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用于缓解患有神经系统疾病的受试者中的胃肠道症状的益生菌组合物

申请号 CN202280051211.0 申请日 2022-06-17 公开(公告)号 CN117750965A 公开(公告)日 2024-03-22
申请人 比奥合姆健康有限公司; 发明人 阿菲夫·甘诺姆; 迈克尔·哈利塔基斯; 罗伯特·弗纳尔德;
摘要 本 发明 一般涉及用于缓解被诊断患有神经系统 疾病 或表现出一种或多种与神经系统疾病(例如孤独症谱系障碍)相关症状的受试者的胃肠道症状的方法和 益生菌 组合物。
权利要求

1.一种包含冷冻干燥喷雾干燥共混物的组合物,包含至少两种(例如两种、三种、四种、五种或六种)分离的且存活的非致病性细菌菌株,所述非致病性细菌菌株选自干酪乳杆菌、长双歧杆菌、副干酪乳杆菌、唾液乳杆菌、德氏乳杆菌和短双歧杆菌。
2.根据权利要求1所述的组合物,其中所述非致病性细菌菌株选自干酪乳杆菌、长双歧杆菌婴儿亚种、副干酪乳杆菌、唾液乳杆菌、德氏乳杆菌保加利亚亚种和短双歧杆菌。
3.根据权利要求1所述的组合物,其中所述非致病性细菌菌株选自干酪乳杆菌、长双歧杆菌和短双歧杆菌。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的组合物,其中所述非致病性细菌菌株选自干酪乳杆菌、长双歧杆菌婴儿亚种和短双歧杆菌。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的组合物,其还包含能够在受试者体内破坏生物膜和/或分解纤维的酶。
6.根据权利要求5所述的组合物,其中所述酶选自淀粉酶、纤维素酶、半纤维素酶、溶菌酶、果胶酶、脱核糖核酸酶I、塞拉提亚肽酶或舍雷肽酶、半纤维素酶/果胶酶复合物、β‑1,
3‑葡聚糖酶、酸性蛋白酶、性蛋白酶、葡聚糖淀粉酶、内切葡聚糖酶、木聚糖酶、α‑半乳糖苷酶、脂肪酶、溶菌酶、蛋白酶/肽酶复合物、二肽基肽酶IV(DPP‑IV)、壳聚糖酶、菠萝蛋白酶、木瓜蛋白酶、猕猴桃奇异果蛋白酶、植物源蛋白酶和植酸酶
7.根据权利要求6所述的组合物,其中所述酶为淀粉酶,其选自嗜热脂肪芽孢杆菌淀粉酶、解淀粉芽孢杆菌淀粉酶、枯草芽孢杆菌淀粉酶、地衣芽孢杆菌淀粉酶、黑曲霉淀粉酶和米曲霉淀粉酶。
8.根据权利要求6所述的组合物,其中所述酶为α‑半乳糖苷酶。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的组合物,其中所述组合物配制成颗粒、丸粒或粉末。
10.一种缓解被诊断患有神经系统疾病或具有一种或多种与神经系统疾病相关症状的受试者中的一种或多种胃肠道症状的方法,所述方法包括让受试者食用或向受试者施用根据权利要求1‑9中任一项所述的组合物,从而缓解受试者中的胃肠道症状。
11.根据权利要求10所述的方法,其中胃肠道症状包含腹痛、腹泻、不规律、腹胀、便秘和炎症中的至少一种。
12.一种破坏被诊断患有神经系统疾病或表现出一种或多种神经系统疾病相关症状的受试者胃肠道中的生物膜的方法,所述方法包括让受试者食用或向受试者施用根据权利要求1‑9中任一项所述的组合物,从而破坏受试者的胃肠道中的生物膜。
13.根据权利要求12所述的方法,其中所述生物膜包含致病性细菌和/或致病性真菌
14.根据权利要求12所述的方法,其中所述致病性细菌包含戴尔福特菌。
15.根据权利要求12所述的方法,其中所述致病性细菌选自食酸戴尔福特菌、池生戴尔福特菌、对虾戴尔福特菌、沙漠戴尔福特菌和鹤羽田戴尔福特菌。
16.根据权利要求12所述的方法,其中所述致病性真菌选自热带念珠菌、光滑念珠菌、白念珠菌、近平滑念珠菌、克鲁斯念珠菌、乳酒念珠菌、法比亚尼念珠菌、葡萄牙念珠菌、都柏林念珠菌、念珠菌和曲霉菌。
17.一种改善被诊断患有神经系统疾病或表现出一种或多种与神经系统疾病相关症状的受试者中的肠道生理机能的方法,所述方法包括让受试者食用或向受试者施用根据权利要求1‑9中任一项所述的组合物,从而改善受试者中的肠道生理机能。
18.一种减少被诊断患有神经系统疾病或表现出一种或多种与神经系统疾病相关症状的受试者肠道中戴尔福特菌的量的方法,所述方法包括让受试者食用或向受试者施用根据权利要求1‑9中任一项所述的组合物,从而减少受试者肠道中戴尔福特菌的量。
19.根据权利要求10‑18中任一项所述的方法,其中所述神经系统疾病选自阿尔茨海默病、孤独症谱系障碍(ASD)、注意缺陷障碍(ADD)、阅读障碍帕金森病
20.根据权利要求19所述的方法,其中孤独症谱系障碍选自自闭症、阿斯伯格综合症、海勒综合症或童年瓦解性障碍、雷特综合症和形式不明的广泛性发育障碍。
21.根据权利要求10‑20中任一项所述的方法,其中所述组合物与供人类食用的膳食组合物一起提供(例如,结合或注入)。
22.根据权利要求21所述的方法,其中所述膳食组合物是谷类产品、年糕、豆饼、食品棒产品、冷成型食品棒产品、奶油冻、酸奶、奶昔、蛋白奶昔、布丁、明胶、米浆、豆浆、果泥产品、糖果、糖和苹果酱中的一种。
23.一种用于缓解被诊断患有神经系统疾病或具有一种或多种与神经系统疾病相关症状的受试者中的一种或多种胃肠道症状的组合物,所述组合物包含冷冻干燥或喷雾干燥共混物,所述组合物包含至少两种(例如两种、三种、四种、五种或六种)分离的且存活的非致病性细菌菌株,所述非致病性细菌菌株选自干酪乳杆菌、长双歧杆菌、副干酪乳杆菌、唾液乳杆菌、德氏乳杆菌和短双歧杆菌。
24.一种用于破坏被诊断患有神经系统疾病或表现出一种或多种神经系统疾病相关症状的受试者胃肠道中的生物膜的组合物,所述组合物包含冷冻干燥或喷雾干燥共混物,所述组合物包含至少两种(例如两种、三种、四种、五种或六种)分离的且存活的非致病性细菌菌株,所述非致病性细菌菌株选自干酪乳杆菌、长双歧杆菌、副干酪乳杆菌、唾液乳杆菌、德氏乳杆菌和短双歧杆菌。
25.一种用于改善被诊断患有神经系统疾病或表现出一种或多种与神经系统疾病相关症状的受试者中的肠道生理机能的组合物,所述组合物包含冷冻干燥或喷雾干燥共混物,所述组合物包含至少两种(例如两种、三种、四种、五种或六种)分离的且存活的非致病性细菌菌株,所述非致病性细菌菌株选自干酪乳杆菌、长双歧杆菌、副干酪乳杆菌、唾液乳杆菌、德氏乳杆菌和短双歧杆菌。
26.一种用于减少被诊断患有神经系统疾病或表现出一种或多种与神经系统疾病相关症状的受试者肠道中戴尔福特菌的量的组合物,所述组合物包含冷冻干燥或喷雾干燥共混物,所述组合物包含至少两种(例如两种、三种、四种、五种或六种)分离的且存活的非致病性细菌菌株,所述非致病性细菌菌株选自干酪乳杆菌、长双歧杆菌、副干酪乳杆菌、唾液乳杆菌、德氏乳杆菌和短双歧杆菌。
27.用于根据权利要求23‑26中任一项的用途的所述组合物,其中所述非致病性细菌菌株选自干酪乳杆菌、长双歧杆菌婴儿亚种、副干酪乳杆菌、唾液乳杆菌、德氏乳杆菌保加利亚亚种和短双歧杆菌。
28.用于根据权利要求23‑26中任一项的用途的所述组合物,其中所述非致病性细菌菌株选自干酪乳杆菌、长双歧杆菌和短双歧杆菌。
29.用于根据权利要求23‑27中任一项的用途的所述组合物,其中所述非致病性细菌菌株选自干酪乳杆菌、长双歧杆菌婴儿亚种和短双歧杆菌。
30.用于根据权利要求23‑29中任一项的用途的所述组合物,其中所述组合物还包含能够在受试者体内破坏生物膜和/或分解纤维的酶。
31.用于根据权利要求30的用途的所述组合物,其中所述酶选自淀粉酶、纤维素酶、半纤维素酶、溶菌酶、果胶酶、脱氧核糖核酸酶I、塞拉提亚肽酶或舍雷肽酶、半纤维素酶/果胶酶复合物、β‑1,3‑葡聚糖酶、酸性蛋白酶、碱性蛋白酶、葡聚糖淀粉酶、内切葡聚糖酶、木聚糖酶、α‑半乳糖苷酶、脂肪酶、溶菌酶、蛋白酶/肽酶复合物、二肽基肽酶IV(DPP‑IV)、壳聚糖酶、菠萝蛋白酶、木瓜蛋白酶、猕猴桃奇异果蛋白酶、植物源蛋白酶和植酸酶。
32.用于根据权利要求31的用途的所述组合物,其中所述酶为淀粉酶,其选自嗜热脂肪芽孢杆菌淀粉酶、解淀粉芽孢杆菌淀粉酶、枯草芽孢杆菌淀粉酶、地衣芽孢杆菌淀粉酶、黑曲霉淀粉酶和米曲霉淀粉酶。
33.用于根据权利要求31的用途的所述组合物,其中所述酶为α‑半乳糖苷酶。
34.用于根据权利要求23‑33中任一项的用途的所述组合物,其中所述组合物配制成颗粒、丸粒或粉末。
35.用于根据权利要求23‑34中任一项的用途的所述组合物,其中所述神经系统疾病选自阿尔茨海默病、孤独症谱系障碍(ASD)、注意缺陷障碍(ADD)、阅读障碍和帕金森病。
36.用于根据权利要求35的用途的所述组合物,其中孤独症谱系障碍选自自闭症、阿斯伯格综合症、海勒综合症、雷特综合症、童年瓦解性障碍和形式不明的广泛性发育障碍。
37.用于根据权利要求23‑36中任一项的用途的所述组合物,其中所述组合物与供人类食用的膳食组合物一起提供(例如,结合或注入)。
38.用于根据权利要求37的用途的所述组合物,其中所述膳食组合物是谷类产品、年糕、豆饼、食品棒产品、冷成型食品棒产品、奶油冻、酸奶、奶昔、蛋白奶昔、布丁、明胶、米浆、豆浆、果泥产品、糖果、糖块和苹果酱中的一种。

说明书全文

用于缓解患有神经系统疾病的受试者中的胃肠道症状的益生

菌组合物

[0001] 相关申请的交叉引用
[0002] 本申请要求于2021年6月17日提交的美国临时专利申请第63/211,967号的权益和优先权,出于所有目的,该申请的全部内容通过引用的方式并入本文。

技术领域

[0003] 本发明一般涉及用于缓解被诊断患有神经系统疾病或具有与神经系统疾病(例如孤独症谱系障碍)相关症状的受试者的胃肠道症状的组合物和方法。

背景技术

[0004] 当单细胞生物生活在一起并形成一个受胞外多糖(EPS)基质保护的群落时,就会形成生物膜。这种EPS基质通常是蛋白质、多糖和细胞外DNA的集合体。与生物膜相关的微生物与它们的浮游生物(自由悬浮)对应物不同。据信,形成生物膜的细胞彼此共同聚集,形成附着在生物或非生物表面的配位基团,细胞被保护性EPS基质包围,通过群体感应进行有效通信,并且具有低代谢活性,这限制了常规抗菌药物(抗真菌剂和抗菌剂)对活跃代谢的
细胞或静止期细胞施加的影响。
[0005] 微生物(包括细菌、真菌和古菌)形成生物膜。对于给定的受试者(例如,人类),许多微生物(称为微生物群)存在于所述受试者的各个区域上或内部,例如肠道。宿主的胃肠道微生物群与消化、免疫和代谢之间有着密不可分的联系。胃肠道微生物群对维生素和代
谢产物的生物合成以及诸如多糖的复合大分子的消化是重要的。在正常条件下,胃肠道微
生物群有助于预防病原微生物的定植,维持肠道屏障的完整性和功能,并支持免疫系统。
[0006] 胃肠道紊乱(例如,腹痛、腹泻和腹胀)和代谢紊乱是典型的微生物生态失调,在患有孤独症谱系障碍的婴儿中经常被描述。(参见De Angelis M等人,PLoS One,2013Oct 9;8(10):e76993)。
[0007] 尽管迄今为止取得了进展,但仍需要改进的组合物和方法来缓解被诊断患有神经系统疾病或表现出与神经系统疾病相关症状的受试者中的胃肠道症状。

发明内容

[0008] 一方面,本发明提供一种包含冷冻干燥喷雾干燥共混物的组合物,其包含至少两种(例如两种、三种、四种、五种或六种)分离的且存活的非致病性细菌菌株,该菌株选自干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)、长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)、副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)、唾液乳杆菌(Lactobacillus salivarius)、德氏乳杆菌
(Lactobacillus delbrueckii)和短双歧杆菌(Bifidobacterium breve)。
[0009] 在另一方面,本发明提供一种缓解被诊断患有神经系统疾病或具有一种或多种与神经系统疾病相关症状的受试者中的一种或多种胃肠道症状的方法,所述方法包括让受试
者食用或向受试者施用包含冷冻干燥或喷雾干燥共混物的组合物,所述组合物包含至少两
种(例如两种、三种、四种、五种或六种)分离的且存活的非致病性细菌菌株,其选自干酪乳杆菌、长双歧杆菌、副干酪乳杆菌、唾液乳杆菌、德氏乳杆菌和短双歧杆菌,从而缓解受试者中的胃肠道症状。在某些实施方案中,胃肠道症状包含腹痛、腹泻、不规律、腹胀、便秘和炎症中的至少一种。
[0010] 在另一方面,本发明提供一种破坏被诊断患有神经系统疾病或表现出一种或多种与神经系统疾病相关的症状的受试者胃肠道中的生物膜的方法,所述方法包括让受试者食
