一种用于调节血管紧张素原基因表达的双链RNA、其缀合物、药物组合物及用途 |
|||||||
| 申请号 | CN202410052283.8 | 申请日 | 2024-01-15 | 公开(公告)号 | CN117568350B | 公开(公告)日 | 2024-04-30 |
| 申请人 | 苏州时安生物技术有限公司; | 发明人 | 陈平; 刘楠; 张红丽; | ||||
| 摘要 | 本 发明 涉及一种用于调节血管紧张素原基因表达的双链RNA、其缀合物、药物组合物及用途，双链RNA包括正义链和反义链，其中，正义链包括5’‑UCAACUGGAUGAAGAAACU‑3’，反义链包括5’‑AGUUUCUUCAUCCAGUUGAGG‑3’，其中，按照5’到3’的方向，正义链的第7位、第9位以及第11位的核苷酸为2’‑氟代修饰的核苷酸，反义链的第2位、第14位以及第16位的核苷酸为2’‑氟代修饰的核苷酸。本发明具有优异的血管紧张素原AGT表达抑制活性，具有良好的 治疗 血管紧张素原AGT表达相关联的 疾病 的潜 力 。本发明还具有组织特异性好，安全性高；药效持续时间长，用药依从性高。 | ||||||
| 权利要求 | 1.一种siRNA缀合物，其特征在于：按照5’‑3’方向，所述siRNA缀合物的正义链为UmsCmsAmAmCmUmGfGmAfUmGfAmAmGmAmAmAmCmUmSA102SA102SA102，反义链为AmsGfsUmUmUmCmUmUmCmAmUmCmCmAfGmUfUmGmAmsGmsGm； |
||||||
| 说明书全文 | 一种用于调节血管紧张素原基因表达的双链RNA、其缀合物、药物组合物及用途 技术领域背景技术[0002] 高血压是心脑血管疾病最主要的危险因素之一，长期高血压将引发人体多个靶器官损伤疾病，如：冠心病、心力衰竭、中风、外周血管病以及肾脏损害，其危害更甚于高血压病本身，因此，有效控制血压是防治高血压病及靶器官损伤的关键。 [0003] 目前，针对高血压的治疗药物主要有如下四种： 1). 利尿剂：噻嗪类药物使用最多，常用的有氢氯噻嗪。主要的不良反应是低钾血症和影响血脂、血糖、血尿酸代谢，其他的还包括乏力、尿量增多等，痛风患者禁用。2). β‑受体拮抗剂：适用于不同程度的高血压患者，尤其是心率较快的中、青年患者或合并心绞痛和慢性心力衰竭者，对老年高血压疗效相对较差。3). 钙通道阻滞剂：对老年患者有较好的降压疗效，对嗜酒患者也有显著降压作用，可用于合并糖尿病、冠心病或外周血管病患者；长期治疗还具有抗动脉粥样硬化作用。4). 血管紧张素转换酶抑制剂和血管紧张素II受体拮抗剂：特别适用于伴有心力衰竭、心肌梗死、房颤、蛋白尿、糖耐量减退或糖尿病肾病的高血压患者。 [0004] 治疗高血压需要长期维持治疗，而且不能随意停止治疗或者频繁改变治疗方案，停降压药后多数患者在半年内又恢复到原来的血压水平。由于降压治疗的长期性，因此患者的治疗依从性非常重要。目前，针对高血压相关的疾病的上市药物主要为小分子药物，都需要每日服用，药效持续时间短，患者依从性差；且大多数药物都伴随不同程度的副作用；部分患者联合服用仍不能很好的控制血压，显然这些药物不能满足现有的临床需求，因此针对该类疾病治疗需求的新药物变得越来越迫切。 [0005] 肾素‑血管紧张素‑醛固酮系统(RAAS)是一种激素级联反应，在血压调节中发挥作用，其抑制具有公认的抗高血压作用。血管紧张素原（angiotensinogen，AGT）是RAAS通路中最上游的前体蛋白，是一种肝脏中特异表达蛋白，多项研究在AGT与高血压和动脉粥样硬化的分子机制和临床相关性方面取得了很大进展，使其成为治疗心血管疾病的靶点。 [0006] 目前，以AGT 为靶点的药物研发，现在有两款核酸药物在进行临床Ⅱ期试验，分别为Alnylam 公司的siRNA药物和 Ionis公司的反义寡核苷酸药物（ASO药物）。目前进行临床试验的两款核酸药物使用剂量都较高，还存在药效提升空间，显然这些药物不能满足现有的临床需求，因此针对该类疾病治疗需求的新药物变得越来越迫切。 发明内容[0007] 本发明的目的在于提供一种用于调节血管紧张素原基因表达的双链RNA、其缀合物、药物组合物及用途，其能够有效抑制AGT蛋白的表达，并可以维持较长时间的半衰期，从而能够延长药效时间。 [0008] 为达到上述目的，本发明采用的技术方案是： [0009] 本发明第一方面提供一种双链RNA，所述双链RNA包括正义链和反义链，其中，所述正义链包括5’‑UCAACUGGAUGAAGAAACU‑3’（SEQ ID NO：1），所述反义链包括5’‑AGUUUCUUCAUCCAGUUGAGG‑3’（SEQ ID NO：2），其中，按照5’到3’的方向，所述正义链的第7位、第9位以及第11位的核苷酸为2’‑氟代修饰的核苷酸，所述反义链的第2位、第14位以及第16位的核苷酸为2’‑氟代修饰的核苷酸。 [0011] 根据一些实施方式，所述正义链的以下核苷酸之间的连接中至少一个为硫代磷酸酯基连接： [0012] 所述正义链的5’端第1个核苷酸和第2个核苷酸之间的连接； [0013] 所述正义链的5’端第2个核苷酸和第3个核苷酸之间的连接。 [0014] 根据一些实施方式，所述反义链的其他位置的核苷酸为2’‑甲氧基修饰的核苷酸。 [0015] 根据另一些实施方式，按照5’到3’的方向，所述反义链的第12位的核苷酸为2’‑氟代修饰的核苷酸，所述反义链的其他位置的核苷酸为2’‑甲氧基修饰的核苷酸。 [0016] 根据再一些实施方式，按照5’到3’的方向，所述反义链的第7位的核苷酸包括如结构式 所示的修饰，其中，R1为H、OH或CH3，R2为天然核碱基、修饰的核碱基、通用碱基或H原子；所述反义链的第12位的核苷酸为2’‑氟代修饰的核苷酸，所述反义链的其他位置的核苷酸为2’‑甲氧基修饰的核苷酸。 [0017] 根据又一些实施方式，按照5’到3’的方向，所述反义链的第7位的核苷酸包括如结构式 所示的修饰，其中，R1为H、OH或CH3，R2为天然核碱基、修饰的核碱基、通用碱基或H原子；所述反义链的其他位置的核苷酸为2’‑甲氧基修饰的核苷酸。 [0018] 进一步地，所述R2为T或U。 [0019] 根据一些实施方式，所述反义链的以下核苷酸之间的连接中至少一个为硫代磷酸酯基连接： [0020] 所述反义链的5’端第1个核苷酸和第2个核苷酸之间的连接； [0021] 所述反义链的5’端第2个核苷酸和第3个核苷酸之间的连接； [0022] 所述反义链的3’端第1个核苷酸和第2个核苷酸之间的连接； [0023] 所述反义链的3’端第2个核苷酸和第3个核苷酸之间的连接。 [0024] 根据第一种具体实施方式，所述双链RNA的正义链为5’‑UmsCmsAmAmCmUmGfGmAfUmGfAmAmGmAmAmAmCmUm‑3’，反义链为5’‑AmsGfsUmUmUmCmUmUmCmAmUmCmCmAfGmUfUmGmAmsGmsGm‑3’。 [0025] 根据第二种具体实施方式，所述双链RNA的正义链为5’‑ UmsCmsAmAmCmUmGfGmAfUmGfAmAmGmAmAmAmCmUm‑3’，反义链为5’‑AmsGfsUmUmUmCmUmUmCmAmUmCfCmAfGmUfUmGmAmsGmsGm‑3’。 [0026] 根据第三种具体实施方式，所述双链RNA的正义链为5’‑UmsCmsAmAmCmUmGfGmAfUmGfAmAmGmAmAmAmCmUm‑3’，反义链为5’‑AmsGfsUmUmUmCmUgoUmCmAmUmCfCmAfGmUfUmGmAmsGmsGm‑3’。 [0027] 根据第四种具体实施方式，所述双链RNA的正义链为5’‑UmsCmsAmAmCmUmGfGmAfUmGfAmAmGmAmAmAmCmUm‑3’，反义链为5’‑AmsGfsUmUmUmCmTgoUmCmAmUmCfCmAfGmUfUmGmAmsGmsGm‑3’。 [0028] 根据第五种具体实施方式，所述双链RNA的正义链为5’‑UmsCmsAmAmCmUmGfGmAfUmGfAmAmGmAmAmAmCmUm‑3’，反义链为5’‑AmsGfsUmUmUmCmUgoUmCmAmUmCmCmAfGmUfUmGmAmsGmsGm‑3’。 [0029] 根据第六种具体实施方式，所述双链RNA的正义链为5’‑UmsCmsAmAmCmUmGfGmAfUmGfAmAmGmAmAmAmCmUm‑3’，反义链为5’‑AmsGfsUmUmUmCmTgoUmCmAmUmCmCmAfGmUfUmGmAmsGmsGm‑3’。 [0030] 进一步地，上述具体实施方式中的Ugo的结构式为 ；Tgo的结构式为。 [0031] 本发明第二方面提供一种siRNA缀合物，其包括上述双链RNA，以及缀合至所述双链RNA的任意位置的缀合基团。 [0032] 根据一些具体实施方式，所述缀合基团来自化合物SA102，所述化合物SA102的结构式为： 。 [0033] 根据一些具体实施方式，所述双链RNA的任意位置连接两个、三个或四个连续连接的所述缀合基团。 [0034] 根据一些具体实施方式，所述缀合基团连接在所述正义链的3’末端和/或5’末端。 [0035] 根据一些具体实施方式，所述siRNA缀合物的正义链为如下结构式中的任意一种： [0036] 、 [0037] 、 [0038] 、 [0039] 、 [0040] 、 [0041] 、 [0042] 、 [0043] 、 [0044] 、 [0045] ， [0046] 其中Y为O或者S，SS为双链RNA的正义链。 [0047] 本发明第三方面提供一种药物组合物，其包括上述双链RNA或上述siRNA缀合物，以及药学上可接受的载体或辅料。 [0048] 根据一些具体实施方式，所述药物组合物用于调节血管紧张素原AGT的表达。 [0049] 本发明第四方面提供上述双链RNA，或上述siRNA缀合物，或上述药物组合物在用于制备调节血管紧张素原AGT表达的药剂中的用途。 [0050] 在一个具体实施方案中，所述血管紧张素原 AGT表达相关联的疾病包括临界性高血压、原发性高血压、继发性高血压、孤立性收缩期或舒张期高血压、妊娠相关高血压、糖尿病性高血压、顽固性高血压、难治性高血压、阵发性高血压、肾血管性高血压、戈德布拉特氏高血压、低血浆肾素活性或血浆肾素浓度相关的高血压、眼高血压、青光眼、肺动脉高血压、门静脉高血压、系统性静脉高血压、收缩期高血压、不稳定性高血压、高血压性心脏病、高血压性肾病、动脉粥样硬化、动脉硬化、血管病变、糖尿病性肾病、糖尿病性视网膜病、慢性心力衰竭、心肌病、糖尿病性心肌病、夜间高血压、肾小球硬化症、主动脉缩窄、主动脉瘤、心室纤维化、心力衰竭、心肌梗塞、心绞痛、中风、肾疾病、肾衰竭、系统性硬化症、宫内发育迟缓(IUGR)、胎儿生长受限、肥胖、肝脂肪变性/脂肪肝、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、非酒精性脂肪肝病(NAFLD)、葡萄糖耐受不良、2 型糖尿病和代谢综合征。 [0051] 本发明还提供了一种调节血管紧张素原AGT 表达的方法，包括将治疗有效量的本发明的双链RNA，或本发明的siRNA 缀合物，或本发明的药物组合物与表达血管紧张素原 AGT的细胞接触或给予有需要的受试者。 [0052] 本发明还提供了一种治疗和/或预防血管紧张素原AGT 表达相关联的疾病的方法，包括将治疗有效量的本发明的双链RNA，或本发明的siRNA缀合物，或本发明的药物组合物给予有需要的受试者。 [0053] 在某些实施方案中，上述双链RNA，或上述siRNA缀合物，或上述药物组合物通过皮下注射、静脉注射、鞘内注射或肌肉注射等形式施用。 [0054] 由于上述技术方案运用，本发明与现有技术相比具有下列优点： [0055] 本发明具有优异的血管紧张素原AGT 表达抑制活性，具有良好的治疗血管紧张素原AGT 表达相关联的疾病的潜力。本发明还具有组织特异性好，安全性高；药效持续时间长，用药依从性高；与现有同类型的药物相比，药效和安全性都有很大的提升。附图说明 [0057] 图2为实施例8的siRNA在食蟹猴体内给药后不同天数的AGT 蛋白相对剩余表达水平结果图。 具体实施方式[0058] 需要说明的是，除非另外定义，本申请使用的技术术语或者科学术语应当为所属领域的技术人员所理解的通常意义。 [0059] 下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的原料、试剂材料等，如无特殊说明，均为市售产品。 [0060] 定义 [0061] 在上文及下文中，2’‑甲氧基修饰的核苷酸指核苷酸的核糖基2'位的羟基被甲氧基取代形成的核苷酸；同理，2’‑氟代修饰的核苷酸是指核苷酸的核糖基2'位的羟基被氟取代所形成的核苷酸。 [0062] 硫代磷酸酯键修饰的核苷酸指核苷酸的磷酸酯基中的磷酸二酯键中的一个氧原子被硫原子取代。 [0063] VP修饰的核苷酸是指核苷酸的磷酸基团被乙烯基磷酸酯基取代形成的核苷酸。 [0064] 在上文及下文中，特别是在描述本公开的siRNA、药物组合物或siRNA缀合物的制备方法时，除非特别说明，所述核苷单体指，根据欲制备的siRNA或siRNA缀合物中核苷酸的种类和顺序，固相亚磷酰胺合成中使用的修饰或未修饰的核苷亚磷酰胺单体。固相亚磷酰胺合成为本领域技术人员所公知的RNA合成中所用的方法。本公开所用的核苷单体均可商购得到。 [0065] 在本公开的上下文中，除非另有说明，“缀合”是指两个或多个各自具有特定功能的化学部分之间以共价连接的方式彼此连接；相应地，“缀合物”是指该各个化学部分之间通过共价连接而形成的化合物。进一步地，“siRNA缀合物”表示一个或多个具有特定功能的化学部分共价连接至siRNA上而形成的化合物。siRNA缀合物应根据上下文，理解为多个siRNA缀合物的总称或者某个化学式所示的siRNA缀合物。在本公开的上下文中，“缀合分子”应当理解为可通过反应缀合至siRNA，最终形成本公开的siRNA缀合物的特定化合物。 [0066] 在本公开中可以使用各种羟基保护基团。一般来说，保护基团使化学官能团对特定的反应条件不敏感，并且可以在分子中的该官能团上添加以及去除，而不实质上损害分子的其余部分。 [0067] 本公开中所述的药学上可接受的载体可以是siRNA给药领域常规使用的载体，例如但不限于磁性纳米粒（magnetic nanoparticles，如基于Fe3O4或Fe2O3的纳米粒）、碳纳米管（carbon nanotubes）、介孔硅（mesoporous silicon）、磷酸钙纳米粒（calcium phosphate nanoparticles）、聚乙烯亚胺（polyethylenimine，PEI）、聚酰胺型树形高分子（polyamidoamine (PAMAM) dendrimer）、聚赖氨酸（poly(L‑lysine)，PLL）、壳聚糖（chitosan）、1,2‑二油酰基‑3‑三甲铵丙烷（1,2‑dioleoyl‑3‑trimethylammonium‑propane，DOTAP）、聚D型或L型乳酸/羟基乙酸共聚物（poly(D&L‑lactic/glycolic acid)copolymer，PLGA）、聚（氨乙基乙撑磷酸酯）（poly(2‑aminoethyl ethylene phosphate)，PPEEA）和聚（甲基丙烯酸‑N,N‑二甲氨基乙酯）（poly(2‑dimethylaminoethyl methacrylate)，PDMAEMA）以及它们的衍生物中的一种或多种。