将发芽的种子转移到泥炭和沙子：谷物混合物的1:1混合物中。幼苗在干净的受控的环境室
中，在20℃光照16小时/16℃黑暗8小时的条件下生长。使用的受控的环境室是一个干净的
发芽室，没有有害生物和病害。根据叶片的大小，收获每个物种每种植物的第一片和第二片叶子，并根据物种在发芽后12至35天用于RNA分离。
[0354] RNA分离
[0355] 根据制造商的方案(Sigma‑Aldrich；T9424)，使用基于Trizol苯酚的方案从叶中提取总RNA。
[0356] RNAseq
[0357] 构建条形码Illumina TruSeq RNA HT文库，并在单个HiSeq 2500的道上的每个道上合并四个样品，以Rapid Run模式运行。使用150bp的配对的末端读取物进行测序。使用
FastQC评估配对的末端读取物的质量，并在组装前使用Trimmomatic(v0.36)进行修剪，参
数设置为ILLUMINACLIP:2:30:10，LEADING：5，TRAILING：5，滑动窗口(SLIDINGWINDOW)：4:
15和MINLEN:36。这些参数用于去除所有具有接头序列、碱基不明确或读取物质量大幅度降低的读取物。使用具有默认参数的Trinity(版本2013‑11‑10)生成从头转录组组件。
Kallisto(v0.43.1)用于使用默认参数和100次bootstraps来估计所有转录本的表达水平。
[0358] 鉴定高度表达的NLR
[0359] TransDecoder(v4.1.0)LongOrfs用于预测从头组装的转录组中的所有开放阅读框。InterProScan(v5.27‑66.0)用于使用Coils和Pfam、Superfamily和ProSite数据库注释结构域。任何同时包含核苷酸结合结构域和富含亮氨酸重复序列的蛋白质都在分析中取得
了进展。使用从FAT‑CAT开发的自定义脚本，基于从源自NLR的水稻、二穗短柄草和大麦核苷酸结合结构域开发的系统发生树，对核苷酸结合域进行分类。NLR编码基因是根据以下要求进展的：转录本必须包含完整的或5'部分开放阅读框；该基因必须在前25％表达的NLR中；
并且该基因不属于已知的需要额外NLR的NLR家族(Bailey等人，(2018)Genome Biol.19:
23，doi.org/10.1186/s13059‑018‑1392‑6)。
[0360] 在候选NLR中，使用需要100％同一性(‑c 1.0)的CD‑HIT(v4.7)去除冗余。使用分别融合到编码序列起始点或终止点的前20个核苷酸的Gateway接头attB1(SEQ ID NO:27)和attB2(SEQ ID NO:28)开发PCR引物。
[0361] 实施例2：在转基因植物中测试候选NLR基因
[0362] NLR鉴定和分子克隆
[0363] 对于来自18种草种的81份植物种质完成测序、从头RNAseq组装、NLR鉴定和PCR引物开发。在测序的81份种质中，69份抗性种质已进展为分子克隆，包括芨芨草属、山羊草属、冰草属、燕麦属、短柄草属、凌风草属、洋狗尾草属、猬禾属、绒毛草属、大麦属、 草属、黑麦草属、臭草属、虉草属和早熟禾属的物种。
[0364] 克隆的NLR的比例根据物种而变化，这取决于每个物种中可用的种质多样性以及对目标病原体的抗性的流行程度。开发了总共1909个NLR的PCR引物。总共有1019个NLR被克隆到Gateway pDONR入门载体中。该组包括对照基因：Mla3(小麦瘟病)，Mla7(小麦条锈病)，Mla8(小麦条锈病)和Rps6(小麦条锈病)。已经鉴定并合成了其它对照基因：Sr33(小麦秆锈病)，Sr50(小麦秆锈病)，Sr35(小麦秆锈病)，Pm3(小麦白粉病)，Lr21(小麦叶锈病)和Yr10(小麦条锈病)。
[0365] 通过 系统的LR反应，将入门克隆中的NLR转移到目的载体pDEST2BL中，该载体是双元载体。通过电穿孔将所得的转化载体导入根癌农杆菌菌株EHA105中。根据公