用或向受试者施用包含冷冻干燥或喷雾干燥共混物的组合物,所述组合物包含至少两种
(例如两种、三种、四种、五种或六种)分离的且存活的非致病性细菌菌株,其选自干酪乳杆菌、长双歧杆菌、副干酪乳杆菌、唾液乳杆菌、德氏乳杆菌和短双歧杆菌,从而破坏受试者胃肠道中的生物膜。在某些实施方案中,生物膜包含致病性细菌和/或致病性真菌。在某些实施方案中,所述致病性细菌包含戴尔福特菌(Delftia)。在某些实施方案中,所述致病性细菌选自食酸戴尔福特菌(Delftia acidovorans)、池生戴尔福特菌(Delftia lacustris)、
对虾戴尔福特菌(Delftia litopenaei)、沙漠戴尔福特菌(Delftia deserti)和鹤羽田戴
尔福特菌(Delftia Tsuruhatensis)。在某些实施方案中,所述致病性真菌选自热带念珠菌(Candida tropicali)、光滑念珠菌(Candida glabrata)、白念珠菌(Candida albicans)、近平滑念珠菌(Candida parapsilosis)、克鲁斯念珠菌(Candida krusei)、乳酒念珠菌
(Candida kefyr)、法比亚尼念珠菌(Candida fabianii)、葡萄牙念珠菌(Candida 
lusitaniae)、都柏林念珠菌(Candida dubliniensis)、念珠菌(Candida auris)和曲霉
菌(Aspergillus)。
[0011] 在又一方面,本发明提供一种改善被诊断患有神经系统疾病或表现出一种或多种与神经系统疾病相关症状的受试者中的肠道生理机能的方法,所述方法包括让受试者食用
或向受试者施用包含冷冻干燥或喷雾干燥共混物的组合物,所述组合物包含至少两种(例
如两种、三种、四种、五种或六种)分离的且存活的非致病性细菌菌株,其选自干酪乳杆菌、长双歧杆菌、副干酪乳杆菌、唾液乳杆菌、德氏乳杆菌和短双歧杆菌,从而改善受试者中的肠道生理机能。
[0012] 在另一方面,本发明提供一种减少被诊断患有神经系统疾病或表现出一种或多种与神经系统疾病相关症状的受试者肠道中戴尔福特菌的量的方法,所述方法包括让受试者
食用或向受试者施用包含冷冻干燥或喷雾干燥共混物的组合物,所述组合物包含至少两种
(例如两种、三种、四种、五种或六种)分离的且存活的非致病性细菌菌株,其选自干酪乳杆菌、长双歧杆菌、副干酪乳杆菌、唾液乳杆菌、德氏乳杆菌和短双歧杆菌,从而减少受试者肠道中戴尔福特菌的量。
[0013] 在某些实施方案中,非致病性细菌菌株选自干酪乳杆菌、长双歧杆菌婴儿亚种(Bifidobacterium longum subsp.Infantis)、副干酪乳杆菌、唾液乳杆菌、德氏乳杆菌保加利亚亚种(Lactobacillus delbrueckii subsp.Bulgaricus)和短双歧杆菌。在某些实施
方案中,非致病性细菌菌株选自干酪乳杆菌、长双歧杆菌和短双歧杆菌。在某些实施方案
中,非致病性细菌菌株选自干酪乳杆菌、长双歧杆菌婴儿亚种和短双歧杆菌。
[0014] 在某些实施方案中,所述组合物还包含能够破坏生物膜和/或分解受试者体内纤维的酶。在某些实施方案中,所述酶选自淀粉酶、纤维素酶、半纤维素酶、溶菌酶、果胶酶、脱核糖核酸酶I、塞拉提亚肽酶或舍雷肽酶、半纤维素酶/果胶酶复合物、β‑1,3‑葡聚糖酶、酸性蛋白酶、性蛋白酶、葡聚糖淀粉酶、内切葡聚糖酶、木聚糖酶、α‑半乳糖苷酶、脂肪酶、溶菌酶、蛋白酶/肽酶复合物、二肽基肽酶IV(DPP‑IV)、壳聚糖酶、菠萝蛋白酶、木瓜蛋白酶、猕猴桃奇异果蛋白酶(kiWi protease actinidi)、植物源蛋白酶和植酸酶。在某些实施方
案中,所述酶为淀粉酶,其选自嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)淀粉
酶、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)淀粉酶、枯草芽孢杆菌(Bacillus 
subtilis)淀粉酶、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformi)淀粉酶、黑曲霉(Aspergillus niger)淀粉酶和米曲霉(Aspergillus oryzae)淀粉酶。在某些实施方案中,所述酶为α‑半乳糖苷酶。
[0015] 在某些实施方案中,所述组合物配制成颗粒、丸粒或粉末。
[0016] 在某些实施方案中,所述神经系统疾病选自阿尔茨海默病、孤独症谱系障碍(ASD)、注意缺陷障碍(ADD)、阅读障碍帕金森病。在某些实施方案中,孤独症谱系障碍选自自闭症、阿斯伯格综合症、海勒综合症或童年瓦解性障碍、雷特综合症和形式不明的广泛性发育障碍。
[0017] 在某些实施方案中,所述组合物与供人类食用的膳食组合物一起提供(例如,结合或注入)。在某些实施方案中,所述膳食组合物是谷类产品、年糕、豆饼、食品棒产品、冷成型食品棒产品、奶油冻、酸奶、奶昔、蛋白奶昔、布丁、明胶、米浆、豆浆、果泥产品、糖果、糖和苹果酱中的一种。
[0018] 在一方面,本发明提供一种用于缓解被诊断患有神经系统疾病或具有一种或多种与神经系统疾病相关症状的受试者中的一种或多种胃肠道症状的组合物,所述组合物包含
冷冻干燥或喷雾干燥共混物,所述组合物包含至少两种(例如两种、三种、四种、五种或六种)分离的且存活的非致病性细菌菌株,其选自干酪乳杆菌、长双歧杆菌、副干酪乳杆菌、唾液乳杆菌、德氏乳杆菌和短双歧杆菌。
[0019] 在一方面,本发明提供一种用于破坏被诊断患有神经系统疾病或表现出一种或多种神经系统疾病相关症状的受试者胃肠道中的生物膜的组合物,所述组合物包含冷冻干燥
或喷雾干燥共混物,所述组合物包含至少两种(例如两种、三种、四种、五种或六种)分离的且存活的非致病性细菌菌株,其选自干酪乳杆菌、长双歧杆菌、副干酪乳杆菌、唾液乳杆菌、德氏乳杆菌和短双歧杆菌。
[0020] 在另一方面,本发明提供一种用于改善被诊断患有神经系统疾病或表现出一种或多种与神经系统疾病相关症状的受试者中的肠道生理机能的组合物,所述组合物包含冷冻
干燥或喷雾干燥共混物,所述组合物包含至少两种(例如两种、三种、四种、五种或六种)分离的且存活的非致病性细菌菌株,其选自干酪乳杆菌、长双歧杆菌、副干酪乳杆菌、唾液乳杆菌、德氏乳杆菌和短双歧杆菌。
[0021] 在另一方面,本发明提供一种用于减少被诊断患有神经系统疾病或表现出一种或多种与神经系统疾病相关症状的受试者肠道中戴尔福特菌的量的包含冷冻干燥或喷雾干
燥共混物的组合物,所述组合物包含至少两种(例如两种、三种、四种、五种或六种)分离的且存活的非致病性细菌菌株,其选自干酪乳杆菌、长双歧杆菌、副干酪乳杆菌、唾液乳杆菌、德氏乳杆菌和短双歧杆菌。
[0022] 在某些实施方案中,非致病性细菌菌株选自干酪乳杆菌、长双歧杆菌婴儿亚种、副干酪乳杆菌、唾液乳杆菌、德氏乳杆菌保加利亚亚种和短双歧杆菌。在某些实施方案中,非致病性细菌菌株选自干酪乳杆菌、长双歧杆菌和短双歧杆菌。在某些实施方案中,非致病性细菌菌株选自干酪乳杆菌、长双歧杆菌婴儿亚种和短双歧杆菌。
[0023] 在某些实施方案中,所述组合物还包含能够在受试者中破坏生物膜和/或分解纤维的酶。在某些实施方案中,所述酶选自淀粉酶、纤维素酶、半纤维素酶、溶菌酶、果胶酶、脱氧核糖核酸酶I、塞拉提亚肽酶或舍雷肽酶、半纤维素酶/果胶酶复合物、β‑1,3‑葡聚糖酶、酸性蛋白酶、碱性蛋白酶、葡聚糖淀粉酶、内切葡聚糖酶、木聚糖酶、α‑半乳糖苷酶、脂肪酶、溶菌酶、蛋白酶/肽酶复合物、二肽基肽酶IV(DPP‑IV)、壳聚糖酶、菠萝蛋白酶、木瓜蛋白酶、猕猴桃奇异果蛋白酶、植物源蛋白酶和植酸酶。在某些实施方案中,所述酶为淀粉酶,其选自嗜热脂肪芽孢杆菌淀粉酶、解淀粉芽孢杆菌淀粉酶、枯草芽孢杆菌淀粉酶、地衣芽孢杆菌淀粉酶、黑曲霉淀粉酶和米曲霉淀粉酶。在某些实施方案中,所述酶为α‑半乳糖苷酶。
[0024] 在某些实施方案中,所述组合物配制成颗粒、丸粒或粉末。
[0025] 在某些实施方案中,所述神经系统疾病选自阿尔茨海默病、孤独症谱系障碍(ASD)、注意缺陷障碍(ADD)、阅读障碍和帕金森病。在某些实施方案中,孤独症谱系障碍选自自闭症、阿斯伯格综合症、海勒综合症、雷特综合症、童年瓦解性障碍和形式不明的广泛性发育障碍。
[0026] 在某些实施方案中,所述组合物与供人类食用的膳食组合物一起提供(例如,结合或注入)。在某些实施方案中,所述膳食组合物是谷类产品、年糕、豆饼、食品棒产品、冷成型食品棒产品、奶油冻、酸奶、奶昔、蛋白奶昔、布丁、明胶、米浆、豆浆、果泥产品、糖果、糖块和苹果酱中的一种。
[0027] 通过下面的详细描述和权利要求,本发明的其他特征和优点会变得明显。
[0028] 附图的简要说明
[0029] 在附图中,相似的附图标记通常在不同的视图中指代相同的部分。此外,附图不一定是按比例绘制的,而是通常强调说明本公开的原理。在以下描述中,参考以下附图描述了本公开的各种实施方案,其中:
[0030] 图1是描述组合模型的诊断图,其中使用LASSO逻辑模型确定了微生物组特征、人口统计学、饮食和临床特征。图中的左垂直线显示了交叉验证(CV)误差曲线达到其最小均
方误差(MSE)的位置。右垂直线向我们展示了CV误差在最小值的1个标准偏差内的最正则化
模型。根据5倍CV选择值λ(调谐参数),其中λ来自LASSO特征选择算法
[0031]
[0032] 图2是显示当险(诊断)评分的截止值为0.6447时,C‑指数=0.983,灵敏度为91%,特异度为100%的模型3的接受操作特征(ROC)曲线的图形图。
[0033] 图3是制备本文所述益生菌组合物的示例性工艺的示意图。

具体实施方式

[0034] 本发明部分地基于这样的发现,即包含某些非致病性细菌的组合物或剂型可以缓解哺乳动物(例如,人类)受试者中与神经系统疾病(例如,孤独症谱系障碍)相关的胃肠道
症状。本文还发现,通过向受试者施用包含至少两种(例如两种、三种、四种、五种或六种)分离的且存活的非致病性细菌菌株的组合物或剂型,可以预防或破坏受试者体内包含致病性
细菌和/或真菌以及任选的古菌和/或原生动物的生物膜,其在施用时促进受试者体内更平
衡的微生物组、分解纤维和/或促进自然微生物组的恢复。除非上下文另有规定,否则术语组合物和剂型在本文中可以互换使用,其中剂型是组合物,反之亦然。例如,可以设想让受试者食用或向受试者施用的组合物可以作为剂型食用或施用,例如作为组合物的一个单位
(例如,一匙)。类似地,应当理解,剂型可以例如包括本文所述的组合物。在某些实施方案中,剂型可以包括本文所述的粉末形式的组合物。在某些实施方案中,剂型可以包含含有这种组合物的胶囊形式的组合物。在某些实施方案中,剂型可以包括颗粒形式的组合物。在某些实施方案中,剂型可以包括丸粒形式的组合物。
[0035] 在一个方面,本发明提供了一种组合物,其包含分离的且存活的非致病性细菌菌株。组合物包含至少2种(例如,3种、4种、5种、6种或更多种)在受试者区域内存活的分离的非致病性细菌菌株。
[0036] 在另一个方面,本发明提供了包含(i)酶和(ii)至少两种非致病性细菌菌株的组合物。例如,组合物包含:(i)一种或多种(例如,1种、2种、3种、4种、5种或更多种)酶和(ii)在受试者区域中存活(例如,有或没有复制)的两种或多种(例如,2种、3种、4种、5种、6种或更多种)非致病性细菌菌株。
[0037] 在另一方面,本发明提供了一种能够破坏生物膜的组合物,所述生物膜包含分布在受试者的预选区域内的致病性细菌和/或致病性真菌。组合物包含(i)一种或多种(例如,
1种、2种、3种、4种、5种或更多种)酶和(ii)在受试者区域中存活(例如,有或没有复制)的两种或多种(例如,2种、3种、4种、5种、6种或更多种)非致病性细菌菌株。在某些实施方案中,所述酶能够破坏包含致病性细菌和/或致病性真菌的生物膜。在某些实施方案中,所述酶分解受试者体内的纤维。在某些实施方案中,非致病性细菌菌株能够破坏包含致病性细菌和/或致病性真菌的生物膜。在某些实施方案中,非致病性细菌菌株分解受试者体内的纤维。
[0038] 在另一方面,本发明提供了一种能够破坏生物膜的剂型,所述生物膜包含分布在受试者的预选区域内的致病性细菌和/或致病性真菌。剂型包含组合物,其包含(i)一种或
多种(例如,1种、2种、3种、4种、5种或更多种)酶和(ii)在受试者区域中存活(例如,有或没有复制)的两种或多种(例如,2种、3种、4种、5种、6种或更多种)非致病性细菌菌株。在某些实施方案中,所述酶能够破坏包含致病性细菌和/或致病性真菌的生物膜。在某些实施方案中,所述酶分解受试者体内的纤维。在某些实施方案中,非致病性细菌菌株能够破坏包含致病性细菌和/或致病性真菌的生物膜。在某些实施方案中,非致病性细菌菌株分解受试者体内的纤维。
