[0001] 本发明属于动物微生态制剂生产技术领域，具体涉及一种鸭源植物乳杆菌的分离及其应用，该鸭源植物乳杆菌能够高效抑制鸭有害菌。

[0002] 鸭疫里默氏杆菌病是由鸭疫里默氏杆菌(Riemerella anatipestifer)引起的一种接触性传染性疾病，又称为鸭传染性浆膜炎。该病多见于1‑8周龄的小鸭，呈急性或慢性败血症。而鸭大肠杆菌病是由大肠杆菌引起的一种急性败血性传染病，故又名鸭大肠杆菌败血症。各种日龄的鸭对大肠杆菌均易感，尤以雏鸭最易感，该病发病毒可达70％～90％。当鸭饲养密度大、卫生条件差，地面潮湿，舍内通风不良，氨气浓度高等情况下上述细菌性疾病往往发病率高，尤其是有其它疾病混合感染时，更易引起本病的发生和流行，死亡率往往很高。由于肉鸭饲养时间短(38天左右)，发病时如果使用抗生素会造成兽药残留安全风险，为此，探索能够具有抗逆境和抑制有害菌的益生菌制剂具有重要意义。

[0003] 迄今为止，在鸭规模化养殖过程中，采用的益生菌多数以促进生长发育与提高饲料转化率等为主要靶向功能，而高效抑制鸭的鸭疫里默氏杆菌、大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌等繁殖特异性益生菌较为缺乏。

[0004] 本发明所要解决的技术问题是提供一种具有抑制有害菌繁殖的植物乳杆菌及应用，该菌株能够更好适应鸭肠道内环境并定值，制备益生菌剂，能够有效防制鸭细菌性疫病。

[0005] 本发明首先提供一种从肉鸭肠道分离提取的高效抑制鸭疫里默氏杆菌、大肠杆菌的益生菌菌株，为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)，于2023年2月21日保藏在位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.26622。

[0006] 本发明提供的植物乳杆菌，其16s rDNA的序列为SEQ ID NO:1；

[0007] 本发明所提供的植物乳杆菌在制备用于抑制病菌的制品中的应用；

[0008] 所述的病菌，为鸭疫里默氏杆菌、大肠杆菌、沙门氏菌或金黄色葡萄球菌。

[0009] 本发明所提供的植物乳杆菌还可作为益生菌来制备鸭饲料。

[0010] 与现有技术相比，本发明方法具有如下性质与优点：

[0011] 本发明筛选获得的鸭源分离的植物乳杆菌是兼性厌氧的革兰氏阳性菌，分子生物学16s DNA鉴定结果证实，该菌与常规植物乳杆菌同源性达到99％。本发明分离后的植物乳杆菌能够高效抑制鸭疫里默氏杆菌、大肠杆菌、沙门氏菌和金黄色葡萄球菌鸭常见有害菌。附图说明