开的方法(Ishida等人，(2015)Methods Mol.Biol.1223:189‑198)使用携带转化载体的农
杆菌菌株转化小麦Fielder品种，但有一个改变：当转移到第二选择性培养基中时，将未成熟胚切成三片。
[0366] 病原体测定
[0367] 候选NLR基因的文库针对多种小麦病原体进行了测试，所述小麦病原体包括：小麦秆锈病(小麦秆锈菌)，小麦条锈病(小麦条锈菌)，小麦叶锈病(小麦叶锈菌)，小麦瘟病(小麦型稻瘟菌)和小麦白粉病(小麦白粉菌)。幼苗病原体测定的实验设计涉及每个NLR接种来
自至少四个不同T1家族的三个种子。保存显示抗性表型的家族用于在T2阶段的种子和表型
再分析，在T2阶段种植8个种子并进行表型分析。
[0368] 筛查的NLR的状态定义如下：确认的NLR对来自抗性T1家族的T2家族或个体具有一致的抗性或中间的表型评分。候选NLR在T2家族中显示出临界的中间的表型分数和/或数据
不足，无法得出结论。用于重筛查的NLR显示出具有跨T2家族的易感表型，T2家族包括来自先前具有抗性或中间的T1家族。这些T2家族可能代表赋予中间抗性的NLR或在当前启动子
下表达不足的NLR。
[0369] 小麦秆锈病(小麦秆锈菌)
[0370] 根据USDA‑ARS谷物病害实验室和明尼苏达大学(Huang等人，(2018)Plant Dis.102(6):1124‑1135，doi:10.1094/PDIS‑06‑17‑0880‑RE)使用的标准方案进行锈病接种。接种前一天，将锈病病原体的夏孢子从–80℃冰箱中取出，在45℃水浴中热激15分钟，然后在80％相对湿度的室内复水化过夜。在评估发芽率后(Scott等人，2014)，将10mg夏孢子放入单独的明胶胶囊(尺寸00)中，向其中加入700ml油性载剂。使用定制的雾化器
(Tallgrass Solutions，Inc.，Manhattan，KS)将接种物悬浮液施加到12天大的植物(第二片叶完全展开)上，该雾化器由设置为25至30kPa的泵加压。每株植物施用约0.15毫克的夏
孢子。接种后立即将植物置于小型电风扇前持续3至5分钟，以加速油性载剂从叶片表面的
蒸发。在将植物放入喷雾室之前，允许植物排气另外90分钟。在喷雾室内，超声波加湿器
(Vick’s model V5100NSJUV；Proctor&Gamble Co.，Cincinnati，OH)连续运行30分钟，为植物提供足够的初始水分，以使夏孢子发芽。在接下来的16至20小时，将植物保持在黑暗中，加湿器每15分钟运行2分钟以保持植物上的水分。对于使用茎锈病病原体的实验，在黑暗阶段后提供光(400W高压钠灯，发射300mmol光子s‑1m‑2)持续2至4小时。然后，将喷雾室门打开一半以使叶片表面完全干燥，然后将植物放回处在上述相同条件下的温室(Huang等人，
(2018)Plant Dis.102(6):1124‑1135，doi:10.1094/PDIS‑06‑17‑0880‑RE)。
[0371] 所有锈病表型实验均以完全随机设计进行，并随时间至少重复一次。如果有足够的种子可用，则在另外的实验中重复在实验间表现出可变反应的种质。接种后12天，使用0到4分制对种质上的茎锈病IT进行评分(Roelfs和Martens(1998)Phytopathol.78:526‑
533；Stakman等人，(1962)“Identification of Physiological Races of Puccinia 
graminis var.tritici,”U.S.Department of Agricultural Publications E617.USDA,
Washington,DC,1962)。
[0372] NLR Dk_04_40在T1中显示出明显的抗性反应，来自两个不同T1家族的所有个体在Stakman量表上均显示0或；。
[0373] 表1：筛查T1材料的秆锈病后确认的NLR的汇总。