[0039] I.生物膜
[0040] 本发明的组合物或剂型可用于破坏和/或替换存在于受试者预选区域处的生物膜,该预选区域可包括例如受试者中的胃肠道。
[0041] 可被本发明剂型组合物破坏的分布在生物膜内的示例微生物包括但不限于,戴尔福特菌(Delftia)的菌种,包括食酸戴尔福特菌(Delftia acidovorans)、池生戴尔福特菌
(Delftia lacustris)、对虾戴尔福特菌(Delftia litopenaei)、沙漠戴尔福特菌(Delftia deserti)和鹤羽田戴尔福特菌(Delftia Tsuruhatensis),厚壁菌(Firmicutes)、子囊菌(Ascomycota)门和接合菌(Zygomycota)门的菌种,例如包括粪肠球菌(Enterococcus 
faecalis)的肠球菌(Enterococcus)属,包括大肠埃希氏菌(Escherichia coli)的埃希氏
菌(Escherichia)属,包括炎衣原体(Chlamydia pneumonia)和沙眼衣原体(Chlamydia 
trachomatis)的披衣菌(Chlamydia)属,包括伤寒沙门氏菌(Salmonella typhi)和鼠伤寒
沙门氏菌(Salmonella typhimurium)的沙门氏菌(Salmonella)属,包括绿假单胞菌
(Pseudomonas aeruginosa)和厌氧假单胞菌(Pseudomonas anaerobius)的假单胞菌
(Pseudomonas)属,包括金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、头状葡萄球菌
(Staphylococcus capitus)、表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)、腐生葡萄球
菌(Staphylococcus saprophyticus)的葡萄球菌(Staphylococcus)属,包括单核细胞增生
李斯特菌(Listeria monocytogenes)的李斯特菌(Listeria)属,包括幽门螺旋杆菌
(Helicobacter pylori)的螺旋杆菌(Helicobacter)属,包括空肠弯曲菌(Campylobacter 
jejuni)的弯曲杆菌(Campylobacter)属,包括鼠疫耶尔森菌(Yersinia pestis)的耶尔森
菌(Yersinia),包括霍乱弧菌(Vibrio cholera)的弧菌(Vibrio)属,包括嗜沫嗜血杆菌
(Haemophilus aphrophilus)和流感嗜血杆菌(Haemophilus influenza)的嗜血杆菌
(Haemophilus)属,包括麻风分枝杆菌(Mycobacterium  leprae)、结核分枝杆菌
(Mycobacterium tuberculosis)的分枝杆菌(Mycobacterium)属,包括洋葱伯克氏菌
(Burkholderia cepacia)的伯克氏菌(Burkholderia)属,包括肺炎支原体(Mycoplasma 
pneumoniae)的支原体(Mycoplasma)属,包括肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)的
克雷伯氏菌(Klebsiella)属,包括阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)的肠杆菌
(Enterobacter)属,包括白色念珠菌(Candida albicans)、都柏林念珠菌(Candida 
dubliniensis)、近平滑念珠菌(Candida parapsilosis)、热带念珠菌(Candida 
tropicalis)、近平滑念珠菌(Candida parapsilosis)、光滑念珠菌(Candida glabrata)、克鲁斯念珠菌(Candida krusei)、耳念珠菌(Candida Auris)的念珠菌(Candida)属,以及
包括棒曲霉菌(Aspergillus clavatus)、黄曲霉(Aspergillus flavus)、土曲霉
(Aspergillus terreus)和烟曲霉(Aspergillus fumigatus)的曲霉菌(Aspergillus)属。
[0042] 胃肠道生物膜
[0043] 在某些实施方案中,本文所述的组合物或剂型可用于破坏受试者的胃肠(GI)道(例如食道、胃、上肠和/或下肠)内的生物膜,所述生物膜包含例如致病性细菌和/或真菌。
在某些实施方案中,预选区域包括上GI道的十二指肠、空肠和/或回肠,而在其他实施方案中,预选区域包括下GI道的阑尾、近端结肠和/或直肠。在某些实施方案中,受试者被诊断患有神经系统疾病或具有与神经系统疾病相关的一种或多种症状。
[0044] 在某些实施方案中,本文所述的组合物或剂型用于破坏分布在受试者胃肠道内的生物膜,当与在健康受试者中通常发现的平相比,分布在受试者胃肠道内的生物膜中致
病性细菌种类(例如戴尔福特菌)的相对丰度升高。在某些实施方案中,本文所述的组合物
或剂型包括非致病性细菌菌株,用于破坏或替换含有一种或多种戴尔福特菌致病性细菌菌
种的生物膜。在某些实施方案中,戴尔福特菌致病性细菌菌种包含食酸戴尔福特菌、池生戴尔福特菌、对虾戴尔福特菌、沙漠戴尔福特菌和鹤羽田戴尔福特菌。
[0045] 生物膜内的细菌与真菌密切接触,但其与真菌的特定相互作用可能不同。在某些实施方案中,致病性细菌(例如戴尔福特菌)可以与生物膜内的真菌细胞融合。可替代地或
另外,生物膜内分布的致病性细菌和致病性细菌真菌可以形成“消化菌斑(digestive 
plaque)”,在那里细菌和真菌受到保护,免受抗微生物药物和宿主免疫系统的影响。应当理解,消化菌斑能够破坏胃肠道的正常或健康微生物组,并且在被诊断患有神经系统疾病或
表现出与神经系统疾病相关的一种或多种症状的受试者中引起胃肠道疾病或病症或以其
他方式与胃肠道疾病或病症相关(例如,高血症、艰难梭菌(Clostridium difficile)结
肠炎、与肝硬化相关的肝性脑病、炎性肠病、克罗恩病、溃疡性结肠炎和/或肠易激综合征)。
[0046] 在某些实施方案中,本文所述的组合物或剂型可用于破坏生物膜,其中细菌种类(例如戴尔福特菌)的丰度显著增加,例如,与未被诊断患有神经系统疾病或未表现出与神
经系统疾病相关的一种或多种症状的受试者相比,在被诊断患有神经系统疾病或表现出与
神经系统疾病相关的一种或多种症状的受试者的胃肠道内分布的生物膜中细菌种类(例如
戴尔福特菌)的丰度显著增加。在某些实施方案中,戴尔福特菌丰度的增加能够与孤独症正向相关。
[0047] II.剂型和组合物
[0048] 本发明提供了可缓解被诊断患有神经系统疾病或具有与神经系统疾病相关的症状的受试者的胃肠道症状的组合物或剂型。
[0049] 本发明还提供了可以预防和/或破坏被诊断患有神经系统疾病或具有与神经系统疾病相关的一种或多种症状的受试者的预选区域处的生物膜的组合物或剂型。在某些实施
方案中,预防和/或破坏是通过例如降解EPS基质并允许非致病性生物体(例如,非致病性细菌和/或真菌)取代该区域处存在的致病性生物体进行。
[0050] 本发明还提供了可在被诊断患有神经系统疾病或具有与神经系统疾病相关的一种或多种症状的受试者中分解纤维的组合物或剂型。
[0051] 本发明还提供了可改善被诊断患有神经系统疾病或具有与神经系统疾病相关的一种或多种症状的受试者中的肠道生理机能的组合物或剂型。
[0052] 本发明还提供了可降低被诊断患有神经系统疾病或表现出与神经系统疾病相关的一种或多种症状的受试者的肠道中戴尔福特菌水平的组合物或剂型。
[0053] 在某些实施方案中,所述组合物配制为至少两种分离的且存活的非致病性细菌菌株的粉末状共混物,所述非致病性细菌菌株能够破坏包括致病性细菌和/或真菌的生物膜
或防止形成包括致病性细菌和/或真菌的生物膜。在某些实施方案中,所述组合物配制为至少两种分离的且存活的非致病性细菌菌株的粉末状共混物,所述非致病性细菌菌株能够在
被诊断患有神经系统疾病或具有与神经系统疾病相关的一种或多种症状的受试者中分解
纤维。在某些实施方案中,用功能性包衣(例如,控释包衣)或非功能性包衣(例如,美观包衣)对组合物进行涂覆。在某些实施方案中,将至少两种分离的且存活的非致病性细菌菌株的粉末共混物冷冻干燥或喷雾干燥。在某些实施方案中,将至少两种分离的且存活的非致
病性细菌菌株的冷冻干燥或喷雾干燥的共混物进一步与酶共混。在某些实施方案中,所述
酶为淀粉酶或α‑半乳糖苷酶。在某些实施方案中,将至少两种分离的且存活的非致病性细菌菌株的冷冻干燥或喷雾干燥的共混物进一步与两种酶共混。在某些实施方案中,这两种
酶为淀粉酶和α‑半乳糖苷酶。
[0054] (i)非致病性细菌
[0055] 所述组合物或剂型包含两种或多种(例如,2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种、10种或更多种)不同的非致病性细菌菌株,所述菌株能够在受试者的预选区域(例如,胃肠
道)中存活或复制。在某些实施方案中,受试者被诊断患有神经系统疾病或具有与神经系统疾病相关的一种或多种症状。
[0056] 在某些实施方案中,本发明的组合物或剂型中包含的示例性细菌菌株可包含以下细菌种类中的任何一种或多种细菌菌株:耶纳农球菌(Agrococcus jenensis)、Alistipes indistinctus、Alistipes massiliensis、Alkalibacterium iburiense、烟草芽抱杆菌
(Anoxybacillus kestanbolensis)、蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)、克劳氏芽孢杆菌
(Bacillus clausii)、凝结芽孢杆菌(Bacillus Coagulans)、嗜粪拟杆菌(Bacteroides 
coprophilus)、埃氏拟杆菌(Bacteroides eggerthii)、卵形拟杆菌(Bacteroides 
ovatus)、脆弱拟杆菌(Bacteroides fragilis)、普通拟杆菌(Bacteroides plebeius)、单形拟杆菌(Bacteroides uniformis)、青春双歧杆菌(Bifidobacterium adolescentis)、动物双歧杆菌(Bifidobacterium animalis)、双裂双岐杆菌(Bifidobacterium bifidum)、短双歧杆菌(Bifidobacterium breve)、链状双歧杆菌(Bifidobacteriumcatenulatum)、链状双歧杆菌柏氏亚种(DSM 21854)(Bifidobacterium catenulatum subsp.Kashiwanohense
(DSM 21854))、长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)、长双歧杆菌(DSM 20219)
(Bifidobacterium longum(DSM 20219))、长双歧杆菌婴儿亚种(Bifidobacterium longum subsp.Infantis)、假小链双歧杆菌(Bifidobacterium pseudocatenulatum)、假小链双歧
杆菌(DSM 20438)(Bifidobacterium pseudocatenulatum(DSM 20438))、假长双歧杆菌
(Bifidobacterium pseudolongum)、卵形布劳特氏菌(Blautia obeum)、生产布拉氏菌
(Blautia product)、Candidatus azobacteroides、Candidatus portiere、Candidatus 
Portiera、白色梭菌(Clostridium celatum)、海莱蒙梭菌(Clostridium hiranonis)、新生梭菌(Clostridium neonatale)、产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)、酪丁酸梭菌
(Clostridium tyrobutyricum)、产气柯林斯菌(Collinsella aerofaciens)、粪便柯林斯