[0012] 图1：分离鸭源植物乳杆菌荧光显微镜下的外观形态图；

[0013] 图2：分离鸭源植物乳杆菌16SrDNA序列对比结果图；

[0014] 图3：分离鸭源植物乳杆菌16SrDNA基因序列峰图；

[0015] 图4：泡菜源、鸭源植物乳杆菌抑制大肠杆菌生长效果图；

[0016] 图5：泡菜源、鸭源植物乳杆菌抑制鸭疫里默氏杆菌生长效果图；

[0017] 图6：分离鸭源植物乳杆菌抑制鸭疫里默氏杆菌生长效果图；

[0018] 图7：分离鸭源植物乳杆菌抑制大肠杆菌生长效果图；

[0019] 图8：分离鸭源植物乳杆菌抑制沙门氏菌生长效果图；

[0020] 图9：分离鸭源植物乳杆菌抑制金黄色葡萄球菌生长效果图。

[0021] 本发明筛选获得了一株鸭源植物乳杆菌，该菌株具有抑制有害菌的功能的，为鸭规模化健康养殖提供了重要技术支撑。

[0022] 下面结合实施例和附图对本发明进行详细描述。

[0023] 实施例1：鸭源植物乳杆菌的分离与鉴定

[0024] (1)菌种分离：无菌操作取28日龄北京鸭的盲肠内容物，放入MRS肉汤中兼性厌氧活化，待活化后取菌液离心(4℃，10min，6000r/min)，待离心结束保留菌泥，加入同体积的无菌生理盐水洗脱后再次重复以上离心洗脱步骤2次，稀释1000倍后，取100μL至盛有LPS(植物乳杆菌选择培养基)培养基的平皿上涂布，厌氧培养36h，将产生碳圈的单一菌落挑出使用LPS培养基进行四区划线进行纯化，连续划线纯化两代，得到纯化后的单一菌落，经革兰氏染色法观察外观形态。从图1结果可以看出，分离的鸭源植物乳杆菌基本为短杆状或杆状。

[0025] (2)生化鉴定：通过挑选健康鸭盲肠内容物，采用表1生化鉴定方法，在MRS培养基中经过多次分离纯化，经外观形态，分离菌株为革兰氏阳性菌，形态呈杆状或短杆状，经生化特性鉴定，该分离菌为植物乳杆菌属。

[0026] 表1：分离植物乳杆菌生理生化鉴定信息表

[0027]

[0028] 注：“+”为阳性，“‑”为阴性。

[0029] (3)分子鉴定：对分离驯化的菌进行宏基因组(16s)测序分析，得到以下基因序列：

[0030] TTAGGCGGCTGGTTCCTAAAAGGTTACCCCACCGACTTTGGGTGTTACAAACTCTCATGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGCGGCATGCTGATCCGCGATTACTAGCGATTCCGACTTCATGTAGGCGAGTTGCAGCCTACAATCCGAACTGAGAATGGCTTTAAGAGATTAGCTTACTCTCGCGAGTTCGCAACTCGTTGTACCATCCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCAGGTCATAAGGGGCATGATGATTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCGGTTTGTCACCGGCAGTCTCACCAGAGTGCCCAACTTAATGCTGGCAACTGATAATAAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACAACCATGCACCACCTGTATCCATGTCCCCGAAGGGAACGTCTAATCTCTTAGATTTGCATAGTATGTCAAGACCTGGTAAGGTTCTTCGCGTAGCTTCGAATTAAACCACATGCTCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCCTTTGAGTTTCAGCCTTGCGGCCGTACTCCCCAGGCGGAATGCTTAATGCGTTAGCTGCAGCACTGAAGGGCGGAAACCCTCCAACACTTAGCATTCATCGTTTACGGTATGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTTGCTACCCATACTTTCGAGCCTCAGCGTCAGTTACAGACCAGACAGCCGCCTTCGCCACTGGTGTTCTTCCATATATCTACGCATTTCACCGCTACACATGGAGTTCCACTGTCCTCTTCTGCACTCAAGTTTCCCAGTTTCCGATGCACTTCTTCGGTTGAGCCGAAGGCTTTCACATCAGACTTAAAAAACCGCCTGCGCTCGCTTTACGCCCAATAAATCCGGACAACGCTTGCCACCTACGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGTAGTTAGCCGTGGCTTTCTGGTTAAATACCGTCAATACCTGAACAGTTACTCTCAGATATGTTCTTCTTTAACAACAGAGTTTTACGAGCCGAAACCCTTCTTCACTCACGCGGCGTTGCTCCATCAGACTTTCGTCCATTGTGGAAGATTCCCTACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTTTGGGCCGTGTCTCAGTCCCAATGTGGCCGATTACCCTCTCAGGTCGGCTACGTATCATTGCCATGGTGAGCCGTTACCTCACCATCTAGCTAATACGCCGCGGGACCATCCAAAAGTGATAGCCGAAGCCATCTTTCAAACTCGGACCATGCGGTCCAAGTTGTTATGCGGTATTAGCATCTGTTTCCAGGTGTTATCCCCCGCTTCTGGGCAGGTTTCCCACGTGTTACTCACCAGTTCGCCACTCACTCAAATGTAAATCATGATGCAAGCACCAATCAATACCAGAGTTCGTTCGACTGC(SEQ ID NO:1)

[0031] 从图2、图3鉴定结果证实，该菌与植物乳杆菌具有最高同源性(99％)。为此，鉴定该菌为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)并保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心(保藏编号：CGMCC No.26622)。

