一种火麻仁酶解提取物及其制备方法 |
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| 申请号 | CN202311520436.9 | 申请日 | 2022-10-17 | 公开(公告)号 | CN117899193A | 公开(公告)日 | 2024-04-19 |
| 申请人 | 清华大学深圳国际研究生院; | 发明人 | 邢新会; 陈海红; 王怡; | ||||
| 摘要 | 本 发明 涉及一种自火麻仁中获得的酶解提取物，及其在降糖、降脂、保肝、护肾、肠道菌群调节等医疗领域方面的用途。 | ||||||
| 权利要求 | 1.一种火麻仁酶解提取物在制备具有减缓体重增加、减脂、调节代谢功能的药物、特殊医学用途食品以及保健食品中的用途，其中， |
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| 说明书全文 | 一种火麻仁酶解提取物及其制备方法技术领域[0002] 本发明涉及生物领域，尤其涉及一种火麻仁酶解提取物及其在降糖、降脂、保肝、护肾等方面的用途。 背景技术[0003] 火麻仁是桑科植物大麻(Cannabis sativa L.)的干燥成熟种子，具有药食同源属性，在我国各地均有栽培，也有半野生者，广泛分布于我国东北、华北、华东、中南等地。火麻仁性平，味甘，具有润肠通便之功效，并且含有丰富的蛋白质、维生素、卵磷脂、挥发油、以及钙、镁等微量元素。火麻仁作为我国传统中药材和食材，虽然拥有多种生理作用，但对其研究并不深入，尚未充分开发其在医药、保健品、食品领域的潜在应用。 [0004] 多肽物质是蛋白质水解的中间产物和功能活性片段，其分子量低于10,000道尔顿，能透过半透膜。研究发现，蛋白质经消化道酶促水解后，主要以肽的形式被吸收，且由蛋白质水解而来的多肽，具有比原蛋白质更好的溶解性、完全吸收性和生物活性，不仅能满足机体必需氨基酸营养补充的需要，还能促进机体新陈代谢、生长发育及调节机体生理和免疫力的双重功能。 [0005] 近年来，天然来源的生物活性肽由于其作用温和、功能明确、安全性高、副作用小等优点，已成为药品或功能性食品开发上的研究热点。而以火麻仁为原料制备火麻活性肽，开发具有医药保健和营养用途的活性肽产品，具有广阔的应用前景。 发明内容[0006] 鉴于此，本申请的目的即在于提供一种来源于火麻仁的蛋白酶解提取物及用途。 [0007] 具体来说，本申请提供一种火麻仁酶解提取物，以在所述火麻仁酶解提取物中所占的质量百分比计，所述火麻仁酶解提取物包含25～90％的分子量小于或等于1000Da的多肽组分、15～50％的分子量为1000‑3000Da的多肽组分、1～50％的分子量大于3000Da的组分。 [0008] 进一步的，以在所述火麻仁酶解提取物中所占的质量百分比计，蛋白质为70～100％，优选为75～85％。 [0009] 进一步的，所述火麻仁酶解提取物通过包含下述步骤的方法制备得到： [0012] 加入蛋白酶对所述火麻仁蛋白质进行酶解， [0013] 对酶解产物经过滤、离心后得到所述火麻仁酶解提取物。 [0015] 进一步的，所述提取火麻仁蛋白质的方法选自超声辅助有机提取法、超声辅助碱提酸沉提取法、碱提酸沉提取法或盐提取法，优选为盐提取法。 [0016] 进一步的，所述蛋白酶选自胃蛋白酶、胰蛋白酶、α‑糜蛋白酶、木瓜蛋白酶、风味蛋白酶、蛋白酶K、中性蛋白酶、碱性蛋白酶、嗜热菌蛋白酶、胃/胰复合酶或糜/胰复合酶，优选为嗜热菌蛋白酶、风味蛋白酶或蛋白酶K，进一步优选为嗜热菌蛋白酶。 [0017] 进一步的，所述过滤的截留分子量为≤3000Da。 [0018] 本申请还提供一种制备火麻仁酶解提取物的方法，包括： [0019] 对火麻仁原料粉末以有机溶剂进行脱脂除油处理，得到脱脂火麻仁粉，[0020] 对所述脱脂火麻仁粉提取火麻仁蛋白质， [0021] 加入蛋白酶对所述火麻仁蛋白质进行酶解， [0022] 对酶解产物经过滤、离心后得到所述火麻仁酶解提取物； [0023] 其中，所述有机溶剂选自纯石油醚、正己烷、正丁醇、无水乙醇、5:2的石油醚/正丁醇、5:2的正己烷/正丁醇、5:2的石油醚/乙醇或5:2的正己烷/乙醇； [0024] 所述提取蛋白质的方法选自超声辅助有机提取法、超声辅助碱提酸沉提取法、碱提酸沉提取法或盐提取法； [0025] 所述蛋白酶选自胃蛋白酶、胰蛋白酶、α‑糜蛋白酶、木瓜蛋白酶、风味蛋白酶、蛋白酶K、中性蛋白酶、碱性蛋白酶、嗜热菌蛋白酶、胃/胰复合酶或糜/胰复合酶。 [0026] 进一步的，所述有机溶剂为无水乙醇，且所述火麻仁原料粉末与无水乙醇以1:10～1:20的比例混合后，经搅拌、离心、弃上清，得到所述脱脂火麻仁粉。 [0027] 进一步的，所述提取蛋白质的方法为盐提取法，包括将所述脱脂火麻仁粉以1:10～1:20的比例溶于0.8M的NaCl溶液，经搅拌、离心、取上清后，调节pH值≤5，得到火麻仁蛋白。 [0028] 进一步的，所述蛋白酶为嗜热菌蛋白酶、风味蛋白酶或蛋白酶K，优选为嗜热菌蛋白酶。 [0029] 进一步的，按照8000～10000U/g的浓度向火麻仁蛋白质中加入嗜热菌蛋白酶，在pH值6.0‑8.5下进行酶解，得到所述酶解产物。 [0030] 进一步的，所述过滤的截留分子量为≤3000Da。 [0031] 本申请还提供了所述火麻仁酶解提取物或使用本申请提供的方法制备得到的火麻仁酶解提取物在制备具有减脂、调节代谢功能的药物、特殊医学用途食品以及保健食品中的用途。 [0032] 本申请还提供了所述火麻仁酶解提取物或使用本申请提供的方法制备得到的火麻仁酶解提取物在制备用于预防、治疗或改善高血糖及高血糖引起的人体相关疾病的药物、特殊医学用途食品以及保健食品中的用途。 [0033] 本申请还提供了所述火麻仁酶解提取物或使用本申请提供的方法制备得到的火麻仁酶解提取物在制备具有保肝、降低谷丙和谷草转氨酶或改善肝损伤功能的药物、特殊医学用途食品以及保健食品中的用途。 [0034] 本申请还提供了所述火麻仁酶解提取物或使用本申请提供的方法制备得到的火麻仁酶解提取物在制备具有护肾、改善肾脏损伤功能的药物、特殊医学用途食品以及保健食品中的用途。 [0035] 本申请还提供了所述火麻仁酶解提取物或使用本申请提供的方法制备得到的火麻仁酶解提取物在制备具有改善肠道菌群紊乱功能的药物、特殊医学用途食品以及保健食品中的用途。 [0036] 发明效果 [0037] 1.本申请提供的火麻仁蛋白酶解提取物能够减缓体重上升趋势、降低血浆中TC、TG和FFA的浓度，增加PYY的浓度，具有一定的减缓体重增加、减脂效果。 [0038] 2.所述火麻仁酶解提取物能够增加血浆中GLP‑1的浓度，降低空腹血糖，增加口服葡萄糖耐量，增加血浆中ADPN的浓度及胰岛素敏感性，促进血糖代谢平衡。 [0039] 3.