辅料可以为本领域常规采用的各种制剂或化合物的一种或多种。例如，所述药学上可接受的其它辅料可以包括pH缓冲液、保护剂和渗透压调节剂中的至少一种。 [0069] “受试者”一词，如本文所使用的，指任何动物，例如哺乳动物或有袋动物。本公开的受试者包括但不限于人类、非人灵长类（例如，恒河猴或其他类型的猕猴）、小鼠、猪、马、驴、牛、兔、绵羊、大鼠和任何种类的家禽。 [0070] 如本文所使用的，“治疗”指的是获得有益的或期望的结果的方法，包括但不限于治疗益处。“治疗益处”意味着根除或改善被治疗的潜在障碍。此外，治疗益处通过根除或改善与潜在障碍相关的一个或多个生理症状，从而在受试者中观察到改善而获得，尽管受试者可能仍然受到潜在障碍的折磨。 [0071] 如本文所使用的“预防”指获得有益或期望的结果的方法，包括但不限于预防性益处。为了获得“预防性益处”，可将siRNA、siRNA缀合物或药物组合物给予有罹患特定疾病风险的受试者，或给予报告疾病的一种或多种生理症状的受试者，即便可能该疾病的诊断尚未作出。 [0072] 下面结合具体的实施例对本发明提供的技术方案做进一步的描述。下述实施例仅用于对本发明进行说明，并不会对本发明的保护范围进行限制。实施例1 siRNA的合成 [0073] 本文中，若未给出实际的试剂来源，则该类试剂可以自任意分子生物学试剂的供应商获得；且具备满足用于分子生物学应用的质量/纯度标准。 [0074] 使用固体支撑物介导的亚磷酰胺化学于Dr.Oligo48合成器(Biolytic)上以200纳摩尔(nmol)规格合成siRNA序列。该固体支撑物是通用固体支撑物(深圳逗点生物)。核苷单体原料2’‑F RNA、2’‑O‑甲基RNA等核苷亚磷酰胺单体购自上海兆维或苏州吉玛。全部亚磷酰胺(50mM乙腈溶液)的偶合时间是6分钟(min)，采用5‑乙基硫‑1H‑四唑(ETT)作为活化剂(0.6M乙腈溶液)，使用0.22 M的PADS溶于1：1体积比的乙腈和三甲基吡啶（苏州柯乐玛）溶液作为硫化试剂，硫化反应时间是3分钟（min），使用碘吡啶/水溶液（柯乐玛）作为氧化剂，氧化反应时间2分钟（min）。 [0075] 固相合成完成后，寡核糖核苷酸自该固体支撑物裂解，采用3：1的28%氨水和乙醇溶液在50℃条件下浸泡16小时。然后高速离心，将上清液转移到另一个离心管中，浓缩蒸发干后，使用C18反向色谱纯化，流动相为0.1M TEAA和乙腈，并使用3%三氟乙酸溶液脱出DMTr。目标寡核苷酸收集后冻干，并经LC‑MS鉴定为目标产物，再经过UV（260nm）定量。 [0076] 所得到的单链寡核苷酸，根据等摩尔比，按照互补配对的两条序列，进行退火，最后所得到的双链siRNA溶于1X PBS中，并调整至实验所需浓度。这些单体通过5’‑3’‑磷酸二酯键相互连接成寡核苷酸。 [0077] 实施例2缀合基团的制备 [0078] 一、化合物SA51 (I‑1‑7)的制备 [0079] 1.1、中间体2‑1的制备 [0080] [0081] 将化合物(R)‑(+)‑N‑苄基‑3‑羟基吡咯烷 (市售，购买于上海泰坦科技股份有限公司) (16.9 mmol，3.0 g) 和咪唑 (3.0 equiv，50.7 mmol，3.45 g) 置于洁净干燥反应瓶中，加入50 mL乙腈，室温下缓慢加入叔丁基二甲基氯硅烷 (1.3 equiv，21.9 mmol，3.31 g)，随后室温继续搅拌12小时。反应后向反应液中加入100 mL乙酸乙酯，并用100 mL饱和碳酸氢钠溶液和100 mL饱和食盐水洗涤，干燥有机相，过滤并浓缩，所得粗产品硅胶柱层析分离纯化 (石油醚/乙酸乙酯 = 20/1 ‑ 5/1)，得到无色油状物化合物2‑1 (4.9 g，16.8 mmol，99%收率)。化合物2‑1分子式：C17H29ONSi，分子量：291.2，LC‑MS实测：292.4 (M+H)。 [0082] 1.2 中间体2‑2的制备 [0083] [0084] 将化合物2‑1 (16.8 mmol, 4.9 g) 置于洁净干燥反应瓶中，加入100 mL甲醇，室温氢气下加入钯碳 (湿基，10% Pd/C) (10%wt，490.0 mg)，随后室温继续搅拌12小时。反应后过滤除去钯碳，滤液浓缩，得到粗产品白色固体化合物2‑2 (3.31 g，16.5 mmol，98%收率)，未纯化直接投入下一步反应。化合物2‑2分子式：C10H23ONSi，分子量：201.1，LC‑MS实测：202.3 (M+H)。 [0085] 1.3 中间体2‑3的制备 [0086] [0087] 将化合物N‑苄氧羰基‑L‑丝氨酸 (市售，购买于上海泰坦科技股份有限公司) (15.0 mmol, 3.58 g) 置于洁净干燥反应瓶中，加入100 mL二氯甲烷，室温下加入苯并三氮唑‑N,N,N',N'‑四甲基脲六氟磷酸盐 (1.5 equiv, 22.5 mmol, 8.53 g)、化合物2‑2 (1.1 equiv, 16.5 mmol, 3.31 g) 和N,N‑二异丙基乙胺 (3.0 equiv, 45.0 mmol, 5.78 g)，随后室温搅拌1小时。反应后向反应液中加入150 mL二氯甲烷，并用150 mL饱和碳酸氢钠溶液和150 mL饱和食盐水洗涤，干燥有机相，过滤并浓缩，所得粗产品硅胶柱层析分离纯化 (石油醚/乙酸乙酯 = 10/1 ‑ 1/3)，得到白色固体化合物2‑3 (4.5 g, 10.65 mmol, 1 63%两步收率)。化合物2‑3分子式：C21H34O5N2Si，分子量：422.2，LC‑MS实测：423.3 (M+H)。H NMR (400 MHz, CDCl3)： δ 7.35–7.29 (m, 5H), 5.96 (dd, J = 14.3, 8.3 Hz, 1H), 5.10 (s, 2H), 4.61 – 4.40 (m, 2H), 3.85 – 3.68 (m, 2H), 3.65 – 3.49 (m, 2H), 3.41 (d, J = 12.7 Hz, 1H), 3.31 (s, 1H), 1.95 (qdd, J = 15.0, 11.8, 5.3 Hz, 2H), 1.77 (s, 1H), 0.86 (s, 9H), 0.06 (d, J = 3.1 Hz, 6H)。 [0088] 1.4 中间体2‑4的制备 [0089] [0090] 将化合物2‑3 (10.65 mmol, 4.5 g) 置于洁净干燥反应瓶中，加入100 mL吡啶，室温下加入4,4'‑双甲氧基三苯甲基氯 (1.2 equiv, 12.78 mmol, 4.32 g)，随后室温继续搅拌12小时。反应后向反应液中加入150 mL乙酸乙酯，并用150 mL饱和碳酸氢钠溶液和150 mL饱和食盐水洗涤，干燥有机相，过滤并浓缩，所得粗产品硅胶柱层析分离纯化 (石油醚/乙酸乙酯 = 20/1 ‑ 1/1), 得到淡黄色油状物化合物2‑4 (7.56 g, 10.43 mmol, 98% 1 收率)。化合物2‑4分子式：C42H52O7N2Si，分子量：724.3，LC‑MS实测：747.4 (M+Na)。H NMR (400 MHz, CDCl3)： δ7.35–7.31 (m, 1H), 7.28 (d, J = 4.7 Hz, 4H), 7.27 – 7.23 (m, 2H), 7.23 – 7.14 (m, 5H), 7.13 – 7.11 (m, 2H), 6.80–6.78 (m, 1H), 6.76 (dd, J = 7.7, 5.4 Hz, 4H), 5.72 (dd, J = 22.7, 8.3 Hz, 1H), 5.08 – 4.99 (m, 2H), 4.69 – 4.59 (m, 1H), 4.35 – 4.30 (m, 1H), 3.73 (dd, J = 4.5, 3.7 Hz, 6H), 3.65 – 3.44 (m, 2H), 3.36 – 3.20 (m, 3H), 1.86 – 1.81 (m, 1H), 1.70 (s, 1H), 0.80 (d, J = 13.1 Hz, 9H), ‑0.02 (dd, J = 14.9, 4.2 Hz, 6H)。 [0091] 1.5 中间体2‑5的制备 [0092] [0093] 将化合物2‑4 (10.43 mmol, 7.56 g) 置于洁净干燥反应瓶中，加入100 mL甲醇，室温氢气下加入钯碳 (湿基，10% Pd/C) (10%wt, 750.0 mg)，随后室温继续搅拌12小时。反应后过滤除去钯碳，滤液浓缩，得到粗产品白色固体化合物2‑5 (6.0 g, 10.22 mmol, 98%收率)，未纯化直接投入下一步反应。化合物2‑5分子式：C34H46O5N2Si，分子量：590.3，LC‑MS实测：591.6 (M+H)。 [0094] 1.6 中间体2‑6的制备 [0095] [0096] 将化合物5‑(((2R,3R,4R,5R,6R)‑3‑乙酰氨基‑4,5‑二乙酰氧基‑6‑(乙酰氧基甲基)四氢‑2H‑吡喃‑2‑基)氧基)戊酸 (市售，购买于诺甘林生物医药科技（苏州）有限公司) (2.06 g, 4.62 mmol) 置于洁净干燥反应瓶中，加入100 mL二氯甲烷，室温下加入苯并三氮唑‑N,N,N',N'‑四甲基脲六氟磷酸盐 (1.5 equiv, 6.93 mmol, 2.63 g)，搅拌十分钟，随后向反应体系中加入化合物2‑5 (1.1 equiv, 5.08 mmol, 3.0 g) 和N,N‑二异丙基乙胺 (3.0 equiv, 13.86 mmol, 17.91 g)，随后室温继续搅拌1小时。反应后向反应液中加入150 mL二氯甲烷，并用150 mL饱和碳酸氢钠溶液和150 mL饱和食盐水洗涤，干燥有机相，过滤并浓缩，所得粗产品硅胶柱层析分离纯化 (二氯甲烷/甲醇 = 50/1 ‑ 10/1)，得到白色固体化合物2‑6 (3.58 g, 3.51 mmol, 76%收率)。化合物2‑6分子式： C53H73O15N3Si，分子量：1019.3，LC‑MS实测：1018.3 (M‑H)。 [0097] 1.7 中间体2‑7的制备 [0098] [0099] 将化合物2‑6 (3.51 mmol, 3.58 g) 置于洁净干燥反应瓶中，加入50 mL吡啶，室温下加入三乙胺氟化氢 (5.0 equiv, 17.55 mmol, 2.97 g)，随后室温继续搅拌12小时。反应后向反应液中加入100 mL乙酸乙酯，并用100 mL饱和碳酸氢钠溶液和100 mL饱和食盐水洗涤，干燥有机相，过滤并浓缩，所得粗产品硅胶柱层析分离纯化 (二氯甲烷/甲醇 = 50/1 ‑ 10/1)，得到淡黄色油状物化合物2‑7 (2.4 g, 2.65 mmol, 76%收率)。化合物2‑7 1 分子式：C47H59O15N3，分子量：905.3，LC‑MS实测：904.4 (M‑H)。H NMR(400 MHz, CDCl3)：δ 7.30 (dd, J = 4.2, 1.9 Hz, 1H), 7.29–7.25 (m, 5H), 7.19–7.15 (m, 4H), 6.85– 6.81 (m, 4H), 5.40–5.34 (m, 1H), 5.30 (s, 1H), 5.26 –5.19 (m, 1H), 5.13 (ddd, J = 14.5, 10.9, 3.3 Hz, 1H), 4.85 – 4.78 (m, 1H), 4.75 – 4.71 (m, 1H), 4.68 – 4.61 (m, 1H), 4.50 (d, J = 11.5 Hz, 1H), 4.18 – 4.11 (m, 2H), 4.06 – 3.97 (m, 1H), 3.90 (dt, J = 10.6, 6.8 Hz, 2H), 3.80 (s, 6H), 3.67 – 3.46 (m, 4H), 3.25 – 3.19 (m, 2H), 2.34 – 2.23 (m, 1H), 2.17 – 2.15 (m, 3H), 2.10 – 2.03 (m, 5H), 1.98 (dt, J = 12.9, 2.4 Hz, 4H), 1.76 – 1.61 (m, 4H), 1.37 (t, J = 7.3 Hz, 3H)。 [0100] 1.8 化合物I‑1‑7的制备 [0101] [0102] 将化合物2‑7 (2.65 mmol, 2.4 g) 置于洁净干燥反应瓶中，加入50 mL无水二氯甲烷（市售，购买于上海泰坦科技股份有限公司）。室温氩气保护下加入化合物2‑氰乙基N,N,N’,N’‑四异丙基亚磷酰二胺 (2.0 equiv, 5.3 mmol, 1.6 g) 和4,5‑二氰咪唑 (1.5 equiv, 3.97 mmol, 470.0 mg)，室温下继续搅拌一小时。反应后向反应液中加入50 mL二氯甲烷，并用100 mL饱和碳酸氢钠溶液洗涤，干燥有机相，过滤并浓缩，所得粗产品经C18反相柱（规格：30μm；100 Å，市售，购买于上海博蕴生物科技有限公司）（MeCN：H2O = 75%：25%）制备得到白色固体I‑1‑7 (2.03 g, 1.84 mmol, 70%收率)。化合物I‑1‑7分子式：1 C56H76O15N6P，分子量：1105.5，LC‑MS实测：1128.4 (M+Na)。H NMR (400 MHz, DMSO‑d6)：δ 8.12–8.06 (m, 1H), 7.78 (dd, J = 9.1, 2.0 Hz, 1H), 7.35–7.28 (m, 4H), 7.23 – 7.17 (m, 5H), 6.88 (d, J = 7.5 Hz, 4H), 5.21 (d, J = 3.3 Hz, 1H), 4.97 (dd, J = 11.2, 3.0 Hz, 1H), 4.86 – 4.75 (m, 1H), 4.52 (s, 1H), 4.47 (d, J = 8.5 Hz, 1H), 4.04 – 3.98 (m, 3H), 3.91 – 3.83 (m, 1H), 3.74 (s, 6H), 3.70 – 3.60 (m, 3H), 3.58 – 3.47 (m, 3H), 3.39 (t, J = 11.7 Hz, 2H), 3.31 (d, J = 4.1 Hz, 1H), 3.19 (qd, J = 8.7, 3.8 Hz, 1H), 3.02 (dt, J = 19.9, 6.8 Hz, 1H), 2.78 – 2.70 (m, 1H), 2.60 (td, J = 5.8, 1.8 Hz, 1H), 2.09 (s, 5H), 1.98 (s, 4H), 31 1.89 (s, 3H), 1.73 (s, 3H), 1.44 (s, 4H), 1.20 – 0.88 (m, 14H)。P NMR (162 MHz, DMSO‑d6)：δ 148.22 (s), 146.82 (t, J = 35.8 Hz)。 [0103] 二、化合物SA102的制备 [0104] 2.1 中间体1‑1的制备 [0105] [0106] 将化合物(R)‑(+)‑N‑苄基‑3‑羟基吡咯烷 (市售，购买于上海泰坦科技股份有限公司) (16.9 mmol, 3.0 g) 和咪唑 (3.0 equiv, 50.7 mmol, 3.45 g) 置于洁净干燥反应瓶中，加入50 mL乙腈，室温下缓慢加入叔丁基二甲基氯硅烷 (1.3 equiv, 21.9 mmol, 3.31 g)，随后室温继续搅拌12小时。