[0374]
[0375] 1每百万转录本(转录本/百万)
[0376] 小麦条锈病(小麦条锈菌)
[0377] 小麦植物在18/11C中以16小时白天时长生长。对于接种，使用旋转接种器在第一叶片阶段用孢子和滑石混合物(1:16的比例)接种小麦植物。使用McNeal表型量表(Roelfs
等人，1992)在接种后10天对植物进行表型分析。抗性个体按McNeal评分为4或更低进行分
类。McNeal评分为5至7的中间个体，或包括叶片上孢子形成的减少，这与叶片上的易感对照或抗性部分明显不同(中等抗病反应)。为了便于表型分析，对几轮T2筛查进行了表型分析，以抗性(R)、中间(I)或易感(S)的综合评分来表示上述McNeal评分。
[0378] 已确认的NLR来自3个物种的6个种质，天然表达范围为每百万0.66至5.24个转录本(tpm)。已确认的NLR为：Dk_01_03、Dk_01_04、Dk_01_06、Dk_01_31、Dk_01_33、Dk_01_34、Dk_01_92、Dk_02_27、Dk_02_28、Dk_02_49、Dk_03_76。
[0379] 表2：用小麦条锈病(小麦条锈菌)分离株16/035筛查源自抗性T1材料的T2家族。
[0380]
[0381]
[0382] 表3：在T2筛查小麦条锈病后确认的NLR汇总。
[0383]
[0384] 小麦叶锈病(小麦叶锈菌)
[0385] 小麦植物在18/11C中以16小时白天时长生长。对于接种，使用旋转接种器在第一叶片阶段用孢子和滑石混合物(1:16的比例)接种小麦植物。所有分离株均以夏孢子形式储
存在–80℃的液氮中或4℃的真空管中。用小麦叶锈病(小麦叶锈菌)分离株13/34筛查植物，并在用于叶锈病的标准表型量表上评分，其中0和；表明不存在夏孢子堆的免疫或近免疫表型。表型评分为1至2表示抗性；X、Y和Z表示不同的异质性反应；3至4表示易感反应(Roelfs，
1984，“Race specificity and methods of study,”AP.Roelfs和W.R.Bushnell编，The Cereal Rusts Vol.I；Origins,Specificity,Structure,and Physiology.Academic 
Press，Orlando，pp.131‑164。
[0386] NLR Dk_01_19在T1中表现出明显的抗性反应，表明转基因对小麦叶锈病具有功能性。来自4个T1家族的所有个体均表现出控制性细胞死亡的抗性反应，其尖端起皱，显示被坏死包围的小夏孢子堆。
[0387] 表4：在筛查T1叶锈病后确认的NLR汇总。
[0388]
[0389] 实施例3：鉴定已知赋予双子叶植物高度表达NLR的亚群对卵菌、坏死性植物病原体、线虫、昆虫和病毒的抗性的NLR基因
[0390] 在双子叶植物的幼苗转录组中表达的NLR组中，高度表达的NLR的亚群对于功能性R基因是饱和的(图12‑14)。为了扩大拟南芥种质Columbia‑0(Col‑0)的观察结果，已知的针对晚疫病(拟南芥霜霉菌)的抗性基因RPP1、RPP5、RPP7和RPP8以及针对白锈病(白色念珠
菌)的WRR4、WRR8和WRR9的等位基因也存在于其它种质Landsberg erecta(Ler‑0)、San 
Feliu(Sf‑2)和Wassilewskija(Ws‑0)幼苗中表达的前25％的NLR中。在Sf‑2和Ws‑0种质中表达最高的NLR是RLM3的等位基因，其赋予对坏死性病原体灰霉病菌(Botrytis cinere)、
甘蓝黑叶斑病菌(甘蓝链格孢)和十字花科黑斑病菌(芸薹链格孢)的抗性。为了进一步确定
通过关联基因组学和长读段测序鉴定的表征的NLR可以使用上述标准从栽培植物物种的野
生近缘种中鉴定，我们研究了来自少花龙葵的Rpi‑amr1e(Witek等人，2021，Nature Plants 