菌(Collinsella stercoris)、规则粪球菌(Coprococcus eutactus)、停滞棒杆菌
(Corynebacterium stationis)、南半球脱硫弯曲孢菌(Desulfosporosinus meridiei)、脱硫弧菌D168(Desulfovibrio D168)、Dorea formicigenerans、迟缓埃格特菌(Eggerthella lenta)、油橄榄欧文氏菌(Erwinia oleae)、普氏栖粪杆菌(Faecalibacterium 
prausnitzii)、嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)、敏捷乳杆菌(Lactobacillus 
agilis)、干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)、德氏乳杆菌(Lactobacillus 
delbrueckii)、德氏乳杆菌保加利亚亚种(Lactobacillus  delbrueckii 
subsp.Bulgaricus)、格氏乳杆菌(Lactobacillus  gasseri)、副干酪乳杆菌
(Lactobacillus paracasei)、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)、植物乳杆菌(DSM 
264)(Lactobacillus plantarum(DSM 264))、罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)、鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)、瘤胃乳酸杆菌(Lactobacillus ruminis)、唾液
乳杆菌(Lactobacillus salivarius)、玉米乳杆菌(Lactobacillus zeae)、乳酸乳球菌
(Lactococcus lactis)、威氏李斯特氏菌(Listeria weihenstephanensis)、胶质类芽胞杆菌(Paenibacillus mucilaginosus)、狄氏副拟杆菌(Parabacteroides distasonis)、乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici)、戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)、消化链球菌(Peptostreptococcus anaerobius)、普雷沃氏菌(Prevotella copri)、产黑普雷沃氏菌(Prevotella melaninogenica)、粪普雷沃氏菌(Prevotella stercorea)、痤疮丙酸杆菌
(Propionibacterium acnes)、Pseudoramibacter eubacterium、粪罗斯氏菌(Roseburia 
faecis)、龋罗斯氏菌(Rothia dentocariosa)、胺胨罗斯氏菌(Rothia mucilaginosa)、布氏瘤胃球菌(Ruminococcus bromii)、伶俐瘤胃球菌(Ruminococcus callidus)、黄色瘤胃
球菌(Ruminococcus flavefaciens)、Ruminococcus lavefaciens、活泼瘤胃球菌
(Ruminococcus gnavus)、扭链瘤胃球菌(Ruminococcus torques)、Salinibacillus 
aidingensis、松鼠葡萄球菌(Staphylococcus sciuri)、咽峡炎链球菌(Streptococcus 
anginosus)、表兄链球菌(Streptococcus sobrinus)、嗜热链球菌(Streptococcus 
thermophilus)、Tissierella soehngenia、殊异韦荣球菌(Veillonella dispar)和小韦荣球菌(Veillonella parvula)。
[0057] 在某些实施方案中,下表1中列出的一种或多种细菌菌株包括在本发明的组合物或剂型中。
[0058] 表1
[0059] 干酪乳杆菌 乳双歧杆菌长双歧杆菌婴儿亚种 德氏乳杆菌乳亚种
动物双歧杆菌 乳酸片球菌
副干酪乳杆菌 植物乳杆菌(DSM 264)
唾液乳杆菌 植物乳杆菌
德氏乳杆菌保加利亚亚种 鼠李糖乳杆菌
短双歧杆菌 格氏乳杆菌
双裂双岐杆菌 乳酸乳球菌
戊糖片球菌 罗伊氏乳杆菌
嗜热链球菌 嗜酸乳杆菌
链状双歧杆菌柏氏亚种(DSM 21854) 长双歧杆菌
长双歧杆菌(DSM 20219) 假小链双歧杆菌(DSM 20438)
[0060] 在某些实施方案中,下表2中列出的一种或多种细菌菌株包括在本发明的组合物或剂型中。
[0061] 表2
[0062]干酪乳杆菌
长双歧杆菌婴儿亚种
副干酪乳杆菌
唾液乳杆菌
德氏乳杆菌保加利亚亚种
短双歧杆菌
[0063] 在某些实施方案中,所述组合物或剂型包括至少两种不同的菌株(例如,表1或表2中列出的菌株)或干酪乳杆菌、长双歧杆菌、副干酪乳杆菌、唾液乳杆菌、德氏乳杆菌和短双歧杆菌中的至少两种,所述菌株能够在被诊断患有神经系统疾病或表现出与神经系统疾病
相关的一种或多种症状的受试者的区域内复制。
[0064] 在某些实施方案中,包括在本发明的组合物或剂型中的非致病性细菌菌株可以包含干酪乳杆菌、长双歧杆菌、副干酪乳杆菌、唾液乳杆菌、德氏乳杆菌和短双歧杆菌中任意两种的组合。在某些实施方案中,包括在组合物或剂型中的非致病性细菌菌株可以包含干
酪乳杆菌、长双歧杆菌婴儿亚种和短双歧杆菌的组合。在某些实施方案中,包括在组合物或剂型中的非致病性细菌菌株可以包含干酪乳杆菌和短双歧杆菌的组合。
[0065] 在某些实施方案中,所述组合物或剂型包含非致病性细菌菌株,用于破坏被诊断患有神经系统疾病或表现出与神经系统疾病相关的一种或多种症状的受试者的胃肠道中
含有戴尔福特菌的生物膜。例如,胃肠道生物膜可以包括一种或多种戴尔福特菌菌种,所述戴尔福特菌菌种选自食酸戴尔福特菌、池生戴尔福特菌、对虾戴尔福特菌、沙漠戴尔福特菌和鹤羽田戴尔福特菌。
[0066] 在某些实施方案中,所述组合物或剂型包括非致病性细菌菌株,用于降低被诊断患有神经系统疾病或表现出与神经系统疾病相关的一种或多种症状的受试者的肠道中的
戴尔福特菌水平。
[0067] 在某些实施方案中,本发明的组合物或剂型包含约10亿至约400亿(例如约10亿至约50亿、约10亿至约100亿、约150亿至约400亿、约200亿至约400亿、约100亿至约300亿、约
150亿至约300亿、约200亿至约300亿)个菌落形成单位的非致病性细菌菌株。
[0068] (ii)酶
[0069] 本发明的组合物或剂型还包含能够破坏生物膜的酶。在一些实施方案中,所述酶优选消化或以其他方式破坏/分解生物膜的EPS基质。在一些实施方案中,所述酶分解被诊
断患有神经系统疾病或具有一种或多种与神经系统疾病相关症状的受试者中的纤维。
[0070] 所述酶可以选自淀粉酶、α‑半乳糖苷酶、纤维素酶、半纤维素酶、溶菌酶、果胶酶、脱氧核糖核酸酶I、塞拉提亚肽酶、舍雷肽酶、半纤维素酶/果胶酶复合物、β‑1,3‑葡聚糖酶、酸性蛋白酶、碱性蛋白酶、葡聚糖淀粉酶、内切葡聚糖酶、木聚糖酶、脂肪酶、溶菌酶、蛋白酶/肽酶复合物、二肽基肽酶IV(DPP‑IV)、壳聚糖酶、菠萝蛋白酶、木瓜蛋白酶、猕猴桃奇异果蛋白酶、植物源蛋白酶、植酸酶、消解酶和核酸酶。可以根据生物膜的类型和分布在其中的微生物来选择酶。例如,淀粉酶可用于降解或以其他方式破坏生物膜的水化合物组分,而核酸酶如脱氧核糖核酸酶I可用于消化或以其他形式破坏生物膜中的DNA。
[0071] 在某些实施方案中,所述组合物或剂型包含一种或多种(例如1种、2种、3种、4种、5种或更多种)不同的酶,所述酶选自淀粉酶、α‑半乳糖苷酶、纤维素酶、半纤维素酶、溶菌酶、果胶酶、脱氧核糖核酸酶I、塞拉提亚肽酶、舍雷肽酶、半纤维素酶/果胶酶复合物、β‑1,3‑葡聚糖酶、酸性蛋白酶、碱性蛋白酶、葡聚糖淀粉酶、内切葡聚糖酶、木聚糖酶、脂肪酶、溶菌酶、蛋白酶/肽酶复合物、二肽基肽酶IV(DPP‑IV)、壳聚糖酶、菠萝蛋白酶、木瓜蛋白酶、猕猴桃奇异果蛋白酶、植物源蛋白酶、植酸酶、消解酶和核酸酶。
[0072] 在某些实施方案中,上文所述的组合物或剂型包含淀粉酶和/或α‑半乳糖苷酶。在某些实施方案中,上文所述的组合物或剂型包含淀粉酶,其选自嗜热脂肪芽孢杆菌淀粉酶、解淀粉芽孢杆菌淀粉酶、枯草芽孢杆菌淀粉酶、地衣芽孢杆菌淀粉酶、黑曲霉淀粉酶和米曲霉淀粉酶。在某些实施方案中,上文所述的组合物或剂型包含淀粉酶和α‑半乳糖苷酶。
[0073] 在某些实施方案中,所述组合物或剂型包含淀粉酶,例如,约20至约5000SKB单位的淀粉酶、100至约5000SKB单位的淀粉酶、约200至约4000SKB单位的淀粉酶、约300至约
2000SKB单位的淀粉酶或约400至约1000SKB单位的淀粉酶。SKB或Sandstedt、Kneen和Blish单位是指每分钟催化1μmol底物的淀粉酶量。在某些实施方案中,组合物或剂型包含纤维
素,例如,每单位组合物或剂型包含约100至约300CU(纤维素酶单元)单位,例如约200CU。
[0074] 在某些实施方案中,所述组合物或剂型包含α‑半乳糖苷酶,例如约5至约200个半乳糖苷酶单位(GalU),例如约10至约20GalU、约20至约30GalU、约30至约40GalU、约40至约50GalU、约50至约60GalU、约60至约70GalU、约70至约80GalU、约80至约90GalU、约90至约
100GalU、约100至约110GalU、约110至约120GalU、约120至约130GalU、约130至约140GalU、约140至约150GalU、约150至约160GalU、约160至约170GalU、约170至约180GalU、约180至约
190GalU、约190至约200GalU的α‑半乳糖苷酶。
[0075] 在某些实施方案中,所述组合物或剂型包含约20至约5000SKB单位的淀粉酶(例如,100至约5000SKB单位的淀粉酶,约200至约4000SKB单位的淀粉酶,约300至约2000SKB单位的淀粉酶或约400至约1000SKB单位的淀粉酶),所述淀粉酶选自α‑淀粉酶、β‑淀粉酶和γ‑淀粉酶或其组合,α‑淀粉酶是一种催化淀粉中内部α‑1,4‑糖苷键水解以产生如葡萄糖和麦芽糖的产物的内水解酶,β‑淀粉酶是一种水解α‑1,4‑葡聚糖键以产生连续麦芽糖单位的外水解酶,γ‑淀粉酶除了切割最后的α‑1,4‑糖苷键,还切割α‑1,6‑糖苷键,以产生葡萄糖。
[0076] (iii)制造工艺
[0077] 在某些实施方案中,本发明的组合物可以根据以下工艺制造:非致病性细菌菌株(例如干酪乳杆菌、长双歧杆菌和短双歧杆菌)分别在小型发酵罐中培养。然后对于每个菌
株使用培养样品接种相应的大规模生产发酵罐。培养的细菌菌株通过过滤和/或离心收获,然后可以干燥,例如冷冻干燥或喷雾干燥。然后,干燥的生物体可以进行包衣,例如,用聚合物如羟丙基甲基纤维素(HPMC)喷雾包衣。包衣的菌株,例如HPMC包衣的菌株,然后可以进行进一步的干燥,例如低温干燥(例如室温)。冻干菌株的喷雾包衣是一个可选步骤。然后将得到的菌株(例如,包衣或未包衣的)以用于所制造的特定制剂的适当浓度共混在一起。为了
确保活性成分(例如细菌菌株)处于适当的浓度,还可以添加制造赋形剂。制造赋形剂(例
如,糖、多糖、糖醇或氨基酸)在本领域是众所周知的。可使用的示例性制造赋形剂是亮氨酸、麦芽糊精、甘露醇及其任何组合。在这个共混阶段,如果需要,可以添加制剂特有的其他成分(例如,干燥的淀粉酶或干燥的α‑半乳糖苷酶)。如果需要,可以将共混的组合物封装,然后将其包装到适当标记的容器中。示例性制造工艺如图3中所示。
[0078] (iv)制剂
[0079] 本文所述的组合物和剂型可用于破坏被诊断患有神经系统疾病或表现出与神经系统疾病相关的一种或多种症状的受试者体内多种区域(例如胃肠道)中存在的生物膜。组
合物或剂型可以配制用于多种递送系统,例如口服递送系统。
[0080] 在某些实施方案中,组合物或剂型包括粉末,例如涂覆粉末,其包含约1000万至约500亿个菌落形成单位(CFU)的分离的非致病性细菌菌株。在某些实施方案中,本发明的组