反应后向反应液中加入100 mL乙酸乙酯，并用100 mL饱和碳酸氢钠溶液和100 mL饱和食盐水洗涤，干燥有机相，过滤并浓缩，所得粗产品硅胶柱层析分离纯化 (梯度洗脱：石油醚/乙酸乙酯 = 20/1 ‑ 5/1)，得到无色油状物化合物1‑1 (4.9 g, 16.8 mmol, 99%收率)。化合物1‑1分子式：C17H29ONSi，分子量：291.2，LC‑MS找到 292.4 (M+H)。 [0107] 2.2中间体1‑2的制备 [0108] [0109] 将化合物1‑1 (16.8 mmol, 4.9 g) 置于洁净干燥反应瓶中，加入100 mL甲醇，室温氢气下加入钯碳 (湿基，10% Pd/C) (10%wt, 490.0 mg)，随后室温继续搅拌12小时。反应后过滤除去钯碳，滤液浓缩，得到粗产品白色固体化合物1‑2 (3.31 g, 16.5 mmol, 98%收率)，未纯化直接投入下一步反应。化合物1‑2分子式：C10H23ONSi，分子量：201.1，LC‑MS找到202.3 (M+H)。 [0110] 2.3中间体1‑3的制备 [0111] [0112] 将化合物N‑苄氧羰基‑L‑丝氨酸 (市售，购买于上海泰坦科技股份有限公司) (15.0 mmol, 3.58 g) 置于洁净干燥反应瓶中，加入100 mL二氯甲烷，室温下加入苯并三氮唑‑N,N,N',N'‑四甲基脲六氟磷酸盐 (1.5 equiv, 22.5 mmol, 8.53 g)、化合物1‑2 (1.1 equiv, 16.5 mmol, 3.31 g) 和N,N‑二异丙基乙胺 (3.0 equiv, 45.0 mmol, 5.78 g), 随后室温搅拌1小时。反应后向反应液中加入150 mL二氯甲烷，并用150 mL饱和碳酸氢钠溶液和150 mL饱和食盐水洗涤，干燥有机相，过滤并浓缩，所得粗产品硅胶柱层析分离纯化 (梯度洗脱：石油醚/乙酸乙酯 = 10/1 ‑ 1/3)，得到白色固体化合物1‑3 (4.5 g, 10.65 mmol, 63%两步收率)。化合物1‑3分子式：C21H34O5N2Si，分子量：422.2，LC‑MS找到 1 423.3 (M+H)。H NMR (400 MHz, CDCl3)： δ 7.35 – 7.29 (m, 5H), 5.96 (dd, J = 14.3, 8.3 Hz, 1H), 5.10 (s, 2H), 4.61 – 4.40 (m, 2H), 3.85 – 3.68 (m, 2H), 3.65 – 3.49 (m, 2H), 3.41 (d, J = 12.7 Hz, 1H), 3.31 (s, 1H), 1.95 (qdd, J = 15.0, 11.8, 5.3 Hz, 2H), 1.77 (s, 1H), 0.86 (s, 9H), 0.06 (d, J = 3.1 Hz, 6H)。 [0113] 2.4中间体1‑4的制备 [0114] [0115] 将化合物1‑3 (10.65 mmol, 4.5 g) 置于洁净干燥反应瓶中，加入100 mL吡啶，室温下加入4,4'‑双甲氧基三苯甲基氯 (1.2 equiv, 12.78 mmol, 4.32 g)，随后室温继续搅拌12小时。反应后向反应液中加入150 mL乙酸乙酯，并用150 mL饱和碳酸氢钠溶液和150 mL饱和食盐水洗涤，干燥有机相，过滤并浓缩，所得粗产品硅胶柱层析分离纯化 (梯度洗脱：石油醚/乙酸乙酯 = 20/1 ‑ 1/1)，得到淡黄色油状物化合物1‑4 (7.56 g, 10.43 1 mmol, 98%收率)。化合物1‑4分子式：C42H52O7N2Si，分子量：724.3，LC‑MS找到747.4 (M+Na)。H NMR (400 MHz, CDCl3)：δ 7.35 – 7.31 (m, 1H), 7.28 (d, J = 4.7 Hz, 4H), 7.27 – 7.23 (m, 2H), 7.23 – 7.14 (m, 5H), 7.13 – 7.11 (m, 2H), 6.80 – 6.78 (m, 1H), 6.76 (dd, J = 7.7, 5.4 Hz, 4H), 5.72 (dd, J = 22.7, 8.3 Hz, 1H), 5.08 – 4.99 (m, 2H), 4.69 – 4.59 (m, 1H), 4.35 – 4.30 (m, 1H), 3.73 (dd, J = 4.5, 3.7 Hz, 6H), 3.65 – 3.44 (m, 2H), 3.36 – 3.20 (m, 3H), 1.86 – 1.81 (m, 1H), 1.70 (s, 1H), 0.80 (d, J = 13.1 Hz, 9H), ‑0.02 (dd, J = 14.9, 4.2 Hz, 6H)。 [0116] 2.5中间体1‑5的制备 [0117] [0118] 将化合物1‑4 (10.43 mmol, 7.56 g) 置于洁净干燥反应瓶中，加入100 mL甲醇，室温氢气下加入钯碳 (湿基，10% Pd/C) (10%wt, 750.0 mg)，随后室温继续搅拌12小时。反应后过滤除去钯碳，滤液浓缩，得到粗产品白色固体化合物1‑5 (6.0 g, 10.22 mmol, 98%收率)，未纯化直接投入下一步反应。化合物1‑5分子式：C34H46O5N2Si，分子量：590.3，LC‑MS找到591.6 (M+H)。 [0119] 2.6中间体1‑6的制备 [0120] [0121] 将化合物1‑5 (10.22 mmol, 6.0 g)置于洁净干燥反应瓶中，加入100 mL二氯甲烷，室温下加入4‑二甲氨基吡啶 (30 mol%, 3.07 mmol, 374.6 mg) 和 N,N‑二异丙基乙胺 (3.0 equiv, 30.66 mmol, 3.96 g)，随后向反应体系中加入己二酸酐 (1.5 equiv, 15.33 mmol, 1.96 g)，室温继续搅拌4小时。反应后将反应液直接浓缩，所得粗产品硅胶柱层析分离纯化 (梯度洗脱：二氯甲烷/甲醇 = 50/1 ‑ 8/1)，得到白色固体化合物1‑6 (5.28 g, 7.36 mmol, 72%收率)。化合物1‑6分子式：C40H54O8N2Si，分子量：718.3，LC‑MS找到717.3 (M‑H)。 [0122] 2.7中间体1‑8的制备 [0123] [0124] 将化合物1‑6 (7.36 mmol, 5.28 g) 置于洁净干燥反应瓶中，加入100 mL二氯甲烷，室温下加入苯并三氮唑‑N,N,N',N'‑四甲基脲六氟磷酸盐 (1.5 equiv, 11.04 mmol, 4.19 g) 、N,N‑二异丙基乙胺 (3.0 equiv, 22.08 mmol, 2.85 g) 和化合物1‑7 (市售，购买于天津药明康德新药开发有限公司) (1.1 equiv, 8.1 mmol, 4.31 g)，室温继续搅拌1小时。反应后向反应液中加入150 mL二氯甲烷，并用150 mL饱和碳酸氢钠溶液和150 mL饱和食盐水洗涤，干燥有机相，过滤并浓缩，所得粗产品硅胶柱层析分离纯化 (梯度洗脱： 二氯甲烷/甲醇 = 50/1 ‑ 10/1)，得到淡黄色固体化合物1‑8 (6.75 g, 6.04 mmol, 82%收率)。化合物1‑8分子式：C58H82O16N4Si，分子量：1118.5，LC‑MS找到1117.3 (M‑H)。 [0125] 2.8中间体1‑9的制备 [0126] [0127] 将化合物1‑8 (6.04 mmol, 6.75 g) 置于洁净干燥反应瓶中，加入50 mL四氢呋喃，室温下加入四丁基氟化铵 (1.0 M in THF) (2.0 equiv, 12.08 mmol, 12.08 mL)，随后室温继续搅拌2小时。