20217:198‑208)。实际上，Rpi‑amr1e被确定为高度表达的NLR的前25％(图15)。为了证实功能性NLR跨组织类型的高度表达，我们研究了来自番茄的Mi‑1.2，其赋予对根结线虫
(Meloidogyne spp.)、马铃薯蚜虫(大戟长管蚜)和甘薯粉虱(烟粉虱)的抗性。Mi‑1.2存在于叶片中高度表达的NLR的前10％(图16和图18)和根中高度表达的NLR的前12％(图17和图
19)。此外，针对包括番茄花叶病毒和烟草花叶病毒在内的烟草病毒的Tm‑2抗性基因存在于番茄VFNT cherry栽培种的叶片中表达的NLR的前17％和根组织中表达的NLR的前10％(图
18和图19)。这些结果表明，本发明制备候选抗性(R)基因的文库的方法可用于产生高度富
集的有效R基因(尤其是NLR)的候选R基因的文库，所述基因抵抗多种植物有害生物，例如真菌、细菌、卵菌、线虫、病毒、昆虫和螨虫，以及这样的文库不仅可以从叶中制备，还可以从其它植物器官或植物部分(例如根)中制备。
[0391] 实施例4：在转基因植物中测试候选NLR基因
[0392] 小麦秆锈病(小麦秆锈菌)
[0393] 根据USDA‑ARS谷物病害实验室和明尼苏达大学(Huang等人，(2018)Plant Dis.102(6):1124‑1135，doi:10.1094/PDIS‑06‑17‑0880‑RE)使用的标准方案进行锈病接种。接种前一天，将锈病病原体的夏孢子从–80℃冰箱中取出，在45℃水浴中热激15分钟，然后在80％相对湿度的室内复水化过夜。在评估发芽率后(Scott等人，2014)，将10mg夏孢子放入单独的明胶胶囊(尺寸00)中，向其中加入700ml油性载剂。使用定制雾化器(Tallgrass Solutions，Inc.，Manhattan，KS)将接种物悬浮液施加到12天大的植物(第二片叶完全展
开)上，该雾化器由设置为25至30kPa的泵加压。每株植物施用约0.15毫克的夏孢子。接种后立即将植物置于小型电风扇前持续3至5分钟，以加速油性载剂从叶片表面的蒸发。在将植
物放入喷雾室之前，允许植物排气90分钟。在喷雾室内，超声波加湿器(Vick’s model 
V5100NSJUV；Proctor&Gamble Co.，Cincinnati，OH)连续运行30分钟，为植物提供足够的初始水分，以使夏孢子发芽。在接下来的16至20小时，将植物保持在黑暗中，加湿器每15分钟运行2分钟以保持植物上的水分。对于使用茎锈病病原体的实验，在黑暗阶段后提供光
(400W高压钠灯，发射300mmol光子s‑1m‑2)持续2至4小时。然后，将喷雾室门打开一半以使叶片表面完全干燥，然后将植物放回处在上述相同条件下的温室(Huang等人，(2018)Plant Dis.102(6):1124‑1135，doi:10.1094/PDIS‑06‑17‑0880‑RE)。
[0394] 所有锈病表型实验均以完全随机设计进行。如果有足够的种子可用，则在另外的实验中重复在实验间表现出可变反应的种质。接种后12天，使用0到4分制对种质上的茎锈
病IT进行评分(Roelfs和Martens(1998)Phytopathol.78:526‑533；Stakman等人，(1962)
“Identification of Physiological Races of Puccinia graminis var.tritici”，
U.S.Department of Agricultural Publications E617.USDA，Washington，DC，1962)。IT被总结为指定为抗性(R)、易感(S)或分离(seg)的表型，其中抗性在T1家族中分离。分离家族的表型表示为单个植物的表型。用小种QTHJC对植物进行表型分析，并用小种TTKSK对抗
性构建体进行进一步表型分析。未接种TTKSK的T1家族用“‑”表示。