合物或剂型包含约1000万至约400亿、约1000万至约300亿、约1000万至约200亿、约1000万至约100亿、约1000万至约50亿、约1000万至约10亿、约1000万至约5亿、约1000万至约1亿、约1000万至约5000万个CFU的非致病性细菌菌株。在某些实施方案中,本发明的组合物或剂型包含约2000万至500亿、约5000万至500亿、约1亿至约500亿、约2亿至约50亿、约5亿至约
500亿、约10亿至约500亿、约50亿至约500亿、约100亿至约500亿、约200亿至约500亿、约300亿至约500亿、或约400亿至约500亿个CFU的非致病性细菌菌株。在某些实施方案中,所述组合物或剂型可进一步包含酶(例如淀粉酶、α‑半乳糖苷酶、纤维素酶、半纤维素酶、溶菌酶、果胶酶、脱氧核糖核酸酶I、塞拉提亚肽酶、舍雷肽酶、半纤维素酶/果胶酶复合物、β‑1,3‑葡聚糖酶、酸性蛋白酶、碱性蛋白酶、葡聚糖淀粉酶、内切葡聚糖酶、木聚糖酶、脂肪酶、溶菌酶、蛋白酶/肽酶复合物、二肽基肽酶IV(DPP‑IV)、壳聚糖酶、菠萝蛋白酶、木瓜蛋白酶、猕猴桃奇异果蛋白酶、植物源蛋白酶、植酸酶、消解酶和核酸酶)。
[0081] 在某些实施方案中,所述组合物或剂型包含约500亿、约400亿、约300亿、约200亿、约100亿、约10亿、约5亿、约1亿、约5000万或约1000万个CFU的非致病性细菌菌株。在某些实施方案中,一个胶囊包含约300亿个菌落形成单位的非致病性细菌菌株和酶。
[0082] (v)口服剂型
[0083] 在某些实施方案中,组合物或剂型可以由受试者口服。在某些实施方案中,所述组合物作为粉末或包含粉末的产品食用。在其他实施方案中,所述组合物可以是口服剂型的形式,例如,其中所述组合物包括在例如胶囊、口服液、丸剂、片剂、含片、粉剂、颗粒中,或作为水溶液或非水溶液液体中的溶液或悬浮液,或作为水包油或油包水液体乳剂,或作为酏
剂或糖浆,或作为锭剂,每个含有所需数量的菌落形成单位的非致病性细菌和非致病性真
菌以及任选的适量的酶。
[0084] 在某些实施方案中,所述组合物分布在胶囊或片剂中。在某些实施方案中,组合物配制成片剂。在某些实施方案中,胶囊是植物纤维素胶囊。在某些实施方案中,剂型,例如胶囊或片剂,用包衣进行涂覆,例如非功能性美学包衣或功能性包衣,例如控释包衣。胶囊或片剂可以配制成提供其中分布的成分的缓释或控释。
[0085] 在某些实施方案中,剂型包含组合物,所述组合物包含(i)能够破坏生物膜的酶和(ii)配制成粉末并包封在胶囊中的至少两种非致病性细菌菌株。
[0086] 在某些实施方案中,所述组合物或剂型包含添加剂,例如碳酸、木糖醇、鲸蜡醇、柠檬酸、天然香料、罗汉果。在某些实施方案中,所述组合物包含添加剂,例如仙人掌皮、木虱壳、番泻叶、亚麻籽、芦荟叶、甘草根、中链甘油三酯(MCT)油。在某些实施方案中,所述组合物或剂型包含添加剂,例如膳食纤维,例如菊粉(低聚果糖FOS)和苹果果胶。在某些实施方案中,所述组合物或剂型包含添加剂,例如螺旋藻、大麦草、苜蓿叶、小麦草、小球藻、掌状红皮藻、菠菜叶、西兰花、欧芹叶、羽衣甘蓝叶、紫锥菊根、甘草根、奶蓟籽、刺五加根(Siberian eleuthero root)、甜菜根、玫瑰果、巴西莓(水果)、绿茶叶、覆盆子叶、蓝莓(水果)、枸杞、越橘(水果)、南非醉茄根、红景天根、灵芝、玛卡根、蜂花粉、荨麻叶、杏(叶提取物)、蜂王浆(3倍浓缩)、葡萄籽的共混物。在某些实施方案中,所述组合物进一步包含维生素,例如维生素C。
[0087] (vi)包衣
[0088] 取决于输送方式或待处理的区域,本发明的组合物或剂型可制备为有机物的粉末共混物,其中粉末可用非功能性包衣(例如,美观包衣)或功能性包衣(例如,以例如时间和/或pH依赖性的方式调节有机物释放的控释包衣)进行包衣。类似地,所述组合物或剂型可以是含有有机物的粉末共混物的胶囊,其中所述胶囊用非功能性包衣(例如,美观包衣)或功
能性包衣(例如,以例如时间和/或pH依赖性的方式调节有机物释放的控释包衣)进行包衣。
在某些实施方案中,控释包衣是羟丙基甲基纤维素(HPMC)。
[0089] 控释包衣可促进本文公开的组合物或剂型中微生物的连续释放、逐渐释放、延长释放和/或程序释放(例如,pH依赖性释放)。
[0090] 示例性的控释包衣可选自乙酸琥珀酸酯、聚乙烯衍生物(例如,聚乙烯醇、聚乙酸乙烯酯、聚乙酸邻苯二甲酸乙烯酯、乙酸乙烯酯和乙烯基吡咯烷的共聚物、乙酸乙烯酯和巴豆酸的共聚物、聚乙烯吡咯烷酮)、聚环氧乙烷、聚丙烯酸、多糖(例如,改性淀粉、交联高直链淀粉、羟丙基淀粉、纤维素和纤维素衍生物(例如,微晶纤维素、羧甲基乙基纤维素、纤维素乙酸酯、甲基纤维素、甲基羟乙基纤维素、乙基纤维素、羟丙基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙甲基纤维素、纤维素邻苯二甲酸酯、醋酸纤维素、纤维素醋酸邻苯二甲酸酯、醋酸丙酸纤维素、醋酸琥珀酸纤维素、醋酸丁酸纤维素、醋酸偏苯三甲酸纤维素、乙基羟乙基纤维素、羧甲基纤维素或甲基羧甲基纤维素)、泊洛沙姆、聚维酮、褐藻酸、海藻酸钠、聚乙二醇、聚乙二醇海藻酸盐、树胶(例如黄原胶)、聚甲基丙烯酸酯(包括,例如甲基丙烯酸和甲基丙烯酸甲酯的共聚物,以及甲基丙烯酸和丙烯酸乙酯的共聚物)、甲基丙烯酸和丙烯酸乙酯的共聚物、聚甲基乙烯基醚和丙二酸酐的共聚物、聚甲基乙烯基醚与丙二酸或丙二酸乙酯、丙二酸异丙酯、丙二酸正丁酯的共聚物、玉米醇溶蛋白,以及上述的混合物。
[0091] 控释膜包衣聚合物的进一步实例包括但不限于乙基纤维素(例如)、甲基羟丙基纤维素(例如 )、丙烯酸聚合物、聚
乙酸乙烯酯、聚氯乙烯、乙酸羟丙基甲基纤维素琥珀酸酯(例如AQOAT)和聚乙酸邻苯二甲酸乙烯酯(例如SURETERIC)。
[0092] 在某些实施方案中,所述包衣可以是肠溶包衣。肠溶包衣可用于形成屏障,控制沿着胃肠道的活性成分释放和吸收的区域。肠溶包衣可以包括,例如,根据pH以不同速率崩解的聚合物。肠溶包衣可包括,例如,乙酸邻苯二甲酸纤维素、乙酸偏苯三甲酸纤维素、丙烯酸甲酯‑甲基丙烯酸共聚物、乙酸琥珀酸纤维素、羟甲基纤维素、邻苯二甲酸羟丙基甲基纤维素、甲基丙烯酸甲酯‑丙烯酸共聚物、丙烯酸乙酯‑甲基丙烯酸聚合物、C型甲基丙烯酸共聚物、聚乙酸邻苯二甲酸乙烯酯、乙酸邻苯二甲酸纤维素、聚乙酸邻苯二甲酸乙烯酯、羧甲基乙基纤维素、共聚甲基丙烯酸/甲基丙烯酸甲酯,诸如例如,商品名为 L12.5、L100或 S12.5、S100的已知的材料或用于获得肠溶包衣的类似化合物。也可以应
用水性胶体聚合物分散体或再分散体,例如 L 30D‑55、 L100‑55、
S100、 制剂4110D(Rohm Pharma); CPD 
30(FMC);KOLLICOAT 30D和30DP(巴斯夫); 30D(Eastman Chemical)。
[0093] 在某些实施方案中,肠溶包衣包括基于甲基丙烯酸、甲基丙烯酸酯/丙烯酸酯或其衍生物的阴离子、阳离子或中性共聚物。阳离子聚合物通常用于掩盖味道,并通过其在口腔(pH 5.8–7.4)中的低溶解度和在胃(pH 1–3.5)中的高溶解度实现活性成分的高生物利用
度。阴离子聚合物在碱性pH下比在酸性pH下具有更高的水溶解度,并且用于保护活性成分
免受胃中的酸降解和/或肠中的酶消化。
[0094] 在某些实施方案中,肠溶包衣包括丙烯酸乙酯‑甲基丙烯酸共聚物。市售肠溶包衣包括 AMB、丙烯酸乙酯‑甲基丙烯酸共聚物(如 )、甲基丙烯酸二甲基氨基乙酯‑甲基丙烯酸丁酯‑甲基丙烯酸甲酯共聚物(2:1:1)或聚(甲基丙烯酸‑co‑甲基丙烯酸甲酯)共聚物和聚(甲基丙烯酸‑co‑甲基丙烯酸甲酯)共聚物(如 )。在某些实
施方案中,肠溶包衣可占剂型(例如胶囊、片剂或丸粒)重量的约0.1%至约10%、约1%至约
10%、约5%至约20%、约8%至约15%、约8%至约18%、约10%至约12%或约12%至约
16%。
[0095] 在某些实施方案中,本发明的组合物或剂型制备为两种或多种分离的且存活的非致病性细菌菌株的粉末混合物,其可以是肠溶包衣的,或制备为含有粉末混合物的胶囊,其中胶囊是肠溶包衣的,用于递送到上肠。在某些实施方案中,将本发明的细菌和真菌菌株混合在共混物中以制备粉末组合物,然后用阳离子共聚物肠溶包衣该粉末组合物。例如,本发明的非致病性细菌和非致病性真菌菌株的粉末混合物可以用阳离子聚合物涂覆,所述阳离
子聚合物包括比例为2:1:1的甲基丙烯酸二甲氨基乙酯、甲基丙烯酸丁酯和甲基丙烯酸甲
酯( E 100);基于比例为2:1:1的甲基丙烯酸二甲氨基乙酯、甲基丙烯酸丁酯和
甲基丙烯酸甲酯的阳离子共聚物( EPO);基于比例为2:1:1的甲基丙烯酸二甲氨
基乙酯、甲基丙烯酸丁酯和甲基丙烯酸甲酯的阳离子共聚物( E 12,5);基于甲
基丙烯酸和丙烯酸乙酯的阴离子共聚物( L 100‑55 ),或其等效
物。
[0096] 在某些实施方案中,将本发明的细菌菌株混合在共混物中以制备粉末组合物,然后用阴离子共聚物肠溶包衣该粉末组合物。例如,本发明的细菌菌株的粉末共混物可以用
包含甲基丙烯酸和甲基丙烯酸甲酯的阴离子共聚物(例如, L 100、
S100、 L/S(25/75、50/50或75/25比例))或包含甲基丙烯酸与丙烯酸乙酯的阴离
子共聚物 L 100‑55 )涂覆(。用于在结肠中递送的包衣的附加但
非限制性实例包括 L 100‑55、 L 30D‑55、 HTP 20、
L 12,5、 FS100、 FS 30D和 T20。
[0097] 在某些实施方案中,将本发明的细菌菌株混合在共混物中以制备肠溶包衣的颗粒或丸粒。
[0098] 在某些实施方案中,本发明的细菌菌株的粉末共混物可以肠溶包衣,用于在整个胃肠道中进行时间控制递送以缓解胃肠道症状。例如,组合物或剂型可以用 RL 
100、 RL PO、 RL 30D、 RL 12,5、 RS100、
RS  PO、 RS  30D、 RS12,5、 NE  30D、
NE 40D和/或 NM 30D进行涂覆。
[0099] 一种生产口服剂型的示例性方法包括根据生长条件选择合适的待组合在剂型中的非致病性细菌菌株,在发酵罐中单独或组合生长生物体。产生了适当量的生物质之后,可以通过过滤和/或离心来收获细胞。如果一种或多种生物体是单独生长的,则可以将这些生物体以适当的量组合以得到适当的组合物或剂型,然后可以例如通过冷冻干燥或喷雾干燥
对其进行干燥。可替代地,收获之后,可以例如通过冷冻干燥或喷雾干燥来干燥生物体,然后可以将每种生物体的适当的干燥生物质以适当的量组合以得到适当的组合物或剂型。在
某些实施方案中,可以添加制造赋形剂(例如亮氨酸、麦芽糊精、甘露醇)以获得适当的浓
度。在某些实施方案中,干燥的生物质以粉末形式制备,并用功能性包衣,例如控释包衣(例如羟丙基甲基纤维素)进行涂覆。在某些实施方案中,将干燥的生物质制备成没有功能性包衣的粉末形式。酶可以在每一个前述步骤的一个或多个过程中添加到生物质中,例如,在生物质干燥之前或之后。在某些实施方案中,酶可以添加到制备为粉末的生物质中,例如,当需要包衣时,在对粉末生物质包衣之前或之后。然后可以将所得生物质(例如,包衣粉末)包装成胶囊并包装到容器中。
[0100] III.益生菌补充食品或营养组合物
[0101] 此外,本发明提供了可以在膳食组合物中与之组合(例如,与之组合或注入其中)的益生菌组合物。示例性膳食组合物可以包括但不限于:谷类产品、年糕、豆饼、食品棒产品、冷成型食品棒产品、奶油冻、酸奶、奶昔、蛋白奶昔、布丁、明胶、米浆、豆浆、果泥产品、糖果、糖块和苹果酱。
[0102] 在某些实施方案中,膳食益生菌组合物(例如,补充益生菌的食物或营养组合物)包含与(i)两种或多种(例如,2种、3种、4种、5种、6种或更多种)非致病性细菌菌株和(ii)至少一种酶组合或注入的食物或营养组合物(例如膳食补充物)。
[0103] 在某些实施方案中,包括在益生菌注入的组合物中的非致病性细菌可以包括干酪乳杆菌、长双歧杆菌、副干酪乳杆菌、唾液乳杆菌、德氏乳杆菌和短双歧杆菌。
[0104] 在某些实施方案中,包括在膳食益生菌组合物中的酶可以包括淀粉酶、α‑半乳糖苷酶、纤维素酶、半纤维素酶、溶菌酶、果胶酶、脱氧核糖核酸酶I、塞拉提亚肽酶或舍雷肽酶、半纤维素酶/果胶酶复合物、β‑1,3‑葡聚糖酶、酸性蛋白酶、碱性蛋白酶、葡聚糖淀粉酶、内切葡聚糖酶、木聚糖酶、脂肪酶、溶菌酶、蛋白酶/肽酶复合物、二肽基肽酶IV(DPP‑IV)、壳聚糖酶、菠萝蛋白酶、木瓜蛋白酶、猕猴桃奇异果蛋白酶、植物源蛋白酶和植酸酶。
[0105] 在一个特定实施方案中,所述膳食益生菌组合物包含益生菌组合物,所述益生菌组合物包含干酪乳杆菌、长双歧杆菌婴儿亚种和短双歧杆菌。在一个特定实施方案中,所述膳食益生菌组合物包含益生菌组合物,所述益生菌组合物包含干酪乳杆菌、长双歧杆菌婴