反应后向反应液中加入100 mL乙酸乙酯，并用100 mL饱和碳酸氢钠溶液和100 mL饱和食盐水洗涤，干燥有机相，过滤并浓缩，所得粗产品硅胶柱层析分离纯化 (梯度洗脱：二氯甲烷/甲醇 = 50/1 ‑ 8/1)，得到淡黄色固体化合物1‑9 (5.22 g, 5.19 mmol, 86%收率)。化合物1‑9分子式：C52H68O16N4，分子量：1004.4，LC‑MS找到1003.3 (M‑H)。 [0128] 2.9化合物SA102的制备 [0129] [0130] 将化合物1‑9 (5.19 mmol, 5.22 g) 置于洁净干燥反应瓶中，加入50 mL无水二氯甲烷。室温氩气保护下加入化合物2‑氰乙基N,N,N’,N’‑四异丙基亚磷酰二胺 (2.0 equiv, 10.38 mmol, 3.13 g) 和4,5‑二氰咪唑 (1.5 equiv, 7.79 mmol, 920.2 mg)，室温下继续搅拌一小时。反应后向反应液中加入50 mL二氯甲烷，并用100 mL饱和碳酸氢钠溶液洗涤，干燥有机相，过滤并浓缩，所得粗产品经C18反相柱 (规格：30 μm；100 Å，市售，购买于上海博蕴生物科技有限公司) (MeCN：H2O = 75%：25%) 制备得到白色固体SA102 (4.44 g, 3.68 mmol, 71%收率)。化合物SA102分子式：C61H85O17N6P，分子量：1204.5，LC‑MS1 找到1227.3 (M+Na)。H NMR (400 MHz, DMSO‑d6)：δ 8.10 (q, J = 8.3 Hz, 1H), 7.80 (d, J = 9.2 Hz, 1H), 7.68 (dd, J = 8.8, 4.9 Hz, 1H), 7.35 – 7.28 (m, 4H), 7.20 (ddd, J = 11.2, 6.7, 2.2 Hz, 5H), 6.89 – 6.87 (m, 4H), 5.21 (d, J = 3.3 Hz, 1H), 4.96 (dd, J = 11.2, 3.4 Hz, 1H), 4.85 – 4.74 (m, 1H), 4.48 (d, J = 8.5 Hz, 2H), 4.04 – 3.99 (m, 3H), 3.87 (dd, J = 20.0, 8.9 Hz, 1H), 3.74 (s, 6H), 3.72 – 3.67 (m, 2H), 3.63 – 3.46 (m, 4H), 3.44 – 3.38 (m, 2H), 3.18 (qd, J = 8.8, 4.6 Hz, 2H), 3.06 – 2.97 (m, 3H), 2.74 (ddd, J = 16.6, 11.8, 5.9 Hz, 1H), 2.61 (td, J = 5.8, 1.8 Hz, 1H), 2.10 (s, 5H), 1.99 (s, 6H), 1.89 (s, 3H), 1.76 (s, 3H), 1.46 – 1.33 (m, 8H), 1.24 – 1.09 (m, 12H), 1.06 (d, J = 31 6.7 Hz, 1H), 1.00 (d, J = 6.7 Hz, 1H)。P NMR (162 MHz, DMSO‑d6)：δ 147.07 (s), 146.74 (t, J = 32.0 Hz)。 [0131] 实施例3 Ugo单体以及Tgo单体的合成 [0133] [0134] （1）在冰水浴条件下分别将化合物1‑4 (9.99 g, 30.8 mmol)、化合物 U‑1（市售，购买于上海皓鸿生物医药科技有限公司） (9.33 g, 43.1 mmol,1.4 equiv) 和三苯基膦 (16.6 g, 63.2 mmol, 2.0 equiv) 溶解于干燥的四氢呋喃 (350.0 mL) 中，随后向反应体系中滴加偶氮二甲酸二异丙酯(13.1 g, 64.7 mmol, 12.6 mL, 2.1 equiv)。随后将反应液在室温条件下搅拌 2小时。反应完毕用饱和碳酸氢钠溶液和乙酸乙酯萃取反应液 3次，将有机相合并旋干，得到的粗产品用硅胶柱层析（石油醚/乙酸乙酯10：1至8：1）进行分1 离纯化，得到白色固体化合物3‑1 (16.1 g，反应收率99%)。化合物3‑1 的 H NMR 数据： (400 MHz, DMSO‑d6) δ 7.89‑7.74 (m,4H), 7.56‑7.53 (m, 2H), 7.33‑7.29 (m, 5H), 5.80‑5.73 (m, 1H), 4.46‑4.38(m, 2H), 4.00‑3.91 (m, 2H), 3.60‑3.50 (m, 1H), 3.49‑3.43 (m, 2H)2.17‑1.98 (m, 1H), 1.13 (s, 3H), 0.83 (s, 9H), 0.01 (d, J = 6.0 Hz, 6H)。化合物3‑1 的质谱鉴定 (C29H38N2O5Si，分子量522.1，[M+H] =523.2)。 [0135] （2）室温条件下将化合物3‑1 (8.05 g, 15.4 mmol) 溶解于甲醇 (160.0mL)中，随后向反应体系中缓慢加入甲醇钠 (2.77 g, 15.4 mmol, 30%纯度, 1.0 equiv)。随后将反应液在室温条件下搅拌12 小时。反应完毕减压蒸馏除去溶剂甲醇，剩余体系用1M 盐酸溶液和乙酸乙酯萃取反应液 3 次，将有机相合并旋干，得到的粗产品用硅胶柱层析（石油醚/乙酸乙酯10：1 至0：1）进行分离纯化，得到白色固体化合物3‑2 (6.1g，反应收率94%)。1 化合物3‑2 的H NMR 数据： (400 MHz, DMSO‑d6) δ 11.1 (s, 1H),7.48 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 7.30‑7.24 (m, 5H), 5.47‑5.44 (m, 1H), 4.45‑4.35(m, 2H), 3.98‑3.94 (m, 1H), 3.79‑3.78 (m, 1H), 3.63‑3.57 (m, 1H),3.38‑3.35 (m, 2H), 2.04‑1.95 (m, 1H), 1.10 (s, 3H), 0.83 (s, 9H), 0.01 (d,J = 6.0 Hz, 6H)。化合物3‑2 的质谱鉴定 (C22H34N2O4Si，分子量418.1，[M+H] =418.2)。 [0136] （3）在‑70℃条件下将化合物3‑2 (4.0 g, 9.56 mmol) 溶解于二氯甲烷(30.0 mL) 中，随后向反应体系中缓慢加入三氯化硼 (1.0 M在DCM中，66.9 mL, 7.0 equiv)。随后将反应液在‑70℃条件下搅拌3 小时。反应完毕用三乙胺 (5.0 mL)和甲醇 (30.0 mL) 淬灭反应，剩余体系用水和二氯甲烷萃取反应液3 次，将有机相合并旋干，得到的粗产品用 1 C18 反相柱制备得到白色固体化合物3‑3 (0.7 g，反应收率33%)。化合物3‑3 的H NMR 数据： (400 MHz, DMSO‑d6) δ 7.54 (d, J =8.0 Hz, 1H), 5.51 (d, J = 7.6 Hz, 1H), 3.88‑3.84 (m, 1H), 3.72‑3.70 (m,1H), 3.61‑3.59 (m, 2H), 1.75‑1.68 (m, 1H), 1.09 (d, J = 6.4 Hz, 3H)。化合物3‑3 的质谱鉴定 (C9H14N2O4，分子量214.1，[ M+H] = 215.2)。 [0137] （4）在室温条件下将化合物3‑1 (0.4 g, 1.87 mmol) 溶解于吡啶 (4.0mL) 中，冰水浴条件下向反应体系中加入 4,4'‑双甲氧基三苯甲基氯(949.0 mg, 2.8 mmol, 1.5 equiv)。随后将反应液在室温条件下搅拌2 小时。