[0032] 实施例2：分离鸭源植物乳杆菌与泡菜源植物乳杆菌的抑菌效果对比[0033] 使用泡菜源植物乳杆菌与鸭源植物乳杆菌进行抑制鸭有害菌(大肠杆菌、里默氏菌)生长测试，两株植物乳杆菌在MRS肉汤中培养24h后取上清液(代谢产物)，与盛有有害菌的肉汤培养基按比例混合(上清液：有害菌比例为1：4)，放入微生物生长分析仪(酶标仪)后进行24h生长曲线的测定。

[0034] 图4、图5抑菌结果表明，鸭源植物乳杆菌与泡菜源植物乳杆菌相比，对鸭有害菌有更好的抑制效果。图4抑菌结果表明，添加鸭源植物乳杆菌组的大肠杆菌在连续24小时内未出现生长现象，而添加泡菜源植物乳杆菌组在10小时后大肠杆菌出现生长趋势。图5抑菌结果表明，添加鸭源植物乳杆菌组的里默氏菌在24小时内未出现明显生长的趋势，而添加泡菜源植物乳杆菌组比添加鸭源植物乳杆菌组出现明显生长趋势。以上结果表明，鸭源植物乳杆菌相较常规的植物乳杆菌对鸭有害菌具有更好抑制效果。

[0035] 实施例3：分离鸭源植物乳杆菌的抑菌效果评定分析

[0036] 鸭源植物乳杆菌在MRS肉汤中培养24h后取上清液(代谢产物)，跟盛有有害菌的培养基中按比例混合，放入微生物生长分析仪后进行生长曲线的测定。

[0037] 由表2表明，鸭源植物乳杆菌对里默氏菌、大肠杆菌等鸭有害菌的生长具有显著的抑制效果，且抑制效果在有害菌的生长中连续不间断。

[0038] 图6、图7、图8、图9抑菌测试结果表明，植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)，在与有害菌添加量为1:3时，具有显著的抑菌效果，在连续15小时内，一直使有害菌处于未增长的状态。表明，鸭源植物乳杆菌能够有效的抑制大肠杆菌和里默氏菌的生长，如图6、图7所示，添加鸭源植物乳杆菌的大肠杆菌、里默氏菌在连续15小时内未出现增长的趋势，这说明鸭源植物乳杆菌对鸭大肠杆菌、里默氏菌具有明显的抑制作用。

[0039] 表2鸭源植物乳杆菌对不同有害菌生长的影响

[0040]

[0041] 实施例4：鸭源植物乳杆菌对肉鸭增重与死淘率的影响

[0042] 选择体重相近的7日龄的北京鸭64只，公母各半，每组4个重复，每个重复8只。对照9
组饲喂基础日粮，试验组饲喂添加鸭源植物乳杆菌活菌数为1×10 CFU/kg的日粮，进行为期21天的饲养试验。试验鸭群分栏饲养，自由采食饮水，每日观察北京鸭健康状况，发现病、死鸭及时淘汰并称取淘汰鸭重量。

[0043] 表3试验结果表明，添加鸭源植物乳杆菌组肉鸭体重比对照组提高了4.65％，日增重比对照组提高了5％，死淘率比对照组降低了3.13％，饲养期间鸭源植物乳杆菌组均未出现精神萎靡、缩脖、食欲不振和腹泻等现象，表明分离的鸭源植物乳杆菌具有安全性，且具有促进肉鸭生长发育的作用。

[0044] 表3:鸭源植物乳杆菌对7‑28日龄肉鸭增重与死淘率的影响表

[0045]

[0046] 同行数据肩标不同小写字母表示差异显著(P＜0.05)，不同大写字母表示差异极显著(P＜0.01)，相同或无小写字母表示差异不显著(P>0.05)。

[0047] 综上，本发明从肉鸭盲肠内容物中筛选分离出鸭源植物乳杆菌并对其进行抗逆境驯化选育，该菌能够更好适应鸭肠道内环境并定值，具有高效抑制鸭有害菌的功能，且对鸭里默氏杆菌和大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌具有显著效果，适合作为功能保健益生菌添加剂而广泛使用，对推动现代鸭规模化无抗或减抗养殖将会起重要保障作用。