儿亚种和短双歧杆菌,以及淀粉酶。在一个特定实施方案中,所述膳食益生菌组合物包含益生菌组合物,所述益生菌组合物包含干酪乳杆菌、长双歧杆菌婴儿亚种和短双歧杆菌,以及α‑半乳糖苷酶。在一个特定实施方案中,所述膳食益生菌组合物包含益生菌组合物,所述益生菌组合物包含干酪乳杆菌、长双歧杆菌婴儿亚种和短双歧杆菌,淀粉酶和α‑半乳糖苷酶。
[0106] IV.饮料产品
[0107] 本发明还提供含有本文所述的本发明的任何益生菌组合物的饮料产品。示例性饮料产品可以包括但不限于:果汁、蛋白奶昔、蛋白奶沙、营养饮料和运动饮料。
[0108] 在某些实施方案中,饮料产品包含益生菌组合物,所述益生菌组合物包含两种或多种(例如,2种、3种、4种、5种或更多种)非致病性细菌菌株。在某些实施方案中,饮料产品包含益生菌组合物,所述益生菌组合物包含(i)两种或多种(例如,2种、3种、4种、5种或更多种)非致病性细菌菌株和(ii)酶。
[0109] 在某些实施方案中,包含在饮料产品中的益生菌组合物中包括的非致病性细菌可以包括干酪乳杆菌、长双歧杆菌、副干酪乳杆菌、唾液乳杆菌、德氏乳杆菌和短双歧杆菌。
[0110] 在某些实施方案中,包含在饮料产品中的益生菌组合物中包括的酶可以包括淀粉酶、α‑半乳糖苷酶、纤维素酶、半纤维素酶、溶菌酶、果胶酶、脱氧核糖核酸酶I、塞拉提亚肽酶或舍雷肽酶、半纤维素酶/果胶酶复合物、β‑1,3‑葡聚糖酶、酸性蛋白酶、碱性蛋白酶、葡聚糖淀粉酶、内切葡聚糖酶、木聚糖酶、脂肪酶、溶菌酶、蛋白酶/肽酶复合物、二肽基肽酶IV(DPP‑IV)、壳聚糖酶、菠萝蛋白酶、木瓜蛋白酶、猕猴桃奇异果蛋白酶、植物源蛋白酶和植酸酶。这样的酶特别适用于破坏生物膜,并且包含该酶的饮料产品适合具有致病性细菌和/或真菌的生物膜的受试者食用。
[0111] 在一个特定实施方案中,所述饮料产品包含益生菌组合物,所述益生菌组合物包含干酪乳杆菌、长双歧杆菌婴儿亚种和短双歧杆菌。在一个特定实施方案中,所述饮料产品包含益生菌组合物,所述益生菌组合物包含干酪乳杆菌、长双歧杆菌婴儿亚种和短双歧杆
菌以及淀粉酶。在一个特定实施方案中,所述饮料产品包含益生菌组合物,所述益生菌组合物包含干酪乳杆菌、长双歧杆菌婴儿亚种和短双歧杆菌以及α‑半乳糖苷酶。在一个特定实施方案中,所述饮料产品包含益生菌组合物,所述益生菌组合物包含干酪乳杆菌、长双歧杆菌婴儿亚种和短双歧杆菌、淀粉酶和α‑半乳糖苷酶。
[0112] V.剂量
[0113] 递送或食用的剂量大小将取决于受试者的大小和年龄、待治疗的适应症或状况以及组合物或剂型的递送方式等。在某些实施方案中,例如,口服组合物或剂型可包含约1mg至约2500mg或50mg至约2500mg的活性成分(例如非致病性细菌和/或酶)。在某些实施方案
中,组合物或剂型可以包含约1mg至约2400mg、约1mg至2000mg、约1mg至1800mg、约1mg至
1500mg、约1mg至1000mg、约1mg至500mg、约1mg至400mg、约1mg至300mg、约1mg至200mg、约
1mg至100mg、约1mg至500mg、约10mg至2500mg、约20mg至约2500mg、约30mg至约2500mg、约
40mg至约2500mg、约50mg至约2500mg、约100mg至约2500mg、约200mg至约2500mg、约300mg至约2500mg、约400mg至约2500mg、约500mg至约2500mg、约600mg至约2500mg、约700mg至约
2500mg、约800mg至约2500mg、或约900mg至约2500mg、约1000mg至约2500mg、约1200mg至约
2500mg、约1500mg至约2500mg、约2000mg至约2500mg、约2200mg至约2500mg、约2400mg至约
2500mg的活性成分(例如,非致病性细菌和/或酶)。
[0114] 在某些实施方案中,组合物或剂型可以包含约100mg至约200mg、约200mg至约300mg、约300mg至约400mg、约400mg至约500mg、约500mg至约600mg、约600mg至约700mg、约
700mg至约800mg、约800mg至约900mg、或约900mg至约1000mg、或约1000mg至约1100mg、或约
1100mg至约1200mg、或约1200mg至约1300mg、或约1300mg至约1400mg、或约1400mg至约
1500mg、或约1500mg至约1600mg、或约1600mg至约1700mg、或约1700mg至约1800mg、或约
1800mg至约1900mg、或约1900mg至约2000mg、或约2000mg至约2100mg、或约2100mg至约
2200mg、或约2200mg至约2300mg、或约2300mg至约2400mg、或约2400mg至约2500mg的活性成分。在某些实施方案中,组合物或剂型可以包含约700mg的活性成分。
[0115] 在某些实施方案中,组合物或剂型包含约500、400、300或200亿个菌落形成单位的非致病性细菌菌株。在某些实施方案中,组合物或剂型包含约300亿个菌落形成单位的非致病性细菌菌株。
[0116] 在某些实施方案中,本发明的组合物或剂型包含约100亿至约400亿(例如约150亿至约400亿、约200亿至约400亿、约100亿至约300亿、约150亿至约300亿、约200亿至约300亿)个菌落形成单位的非致病性细菌菌株。
[0117] 在治疗期间,组合物或剂型(一个或多个单位(例如2、3、4或5个单位,例如胶囊或片剂)可以每天给药一次、两次或三次,例如,直到关注的生物膜被破坏、阻止形成、受试者的胃肠道症状得到改善和/或受试者正常的微生物组得到恢复,这可能需要例如一周、两周、一个月、两个月或三个月和一年。在某些实施方案中,一种胶囊,例如一种肠溶包衣胶囊,其包含约300亿个菌落形成单位的非致病性细菌菌株和酶,在治疗期间每天给药一次、两次或三次,例如,直到关注的生物膜被破坏和/或受试者的正常微生物组被恢复,这可能需要例如一周、两周、一个月、两个月或三个月和一年。
[0118] VI.神经系统疾病
[0119] 本公开的组合物或剂型可用于缓解被诊断患有神经系统疾病或具有与神经系统疾病相关的一种或多种症状的受试者中的胃肠道症状。
[0120] 阿尔茨海默病
[0121] 肠道微生物群包括复杂的微生物种类的群落,存在于我们的胃肠道生态系统中,其变化不仅影响各种肠道疾病,还影响中枢神经系统疾病,如阿尔茨海默病(AD)。阿尔茨海默病是最常见的痴呆形式,是一种与认知受损和大脑淀粉样蛋白‑β肽(Aβ)积累有关的神经退行性疾病。最值得注意的是,微生物群‑肠道‑脑轴是一个双向通信系统,其尚未被完全理解,但包括神经、免疫、内分泌和代谢途径。对无菌动物和暴露于致病性微生物感染、抗生素、益生菌或粪便微生物群移植的动物的研究表明,肠道微生物群在宿主认知或AD相关发
病机制中发挥作用。微生物群失调引起的肠道和血脑屏障通透性增加可能介导或影响AD的
发病机制。(参见Jiang C,Li G,Huang P,Liu Z,Zhao B.The Gut Microbiota and 
Alzheimer's Disease.J Alzheimers Dis.2017;58(1):1‑15)。在某些实施方案中,本公开的组合物或剂型缓解被诊断为患有阿尔茨海默病的受试者中的一种或多种胃肠道症状。在
某些实施方案中,胃肠道症状包含腹痛、腹泻、不规律、腹胀、便秘和炎症。
[0122] 孤独症谱系障碍(ASD)
[0123] 孤独症谱系障碍(ASD)是一系列以社交和沟通缺陷为特征的心理状况。症状还包括童年早期出现的重复行为,通常在3岁之前,通常伴有认知功能异常。CDC,MMWR,58(SS10:
1‑20(2009))和American Psychiatric Association,Diagnostic and Statistical 
Manual of Mental Disorders(4th ed),Washington,D.C.(1994)。在美国,孤独症的患病
率约为每110个新生儿中就有1个(每70个男孩中就有一个)。CDC,MMWR,58(SS10:1‑20
(2009)。ASD包括一系列行为定义的病症。ASD的形式包括自闭症、阿斯伯格综合症、海勒综合症、雷特综合症和形式不明的广泛性发育障碍。阿斯伯格综合症在症状和病因上最接近
孤独症。雷特综合症和和童年瓦解性障碍的症状与孤独症相似,但它们的病因可能无关。
Volkmar等人,J.Child Psychol.Psychiatry,50:108‑15(2009)。
[0124] 阿斯伯格综合症是一种孤独症谱系障碍,其特征是社交活动中存在显著困难,以及行为和兴趣的受限和重复模式。它与其他孤独症谱系障碍的不同之处在于它相对保留了
语言和认知发展。
[0125] 海勒综合症或童年瓦解性障碍是一种罕见的疾病,其特征是语言、社会功能和运动技能发育迟缓的晚发(>3岁)。CDD与孤独症有一些相似之处,有时被认为是孤独症的一种功能低下的形式,但在技能退化或一系列技能退化之前,通常会出现一段明显的相当正常
的发育期。
[0126] 雷特综合症是一种大脑灰质的遗传性神经发育障碍,几乎只影响女孩。它有许多孤独症的共同特征。临床特征包括手脚小和头部生长速度减慢(包括一些小头畸形)。还注
意到重复的手部动作,如绞扭双手和/或反复把手伸进嘴里。胃肠道疾病在雷特综合症患者中非常普遍。
[0127] 形式不明的广泛性发育障碍也称为“未另行指定的广泛性发展障碍”(PDD‑NOS)是一种广泛性发育障碍(PDD)/孤独症谱系障碍(ASD),其中患者具有孤独症谱系上的一些障碍特征,但不符合任何其他孤独症障碍上的诊断标准。虽然PDD‑NOS与典型的孤独症有相似之处,但它往往更温和。这些患者社交困难,表现出重复行为,对某些刺激过于敏感。在他们与他人的互动中,他们可能很难保持眼神交流,看起来没有情绪,或者看起来无法说话。他们也可能难以从一种行为过渡到另一种行为。
[0128] 注意缺陷障碍(ADD)
[0129] 注意缺陷多动障碍(ADHD)是一种注意力不集中和/或多动‑冲动程度不适当的慢性疾病,其干扰社会功能、学术功能或职业功能的质量。ADHD是儿童时期最常见的神经精神障碍之一,大多数病例持续到成年。据估计,全世界18‑44岁年龄组的ADHD患病率为
3.4%。许多研究表明,患有ADHD的儿童腹胀、腹痛、超重和食物过敏的发生率较高。(参见Kaplan BJ等人,J Dev Behav Pediatr.1987;8:305–310,Hubel等人,Eat Weight 
Disord.,2006;11:139–146,Waring ME等人,Pediatrics.2008;122:e1–e6,Jameson ND等人,J Child Neurol.2016;31:1282–1289)。
[0130] 阅读障碍
[0131] 阅读障碍是一种可能有遗传基础的神经发育障碍,通常认为受影响的男孩多于女孩(尽管参考样本中的性别比例更高)。阅读障碍的核心特征是单词解码问题,这反过来又
影响拼写表现和阅读流利性的发展。阅读障碍在一生中持续存在,成人的结果是可变的;尽管一些患有阅读障碍的年轻人继续接受大学教育,但其他人离开学校时只获得最低学历。
大多数患有阅读障碍的成年人抱怨阅读缓慢、拼写问题和书面表达困难。此外,工作记忆、注意力和组织方面的问题也经常被报道。(参见Snowling MJ.,J Res Spec Educ Needs,
2013;13(1):7‑14)。
[0132] 帕金森病
[0133] 帕金森病是一种神经退行性疾病,与黑质中的神经元缺失有关,黑质中的神经元缺失导致纹状体多巴胺缺乏和含有α‑突触核蛋白聚集体的细胞内内含物。帕金森病与许多非运动症状有关,包括增加整体残疾的胃肠道症状。
[0134] VII.缓解胃肠道症状的方法
[0135] 本公开提供了缓解被诊断患有神经系统疾病或具有与神经系统疾病相关的一种或多种症状的受试者中的胃肠道症状的方法,所述方法包括让受试者食用或向受试者施用
本文公开的组合物,从而缓解受试者中的一个或多个胃肠道症状。
[0136] 该方法包括向受试者施用一个或多个单位(例如胶囊、粉末、片剂或膳食组合物)的本文所述组合物或剂型,从而缓解胃肠道症状。在某些实施方案中,受试者可以是哺乳动物(如人、伴生动物(如狗、猫或兔)或家畜(如绵羊、猪、山羊、、驴、骡、水牛、黄牛或骆驼))。
[0137] 在某些实施方案中,向被诊断出患有神经系统疾病或表现出一种或多种神经系统疾病相关症状的受试者施用组合物或剂型,缓解所述受试者中的一种或多种胃肠道症状。