反应完毕减压蒸馏除去溶剂吡啶，剩余体系用饱和碳酸氢钠溶液和乙酸乙酯萃取反应液3 次，将有机相合并旋干，得到的粗产品用硅胶柱层析（石油醚/乙酸乙酯4：1 至0：1）进行分离纯化，得到白色固体化合物 3‑4 (0.7 1 g，反应收率 70%)。化合物3‑4 的 H NMR 数据： (400 MHz, DMSO‑d6) δ 11.3 (s, 1H), 7.37 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 7.33‑7.29 (m, 4H), 7.20‑7.17 (m, 5H), 6.86‑6.83(m, 4H), 5.40 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 4.61 (d, J = 4.8 Hz, 2H), 3.83‑3.79 (m,2H), 3.72 (s, 6H), 3.71‑3.68 (m, 1H), 3.08‑2.90 (m, 2H), 1.90 (s, 1H), 1.01 (d, J = 6.4 Hz, 3H)。化合物3‑4 的质谱鉴定 (C30H32N2O6，分子量516.1，[M+H] =517.4)。 [0138] （5）在室温氮气条件下将化合物 3‑4 (1.2 g, 2.32 mmol) 溶解于二氯甲烷 (12.0 mL) 中，分别向反应体系中加入4,5‑二氰基咪唑 (357.0 mg,3.02 mmol, 1.3 equiv) 和双(二异丙基氨基)(2‑氰基乙氧基)膦 (1.05 g,3.48 mmol, 1.5 equiv)。随后将反应液在室温条件下搅拌2 小时。反应完毕将反应液溶解于甲基叔丁基醚 (10.0 mL) 和1%氢氧化钠溶液(10.0 mL)，室温条件下继续搅拌 0.5 小时。剩余体系用乙酸乙酯萃取反应液3 次，将有机相合并旋干，得到的粗产品用C18 反相柱制备得到白色固体化合物1 SA000016 (1.2 g，反应收率71%)。化合物SA000016 的H NMR 数据： (400 MHz, CD3CN) δ 9.39 (s,1H), 7.39‑7.24 (m, 10H), 6.85‑6.81 (m, 4H), 5.43‑5.39 (m, 1H), 4.21‑ 4.18(m, 1H), 3.86‑3.77 (m, 1H), 3.75 (s, 6H), 3.56‑3.53 (m, 5H), 3.28‑3.05 31 (m,2H), 2.62‑2.61 (m, 2H), 2.22‑2.19 (m, 2H), 1.22‑1.07 (m, 15H). P NMR数据： (400 MHz, CD3CN) δ 147.6, 146.5。化合物SA000016 的质谱鉴定 (C39H49N4O7P，分子量 716.1，[M+H]= 717.5)。 [0139] 3.2. Tgo单体的合成 [0140] [0141] 根据实施例Ugo的合成方法，制备得到白色固体Tgo (4.8 g, 6.6 mmol, 74%收1 率)。化合物Tgo分子式：C40H51O7N4P，分子量：730.3，LC‑MS找到753.4 (M+Na)。H NMR (400 MHz, DMSO‑d6)：δ 11.75 (d,J= 215.2 Hz, 1H), 7.90 (d,J= 4.6 Hz, 1H), 7.23 – 7.22 (m, 4H), 7.20 – 7.14 (m, 1H), 7.09 (td,J= 7.1, 3.5 Hz, 4H), 7.23 – 7.22 (m, 4H), 4.23 (dd,J= 13.9, 5.2 Hz, 1H), 4.14 – 3.99 (m, 2H), 3.71 (s, 6H), 3.59 – 3.53 (m, 1H), 3.51 – 3.43 (m, 2H), 3.13 (td,J= 9.4, 5.5 Hz, 1H), 3.05 – 2.93 (m, 1H), 2.82 (dt,J= 13.5, 6.8 Hz, 1H), 2.73 (t,J= 5.9 Hz, 1H), 2.65 31 (t,J= 5.8 Hz, 1H), 1.26 – 0.98 (m, 19H)。P NMR (162 MHz, DMSO‑d6)：δ 147.0, 146.6。 实施例4 siRNA缀合物的制备 [0142] 通过固相亚磷酰胺法，分别利用实施例2制备的化合物SA51或者化合物SA102为起始循环，按照核苷酸排布顺序自3’‑5’方向逐一连接核苷单体。每连接一个核苷单体都包括脱保护、偶联、盖帽、氧化或硫化四步反应。正义链和反义链采用相同的合成条件。 [0143] 仪器设备型号：Biolytic Dr. Oligo 48固相合成仪，逗点生物Embed CPG Frits通用合成柱DS0200，逗点生物96孔板脱盐柱DC189650（80mg）。表1为合成siRNA缀合物使用的试剂。 [0144] [0145] 合成条件如下： [0146] 核苷单体以0.05M浓度的乙腈溶液提供，每一步的脱保护反应的条件相同，即温度为25℃，反应时间为3分钟，脱保护试剂为DCA，进样体积180 μL。 [0147] 每一步偶联反应条件均相同，包括温度为25℃，反应时间为3分钟。核苷单体进样体积90 μL，催化剂ACT进样体积110 μL。 [0148] 每一步盖帽条件均相同，包括温度为25℃，反应时间为2分钟。盖帽试剂溶液的摩尔比为1：1的CapA和CapB的混合溶液。盖帽试剂进样体积180 μL。 [0149] 每一步氧化反应条件均相同，包括温度为25℃，反应时间为3分钟，氧化试剂OXD进样体积为180 μL。 [0150] 每一步硫化反应条件均相同，包括温度为25℃，反应时间为4分钟，硫化试剂为0.05 M PADS的吡啶乙腈溶液。硫化试剂进样体积180 μL。 [0151] 待最后一个核苷单体连接完成后，依次对固相载体上连接的核酸序列进行切割、脱保护、纯化、脱盐，随后冻干获得正义链和反义链，其中： [0152] 切割和脱保护条件如下：将合成的连接有载体的核苷酸序列加入氨水：乙醇=3：1的混合溶液至体积为0.8 mL。在50℃反应15h，过滤除去剩余载体，将上清液真空浓缩至干。 [0153] 纯化和脱盐条件如下：利用C18反相色谱柱进行脱盐。具体条件包括： [0154] (1) 样品的准备 [0155] 向寡核苷酸样品中加入0.1M的TEAA（三乙胺醋酸盐）至体积为0.8 mL。 [0156] (2) 96孔板的活化 [0157] 活化：0.8 mL乙腈通过96孔板的每个孔中进行活化； [0158] 平衡：用0.8 mL TEAA（pH 7.0）溶液进行96孔板的平衡。 [0159] (3) 纯化过程依次按照如下操作： [0160] 将0.8 mL包含寡核苷酸的溶液通过脱盐柱； [0161] 用0.8 mL 6.5%氨水洗涤96孔板2次，去除失败的序列； [0162] 用0.8 mL去离子水冲洗96孔板2次，去除盐分； [0163] 用0.8 mL 3%三氟乙酸冲洗96孔板3次，去除DMT，观察到吸附层变橙红色； [0164] 用0.8 mL 0.1 M TEAA冲洗96孔板； [0165] 用0.8 mL去离子水冲洗96孔板2次，去除三氟乙酸和残余的盐分； [0166] 用0.6 mL 20%乙腈进行洗脱，并收集冻干。 [0167] 检测方法如下：使用WATERS ACQUITY UPLC‑LTQ LCMS（COLUMN：ACQUITY UPLC BEH C18）检测上述正义链和反义链纯度并分析分子量。实测值与理论值相符，表明所合成的是3’端和/或5’端缀合了基团的正义链以及反义链。 [0168] 退火操作如下：将合成获得的正义链和反义链分别溶于注射用水中，配制0.1mg/mL‑40mg/mL的溶液，用浓度仪标定等摩尔比混合，90℃加热5分钟，再缓慢自然降温，使它们通过氢键形成双链结构，取样送检测产品的SEC纯度。