所述火麻仁酶解提取物能够降低血浆中ALT、AST、ALP和TP II的浓度，具有一定的肝脏保护功能。 [0040] 4.所述火麻仁酶解提取物能够降低血浆中肌酐(Creas)和尿素(Urea)的浓度，具有一定的肾脏保护作用。 [0041] 5.所述火麻仁酶解提取物能够有效的增加有益菌属包括Lactobacillus、Akkermansia、Bacteroides等的丰度，降低有害菌属Prevotella的丰度，增加Bacteroidetes/Firmicutes的比例，增加肠道菌群的α多样性，具有一定的改善肠道菌群紊乱的功能。 [0043] 图1所示是实施例6合成多肽细胞实验中DPP IV抑制活性示意图。 [0044] 图2所示是实施例6合成多肽细胞实验中GLP‑1的浓度示意图。 [0045] 图3所示是实施例6合成多肽细胞实验中胰岛素的浓度示意图。 [0046] 图4所示是实施例7动物实验中小鼠饮水情况示意图。 [0047] 图5所示是实施例7动物实验中小鼠饮食情况示意图。 [0048] 图6所示是实施例7动物实验中小鼠能量摄入情况示意图。 [0049] 图7所示是实施例7动物实验中小鼠体重变化情况示意图。 [0050] 图8所示是实施例7动物实验中小鼠血浆PYY浓度示意图。 [0051] 图9所示是实施例7动物实验中小鼠血浆TG含量示意图。 [0052] 图10所示是实施例7动物实验中小鼠血浆TC含量示意图。 [0053] 图11所示是实施例7动物实验中小鼠血浆FFA含量示意图。 [0054] 图12所示是实施例7动物实验中灌胃期间小鼠血糖变化示意图。 [0055] 图13所示是实施例7动物实验中口服葡萄糖耐量实验期间葡萄糖浓度变化(左)及曲线下面积(右)示意图。 [0056] 图14所示是实施例7动物实验中血浆GLP‑1浓度示意图。 [0057] 图15所示是实施例7动物实验中血浆Insulin浓度和HOMA‑IR示意图。 [0058] 图16所示是实施例7动物实验中血浆GHb浓度示意图。 [0059] 图17所示是实施例7动物实验中血浆ADPN浓度示意图。 [0060] 图18所示是实施例7动物实验中肠道菌群α多样性示意图。 [0061] 图19所示是实施例7动物实验中Lactobacillus、Akkermansia、Bacteroides、Prevotella丰度及Bacteroidetes/Firmicutes的比例示意图。 [0062] 图20所示是实施例8酶解提取物细胞实验中DPP IV抑制活性示意图。 [0063] 图21所示是实施例8酶解提取物细胞实验中GLP‑1浓度示意图。 [0064] 图22所示是实施例8酶解提取物细胞实验中胰岛素浓度示意图。 [0065] 图23所示是实施例9动物实验中小鼠饮水情况示意图 [0066] 图24所示是实施例9动物实验中小鼠饮食情况示意图。 [0067] 图25所示是实施例9动物实验中小鼠能量摄入情况示意图。 [0068] 图26所示是实施例9动物实验中小鼠体重变化情况示意图。 [0069] 图27所示是实施例9动物实验中小鼠血浆PYY浓度示意图。 [0070] 图28所示是实施例9动物实验中小鼠血浆TG含量示意图。 [0071] 图29所示是实施例9动物实验中小鼠血浆TC含量示意图。 [0072] 图30所示是实施例9动物实验中小鼠血浆FFA含量示意图。 [0073] 图31所示是实施例9动物实验中灌胃期间小鼠血糖变化示意图。 [0074] 图32所示是实施例9动物实验中口服葡萄糖耐量实验期间葡萄糖浓度变化(左)及曲线下面积(右)示意图。 [0075] 图33所示是实施例9动物实验中小鼠血浆GLP‑1浓度示意图。 [0076] 图34所示是实施例9动物实验中小鼠血浆Insulin浓度和HOMA‑IR示意图。 [0077] 图35所示是实施例9动物实验中小鼠血浆GHb浓度示意图。 [0078] 图36所示是实施例9动物实验中小鼠血浆ADPN浓度示意图。 [0079] 图37所示是实施例9动物实验中肠道菌群α多样性示意图。 [0080] 图38所示是实施例9动物实验中Lactobacillus、Akkermansia、Bacteroides、Prevotella丰度及Bacteroidetes/Firmicutes的比例示意图。 具体实施方式[0081] 下面结合具体实施方式对本申请做进一步的详细描述，给出的实施例是为了能够更透彻地理解本申请，并且能够将本申请的范围完整的传达给本领域的技术人员。 [0082] 需要说明的是，在说明书及权利要求当中使用了某些词汇来指称特定组件。本领域技术人员应可以理解，技术人员可能会用不同名词来称呼同一个组件。本说明书及权利要求并不以名词的差异作为区分组件的方式，而是以组件在功能上的差异作为区分的准则。如在通篇说明书及权利要求当中所提及的“包含”或“包括”为开放式用语，故应解释成“包含但不限定于”。说明书后续描述为实施本申请的较佳实施方式，然而所述描述乃以说明书的一般原则为目的，并非用以限定本申请的范围。本申请的保护范围当视所附权利要求所界定者为准。 [0083] 本申请提供了一种提取自火麻仁蛋白的火麻仁酶解提取物，其中，以在所述火麻仁酶解提取物包含25～90％的分子量小于或等于1000Da的多肽组分、15～50％的分子量为1000‑3000Da的多肽组分、1～50％的分子量大于3000Da的组分。 [0084] 例如，以在所述火麻仁酶解提取物中所占的质量百分比计，所述火麻仁酶解提取物包含77％的分子量小于或等于1000Da的多肽组分、14％的分子量为1000‑3000Da的多肽组分、9％的分子量大于3000Da的多肽组分。 [0085] 在本申请中，对于分子量为1000‑3000Da的多肽，其指的是分子量大于1000Da且分子量小于等于3000Da的多肽。 [0086] 在本申请中，对于火麻仁酶解提取物的不同含量的分子量多肽分布的测定方法，本申请不作任何限制，其可以按照本领域常规的方法进行测定，例如采用高效液相色谱法分析所述火麻仁酶解提取物的分子量分布。在一些实施方式中，使用标准品制备标准曲线，测定火麻仁酶解提取物中的不同肽的含量。 [0087] 在一些实施方式中，以在所述火麻仁酶解提取物中所占的质量百分比计，蛋白质为70～100％，优选为75～85％。例如，以在所述火麻仁酶解提取物中所占的质量百分比计，蛋白质为70％，75％，80％，85％，90％，95％，100％。 [0088] 在本申请中，对于蛋白质在火麻仁多肽混合物中的含量的测定，本申请不作任何限制，其可以按照本领域常规的方法进行测定，例如，采用国标GB 5009.5‑2016第一法中测定蛋白质的方法进行测定。 [0089] 在本申请提供的实施方式中，所述火麻仁酶解提取物通过包含下述步骤的方法制备得到： [0090] 对火麻仁原料粉末以有机溶剂进行脱脂除油处理，得到脱脂火麻仁粉，[0091] 对所述脱脂火麻仁粉提取火麻仁蛋白质， [0092] 加入蛋白酶对所述火麻仁蛋白质进行酶解， [0093] 对酶解产物经过滤、离心后得到所述火麻仁酶解提取物。 [0095] 在本申请中，将火麻仁原料粉末加入抽提试剂中，搅拌、离心以脱除火麻仁粉末中的油脂。所述抽提试剂为有机溶剂，在一个具体的实施方式中，所述有机溶剂选自纯石油醚、正己烷、正丁醇、无水乙醇中的一种或两种以上。在一些具体的实施例中，所述有机溶剂为以一定比例混合的石油醚/正丁醇、正己烷/正丁醇、石油醚/乙醇或正己烷/乙醇。在一些具体的实施方式中，所述有机溶剂为5:2的石油醚/正丁醇、5:2的正己烷/正丁醇、5:2的石油醚/乙醇或5:2的正己烷/乙醇。在一个优选的实施方式中，所述有机溶剂为无水乙醇。 [0096] 在本申请一个具体的实施方式中，将火麻仁原料粉末与所述有机溶剂以1:10～1:20(g/mL)的料液比进行混合，经搅拌、离心、弃上清，得到所述脱脂火麻仁粉。 [0097] 例如，火麻仁原料粉末与有机溶剂混合的比例(g/mL)可以为1：10，1：11，1：12，1：13，1：14，1：15，1：16，1：17，1：18，1：19，1：20等。 [0098] 在一个优选的实施方式中，火麻仁原料粉末与无水乙醇以1:20(g/mL)的料液比进行混合。 [0099] 在本申请中，对火麻仁粉末中的油脂进行抽提的方法不作任何限制，可以按照本领域常规的方法进行，在一些具体的实施方式中，可以采用静置搅拌或超声提取的方法。 [0100] 在一个具体的实施方式中，采用静置搅拌法进行油脂抽提：火麻仁原料粉末与抽提试剂的混合液在20‑25℃的室温下搅拌12h，离心去除上清，对沉淀物质再次加入抽提试剂在20‑25℃的室温下搅拌6h，离心去除上清，将沉淀物质先在60℃左右的水浴中挥干至无有机，再进行烘干、冷却，获得脱脂火麻仁粉。 [0101] 在另一个具体的实施方式中，采用超声提取法进行油脂抽提：火麻仁原料粉末与抽提试剂的混合液在20‑25℃的室温下搅拌10min，超声(100kHZ)10min，离心去除上清，对沉淀物质再次加入抽提试剂重复搅拌和超声，离心去除上清，将沉淀物质先在60℃左右的水浴中挥干至无有机，再进行烘干、冷却，获得脱脂火麻仁粉。 [0102] 在本申请一个优选的实施方式中，采用静置搅拌法对火麻仁粉末中的油脂进行抽提。 [0103] 在本申请中，对火麻仁蛋白质的提取方法不作任何限制，可以按照本领域常规的方法进行，在一些具体的实施方式中，提取火麻仁蛋白质的方法选自超声辅助有机提取法、超声辅助碱提酸沉提取法、碱提酸沉提取法或盐提取法。 [0104] 在一个具体的实施方式中，采用超声辅助有机提取法提取火麻仁蛋白质：将脱脂火麻仁粉与正己烷混合，在超声下离心后取上清，可对剩余物质重复数次，将得到上清合并挥干至无有机，烘干得到。 [0105] 优选地，脱脂火麻仁粉与正己烷以料液比1：30～1：50(g/mL)的比例进行混合；优选地，超声频率为2kHZ；优选地，每次超声时间为20～40min；优选地，采用水浴55～65℃进行挥干；优选地，采用烘箱55～65℃进行烘干。 [0106] 在另一个具体的实施方式中，采用超声辅助碱提酸沉提取法提取火麻仁蛋白质：将脱脂火麻仁粉与超纯水混合(pH8.5)，超声(200W)后离心取上清，可对剩余物质重复数次，将得到上清合并后调节pH4.5使蛋白沉淀，水洗后调节pH至7.0，烘干得到。 [0107] 优选地，脱脂火麻仁粉与超纯水比1：10～1：30(g/mL)的比例进行混合；优选地，超声频率为100～300W；优选地，超声处理温度为20‑25℃；优选地，每次超声时间为20～40min；优选地，采用烘箱55～65℃进行烘干。 [0108] 在另一个具体的实施方式中，采用碱提酸沉提取法提取火麻仁蛋白质：将脱脂火麻仁粉与超纯水混合(pH10.0)，搅拌后离心取上清，可对剩余物质重复数次，将得到上清合并后调节pH5.0使蛋白沉淀，水洗后调节pH至7.0，烘干或冻干得到。 [0109] 优选地，脱脂火麻仁粉与超纯水比1：5～1：20(g/mL)的比例进行混合；优选地，搅拌处理温度为30～40℃；优选地，每次搅拌时间为1～3h；优选地，采用烘箱55～65℃进行烘干。 [0110] 在另一个具体的实施方式中，采用盐提取法提取火麻仁蛋白质：将脱脂火麻仁粉与NaCl溶液混合(pH7.0)，搅拌后离心取上清，可对剩余物质重复数次，对剩余物质再加入超纯水(pH10.0)搅拌后离心取上清，将得到上清合并后调节pH4.5使蛋白沉淀，水洗后调节pH至7.0，烘干或冻干得到。 [0111] 优选地，NaCl溶液浓度为0.5～1.0M；优选地，脱脂火麻仁粉与NaCl溶液比1：5～1：20(g/mL)的比例进行混合；优选地，搅拌处理温度为30～40℃；优选地，每次搅拌时间为1～ 3h；优选地，采用烘箱55～65℃进行烘干。 [0112] 在本申请一个优选的实施方式中，采用盐提取法提取火麻仁蛋白质。 [0113] 本申请中，对火麻仁蛋白质进行蛋白酶酶解。在一些实施方式中，所述蛋白酶选自胃蛋白酶、胰蛋白酶、α‑糜蛋白酶、木瓜蛋白酶、风味蛋白酶、蛋白酶K、中性蛋白酶、碱性蛋白酶、嗜热菌蛋白酶等单酶，或胃/胰复合酶、糜/胰复合酶的复合酶。 [0114] 在一些优选的实施方式中，所述蛋白酶选自嗜热菌蛋白酶、风味蛋白酶或蛋白酶K。进一步优选的，为嗜热菌蛋白酶。 [0115] 在一些实施方式中，将火麻仁蛋白质配制为一定质量浓度的蛋白溶液，按8000～10000U/g的浓度加入蛋白酶进行酶解，优选地，在35‑60℃下进行蛋白酶酶解；优选地，在pH为7‑11的条件下进行蛋白酶酶解；优选地，酶解时间为3‑6h。 [0116] 例如，可以在35℃、40℃、42℃、45℃、48℃、50℃、52℃、55℃、58℃、60℃、65℃、70℃等下进行蛋白酶酶解； [0117] 可以在pH为6、7、8、9、10、11等的条件下进行蛋白酶酶解； [0118] 酶解时间可以为3h、4h、5h、6h、7h等。 [0119] 在本申请中，对蛋白酶酶解后的产物进行过滤，并进一步离心，冻干，获得所述火麻仁酶解提取物。 [0120] 在一个具体的实施例中，收集分子量为≤3000Da的酶解产物，例如，选用3kDa超滤管对酶解组分进行分级。 [0121] 进一步的，收集分子量为≤1000Da的酶解产物，例如，选用1kDa超滤管对酶解组分进行分级。 [0122] <3kDda的多肽氨基酸序列长度约为23，属于短肽，更容易通过口服的方式发挥作用，因此本申请中优选得到<3kDa短肽，更优选的为小于1000Da的多肽 [0123] 本申请提供了上述所述火麻仁酶解提取物及上述所述的方法制备得到的火麻仁酶解提取物在制备具有减脂、调节代谢功能的药物、特殊医学用途食品以及保健食品中的用途。 [0125] 在一些具体的实施方式中，本申请提供的火麻仁酶解提取物能够降低能量摄入，减缓体重的增加，并能够降低血浆中TC、TG和FFA的浓度，增加PYY的浓度，可应用于减脂、调节代谢相关药物、特殊医学用途食品以及保健食品的开发中。 [0126] 本申请提供了上述所述火麻仁酶解提取物及上述所述的方法制备得到的火麻仁酶解提取物在制备用于预防、治疗或改善高血糖及高血糖引起的人体相关疾病的药物、特殊医学用途食品以及保健食品中的用途。 [0127] 高血糖是血糖明显增高引起的代谢紊乱性疾病，高血糖引起的人体相关疾病包括长期高血糖引起的慢性疾病，如糖尿病、视网膜病变、肾脏病变、糖尿病肾病、糖尿病性视网膜病变、动脉粥样硬化、周围神经病变、自主神经病变等；还包括急性血糖明显增高时引起的急性严重代谢紊乱，如糖尿病酮症酸中毒、高渗高血糖综合征等。 [0128] 在一些具体的实施方式中，本申请提供的火麻仁酶解提取物能够抑制DPP‑IV活性，提高体内的GLP‑1水平，产生调节血糖的作用，可应用于高血糖及高血糖引起的人体相关疾病的药物、特殊医学用途食品以及保健食品的开发中。 [0129] 本申请提供了上述所述火麻仁酶解提取物及上述所述的方法制备得到的火麻仁酶解提取物在在制备具有保肝、降低血浆谷丙和谷草转氨酶浓度或改善肝损伤功能的药物、特殊医学用途食品以及保健食品中的用途。 [0130] 本申请提供了上述所述火麻仁酶解提取物及上述所述的方法制备得到的火麻仁酶解提取物在制备具有护肾、改善肾脏损伤功能的药物、特殊医学用途食品以及保健食品中的用途。 [0131] 本申请提供了上述所述火麻仁酶解提取物及上述所述的方法制备得到的火麻仁酶解提取物在制备具有肠道菌群调节功能的药物、特殊医学用途食品以及保健食品中的用途。 [0132] 在本申请提供的所述药物、特殊医学用途食品以及保健食品中，还可以进一步包括药物学上可接受的载体或辅料。 [0134] 其中，所述赋形剂可选自但不限于淀粉，乳糖，蔗糖，碳酸钙，磷酸钙；所述粘合剂可选自但不限于淀粉，阿拉伯胶，羧甲纤维素，羟丙基纤维素，结晶纤维素，海藻酸，凝胶，聚乙烯吡咯烷酮；所述缓冲剂可选自但不限于柠檬酸盐缓冲溶液、乙酸盐缓冲溶液、磷酸盐缓冲溶液、硼酸盐缓冲溶液、tris盐缓冲溶液及其类似物；所述抗氧化剂可选自但不限于丁基羟基甲苯、丁基羟基苯甲醚、亚硫酸钠、亚硫酸氢钠、偏亚硫酸氢钠、抗坏血酸、半胱氨酸盐酸盐、胱氨酸、硫辛酸、硫代甘油及其类似物；所述润滑剂可选自但不限于硬脂酸镁，硬脂酸钙，滑石粉；所述增稠剂可选自但不限于甲基纤维素、羟甲基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、无定形纤维素、多糖(包括淀粉衍生物)、聚乙烯醇及聚乙烯吡咯烷酮或其混合物；所述崩解剂可选自但不限于羧甲纤维素钙，滑石粉；所述稀释剂可选自但不限于注射用水，盐水；所述防腐剂可选自但不限于硫酸氢钠、亚硫酸氢钠、三硫酸钠、苯扎氯铵、氯丁醇、硫柳汞、乙酸苯汞、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯及苯乙醇；所述等渗剂可选自但不限于氯化物及糖。 [0135] 本申请还提供了包含所述火麻仁酶解提取物的药物可以以如下形式制备：将所述多肽和药学上可接受的载体混合，例如得到口服制剂，诸如片剂(包括糖衣片剂、薄膜包衣片剂、舌下片剂、口腔崩解片剂)、胶囊剂(包括软胶囊剂、微囊剂)、颗粒剂、粉末剂、锭剂、糖浆剂、乳剂、混悬剂、薄膜(例如、口服崩解性的薄膜)等、肠胃外制剂如注射剂(例如皮下注射剂、静脉内注射剂、肌内注射剂、腹腔注射剂、滴注剂)、外用制剂(例如皮肤制剂、软膏剂)、栓剂(例如直肠栓剂、阴道栓剂)、丸剂、滴鼻剂、呼吸制剂(吸入剂)、眼药水等。除此之外，这些制剂可作为控释制剂(例如持续释放微囊剂)、诸如立即释放制剂、持续释放制剂等。这样的制剂可通过本技术领域中常规使用的制备方法获得。 [0136] 含有本申请所述火麻仁酶解提取物的药物、特殊医学用途食品以及保健食品可以给药于哺乳动物(例如人、小鼠、大鼠、兔、狗、猫、牛、马、猪、猴)。给药方式可以是口服或肠胃外给药(例如，静脉内、肌内、皮下、器官内、鼻内、皮内、滴注、脑内、直肠、阴道、腹膜内等)。 [0137] 本申请的多肽向受试者的给药量根据给药途径、症状、患者年龄等等而不同，临床医生可以实际确定。 [0138] 本申请中涉及的药物、特殊医学用途食品以及保健食品也可以与其他现有已知的治疗高血糖、2型糖尿病、肥胖症、代谢异常疾病及具有保肝、护肾、肠道菌群调节功能的药物一起使用。在一起使用时，对于各自药物的给药时间没有限制，可以同时给药两种或多种不同的药物，可以在不同的时间给药各个药物。可以按照临床上使用的给药数量来确定已知药物的剂量，并根据给药患者、给药途径等来适当地选择。 [0139] 实施例 [0140] 本申请以下实施例中所使用火麻仁来源于广西巴马、嗜热菌蛋白酶购自于上海源叶生物科技有限公司。其他材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。 [0141] 实施例1火麻仁酶解提取工艺及方法优化 [0142] 本实施例公开的火麻仁酶解提取方法包括如下具体步骤：使用有机溶剂抽提去除火麻仁中的油脂；提取脱脂火麻仁中的蛋白质；加入蛋白酶对火麻仁蛋白质进行酶解；对酶解产物离心收集上清，获得火麻仁酶解提取。通过以下实验对油脂抽提、蛋白质提取及酶解各步骤中的工艺条件进行筛选，以得到所述火麻仁酶解提取物的较佳制备方法。 [0143] (1)火麻仁油脂抽提方法的筛选 [0144] 分别选用了纯石油醚、正己烷、正丁醇、乙醇、5:2的石油醚/正丁醇、5:2的正己烷/正丁醇、5:2的石油醚/乙醇、5:2的正己烷/乙醇作为抽提试剂，以料液比1:20对火麻仁中的油脂进行抽提。抽提方法分别采用静置搅拌和超声提取。详细工艺参数如下： [0145] 静置搅拌法：称取火麻仁(～2g)→以料液比1:20(w/v，g/mL)加入抽提试剂→室温(20‑25℃)下搅拌12h→离心去弃清→对沉淀物质再次加入料液比1:20(w/v，g/mL)的抽提试剂→室温(20‑25℃)下搅拌6h→离心，弃上清→沉淀物质先在水浴(60℃)挥干至无有机→烘箱烘干(60℃)30min→冷却至室温后称量； [0146] 超声抽提法：称取火麻仁(～2g)→以料液比1:20(w/v)加入抽提试剂→室温(20‑25℃)下搅拌10min→室温(20‑25℃)下超声(100kHZ)10min→离心去上清→对沉淀物质再次加入料液比1:20(w/v，g/mL)的抽提试剂→室温(20‑25℃)下搅拌10min→室温(20‑25℃)下超声(100kHZ)10min→离心，弃上清→沉淀物质先在水浴(60℃)挥干至无有机→烘箱烘干(60℃)30min→冷却至室温后称量。 [0147] 采用以上试剂和抽提方法最终原料的得率如表1所示，正丁醇静置搅拌提取提油除杂具有最低的回收率，说明其除油除杂效果最优，其次是乙醇静置搅拌提取以及石油醚/正丁醇超声提取，但实验发现采用正丁醇或者石油醚提取后的火麻仁残渣具有不太友好的刺激性味道，同时发现乙醇抽提法所得残渣颜色相比其它方法抽提颜色浅，所以综合评价采用乙醇静置搅拌除油方法效果较优。 [0148] 表1不同试剂及不同抽提方法所得火麻仁去油后的回收率(n＝3) [0149] [0150] (2)火麻仁蛋白提取工艺优化 [0151] 分别采用超声辅助有机提取法、超声辅助碱提酸沉提取法、碱提酸沉提取法以及盐提取法对火麻仁蛋白进行提取，优化提取工艺。各方法具体的操作流程如下所述： [0152] 超声辅助有机提取法：称取火麻仁(～5g)→以料液比1:40(w/v，g/mL)加入正己烷→30℃、2kHZ超声30min→离心取上清→对剩余物质再次以料液比1:40(w/v，g/mL)加入正己烷→30℃、2kHZ超声30min→离心，取上清→合并两次上清并在水浴(60℃)挥干至无有机→烘箱烘干(60℃)。 [0153] 超声辅助碱提酸沉提取法：称取火麻仁(～5g)→以料液比1:20(w/v，g/mL)加入超纯水(pH8.5)→室温(20‑25℃)下超声(200W)30min→离心取上清→对剩余物质再次以料液比1:10(w/v，g/mL)加入超纯水(pH8.5)→室温(20‑25℃)下超声(200W)30min→离心取上清→合并两次调去的上清并调节pH4.5使蛋白沉淀→水洗3次→调节pH至7.0→烘箱烘干。 [0154] 碱提酸沉提取法：称取火麻仁(～5g)→以料液比1:10(w/v，g/mL)加入超纯水(pH10.0)→35℃搅拌提取2h→离心取上清→对剩余物质再次以料液比1:10(w/v，g/mL)加入超纯水(pH10.0)→35℃搅拌提取2h→离心取上清→合并两次调去的上清并调节pH5.0使蛋白沉淀→水洗3次→调节pH至7.0→烘箱烘干/冻干保存。 [0155] 盐提取法：称取火麻仁(～5g)→以料液比1:10(w/v，g/mL)加入0.8M的NaCl溶液(pH7.0)→35℃搅拌提取2h→离心取上清→对剩余物质再次以料液比1:10(w/v，g/mL)加入超纯水(pH10.0)→35℃搅拌提取2h→离心取上清→合并两次调去的上清并调节pH4.5使蛋白沉淀→水洗3次→调节pH至7.0→烘箱烘干/冻干保存。 [0156] 采用以上四种方法最终蛋白得率如表3所示，由表2可知盐提冷冻干燥法所得的蛋白得率最高达24.15％，同时经比较发现采用盐提法蛋白的颜色较碱提法显著浅。所以综合评价，采用上述盐提法进行蛋白提取效果较优。 [0157] 表2不同提取方法蛋白提取得率(n＝3) [0158] [0159] (3)火麻仁蛋白的酶解工艺优化 [0160] a火麻仁蛋白的酶解 [0161] 分别选用胃蛋白酶(pepsin)、胰蛋白酶(trypsin)、α‑糜蛋白酶(chymotrypsin)、木瓜蛋白酶(papain)、风味蛋白酶(flavourzyme)、蛋白酶K(proteinase K)、中性蛋白酶(neutral protease)、碱性蛋白酶(alcalase)、嗜热菌蛋白酶(thermolysin)单酶及胃/胰(trypsin/pepsin)、糜/胰(trypsin/chymotrypsin)复合酶对火麻仁蛋白进行酶解，具体方法为：配制0.1％质量浓度的蛋白溶液，按10000U/g(嗜热菌蛋白酶8000U/g)蛋白样品浓度加入蛋白酶，依据文献报道按照各酶最优的作用条件进行酶解5h，酶解后5000rpm离心20min，收集上清，冻干即得火麻仁酶解产物，各酶酶解的最优条件如表3所示。 [0162] 表3酶的种类及其酶解条件 [0163] [0164] b酶解液超滤分级 [0165] 选用3kDa超滤管对酶解组分进行分级，离心条件为4200rpm/min，一次离心25min，重复离心至无滤液被离心至收集管，合并每次的滤液待用。 [0166] c酶解液蛋白/多肽浓度测定 [0167] 采用双缩脲法测定分级液蛋白/多肽浓度，具体步骤为：取200μL各酶解组分/标准液(5mg/mL牛血清白蛋白)。再加入1mL的显色剂混匀后静置15min，然后取200μL反应液至96孔板中，于540nm处测定吸光度，待测液的蛋白/多肽浓度计算公式如下： [0168] C＝5*(A1‑A0)/(A2‑A0) [0169] 其中A0为空白即样品溶剂孔的吸光度，A1为待测样品吸光度，A2为标准品吸光度，依据此公式计算各分离组分蛋白/多肽浓度如表4所示。 [0170] 表4酶切后各分级组分的浓度及占比 [0171] [0172] [0173] 由表5可知嗜热菌蛋白酶、风味蛋白酶和蛋白酶K的酶解效果较优，其中尤其是嗜热菌蛋白酶，其酶解组分中<3kDa的酶解组分含量大于86.31％。 [0174] 实施例2火麻仁酶解提取物的制备 [0175] 根据上述实验得到的优化工艺，以如下步骤及条件进行火麻仁酶解提取物的制备： [0176] 将火麻仁原料用磨碎仪打碎，称取一定量的火麻仁粉末与无水乙醇以料液比1:20(w/v，g/mL)进行混合，在20‑25℃下搅拌12h，然后5000rpm离心10min后弃上清收集沉淀物质，重复上述混合、搅拌及离心步骤3次，然后合并所有沉淀物质，在60℃水浴上至乙醇挥干，得到除油的火麻仁粉； [0177] 称取一定量上述火麻仁粉，以料液比1:10(w/v，g/mL)加入0.8M的NaCl溶液(pH7.0)，在35℃下搅拌2h，8000rpm离心10min取上清，对剩余物质再次以料液比1:10(w/v，g/mL)加入超纯水(pH10.0)，在35℃下搅拌2h，离心取上清，合并两次调去的上清并调节pH4.5使蛋白沉淀，水洗3次，调节pH值至7.0，冻干得到火麻仁蛋白粉； [0178] 将上述火麻仁蛋白粉加超纯水配制成0.1％质量浓度的蛋白溶液，按8000U/g蛋白样品浓度加入嗜热菌蛋白酶，调节pH值至7.0、在55℃下进行酶解5h，酶解后5000rpm离心20min，收集上清，冻干即得火麻仁酶解提取物。 [0179] 实施例3火麻仁酶解提取物中的多肽鉴定 [0180] 将实施例2得到火麻仁酶解提取物加超纯水配制为5mg/mL的溶液，然后用除盐柱进行除盐，之后冻干再加入乙腈水溶液进行复融，采用NannoDrop对多肽浓度进行定量，并统一配制为2mg/mL，最后过0.22μM虑膜，用赛默飞的组合型四极杆轨道离子阱质谱仪(Q Exactive Plus Hybrid Quadrupole‑Orbitrap Mass Spectrometer)进行检测，下机数据用Maxquant进行分析，最后获得火麻仁酶解组分的多肽组成，表5为其中相对丰度最高的前十条多肽LLY、VFTPQ(Seq ID No.21)、VADW(Seq IDNo.1)、YNLP(Seq ID No.14)、LNAP(Seq ID No.13)、VAMP(Seq ID No.2)、NYLP(Seq ID No.15)、FNPRG(Seq ID No.16)、IEQMPQRS(Seq ID No.23)、PQNH(Seq ID No.20)。 [0181] 表5质谱鉴定相对丰度最高的10条多肽 [0182] [0183] [0184] 人工合成这10条多肽进行后续的体外DPP‑IV抑制活性验证。 [0185] 实施例4基于分子对接技术的DPP‑IV抑制活性多肽筛选 [0186] 以5YP3晶体结构前处理后DPP‑IV的A链作为受体，以上鉴定到的火麻仁多肽文库作为受体，以MOE软件进行分子对接，然后根据Docking score大小筛选潜在DPP‑IV抑制活性最强的火麻仁多肽序列。最后经筛选选定YGDQ(Seq ID No.6)、LTTVASY(Seq ID No.26)、WIAVK(Seq ID No.12)、YSYA(Seq ID No.10)、WNVN(Seq ID No.11)、FNVDSE(Seq ID No.24)、PSSQQTR(Seq ID No.25)、PQNHA(Seq IDNo.22)、WDSY(Seq ID No.19)、YTGD(Seq ID No.7)、YQLM(Seq ID No.3)、FSPSSQQ(Seq ID No.5)、FDGEL(Seq ID No.18)、YTPHW(Seq ID No.17)、PSSQQ(Seq ID No.9)、YQL、FPQS(Seq IDNo.4)、FLQ、YNL、FQL、WLE、VVDNNGRS(Seq ID No.8)共22条多肽进行后续的体外DPP‑IV抑制活性验证。具体筛选结果如表6所示。 [0187] 表6分子对接结果 [0188] [0189] [0190] 实施例5多肽的DPP IV体外抑制活性测定 [0191] 人工合成实施例3和实施例4中得到的32种多肽，测定多肽对DPP‑IV抑制的IC50值，以评价其对DPP IV的抑制效果。 [0192] 实验方法：对每种多肽分别配制1.0、0.4、0.08、0.016和.0032mg/mL5个样品浓度梯度。在96孔透明酶标仪板内构建如下的100μL反应体系：①首先添加60μL上述不同浓度的多肽溶液，②添加20μL2.0 mM的Gly‑Pro‑pNA溶液(终浓度0.40mM)，并使用平板振荡器混匀1分钟，③添加20μLrhDPP‑IV溶液，使得最终rhDPP‑IV活性为0.025Unit/mL。加入rhDPP‑IV后，立即放入酶标仪37℃孵育60min，期间每隔10min测定一次405nm下的吸光度值。对于任意样本，选取吸光度值在线性范围内变化的两个点计算吸光度对时间的变化率S＝(Abs2‑Abs1)/(t2‑t1)，并由下述公式(2‑1)计算DPP‑IV抑制率： [0193] [0194] 式(2‑1)中，IRsample代表样品对rhDPP‑IV的抑制率，SNC代表阴性对照即溶剂组在检测体系中吸光度的变化速率(斜率)，Ssample代表样品组吸光度的变化速率。所有样品和对照组均需三组检测重复，并计算标准偏差，实验结果如表7所示。由测定结果可知，其中VAMP、YQLM、FPQS、FSPSSQQ、YGDQ及WLE多肽的IC50小于1.0mmol/L，尤其是多肽VAMP的IC50为1.0μmol/L；多肽YTGD、VVDNNGRS、PSSQQ、VADW、YSYA、WNVN、WIAVK、LNAP多肽的IC50小于10mmol/L；YNLP、FLQ、NYLP、LLY多肽的IC50小于100mmol/L；其中多肽FNVDSE、PSSQQTR、FQL、LTTVNSY、YNL、YQL的IC50相对较高。 [0195] 表7各合成多肽的IC50 [0196] [0197] [0198] 实施例6多肽的降糖活性评价细胞实验 [0199] 人工合成实施例3和实施例4中得到的32种多肽，进行Caco2细胞DPP‑IV抑制活性、GLP‑1浓度及胰岛素浓度测定实验，评价其降糖活性。 [0200] 实验方法： [0201] (1)将浓度为1×105个/mL的Caco2细胞接种于24孔板中，然后于培养箱中培养24h后将培养基置换成含2mg/mL各合成多肽或者5mg/mL蛋白水解液的培养基中培养24h。然后将上清取出并对上清中DPP IV的活性及GLP‑1的浓度进行测定。其中DPP IV的抑制活性采TM用DPPIV‑Glo Protease Assay(Promega)进行测定，GLP‑1浓度采用索莱宝GLP‑1的ELSA试剂和进行测定，测定结果如图1和图2所示。 [0202] (2)将1000μL浓度为1×105个/mL的INS‑1细胞接种于24孔板中，然后于培养箱中培养24h后将培养基置换成含2mg/mL的各合成多肽的培养基中培养24h。然后用KRBH缓冲液(Krebs‑Ringer Bicarbonate HEPES Buffer)清洗1次后加入1000μL的KRBH缓冲液于24孔板中并于培养箱中孵育1小时。然后将KRBH缓冲液取出并加入含16.7mM葡萄糖溶液的KRBH缓冲液并于培养箱中孵育2小时。将上清取出并采用索莱宝Insulin试剂盒对上清中胰岛素(Insulin)的浓度进行测定，测定结果如图3所示。 [0203] 由分析结果可知所有合成多肽都能在一定程度上抑制DPP IV活性以及促进胰岛素的分泌，其中在抑制DPP IV活性方面，多肽VADW、WDSY、VAMP、WIAVK以及FNPRG的效果最优；在促进GLP‑1分泌方面多肽FPQS、VFTPQ、FNVDSE、YTGD以及YQLM的效果最佳；在促进胰岛素分泌方面多肽YSYA、PSSQQTR、VFTPQ、PQNHA以及VADW的效果最佳。 [0204] 实施例7多肽降糖、减脂、护肝、护肾、肠道菌群调节功效评价动物实验[0205] 综合质谱鉴定的相对丰度、IC50值和细胞水平活性评价结果，选择了三条多肽VADW、VAMP和YQLM进行体内活性验证，具体的实验方案如下： [0206] 选用6周龄(体重18～22g)的C57BL/6J雄性小鼠60只(购买于浙江维通利华实验动物技术有限公司)，适应性饲养一周后开始造模并灌胃。 [0207] 实验分为6组，每组10只小鼠，以打耳标的形式区分动物，分别为正常组(Wide Type，WT)、模型组(High‑fat‑diet，HFD)、阳性药物组(Sitagliptin，PC)和3个多肽样品组(VADW、VAMP和YQLM)，采用灌胃的方式进行。 [0208] 实验的过程中除正常组外均喂以高脂饲料(高脂饲料中，蛋白20kcal％，碳水化合物20kcal％；脂肪60kcal％)进行造模，另无其它特殊处理，期间所有的组依据0.2mL/20g小鼠体重进行灌胃，每天灌胃一次，其中正常组(Wide Type，WT)和模型组(High‑fat‑diet，HFD)每天灌胃水(样品溶剂)，阳性药物组每天灌胃1.25mg/kg阳性药物磷酸西格列汀(Sitagliptin，购买自sigma)，VADW、VAMP和YQLM多肽样品组分别灌胃相应样品50mg/kg。待模型组小鼠的体重及空腹血糖值均高于正常组20％以上时结束实验。 [0209] 灌胃期间每周对小鼠饮食、饮水、血糖及体重进行测量并统计分析。结果显示，灌胃8周后，模型组小鼠的体重及空腹血糖值均高于正常组20％，所以整个动物实验在灌胃8周后结束实验。 [0210] (1)多肽减脂功效评价 [0211] 灌胃8周后处理小鼠并收集小鼠血液，离心后获得小鼠血浆，采用动物全自动生化分析仪(chemistry analyzer)对血浆中总胆固醇(Total cholesterol，TC)、总甘油三酯(Total triglycerides，TG)进行分析，同时采用Elasa试剂盒(Elabscience)对血浆中游离脂肪酸(Non‑esterified fatty acid，FFA)和酪酪肽(PPY)进行测定。统计结果如图4‑11所示。 [0212] 对结果进行分析后发现灌胃3种多肽样品均能够显著降低小鼠的饮食、饮水和能量摄入，减缓小鼠体重的增加。同时，灌胃3种多肽还能显著降低小鼠血浆中TC、TG和FFA的浓度，增加PYY的浓度，表明几种多肽均具有减脂效果。 [0213] (2)多肽的降糖功效评价 [0214] 实验期间每周对小鼠的空腹血糖进行测定，并在第八周对小鼠的口服葡萄糖耐量水平进行了评价，具体操作为：在0min测定小鼠的空腹血糖，然后给小鼠灌胃2g/kg的葡萄糖，然后分别于15min、30min、60min、90min和120min这5个时间点测定小鼠的血糖并计算曲线下面积(Area under the curve)，同时采用Elasa试剂盒(Elabscience)对小鼠血浆中的胰岛素(Insulin)、胰高血糖素样肽1(GLP‑1)、糖化血红蛋白(GHb)和脂联素(Adiponectin)的浓度进行了测定，并依据以下公式计算胰岛素抵抗指数(HOMA‑IR)以评价小鼠的胰岛素抵抗情况。实验结果如图12‑17所示。 [0215] HOMA‑IR＝C(Insulin)*C(FBS)/22.5 [0216] 其中，C(Insulin)：血浆胰岛素的浓度；C(FBS)：空腹葡萄糖浓度 [0217] 对结果进行分析后发现，灌胃VADW、VAMP和YQLM能够显著增加血浆中GLP‑1的浓度，降低小鼠的空腹血糖，同时增加小鼠的口服葡萄糖耐量，增加血浆中ADPN的浓度进而增加小鼠的胰岛素敏感性。同时也发现小鼠血浆中GHb的浓度降低，表明灌胃VADW、VAMP和YQLM多肽能够促进小鼠的血糖代谢平衡。 [0218] (3)多肽对肝、肾的保护功效评价 [0219] 灌胃8周实验结束后，测定了小鼠血浆中T‑bil‑D‑II：直接胆红素，升高说明肝细胞受损。测定谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、碱性磷酸酶(ALP)、总蛋白(TP II)和白蛋白(ALB II)的含量，以评价VADW、VAMP和YQLM多肽的护肝功效。同时测定了血浆中的肌酐和尿素浓度以评价多肽的护肾功效，具体结果表8所示。 [0220] 表8多肽干预后血生化指标变化(n＝6) [0221] [0222] 注：不同字母之间表示存在显著差异，p<0.05。T‑bil‑D‑II：直接胆红素；ALT：谷丙转氨酶；AST：谷草转氨酶；ALP：碱性磷酸酶；TP II：总蛋白；ALB II：白蛋白； [0223] Creas：肌酐；Urea：尿素。 [0224] 经分析发现，灌胃VADW、VAMP和YQLM能显著降低血浆中ALT、AST、ALP和TP II的浓度，表明VADW、VAMP和YQLM三种多肽具有一定的肝脏保护作用。同时也分析发现，在三种多肽灌胃组血浆中肌酐(Creas)和尿素(Urea)的浓度也显著低于模型组，表明VADW、VAMP和YQLM三种多肽具有一定的肾脏保护作用。 [0225] (4)多肽调节肠道菌群功效评价 [0226] 灌胃8周实验结束后，取小鼠结肠内容物并采用16sRNA测序技术对小鼠结肠内容物中肠道微生物组成进行分析测定，具体结果如图18、19所示。由图18结果可知，灌胃几种多肽能够显著的增加结肠肠道菌群的α多样性，包括增加Chao1和Observed_species指数，降低Goods_coverage指数；同时灌胃火麻仁多肽能够有效的增加有益菌属包括Lactobacillus、Akkermansia、Bacteroides等的丰度，降低有害菌属Prevotella的丰度，增加Bacteroidetes/Firmicutes的比例(图19)，表明灌胃火麻仁多肽具有一定的改善肠道菌群紊乱的功能。 [0227] 实施例8火麻仁酶解提取物降糖活性评价(细胞实验) [0228] 实验方法：将浓度为1×105个/mL的Caco2细胞接种于24孔板中，然后于培养箱中培养24h后将培养基分别置换成含5mg/mL各火麻仁蛋白酶酶解组分的培养基中培养24h。然后将上清取出并对上清中DPP IV的活性及GLP‑1的浓度进行测定。其中DPP IV的浓度采用Elabscience的Elasa试剂盒进行测定、GLP‑1浓度采用索莱宝GLP‑1的ELSA试剂盒进行测定，测定结果如图20、21所示。 [0229] 将1000μL浓度为1×105个/mL的INS‑1细胞接种于24孔板中，然后于培养箱中培养24h后将培养基置换成含5mg/mL各火麻仁蛋白酶解组分的培养基中培养24h。然后用KRBH缓冲液(Krebs‑Ringer Bicarbonate HEPES Buffer)清洗1次后加入1000μL的KRBH缓冲液于 24孔板中并于培养箱中孵育1小时。然后将KRBH缓冲液取出并加入含16.7mM葡萄糖溶液的KRBH缓冲液并于培养箱中孵育2小时。将上清取出并采用索莱宝Insulin试剂盒对上清中胰岛素(Insulin)的浓度进行测定，测定结果如图22所示。 [0230] 上述实验中，各火麻仁蛋白酶为实施例1表3中的11种蛋白酶。另设置对照组为西格列汀(Sitagliptin，10μM)。 [0231] 综合评价细胞实验的结果，可以看出各蛋白酶酶解组分均能在一定程度上降低DPPIV的浓度，增加GLP‑1和Insulin的浓度，具备有潜在的降糖功效，其中嗜热菌蛋白酶酶解火麻仁蛋白得到的酶解产物具有最好的潜在降糖效果，相比现有技术中的常用的DPP IV抑制剂类降糖药物西格列汀效果更佳。 [0232] 实验例9火麻仁酶解提取物的减脂、降糖、护肝、护肾、肠道菌群调节功效评价动物实验 [0233] 以实施例2得到的火麻仁蛋白及酶解提取物作为研究对象，开展动物实验，评价其在减脂、降糖、护肝、护肾、肠道菌群调节等方面的的功效。