胃肠道症状可以包括恶心、腹痛、腹胀、便秘、腹泻、不规律、炎症、功能性肠病、肠易激综合征、克罗恩病、溃疡、胃灼热、不规律、胃神经官能症、憩室、肝硬化、脂泻病、急性胃炎、消化不良、胃痛、胃癌、胃眩晕、小肠炎、消化性溃疡、霍乱病、婴儿霍乱、肠胃炎、胀气、炎症性肠病、酸反流病和溃疡性结肠炎。
[0138] 在某些实施方案中,缓解被诊断患有神经系统疾病或表现出一种或多种与神经系统疾病有关的症状的受试者中的胃肠道症状,包括让受试者食用或向受试者施用益生菌组
合物,其包含两种或多种(例如2种、3种、4种、5种或更多种)非致病性细菌菌株。在某些实施方案中,该方法包括让受试者食用或向受试者施用益生菌组合物,其包含(i)两种或多种
(例如2种、3种、4种、5种或更多种)非致病性细菌菌株,以及(ii)酶。在某些实施方案中,该方法包括让受试者食用或向受试者施用益生菌组合物,其包含(i)两种或多种(如2种、3种、
4种、5种或更多种)非致病性细菌菌株,以及(ii)两种酶。
[0139] 在某些实施方案中,组合物包含(i)一种或多种(如1种、2种、3种、4种、5种或更多种)酶和(ii)两种或多种(如2种、3种、4种、5种或更多种)非致病性细菌菌株。在某些实施方案中,所述酶能够破坏包含致病性细菌和/或致病性真菌的生物膜。在某些实施方案中,所述酶分解受试者体内的纤维。在某些实施方案中,非致病性细菌菌株能够破坏包含致病性细菌和/或致病性真菌的生物膜。在某些实施方案中,非致病性细菌菌株分解受试者体内的纤维。
[0140] VIII.改善肠道生理机能的方法
[0141] 本公开提供了改善被诊断患有神经系统疾病或表现出一种或多种与神经系统疾病相关症状的受试者中的肠道生理机能的方法,该方法包括让受试者食用或向受试者施用
本文公开的组合物,从而改善受试者中的肠道生理机能。
[0142] 根据情况,组合物或剂型中的非致病性细菌菌株能够:(i)替换生物膜中的致病性细菌,(ii)干扰致病性细菌/真菌对生物膜底层的附着,(iii)从生物膜中存在的细胞外聚
合物基质替换致病性细菌/真菌,(iv)防止致病性真菌在生物膜中的丝状化,(v)上述方法
的任意组合,(vi)抑制致病性细菌和真菌的毒性因素(例如,发芽、附着等)。
[0143] 在某些情况下,向受试者施用组合物或剂型维持受试者肠道微生物组(包括受试者的真菌生物组和/或细菌组)的总体平衡,而不会引起有害的消化菌斑,从而支持受试者
的最佳消化健康。
[0144] 在某些实施方案中,改善被诊断患有神经系统疾病或表现出一种或多种神经系统疾病相关症状的受试者中的肠道生理机能,包括让受试者食用或向受试者施用益生菌组合
物,其包含两种或多种(如3种、4种、5种或更多种)非致病性细菌菌株。在某些实施方案中,该方法包括让受试者食用或向受试者施用益生菌组合物,其包含(i)两种或多种(例如3种、
4种、5种或更多种)非致病性细菌菌株,以及(ii)酶。在某些实施方案中,该方法包括让受试者食用或向受试者施用益生菌组合物,其包含(i)两种或多种(如3种、4种、5种或更多种)非致病性细菌菌株,以及(ii)两种酶。
[0145] IX.降低致病性细菌水平的方法
[0146] 本公开提供了减少被诊断患有神经系统疾病或表现出一种或多种与神经系统疾病相关症状的受试者肠道中戴尔福特菌的量的方法,该方法包括让受试者食用或向受试者
施用本文公开的组合物,从而减少受试者体内戴尔福特菌的量。
[0147] 在某些实施方案中,本文所述的组合物或剂型可用于降低受试者GI道中一种或多种戴尔福特菌细菌菌种的水平,戴尔福特菌细菌菌种包括但不限于食酸戴尔福特菌、池生
戴尔福特菌、对虾戴尔福特菌、沙漠戴尔福特菌和鹤羽田戴尔福特菌。与健康受试者相比,被诊断出患有神经系统疾病或表现出一种或多种相关症状的受试者有大量的戴尔福特菌。
可通过测量从受试者获取的生物样本(如粪便样本)中戴尔福特菌的增加的检出率来确定
受试者GI道中戴尔福特菌菌种的丰度。
[0148] 在某些实施方案中,与健康受试者相比,本文所述的组合物或剂型可用于降低被诊断患有神经系统疾病或表现出一种或多种与神经系统疾病相关症状的受试者体内的戴
尔福特菌水平。
[0149] 在某些实施方案中,减少被诊断出患有神经系统疾病或表现出一种或多种与神经系统疾病相关症状的受试者肠道中的戴尔福特菌的量包括让受试者食用或向受试者施用
益生菌组合物,其包含两种或多种(例如2种、3种、4种、5种或更多种)非致病性细菌菌株。在某些实施方案中,该方法包括让受试者食用或向受试者施用益生菌组合物,其包含(i)两种或多种(例如2种、3种、4种、5种或更多种)非致病性细菌菌株,以及(ii)酶。在某些实施方案中,该方法包括让受试者食用或向受试者施用益生菌组合物,其包含:(i)两种或多种(如2种、3种、4种、5种或更多种)非致病性细菌菌株,和(ii)两种酶。
[0150] 在某些实施方案中,施用本文所述的组合物或剂型可使戴尔福特菌的量减少5%(例如,至少减少10%、20%、30%、50%、75%、90%、95%或更多)。
[0151] 多达50%的健康受试者中未检测到戴尔福特菌,但检测到时,该值范围在0.001到0.017个操作分类单位(OTU)之间。
[0152] X.破坏生物膜的方法
[0153] 本公开提供了破坏被诊断患有神经系统疾病或表现出一种或多种与神经系统疾病相关症状的受试者胃肠道中生物膜的方法,该方法包括让受试者服用或向受试者施用本
文公开的组合物,从而破坏受试者胃肠道中的生物膜。
[0154] 在某些实施方案中,本文所述的组合物或剂型可用于破坏生物膜,其中,例如,与健康受试者相比时,在被诊断患有神经系统疾病或表现出一种或多种与神经系统疾病相关症状的GI道内的生物膜中,细菌种类(例如戴尔福特菌)的丰度显著增加。
[0155] 在某些实施方案中,破坏受试者体内的生物膜包括让受试者食用或向受试者施用益生菌组合物,其包含两种或多种(例如2种、3种、4种、5种或更多种)非致病性细菌菌株。在某些实施方案中,该方法包括让受试者食用或向受试者施用益生菌组合物,其包含(i)两种或多种(例如2种、3种、4种、5种或更多种)非致病性细菌菌株,以及(ii)酶。在某些实施方案中,该方法包括让受试者食用或向受试者施用益生菌组合物,其包含(i)两种或多种(如2
种、3种、4种、5种或更多种)非致病性细菌菌株,以及(ii)两种酶。
[0156] XI.预测发展为孤独症的易感性的方法
[0157] 许多研究假设孤独症谱系障碍(ASD)中的肠道‑脑轴之间存在联系(Reichelt KL等人,2009,Ann Clin Psychiatry,21:205‑211;de Theije CG等人,2011,Eur J 
Pharmacol 668Suppl 1:S70‑80;Mayer等人,2014,Bioessays,36:933‑939;Buie T,2015,Clin Ther,37:976‑983;Kraneveld等人,2016,Int Rev Neurobiol,131:263‑287;Luna RA等人,2016,Curr Dev Disord Rep,3:75‑81;Estes ML等人,2017,Immunity,47:816‑819;
Vasquez A,2017,Ann N Y Acad Sci,1408:5‑6;Vuong HE and Hsiao EY,2017,Biol 
Psychiatry,81:411‑423;Fowlie G等人,2018,Int J Mol Sci 19;Hicks等人,2018,
Autism Res,11:1286‑1299.,2018;Israelyan and Margolis,2018,Pharmacol Res,132:
1‑6;Sharon G等人,2019,Cell,177:1600‑1618e1617)。虽然这些研究已经在细菌组水平上对此进行了研究,但围绕真菌(mycobiome,真菌微生物组)联系的知识还存在很大差距。
[0158] 本公开提供了一种预测受试者发展为孤独症的易感性的方法。受试者中发展为孤独症的易感性基于肠道微生物组。所述方法包括:(a)量化从测试受试者获取的组织或体液样本中存在的至少一种致病性细菌菌株的生物体的数量或密度和/或丰度;及(b)将所述样
品中定量的生物体的数量或密度与阈值进行比较,其中所述阈值为通常存在于健康受试者
中的相应生物体的数量或密度。在某些实施方案中,致病性细菌菌株包含来自戴尔福特菌
和蓝细菌(Cyanobacteria)的菌株。在某些实施方案中,如果测试受试者中来自蓝细菌的细菌菌株的密度小于健康受试者的密度,则测试受试者易发展为孤独症。在某些实施方案中,如果来自戴尔福特菌的细菌菌株在测试受试者中的密度大于健康受试者的密度,则测试受
试者容易发展为孤独症。
[0159] XII.定义
[0160] 为便于理解本主题和构建所附专利权利要求,包括以下定义。
[0161] 在整个说明书中,当组合物被描述为具有、包括或由特定成分组成时,或者当工艺和方法被描述为具有、包括或由特定步骤组成时,可以认为,额外地,本发明的组合物基本上由所列举的成分组成,或者由所列举的成分组成,而且根据本发明的工艺和方法基本上由所列举的加工步骤组成,或者由所列举的加工步骤组成。
[0162] 在本申请中,如果说某个元素或元件包括在所列举的元素或元件列表中和/或从中选出,则应理解为该元素或元件可以是所列举的元素或元件中的任何一个,或者该元素
或元件可以从由两个或多个所列举的元素或元件组成的组中选出。
[0163] 此外,应该理解的是,本文所述组合物或方法的要素和/或特征可以以各种方式组合,而不脱离本发明的精神和范围,无论在本文中是明确的还是隐含的。例如,在提及特定组合物时,该组合物可用于本发明这些组合物的各种实施方案和/或本发明方法中,除非根据上下文另有理解。换句话说,在本申请中,对实施方案的描述和描绘是以能够编写和绘制出清晰简明的申请书的方式进行的,但是本申请的意图是并将被理解为,在不脱离本教导
和发明的情况下,可以对实施方案进行各种组合或分离。例如,可以理解的是,本文所描述和描绘的所有特征均可适用于本文所描述和描绘的本发明的所有方面。
[0164] 应该理解的是,除非根据上下文和用途另有理解,否则“至少一个”的表述单独地包括表述后的每一个所陈述的对象,以及两个或多个所陈述对象的各种组合。除非根据上下文另有理解,否则“和/或”的表述在与三个或三个以上所述对象相结合时应理解为具有相同的含义。
[0165] 术语“包括”、“包含”、“含有”、“有”、“存在”、“具有”、“含”、“涵盖”或“囊括”的使用,包括其语法上的等价物,应一般理解为开放式的和非限制性的,例如,不排除额外的未列举的要素或步骤,除非另有明确说明或根据上下文理解。
[0166] 在定量值之前使用术语“约”时,除非另有特别说明,否则本发明也包括具体的定量值本身。在本文中使用的术语“约”是指与标称值的±10%的变化,除非另有说明或推断。
[0167] 应该理解的是,只要本发明仍可操作,步骤的顺序或执行某些操作的顺序并不重要。此外,两个或多个的步骤或操作可以同时进行。
[0168] 在本说明书的不同地方,其组件或特征是以组或范围的形式公开的。具体的意图是,说明包括这些组和范围成员的每一个单独的子组合。通过其他示例,1至20范围内的整数特指单独公开1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19和20。
[0169] 本文中使用的任何及所有示例或示例性语言,例如“例如”或“包括”,只是为了更好地说明本发明,并不构成对本发明范围的限制,除非本发明已提出要求。说明书中的任何语言都不应被解释为表明任何未要求的要素对于本发明的实践是必不可少的。
[0170] 一般来说,除非另有说明,标明百分比的组合物都是按重量计算的。
[0171] 本文使用的术语“受试者”、“患者”、“需要其的受试者”和“需要其的患者”在本文中可以互换使用,是指表现出一种或多种与神经系统疾病相关症状的活的生物体,包括动物和人类,可以通过本文提供的方法和组合物进行治疗。受试者可以是人类或非人类动物。
[0172] 从上述示例中可以更充分地理解本发明的实践,本文中存在这些示例仅用于说明目的,不应被解释为以任何方式限制本发明。
[0173] 实施例
[0174] 以下实施例仅用于说明,无意以任何方式限制本发明的范围或内容。
[0175] 实施例1‑患有孤独症的受试者中肠道微生物组的特征
[0176] 在本实施例中,使用逻辑模型对基于肠道微生物组预测孤独症的能力进行了测试。
[0177] 为了更深入地了解肠道微生物组在孤独症中的作用,研究人员对从患有孤独症的儿童及其非孤独症兄弟姐妹(n=76名受试者)获得的粪便样本进行了细菌生物组和真菌生
物组的rRNA测序。这两组将描述ASD和非ASD个体中的细菌和真菌微生物群落