[0395] 确认的NLR来自8个物种的14个种质。已确认的NLR为：Dk_01_21、Dk_01_48、Dk_03_15、Dk_03_49、Dk_03_68、Dk_04_40、Dk_04_67,Dk_04_71、Dk_04_91、Dk_05_75、Dk_05_92、Dk_06_02、Dk_06_03、Dk_06_10、Dk_06_36、Dk_06_52、Dk_08_16、Dk_08_79、Dk_09_55。
[0396] 表5：用小麦秆锈病(小麦秆锈菌)分离株QTHJC和TTKSK筛查T1家族。
[0397]
[0398]
[0399]
[0400] 表6：筛查T1的秆锈病后确认的NLR的汇总。
[0401]
[0402] 小麦条锈病(小麦条锈菌)
[0403] 小麦植物在18/11C中以16小时白天时长生长。对于接种，使用旋转接种器在第一叶片阶段用孢子和滑石混合物(1:16的比例)接种小麦植物。使用McNeal表型量表(Roelfs
等，1992)在接种后10天对植物进行表型分析。抗性个体按McNeal评分为4或更低进行分类。
McNeal评分为5至7的中间个体，或包括叶片上孢子形成的减少，这与叶片上的易感对照或
抗性部分明显不同(中等抗病反应)。为了便于表型分析，对几轮T2筛查进行了表型分析，以抗性(R)、中间(I)或易感(S)的综合评分来表示上述McNeal评分。
[0404] 已确认的NLR来自9个物种的18个种质。已确认的NLR为：Dk_01_35，Dk_01_55，Dk_01_57，Dk_01_59，Dk_01_60，Dk_01_61，Dk_01_62，Dk_01_64，Dk_01_68，Dk_02_02，Dk_02_
03，Dk_02_06，Dk_02_07，Dk_02_08，Dk_02_11，Dk_02_13，Dk_02_14，Dk_02_19，Dk_02_20，Dk_02_25，Dk_02_34，Dk_02_35，Dk_02_36，Dk_02_38，Dk_02_39，Dk_02_42，Dk_02_44，Dk_
02_46，Dk_03_13，Dk_03_16，Dk_03_19，Dk_03_48，Dk_03_58，Dk_03_60，Dk_04_34，Dk_04_
44，Dk_04_85，Dk_04_88，Dk_04_92，Dk_04_95，Dk_04_96，Dk_05_11，Dk_05_14，Dk_05_15，Dk_05_16，Dk_05_24，Dk_05_29，Dk_05_30，Dk_05_33，Dk_05_34，Dk_05_35，Dk_05_38，Dk_
05_42，Dk_05_44，Dk_05_47，Dk_05_53，Dk_05_56，Dk_06_01，Dk_06_03，Dk_06_04，Dk_06_
05，Dk_06_06，Dk_06_52，Dk_06_53。
[0405] 表7：用小麦条锈病(小麦条锈菌)分离株16/035筛查源自抗性T1材料的T2家族。
[0406]
[0407]
[0408]
[0409]
[0410]
[0411]
[0412]
[0413] 表8：在T2筛查小麦条锈病后确认的NLR汇总。
[0414]
[0415]
[0416]
[0417] 本文中的冠词“一个”和“一种”是指该冠词的语法宾语中的一个或多个(即至少一个/一种)。例如，“一种要素”是指一种或多种要素。
[0418] 在整个说明书中，词语“包含”或如“含有”或“包括”的变化形式将被理解为意味着包含所述的要素、整数或步骤，或要素、整数或步骤的组，但不排除任何其它要素、整数或步骤，或要素、整数或步骤的组。
[0419] 说明书中提到的所有出版物和专利申请都表明了本发明所属领域技术人员的水平。所有出版物和专利申请均通过引用并入本文，其程度与每个单独的出版物或专利申请
明确且单独指示通过引用并入的程度相同。
[0420] 尽管为了理解清楚的目的，已经通过阐述和举例对前述发明进行了一些详细描述，但显而易见的是，可以在所附权利要求的范围内实施某些改变和修改。
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