荷叶碱治疗改善认知障碍、脑萎缩、神经细损伤的新用途 |
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| 申请号 | CN202311744680.3 | 申请日 | 2023-12-18 | 公开(公告)号 | CN117919243A | 公开(公告)日 | 2024-04-26 |
| 申请人 | 中国农业大学; | 发明人 | 杨海霞; 杨晓洁; 张俊桃; 周凯旋; 邓建军; | ||||
| 摘要 | 本 发明 公开了荷叶 碱 在制备药物、食品或保健品、制备 试剂 盒 以及细胞培养中的用途。具体公开了荷叶碱在制备 预防 和/或 治疗 认知障碍 、脑萎缩、神经细胞损伤和降低受试者神经细胞乙酰胆碱酯酶活 力 药物中的用途，在制备延缓和/或改善认知障碍、脑萎缩、抵抗和/或恢复神经细胞损伤、调节服用者神经细胞乙酰胆碱酯酶活力 水 平的食品或保健品中的用途，以及在制备试剂盒中的用途以及体外降低神经细胞损伤的方法和体外降低神经细胞乙酰胆碱酯酶活力的方法。如前所述， 发明人 发现荷叶碱能够改善神经细胞损伤或恢复受损神经细胞，能够降低脑内乙酰胆碱酯酶活力提高脑组织乙酰胆碱含量，抵抗脑萎缩。 | ||||||
| 权利要求 | 1.荷叶碱在制备药物、食品或保健品中的用途，所述药物用于预防和/或治疗认知障碍，所述食品或保健品用于延缓和/或改善认知障碍。 |
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| 说明书全文 | 荷叶碱治疗改善认知障碍、脑萎缩、神经细损伤的新用途技术领域[0001] 本发明涉及化合物的新用途，特别涉及荷叶碱在制备药物、试剂盒以及细胞培养中的用途，尤其是在制备预防和治疗认知障碍、脑萎缩、神经细胞损伤和降低受试者神经细胞乙酰胆碱酯酶活力药物中的用途，在制备延缓和/或改善认知障碍、脑萎缩、抵抗和/或恢复神经细胞损伤、调节服用者神经细胞乙酰胆碱酯酶活力水平的食品或保健品中的用途，以及制备试剂盒中的用途以及体外降低神经细胞损伤的方法和体外降低神经细胞乙酰胆碱酯酶活力的方法。 背景技术[0002] 荷叶有清心解暑、活血化瘀、凉血止血等功效，近年的药理研究证明其有调血脂、减肥、抑制脂肪肝、抗动脉粥样硬化、保护心血管、降糖、抗氧化、抗衰老、抑菌、抗病毒、保肝、抗纤维化以及对神经兴奋有选择性抑制作用。荷叶碱是从荷叶中提取的阿朴菲类生物碱，在成熟荷叶中含量高，具有改善肥胖、改善高血压、高血脂等疗效，但是改善认知障碍的功效未见报道。 [0003] 认知障碍泛指由各种原因导致不同程度的认知功能损害，也被称为脑退化症或痴呆综合征，通常因学习记忆以及思维判断有关的大脑高级智能加工过程出现异常，从而引起严重学习、记忆障碍，同时伴有失语、失用、失认、失行以及视空间、语言、执行、计算和理解判断等能力受损。 [0004] 由此，目前针对荷叶碱的新用途仍有待研究。 发明内容[0005] 本发明旨在至少在一定程度上解决现有技术中存在的技术问题至少之一。为此，本发明提供了荷叶碱在制备预防和/或治疗认知障碍、脑萎缩、神经细胞损伤和降低受试者神经细胞乙酰胆碱酯酶活力的药物中的用途，荷叶碱在制备延缓和/或改善认知障碍、脑萎缩、抵抗和/或恢复神经细胞损伤、调节服用者神经细胞乙酰胆碱酯酶活力水平的食品或保健品中的用途。 [0006] 为此，在本发明的一个方面，本发明提出了荷叶碱在制备药物、食品或保健品中的用途，所述药物用于预防和/或治疗认知障碍疾病，所述食品或保健品用于延缓和/或改善认知障碍。 [0008] 根据本发明的实施例，所述认知障碍包括：空间记忆障碍、学习记忆障碍和新物体识别障碍的至少之一。 [0009] 根据本发明的实施例，所述认知障碍由脑萎缩、神经细损伤或神经细胞乙酰胆碱酯酶活力异常引起。根据本发明实施例，荷叶碱能够改善和缓解脑组织萎缩症状，由此，可用于预防或治疗由脑萎缩引起的认知障碍；荷叶碱能够改善神经细胞损伤或恢复受损神经细胞，由此，可用于预防或治疗由神经细胞损伤引起的认知障碍；荷叶碱还能够降低脑内乙酰胆碱酯酶活力，提高脑组织Ach含量，由此，可用于预防或治疗由乙酰胆碱酯酶活力异常升高引起的认知障碍。 [0010] 示例性地，所述认知障碍可以是阿尔茨海默病(AD)，血管性痴呆(VD)，路易体痴呆(DLB)，帕金森痴呆(PDD)，额颞叶痴呆(FTLD)，快速进展性痴呆(RPD)。 [0011] 在本发明的第二方面，本发明提出了荷叶碱在制备药物、食品或保健品中的用途，所述药物用于预防和/或改善脑萎缩，所述食品或保健品用于延缓和/或改善脑萎缩。根据本发明的实施例，荷叶碱能够改善和缓解脑组织萎缩症状，由此，可用于预防和治疗或延缓和改善脑萎缩。 [0012] 示例性地，所述脑萎缩可以是脑部创伤、神经系统疾病、感染等引起的。 [0013] 在本发明的第三方面，本发明提出了荷叶碱在制备药物、食品或保健品中的用途，所述药物用于预防和/或治疗神经细胞损伤，所述食品或保健品用于抵抗和/或恢复神经细胞损伤。根据本发明的实施例，荷叶碱能够改善神经细胞损伤或恢复受损神经细胞，由此，可用于预防和治疗神经细胞损伤或抵抗和恢复神经细胞损伤。 [0014] 在本发明的第四方面，本发明提出了荷叶碱在制备药物、食品或保健品中的用途，所述药物用于降低受试者神经细胞乙酰胆碱酯酶活力，所述食品或保健品用于调节服用者神经细胞乙酰胆碱酯酶活力水平。根据本发明的实施例，荷叶碱能够降低脑内乙酰胆碱酯酶活力，提高脑组织乙酰胆碱含量，由此，可用于降低或调节神经细胞乙酰胆碱酯酶活力异常受试者的乙酰胆碱酯酶活力。 [0015] 根据发明的实施例，所述乙酰胆碱酯酶活力异常为相对于健康个体神经元细胞的乙酰胆碱酯酶活力水平，受试者个体的乙酰胆碱酯酶活力异常升高。 [0016] 示例性地，所述受试者为人、小鼠、大鼠、兔、猴、狗或猪。 [0017] 在本发明的第五方面，本发明提出了荷叶碱在制备试剂盒中的用途，所述试剂盒用于体外预防和/或缓解神经细胞损伤。由此，可在体外维持神经细胞功能正常，便于药物筛选或构建神经细胞模型等应用。 [0018] 根据本发明的实施例，所述神经细胞损伤是由神经细胞氧化应激引起的。 [0019] 根据本发明的实施例，所述氧化应激由D‑半乳糖或双氧水诱导产生。 [0020] 在本发明的第六方面，本发明提出了一种体外降低神经细胞损伤的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：将所述神经细胞与荷叶碱接触。由此，可在体外维持神经细胞功能正常，获得神经细胞及其培养物，便于药物筛选或构建神经细胞模型等应用。 [0021] 根据本发明的实施例，所述荷叶碱的浓度为5～100mg/mL；优选10mg/mL。发明人经过试验摸索，确定该较佳浓度。 [0022] 根据本发明的实施例，所述神经细胞损伤是由神经细胞氧化应激引起的。 [0023] 根据本发明的实施例，所述氧化应激由D‑半乳糖或双氧水诱导产生。 [0024] 在本发明的第七方面，本发明提出了一种体外降低神经细胞乙酰胆碱酯酶活力的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：将所述神经细胞与荷叶碱接触。由此，可在体外维持神经细胞的乙酰胆碱酯酶活力处于低水平，便于药物筛选或构建神经细胞模型等应用。 [0025] 根据本发明的实施例，所述荷叶碱的浓度为5～100mg/mL；优选5～10mg/mL。发明人经过试验摸索，确定该较佳浓度。 [0026] 在本发明的第八方面，本发明提出了一种体外促进神经细胞再生或体外促进神经细胞表达神经营养因子的方法。所述方法包括：将所述神经细胞与荷叶碱接触。由此，可在体外促进神经细胞再生或维持神经细胞活性及功能。 [0027] 根据本发明的实施例，所述荷叶碱的浓度为5～100mg/mL；优选5～10mg/mL。发明人经过试验摸索，确定该较佳浓度。 [0029] 本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中： [0030] 图1为本发明实施例1的Y迷宫示意图，其中，S表示起始臂，N表示新异臂，O表示其他臂； [0031] 图2为本发明实施例2的Y迷宫‑新异臂测试结果图，其中，control表示空白组，model表示模型组，5mg/kg NF表示荷叶碱低剂量组，10mg/kg NF表示荷叶碱高剂量组，*表示P＜0.05，具有显著性，ns表示无显著性，A为试验小鼠进入新异臂后的停留时间统计结果，B为试验小鼠进入新异臂的次数统计结果； [0032] 图3为本发明实施例3的Y迷宫‑自主交替测试结果图，其中，control表示空白组，model表示模型组，5mg/kg NF表示荷叶碱低剂量组，10mg/kg NF表示荷叶碱高剂量组，*表示P＜0.05，具有显著性，**表示P＜0.01，具有显著性； [0033] 图4为本发明实施例4的旷场测试结果图，其中，control表示空白组，model表示模型组，5mg/kg NF表示荷叶碱低剂量组，10mg/kg NF表示荷叶碱高剂量组，*表示P＜0.05，具有显著性，ns表示无显著性； [0034] 图5为本发明实施例5的试验小鼠脑组织系数考察结果图，其中，control表示空白组，model表示模型组，5mg/kg NF表示荷叶碱低剂量组，10mg/kg NF表示荷叶碱高剂量组，*表示P＜0.05，具有显著性，ns表示无显著性； [0035] 图6为本发明实施例5的试验小鼠脑切片尼氏体染色结果图，其中，Ctrl表示空白组，D‑gal表示模型组，D‑gal+NF5表示5mg/kg荷叶碱低剂量组，D‑gal+NF10表示10mg/kg荷叶碱高剂量组，比例尺为500μm； [0036] 图7为本发明实施例5的试验小鼠脑切片尼氏体染色阳性细胞统计结果图，其中，control表示空白组，model表示模型组，5mg/kg NF表示荷叶碱低剂量组，10mg/kg NF表示荷叶碱高剂量组，*表示P＜0.05，具有显著性，ns表示无显著性； [0037] 图8为本发明实施例5的试验小鼠脑组织乙酰胆碱酯酶活力测定结果图，其中，control表示空白组，model表示模型组，5mg/kg NF表示荷叶碱低剂量组，10mg/kg NF表示荷叶碱高剂量组，***表示P＜0.001，具有显著性，****表示P＜0.0001，具有显著性； [0038] 图9为本发明实施例5的试验小鼠海马体HE染色结果图，其中，Ctrl表示空白组，D‑gal表示模型组，D‑gal+NF5表示5mg/kg荷叶碱低剂量组，D‑gal+NF10表示10mg/kg荷叶碱高剂量组，比例尺为500μm； [0039] 图10为本发明实施例5的试验小鼠海马体CA1区细胞凋亡细胞统计结果图，其中，control表示空白组，model表示模型组，5mg/kg NF表示荷叶碱低剂量组，10mg/kg NF表示荷叶碱高剂量组，*表示P＜0.05，具有显著性，**表示P＜0.01，具有显著性，***表示P＜0.001，具有显著性； [0040] 图11为本发明实施例5的试验小鼠脑组织BDNF表达水平考察结果图，其中，ontrol表示空白组，model表示模型组，5mg/kg NF表示荷叶碱低剂量组，10mg/kg NF表示荷叶碱高剂量组，**表示P＜0.01； [0041] 图12为本发明实施例5的试验小鼠脑组织DCX表达水平考察结果图，其中，ontrol表示空白组，model表示模型组，5mg/kg NF表示荷叶碱低剂量组，10mg/kg NF表示荷叶碱高剂量组，**表示P＜0.01，具有显著性，ns表示无显著性。 具体实施方式[0042] 下面详细描述本发明的实施例。下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。 [0043] 需要说明的是，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。进一步地，在本发明的描述中，除非另有说明，“多个”的含义是两个或两个以上。 [0044] 在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。 [0045] 实施例中的质量检测指标数据均为平均值。 [0046] 在本文中，术语“乙酰胆碱酯酶”等同于“AChE”。 [0047] 在本文中，术语“乙酰胆碱酯”等同于“Ach”。 [0048] 在本文中，术语“CMC”等同于“羧甲基纤维素”。 [0049] 下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。 [0050] 实施例1：空间记忆、学习记忆以及新物体识别障碍小鼠模型构建 [0051] 发明人通过Y迷宫试验、旷场测试，考察了荷叶碱对小鼠空间记忆能力、学习记忆能力以及新物体识别能力的影响。具体试验分组和小鼠模型构建(给药方案)方法如下： [0052] 试验分组：将C57BL/6小鼠按照随机原则分成空白(control)组、模型(model)组、荷叶碱低剂量(5mg/kgNF)组和荷叶碱高剂量(10mg/kgNF)组，每组6只。 [0053] 小鼠模型构建(给药方案)： [0054] 试验开始，荷叶碱低剂组和荷叶碱高剂量组小鼠每天按5mg/kg和10mg/kg的量，荷叶碱(荷叶碱溶剂为0.5％ CMC)灌胃给药，control组和model组小鼠每天按0.1mL/10g的量，0.5％ CMC(羧甲基纤维素溶液)灌胃给药；持续灌胃给药两周。 [0055] 持续灌胃给药两周后，control组小鼠每天皮下注射150mg/kg的生理盐水溶液，model组和NF组每天皮下注射150mg/kg D‑半乳糖溶液；持续灌胃给药、皮下注射生理盐水或D‑半乳糖溶液15周，从第14周开始，control组、model组、5mg/kg NF组、10mg/kg NF组小鼠灌胃及皮下注射给药3h后，进行行为学测试。 [0056] 实施例2：荷叶碱对小鼠空间记忆能力的影响 [0057] 在该实施例中，通过Y迷宫‑新异臂测试，按如下方法考察了荷叶碱对小鼠空间记忆能力的影响。 [0058] 将每个Y迷宫的3个臂随机设为：新异臂(novel arm)、起始臂(start arm)和其他臂(other arm)。新异臂：在实验的第1个阶段即训练期时用隔板挡住，在第2个阶段即测试期时打开。起始臂：小鼠进入迷宫时所在的臂。整个实验过程中起始臂和其他臂始终打开，试验小鼠可以自由出入。 [0059] 先随机封闭一个臂，让小鼠在剩余的两个臂中自由探索10min，4h后打开挡板，每只小鼠自由探索5min，记录老鼠进入各臂的次数和时间，尤其是进入新臂的次数和时间。每只小鼠测试结束后放回笼子，进行下一只小鼠测试前，用75％酒精对Y迷宫各臂进行消毒，消除气味影响。 [0060] 分别记录试验小鼠进入新异臂、起始臂和其他臂后的停留时间，以及进入新异臂、起始臂和其他臂次数。 [0061] 试验小鼠进入新异臂后的停留时间通过试验小鼠在新异臂的停留时间与在新异臂、起始臂和其他臂的总停留时间的百分比体现。 [0062] 试验小鼠进入新异臂的次数通过试验小鼠进入新异臂的次数与进入新异臂、起始臂和其他臂的总次数的百分比体现。 [0063] 统计结果如图2所示。 [0064] 结果显示：1)啮齿类动物有探索新事物的本能，当出现空间记忆障碍后，试验小鼠在新异臂中探索的时间和次数将减少。与空白组相比，模型组小鼠在新异臂中停留时间、进入次数显著减少，表明模型组小鼠空间记忆力降低，出现空间记忆障碍。2)与模型组相比，荷叶碱低剂量和高剂量组小鼠在新异臂中停留时间增多，进入新异臂的次数显著增多，表明荷叶碱能够提高小鼠的空间记忆能力，改善模型小鼠空间记忆障碍。 [0065] 实施例3：荷叶碱对小鼠学习记忆能力的影响 [0066] 在该实施例中，通过Y迷宫‑自主交替测试，按如下方法考察了荷叶碱对小鼠学习记忆能力的影响。 [0067] 将每只小鼠从Y迷宫的起始臂放入，连续自主交替8min，记录小鼠依次连续进入Y迷宫全部三个臂的次数，统计自主交替率。每只小鼠测试结束后放回笼子，进行下一只小鼠测试前，用75％酒精对Y迷宫各臂进行消毒，消除气味影响。 [0068] 自主交替率(％)＝(总轮流次数÷最大轮流次数)×100％ [0069] 其中，总轮流次数为试验动物依次连续进入Y迷宫全部三个臂的次数，假设Y迷宫有A、B和C三个臂，那么试验动物依次连续进入Y迷宫全部三个臂的可能情形为：ABC、ACB、BAC、BCA、CAB、CBA；最大轮流次数为试验动物总进臂次数－2，其中，总进臂次数为试验动物进入Y迷宫臂的次数(以小鼠身体入臂60％为进臂一次统计标准)。 [0070] 统计结果如图3所示。 [0071] 结果显示：1)小鼠自主交替率反应其学习记忆能力，当出现学习记忆障碍后，试验小鼠的自主交替率将降低。与空白组相比，模型组小鼠自主交替率显著降低，表明模型组小鼠学习记忆能力降低，出现学习记忆障碍。2)与模型组相比，荷叶碱低剂量和高剂量组小鼠自主交替率显著提高，表明荷叶碱能够提高小鼠的学习记忆能力，改善模型小鼠学习记忆障碍。 [0072] 实施例4：荷叶碱对小鼠新物体识别能力的影响 [0073] 在该实施例中，通过旷场测试，按如下方法考察了荷叶碱对小鼠新物体识别能力的影响。 [0074] 习惯化：把小鼠放在旷场中间，允许小鼠自由探索5分钟。5分钟后，取出小鼠并放入新的笼中，以免其影响其余待测试小鼠的行为。用75％酒精对旷场进行消毒，消除气味影响。 [0075] 训练期：习惯化24小时后，将两个相同的物体(确保物体没有气味，不被推动)放置在测试箱对角线的位置，物体距离两侧壁10cm。将小鼠置于测试箱中心，与两个相同的物体保持等距离。允许自由探索至少10分钟，以嘴或者鼻子接触到物体和凑近物体约2‑3cm范围记为对物体的探索。进行下一只小鼠测试前，用75％酒精对设备和物体进行消毒，消除气味影响。 [0076] 测试期：训练期1h后，将训练期期间使用过的一个物体(熟悉物体)和一个新物体放在测试箱对角线的位置。对每个小鼠都使用它们在训练期间相同的物体位置。将小鼠放在测试箱中心，与两个物体保持等距离。允许自由探索10分钟，以嘴或者鼻子接触到物体和凑近物体约2‑3cm范围记为对物体的探索。试验结束后，将小鼠移出并放入新的笼中，进行下一只小鼠测试前，用75％酒精对设备和物体进行消毒，消除气味影响。 [0077] 按如下公式统计新物体识别系数： [0078] 新物体识别系数＝(TN‑TF)/(TN+TF) [0079] 其中，TN为小鼠探索新物体的时间；TF小鼠探索熟悉物体的时间。 [0080] 熟悉阶段，各组小鼠探索左右两个熟悉物体的时间(TF)不应该有统计差异。 [0081] 结果如图4所示。 [0082] 结果显示：1)与空白组相比，模型组小鼠识别系数显著降低，表明模型组小鼠学习记忆能力降低。2)与模型组相比，荷叶碱高剂量组小鼠识别系数显著升高。该结果表明荷叶碱能够提升小鼠学习记忆功能力。 [0083] 实施例5：荷叶碱对小鼠脑组织的影响 [0084] 在该实施例中，通过对试验小鼠脑组织系数、小鼠海马体病理染色、脑组织乙酰胆碱酯酶活力的测定以及脑源性神经营养因子BDNF(诱导大脑神经元存活发育和发挥功能)和新生神经元的标志物DCX(在大脑皮层发育过程中，可以调节微管的组织和稳定性并使其成束)表达水平考察，考察了荷叶碱对小鼠脑组织的影响。具体方法如下： [0085] 1、小鼠脑组织系数测定 [0086] 处死试验小鼠后取脑，去除小脑组织并称重，脑组织系数＝脑组织重量(mg)/小鼠体重(g)。 [0087] 结果如图5所示。 [0088] 结果显示：1)与空白组相比，模型组小鼠脑组织系数显著降低，表明模型组小鼠脑组织出现萎缩；2)与模型组相比，荷叶碱低剂量和高剂量组小鼠脑组织系数升高。该结果表明荷叶碱能够改善和缓解小鼠脑组织萎缩症状，其中，5mg/kg荷叶碱低剂量组效果更优。 [0089] 2、小鼠海马体病理染色 [0090] 小鼠脑切片尼氏体染色：处死试验小鼠后取脑，将新鲜的脑组织置4％多聚甲醛中固定，15％蔗糖溶液4℃脱水处理24h，次日更换30％蔗糖溶液后，继续4℃脱水处理24h，然后将脑冠状切片，切片厚度为15μm。将小鼠脑切片置于载玻片上，通过尼氏体染色试剂盒对脑切片染色，然后通过共聚焦显微镜拍摄海马区照片，统计Nissl染色阳性细胞数。