将双链样品冻干。 [0169] 实施例5 siRNA缀合物在Hep3B细胞中的活性，IC50体外测试 [0170] 在本实例中，对前期优选的siRNA进行修饰合成，合成方法参见上述实施例，序列见下表2，在HEP3B细胞中开展IC50体外筛选。 [0171] [0172] 其中，大写字母A、C、G、U分别表示腺苷‑3'‑磷酸、胞苷‑3'‑磷酸、鸟苷‑3'‑磷酸、尿苷‑3'‑磷酸；小写字母m表示该字母m左侧相邻的一个核苷酸为2’‑甲氧基修饰的核苷酸；小写字母f表示左侧相邻的一个核苷酸为2’‑氟代修饰的核苷酸；小写字母s在大写字母中间表示s左右相邻的两个核苷酸之间为硫代磷酸酯基连接；s在3’端第一个时表示与该字母s左侧相邻的一个核苷酸末端为硫代磷酸酯基；VP修饰的核苷酸是指核苷酸的磷酸基团被乙烯基磷酸酯基取代形成的核苷酸。 [0173] SA102SA102SA102表示3个化合物SA102连续缀合在正义链的3’端，其缀合物结构为 [0174] ，SA51SA51SA51表示3个化合物SA51连续缀合在正义链的3’端，其缀合物结构为 。 [0175] 在体外测试靶向AGT的siRNA对AGT mRNA表达水平的影响。Hep3B细胞培养于含10%胎牛血清的DMEM高糖培养基中，在37℃，5% CO2条件下培养。转染时，将Hep3B细胞接种于96孔板，接种密度为每孔2万个细胞，每孔100μL培养基。 [0176] 参照产品说明手册，使用LIPOFECTAMINE RNAIMAX（THERMOFISHER，13778150）转染siRNA，siRNA以2.5倍稀释8nM至0.000839进行转染。siRNA序列见表2。在转染24小时后，利用组织细胞提取试剂盒（志昂生物，MNTR/FX96）从细胞中分离RNA，采用逆转录试剂盒（Takara PrimeScript™ II 1st Strand cDNA Synthesis Kit，6210A）进行反转录，并以qPCR反应试剂盒（ThermoFisher TaqMan Fast Advanced Master Mix，4444964）进行定量实时PCR检测，测定各个浓度下AGT的mRNA水平，并计算IC50值，检测结果见表3， 这些缀合物都有很好的体外活性。 [0177] 目的基因AGT引物和探针： [0178] 正向引物：GTATGTACACCCGGTCACC（SEQ ID NO：5）； [0179] 反向引物：GTTGTTCTGGGTACTACAGCA（SEQ ID NO：6）； [0180] 探针：CATCCTCTGCCTCCTGGCCTG（SEQ ID NO：7）； [0181] 内参基因β‑actin引物和探针： [0182] 正向引物：TGCACCACCAACTGCTTAGC（SEQ ID NO：8）； [0183] 反向引物：ACTGTGGTCATGAGTCCTTCCA（SEQ ID NO：9）； [0184] 探针：TCATCCATGACAACTTTGGTA（SEQ ID NO：10）。 [0185] [0186] 实施例6 不同序列及不同化学修饰的siRNA在HDI小鼠体内活性 [0187] 在缀合物给药前至少14天，对六至八周龄雌性Bab/C小鼠通过高压尾静脉注射构建人源化表达AGT的小鼠，如先前所描述，在5‑7秒内通过尾静脉将2ug含有AGT mRNA序列的质粒注射至小鼠中，以产生AGT‑SEAP模型小鼠(Zhang G等人,“High levels of foreign gene expression inhepatocytes after tail vein injection of naked plasmid DNA.” Human GeneTherapy 1999 Vol. 10, p1735‑1737.)。AGT siRNA缀合物对AGT表达的抑制导致SEAP表达的抑制。在给药前1天，通过眼眶采血，收集血清，根据产品说明书，用Phospha‑Light™ SEAP报告基因检测系统(Invitrogen)来测量血清中的SEAP表达水平，且根据平均SEAP水平对小鼠进行分组。其中实验组小鼠给予缀合物，溶媒组小鼠给予磷酸盐缓冲盐水（PBS），按照每只小鼠给予1mg/kg缀合物的剂量进行皮下给药。在给药后6，14，21，28天分别再次采血，收集血清，并根据产品说明书，用Phospha‑Light™ SEAP报告基因检测系统(Invitrogen)来测量血清中的SEAP表达水平。将各动物给药后的SEAP水平除以该动物给药前的SEAP水平，以确定“针对处理前归一化”的表达比率。 [0188] 结果以各组给药前后血清SEAP的剩余表达水平表示（溶媒组为100%），用于注射的缀合物序列同表2，相对剩余表达水平结果见表4，结果显示SD004457的活性要优于SD004230和SD004232。 [0189] [0190] 实施例7 包含不同化学修饰的siRNA在HDI小鼠体内活性 [0191] 在缀合物给药前至少14天，对六至八周龄雌性Bab/C 小鼠通过高压尾静脉注射构建人源化表达AGT的小鼠，如先前所描述，在5‑7秒内通过尾静脉将2ug含有AGT mRNA序列的质粒注射至小鼠中，以产生AGT‑SEAP模型小鼠(Zhang G等人, “High levels of foreign gene expression inhepatocytes after tail vein injection of naked plasmid DNA.” Human GeneTherapy 1999 Vol. 10, p1735‑1737.)。AGT siRNA缀合物对AGT表达的抑制导致SEAP表达的抑制。在给药前1天，通过眼眶采血，收集血清，根据产品说明书，用Phospha‑Light™ SEAP报告基因检测系统(Invitrogen)来测量血清中的SEAP表达水平，且根据平均SEAP水平对小鼠进行分组。其中实验组小鼠给予缀合物，溶媒组小鼠给予磷酸盐缓冲盐水（PBS），按照每只小鼠给予1mg/kg缀合物的剂量进行皮下给药。在给药后7天再次采血，收集血清，并根据产品说明书，用Phospha‑Light ™ SEAP报告基因检测系统(Invitrogen)来测量血清中的SEAP表达水平。将各动物给药后的SEAP水平除以该动物给药前的SEAP水平，以确定“针对处理前归一化”的表达比率。 [0192] 结果以各组给药前后血清SEAP的剩余表达水平表示（溶媒组为100%），用于注射的缀合物序列同表2，相对剩余表达水平结果如图1所示，SD004457在这些修饰序列中活性最好。 [0193] 实施例8食蟹猴体内药效测试 [0194] 在本实施例中，选取siRNA进行缀合合成，在食蟹猴中进一步评估AGT siRNA缀合物的体内活性。选取体重均一、状态无异常的动物进行随机分组，每组3只，分别给予表2中缀合物SD004457、SD004230和SD004232，按照每只猴子给予6mg/kg的剂量进行皮下给药。在给药前‑7天，0天及给药后7天，14天，21天，28天和42天分别进行采血收集血清。血清中AGT蛋白水平通过Elisa的方法检测，与给药前‑7和0天的血清中AGT的平均水平相比剩余百分比的结果如图2所示，SD004457在食蟹猴体内的活性要明显优于SD004230和SD004232。 [0195] 以上对本发明做了详尽的描述，其目的在于让熟悉此领域技术的人士能够了解本发明的内容并加以实施，并不能以此限制本发明的保护范围，凡根据本发明的精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围内。 |
||||||
QQ群二维码
意见反馈
意见反馈