[0178] 统计方法
[0179] 使用单变量逻辑回归模型初步估算了微生物组数据(细菌和真菌在门、属和种的水平下)和调查数据(人口统计学、饮食、生活方式)对预测孤独症的影响。(参见McCullagh P,Nelder JA;1998;Monographs on statistics and applied probability 37.Boca 
Roton:Chapman and Hall CRC)McCullagh and Nelder,1998)。调查的人口统计学和个人
数据与微生物组数据之间的关联采用T检验进行两组比较;两个连续测量值的皮尔逊相关
系数和两个分类变量的关联采用卡方检验来考核。在数据降维、微生物组特征选择和最终
模型构建过程中,采用了带有LASSO(最小绝对收缩和选择算子)正则化的逻辑回归模型
(Lim M,Hastie T,2015,J Comput Graph Stat;24:627‑654)。
[0180] 采用不同的方法进行LASSO正则化。模型1‑‑单独微生物组(门、属、种):这种方法用于对基于单变量分析选出的可预测孤独症的重要细菌和真菌(门、属、种)进行正则化;模型2‑‑单独调查数据:这种方法用于对基于单变量分析选出的可预测孤独症的重要人口统计学和饮食因素进行正则化;模型3‑‑微生物组(门、属、种)和调查:这种方法用于对基于单变量分析选出的可预测孤独症的重要的细菌、真菌(门、属、种)、人口统计学和饮食因素进行正则化;模型4‑‑微生物组(所有级别)和调查:这种方法用于对基于单变量分析选出的可预测的重要的细菌、真菌(所有分类级别)、人口统计学和饮食因素进行正则化。所有检验均为双侧检验,P‑值≤0.05被认为是统计学上显著的。
[0181] 发现队列的人口统计学数据在表3中示出。临床数据调查结果也包括在内。
[0182] 表3
[0183]
[0184]
[0185] 表4描述了使用逻辑回归对微生物组数据进行单变量分析的结果,并显示了相关的P‑值。
[0186] 表4
[0187]
[0188]
[0189] 表5列出了对调查数据进行单变量分析后得出的各因素的几率比例和p‑值。如表5所示,性别和上消化道障碍与孤独症有统计学关联。
[0190] 表5
[0191] 因素 优势比 P‑值5性别(男VS女) 8.38 <0.001
上胃肠道紊乱(是VS否) 4.94 0.05
[0192] 为了检验预测孤独症的能力,进行了几次LASSO逻辑模型分析以确定在单变量分析中具有重要意义的重要细菌和真菌。基于LASSO逻辑模型,确定的细菌有:蓝细菌门(p_
Cyanobacteria)、变黑普雷沃菌种(s_Prevotella  nigrescens)、厌氧菌属(g_
Anaerostipes)、拟杆菌属(g_Bacteroides)、规则粪球菌种(s_Coprococcus eutactus)、纤毛菌属(g_Leptothrix)、希瓦氏菌属(g_Shewanella)和固氮螺菌属(g_Azospirillum)。
[0193] 而通过单变量分析确定的重要真菌包括:半乳糖霉菌种(s_Galactomyces_geotrichum)、壶菌门(p_Chytridiomycota)、地霉菌属(g_Geotrichum)和绿僵菌属(g_
Metarhizium)。
[0194] 在单变量分析中,使用LASSO逻辑回归法选出的可预测孤独症的重要人口统计学和饮食因素包括鱼类摄入量、性别和上GI道功能紊乱。
[0195] 利用LASSO逻辑模型选择的细菌生物组(门、属、种)和真菌生物组中的重要因素与调查数据的结合确定了以下细菌:蓝细菌门、变黑普雷沃菌种、厌氧菌属、拟杆菌属、纤毛菌属、希瓦氏菌属、戴尔福特菌属和固氮螺菌属。
[0196] 利用LASSO逻辑模型选择的细菌生物组(门、属、种)和真菌生物组中的重要因素与调查数据的结合确定了以下真菌:绿僵菌属。而鱼类摄入量、性别和上胃肠道紊乱则与孤独症有显著关联。有趣的是,绿僵菌曾被用作生物杀虫剂,因此这种真菌的确定可能是食物食用的结果。最后,利用LASSO逻辑模型确定了微生物组特征、人口统计学特征、饮食特征和临床特征的综合模型,其生成了图1所示的诊断图。
[0197] 对每个建议模型的性能(一致性指数(C‑指数))进行了评估。表6比较了根据不同策略建立的四个建议模型(模型1、模型2、模型3和模型4)的C‑指数值。如表6中所示,虽然每个模型的C‑指数都相对高,但模型3是最稳健的模型,因此被用于进一步测试。
[0198] 表6
[0199]
[0200] 多变量逻辑模型分析了不同因素来了解是什么影响了孤独症,通过剔除无关因素(即,其集中分析)使分析更加有力。使用模型3进行多变量逻辑建模的结果如表7所示。
[0201] 表7
[0202]
[0203] 控制了其他因素(性别和上胃肠道紊乱病史)的影响,蓝细菌门每增加0.01%,患孤独症的几率就会降低约24%(p=0.013)。类似地,戴尔福特菌属每增加0.01%,患孤独症的几率就会增加9.99倍(p=0.025)。另外一个菌属(固氮螺菌属)达到了统计学意义上显著
的P值(P=0.026),因此,固氮螺菌属每增加0.01%,患孤独症的几率就会降低约81%。
[0204] 如图2中所示,接受者操作特征曲线(ROC)分析表明,最终模型(模型3)具有非常好的诊断性能,C‑指数为0.983,在以上限定的风险评分的截止值为0.6447时,孤独症诊断的灵敏度和特异度分别为91%和100%。
[0205] 发现,孤独症患者体内蓝细菌门(一种在纤维分解中发挥重要作用的细菌)的丰度低(p=0.013),而戴尔福特菌属(一种已知的生物膜生产者)的丰度增加(p=0.025)(Rema 
T,等人,2014,Antimicrob Agents Chemother,58:5673‑5686),从而提出了这样的假设:确定能够分解纤维并抑制戴尔福特菌形成生物膜的能力的益生菌株,将缓解孤独症患者遇到
的胃肠道问题,提高他们对富含纤维饮食的耐受性,从而提高孤独症患者的生活质量
[0206] 实施例2‑确定具有分解纤维能力的益生菌菌株
[0207] 本实施例提供了一种方法,用于确定能够分解纤维并能够调节患有神经系统疾病如孤独症的受试者的微生物组的益生菌菌株。
[0208] 本研究中测试了许多非致病性细菌和真菌菌株。表8列出了测试的不同细菌和真菌菌株。
[0209] 表8
[0210]动物双歧杆菌(BSF) 副干酪乳杆菌(BSF)
双裂双岐杆菌(BSF) 植物乳杆菌(BSF)
短双歧杆菌(BIOHM) 罗伊氏乳杆菌(BSF)
乳双歧杆菌(BSF) 鼠李糖乳杆菌(BIOHM)lot 200224LR
长双歧杆菌婴儿亚种(BSF) 鼠李糖乳杆菌(BIOHM)lot 200227LR
长双歧杆菌(BSF) 唾液乳杆菌(BSF)
嗜酸乳杆菌(BIOHM) 乳酸乳球菌(BSF)
干酪乳杆菌(BSF) 乳酸片球菌(BSF)
德氏乳杆菌保加利亚亚种(BSF) 戊糖片球菌(BSF)
德氏乳杆菌乳亚种(BSF) 布拉酵母菌(BIOHM)
格氏乳杆菌(BSF) 嗜热链球菌(BSF)
[0211] 纤维发酵测定
[0212] 为了测试微生物菌株分解纤维的能力,使用了纤维发酵测定。
[0213] 培养基:使用两种不同的生长培养基来评估微生物菌株分解纤维的能力:GAM肉汤培养基(Gifu厌氧培养基)和不含碳水化合物的Remel Andrade肉汤培养基基础对照(Remel 
R060102)。
[0214] 测试纤维:本研究中使用了四种不同配方的Andrade肉汤培养基作为测试纤维:(1)1%的来自菊苣的菊粉(Sigma‑I2255)‑‑在不含碳水化合物的Andrade基础肉汤培养基中重组1%菊粉(w/v);(2)1%龙舌兰菊粉(Nuts.com‑p73756952)‑‑在不含碳水化合物的Andrade基础肉汤培养基中重组1%的龙舌兰菊粉(w/v);(3)1%的果寡糖(FOS)‑‑Orafti TM
95 (Beneo)‑‑在不含碳水化合物的Andrade基础肉汤培养基中重组1%的果寡糖(w/v);以及(4)对照组‑‑不含碳水化合物的Andrade基础肉汤培养基。
[0215] 细菌生长:所有分离物均在37℃、使用AMG气体(5% CO2、5% H2和90%氮气)的厌氧环境中使用GAM生长96小时。
[0216] 纤维代谢试验:在不含碳水化合物的Andrade基础肉汤培养基中将分离物稀释至16
×10个细胞/mL,然后用25μL接种测试纤维溶液。
[0217] 评估菌株分解市售普通纤维的能力:通过目测对每种可发酵纤维进行独立评分,分数总和报告为益生菌纤维分解分数(PFBS),其中最大的总和相当于菌株在作为唯一碳源
检测时发酵1%菊粉、1%龙舌兰菊粉和1%果寡糖(FOS)纤维分子的能力。PFBS基于以下标
准:黄色=0(无纤维发酵);浅粉色=1(低效纤维发酵);粉红色=2(良好纤维发酵);红色/品红色=3(高效纤维发酵)。
[0218] 表9显示了1%菊粉、1%龙舌兰菊粉和1%果寡糖(FOS)纤维分子的可发酵纤维得分,以及候选菌株的总的益生菌潜能评分(PFBS)。
[0219] 表9
[0220]
[0221] 如表9所示,干酪乳杆菌和长双歧杆菌婴儿亚种显示出发酵这些纤维的最大能力。副干酪乳杆菌、德氏乳杆菌保加利亚亚种和唾液乳杆菌分解纤维的效率也很高。副干酪乳
杆菌和德氏乳杆菌保加利亚亚种在代谢1%菊粉时略有减少,而唾液乳杆菌在代谢FOS时略
有减少。表9还显示,除德氏乳杆菌保加利亚亚种外,所有候选益生菌株都表现出良好的生长潜力。短双歧杆菌有效分解龙舌兰菊粉和FOS,但不能有效分解菊粉。基于这些数据,选择了六种PFBS为6或以上的菌株(用粗体表示)来评估它们抑制食酸戴尔福特菌(在实施例3中
讨论)形成生物膜的能力。
[0222] 实施例3‑抑制食酸戴尔福特菌产生生物膜能力的益生菌株的确定
[0223] 本实施例提供了一种方法,用于确定前述实施例2中选择的益生菌株抑制食酸戴尔福特菌产生生物膜的能力。
[0224] 厌氧生物在GAM预还原肉汤培养基中在严格厌氧条件下生长。分离物在37℃下培养24至48小时。培养结束后,通过0.22μM过滤器过滤所有菌株的上清液。然后,将每种候选微生物的滤液与GAM肉汤培养基(1:1)混合,对戴尔福特菌生物膜进行测试。
[0225] 戴尔福特菌生物膜的形成
[0226] 将无菌的15mm胶盘浸泡在胎牛血清(FBS)中,并在37℃下培养过夜。在严格厌氧7
条件下,食酸戴尔福特菌在GAM预还原培养基中生长。使用浊度计将1×10 个细胞/mL的食
酸戴尔福特菌悬浮于磷酸盐缓冲盐水(PBS)中。将单个圆盘放入12孔培养板的孔中,并加入
7
4mL的食酸戴尔福特菌细胞悬浮液(1×10 个细胞/mL)。然后将圆盘在37℃下培养90分钟。
90分钟后,将圆盘转移到24孔培养板的单孔中,其中含有1.5mL来自每种候选益生菌的候选滤液和GAM肉汤培养基混合物。作为阳性生长对照,在一组圆盘中单独加入GAM肉汤培养基。
将圆盘放在摇床上,在37℃下培养96小时。96小时后,将每个圆盘放入2mL的PBS中,用细胞刮刀去除生物膜并悬浮细胞。进行系列稀释并进行平板计数,以计数菌落形成单位(CFU)。
有实验均一式三份。将每个候选益生菌株的平均对数CFU±SD与阳性生长对照进行比较,p‑值小于0.05被认为是显著的。
[0227] 表10显示了在候选益生菌上清液存在下,与生长对照组相比,食酸戴尔福特菌生物膜生长的p‑值。
[0228] 表10
[0229]
[0230] 如表10所示,干酪乳杆菌、长双歧杆菌婴儿亚种和副干酪乳杆菌的上清液可显著抑制食酸戴尔福特菌生物膜(p‑值<0.05)。短双歧杆菌、双裂双岐杆菌和长双歧杆菌也能明显抑制食酸戴尔福特菌生物膜(p‑值<0.05)。
[0231] 基于实施例2和实施例3中所述的试验,选出了以下菌株作为既能高效发酵纤维、又能抑制食酸戴尔福特菌形成生物膜且具有良好的生长速度的顶级细菌菌株:干酪乳杆
菌、长双歧杆菌婴儿亚种和短双歧杆菌。这些细菌菌株的组合能够对孤独症人群产生有益
的影响。
[0232] 参考文献
[0233] 本文提及的每项专利和科学文献的全部公开内容均以引用方式并入本文,用于所有目的。
[0234] 等价物
[0235] 本发明可以在不脱离其精神或基本特征的前提下,以其它具体形式体现。因此,上述实施例在所有方面都应被视为例证而非限制本文描述的本发明。因此,本发明的范围由所附的权利要求书而不是前述的描述来表示,所有在权利要求书的含义和等同范围内的变
化都旨在包含在权利要求书中。
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