实验方法如下： [0234] 选用6周龄(体重18～22g)的C57BL/6J雄性小鼠(购买于浙江维通利华实验动物技术有限公司)，适应性饲养一周后开始造模并灌胃。 [0235] 实验分为7组，每组10只小鼠，以打耳标的形式区分动物，分别为正常组(Wide Type，WT)、模型组(High‑fat‑diet，HFD)、阳性药物组(Sitagliptin，PC)，3个火麻仁酶解提取物样品组(低剂量组，TPH‑L；中剂量组，TPH‑M；高剂量组，TPH‑H)和火麻仁蛋白组(Pro)，采用灌胃的方式进行。 [0236] 实验的过程中除正常组外均喂以高脂饲料(高脂饲料中，蛋白20kcal％，碳水化合物20kcal％；脂肪60kcal％)进行造模，另无其它特殊处理，期间所有的组依据0.2mL/20g小鼠体重进行灌胃，每天灌胃一次，其中正常组(Wide Type，WT)和模型组(High‑fat‑diet，HFD)每天灌胃水(样品溶剂)，阳性药物组每天灌胃1.25mg/kg阳性药物磷酸西格列汀(Sitagliptin，购买自sigma)，火麻仁酶解提取物低剂量组(TPH‑L)、中剂量组(TPH‑M)、高剂量组(TPH‑H)分别以80、160、320mg/kg灌胃火麻仁酶解提取物，火麻仁蛋白组(Pro)以320mg/kg灌胃未酶解的火麻仁蛋白。灌胃8周，期间每周对其饮食、饮水及体重进行测量并统计。待模型组小鼠的体重及空腹血糖值均高于正常组20％以上时结束实验。 [0237] 灌胃期间每周对小鼠饮食、饮水、血糖及体重进行测量并统计分析。结果显示，灌胃8周后，模型组小鼠的体重及空腹血糖值均高于正常组20％，所以整个动物实验在灌胃8周后结束实验。 [0238] (1)火麻仁酶解提取物减脂功效评价 [0239] 灌胃8周后处理小鼠并收集小鼠血液，离心后获得小鼠血浆，采用动物全自动生化分析仪(chemistry analyzer)对血浆中总胆固醇(Total cholesterol，TC)、总甘油三酯(Total triglycerides，TG)进行分析，同时采用Elasa试剂盒(Elabscience)对血浆中游离脂肪酸(Non‑esterified fatty acid，FFA)和酪酪肽(PYY)进行测定。统计结果如图23‑30所示。 [0240] 对结果进行分析后发现灌胃三个剂量的火麻仁酶解提取物均能够降低小鼠的饮食、饮水和能量摄入，减缓小鼠体重的增加，同时还能显著降低小鼠血浆中TC、TG和FFA的浓度，增加PYY的浓度，表明所述火麻仁酶解提取物具有减脂效果。 [0241] (2)火麻仁酶解提取物降糖功效评价 [0242] 实验期间每周对小鼠的空腹血糖进行测定，并在第八周对小鼠的口服葡萄糖耐量水平进行了评价，具体操作为：在0min测定小鼠的空腹血糖，然后给小鼠灌胃2g/kg的葡萄糖，然后分别于15min、30min、60min、90min和120min这5个时间点测定小鼠的血糖并计算曲线下面积(Area under the curve)，同时采用Elasa试剂盒(Elabscience)对小鼠血浆中的胰岛素(Insulin)、胰高血糖素样肽1(GLP‑1)、糖化血红蛋白(GHb)和脂联素(Adiponectin)的浓度进行了测定，并依据以下公式计算胰岛素抵抗指数(HOMA‑IR)以评价小鼠的胰岛素抵抗情况。实验结果如图31‑36所示。 [0243] HOMA‑IR＝C(Insulin)*C(FBS)/22.5 [0244] 其中，C(Insulin)：血浆胰岛素的浓度；C(FBS)：空腹葡萄糖浓度 [0245] 对结果进行分析后发现，灌胃火麻仁酶解提取物能够显著增加血浆中GLP‑1的浓度，降低小鼠的空腹血糖，同时增加小鼠的口服葡萄糖耐量，增加血浆中ADPN的浓度进而增加小鼠的胰岛素敏感性，同时也发现小鼠血浆中GHb的浓度降低表明灌胃火麻仁蛋白酶解液能够促进小鼠的血糖代谢平衡。 [0246] (3)火麻仁酶解提取物对肝、肾的保护功效评价 [0247] 灌胃8周实验结束后，测定了小鼠血浆中T‑bil‑D‑II：直接胆红素，升高说明肝细胞受损谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、碱性磷酸酶(ALP)、总蛋白(TP II)和白蛋白(ALB II)的含量以评价火麻仁酶解提取物的护肝功效。同时测定了血浆中的肌酐和尿素浓度以评价火麻仁酶解提取物的护肾功效，具体结果表9所示。 [0248] 表9蛋白及蛋白酶解提取物干预后血生化指标变化(n＝6) [0249] [0250] [0251] 注：不同字母之间表示存在显著差异，p<0.05。T‑bil‑D‑II：直接胆红素；ALT：谷丙转氨酶；AST：谷草转氨酶；ALP：碱性磷酸酶；TP II：总蛋白；ALB II：白蛋白； [0252] Creas：肌酐；Urea：尿素。 [0253] 经分析发现，灌胃火麻仁酶解提取物能显著降低血浆中ALT、AST、ALP和TP II的浓度，表明灌胃火麻仁酶解提取物具有一定的肝脏保护作用。同时也发现在火麻仁酶解提取物灌胃组血浆中肌酐(Creas)和尿素(Urea)的浓度也显著低于模型组，表明灌胃火麻仁酶解提取物具有一定的肾脏保护作用。 [0254] (4)火麻仁酶解提取物调节肠道菌群功效评价 [0255] 灌胃8周实验结束后，取小鼠结肠内容物并采用16sRNA测序技术对小鼠结肠内容物中肠道微生物组成进行分析测定，具体结果如图37、38所示。由图37结果可知，灌胃火麻仁酶解提取物能够显著的增加结肠肠道菌群的α多样性，包括增加Chao1和Observed_species指数(数值越高表明菌群丰富度越高)，降低Goods_coverage指数(表明样品丰富度较高)；同时灌胃火麻仁酶解提取物能够有效的增加有益菌属包括Lactobacillus、Akkermansia、Bacteroides等的丰度，降低有害菌属Prevotella的丰度，增加Bacteroidetes/Firmicutes(拟杆菌/厚壁菌，据文献报道该比值与肥胖成反相关)的比例(图38)，表明灌胃火麻仁酶解提取物具有一定的改善肠道菌群紊乱的功能。 [0256] 以上所述，仅是本申请的较佳实施例而已，并非是对本申请作任何形式的限制。任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例。但是凡是未脱离本申请技术方案内容，依据本申请的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与改型，仍属于本申请技术方案的保护范围。 |
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