结果如图6、图7所示。 [0091] 小鼠海马体HE染色：取小鼠脑组织海马体部位，进行包埋切片，HE染色，统计海马体CA1区细胞凋亡数。结果如图9、图10所示。 [0092] 结果显示：1)海马体中尼氏体大而多，表明神经细胞具有很强的蛋白质合成功能，当神经细胞受损时，尼氏体数量减少，甚至消失，细胞排列及形态出现紊乱。与空白组相比，模型组小鼠海马体CA1区(CA1区为海马体中最为复杂的区域之一，对于情绪、空间记忆和情境记忆都非常重要)细胞数目减少、排列疏松，细胞间产生间隙，胞体肿胀不规则，部分细胞出现核移位现象，尼氏体数量减少；与空白组相比，模型组小鼠海马体尼氏体染色阳性细胞占比明显降低。该结果表明模型小鼠神经细胞受损。2)与模型组相比，荷叶碱低剂量和高剂量组小鼠海马体CA1区细胞数目增多，排列紧密、细胞间间隙明显缩小，胞体肿胀不规则和核移位现象明显减轻，形态结构趋向正常，尼氏体数目显著增加且分布均匀，呈虎斑状；模型组相比，荷叶碱低剂量和高剂量组小鼠海马体尼氏体染色阳性细胞占比明显升高。该结果表明荷叶碱能够改善神经细胞损伤或恢复受损神经细胞，减少海马体细胞凋亡，提高小鼠海马体尼氏体数量，其中，10mg/kg荷叶碱高剂量组效果更优。 [0093] 3、小鼠脑组织乙酰胆碱酯酶活力测定 [0094] 处死试验小鼠后取脑，提取脑组织乙酰胆碱酯酶，采用乙酰胆碱酯酶测定试剂盒定量酶活。 [0095] 结果如图8所示。 [0096] 结果显示：1)乙酰胆碱(Ach)是脑内的经典神经递质，与认知、学习、记忆等大脑高级神经功能有关，脑组织Ach含量不足，将导致中枢神经系统功能障碍，出现学习记忆能力下降。AChE是Ach的水解酶，它的活力变化可间接反映脑内Ach含量和代谢情况，作为评价学习记忆功能的主要指标。与空白组相比，模型组小鼠脑内AChE活性显著提高空，表明模型组小鼠脑组织Ach含量不足。2)与模型组相比，荷叶碱低剂量和高剂量组小鼠脑内AChE活性显著降低，甚至低于空白组。该结果表明荷叶碱能够降低脑内AChE活性，提高脑组织Ach含量。 [0097] 4、小鼠脑组织脑源性神经营养因子BDNF和新生神经元的标志物DCX表达水平考察[0098] 处死试验小鼠后取脑，提取脑组织mRNA，并将其逆转录为cDNA，采用实时定量基因扩增荧光检测系统(qPCR)进行靶特异性相关的靶基因的绝对拷贝数定量，基因表达变化采用ΔΔCt方法进行分析，根据内参基因甘油醛‑3‑磷酸脱氢酶(GAPDH)的绝对拷贝数对脑组织标准曲线进行归一化。 [0099] 其中引物序列为： [0100] BDNF： [0101] fw‑AGCTGAGCGTGTGTACAGT(SEQ ID NO：1)； [0102] rev‑TCCATAGTAAGGGCCCGAAC(SEQ ID NO：2)； [0103] DCX： [0104] fw‑TCTGTTTCCCAGGCAATGCT(SEQ ID NO：3)； [0105] rev‑AAAGGGCCTGCTCTAACCAGT(SEQ ID NO：4)； [0106] 结果如图11、12所示。 [0107] 结果显示：1)脑源性神经营养因子BDNF可诱导大脑神经元存活发育以及发挥功能，新生神经元标志物DCX在大脑皮层发育过程中，可以调节微管的组织和稳定性并使其成束。与空白组相比，模型组小鼠脑内BDNF表达水平显著降低，表明模型小鼠脑组织神经元活性降低，神经元发育及功能发挥受到影响。空白组和模型组新生神经元标志物无显著区别，表明两组新生神经元无区别。2)与模型组相比，荷叶碱低剂量和高剂量组小鼠脑内BDNF表达水平显著升高，新生神经元标志物DCX显著升高。该结果表明荷叶碱能够促进脑源性神经营养因子表达，促进神经元再生。 [0108] 在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。 |
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