一种耐热型马克斯克鲁维酵母菌株的筛选方法 |
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| 申请号 | CN202311764101.1 | 申请日 | 2023-12-21 | 公开(公告)号 | CN117736871A | 公开(公告)日 | 2024-03-22 |
| 申请人 | 安徽天邦生物技术有限公司; | 发明人 | 周少华; 胡传炯; 徐杰; 薛兵; | ||||
| 摘要 | 本 发明 公开了一种耐热型 马 克斯克鲁维 酵母 菌株的筛选方法，将1kg 酒糟 样品添加富集培养基，在37℃下固态 发酵 7‑15天；称取10g酒糟发酵样品，加入90mL无菌 水 ，磁 力 搅拌20min，用无菌水进行梯度稀释；取100μL样品稀释液在YPD培养基平板上涂布，挑选菌落形态符合且生长较好的酵母菌株，通过多次划线纯化菌株，通过18s rDNA测序，菌株鉴定为马克斯克鲁维酵母。本发明提供的马克斯克鲁维酵母菌株的酵母培养物可改善 饲料 营养价值，促进 机体 免疫，提高动物生长性能。马克斯克鲁维酵母相比传统酵母具有高温耐受性和更高的生长速率，可节约生产成本，减少染菌 风 险，提高生产效率，具有较高的工业应用价值。 | ||||||
| 权利要求 | 1.一种耐热型马克斯克鲁维酵母菌株的筛选方法，其特征在于，包括如下步骤： |
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| 说明书全文 | 一种耐热型马克斯克鲁维酵母菌株的筛选方法技术领域背景技术[0002] 马克斯克鲁维酵母属于真菌子囊菌门酵母菌亚门酵母菌目酵母科克鲁维酵母属，广泛存在于植物和乳制品中，其所产生的脂类、酮类、醛类和醇类可以为乳制品、酒类等发酵产品增加特殊风味。马克斯克鲁维酵母是美国食品药品监督管理局认证的GRAS级别微生物，通过了欧盟食品安全监督局的安全认证，在2013年被中国卫计委批准为新食品原料，2023年7月，中国农业农村部批准其为新饲料添加剂。 [0003] 马克斯克鲁维酵母作为一种非常规酵母，在生物燃料生产、重组蛋白合成、污水处理等领域应用广泛。除此之外，马克斯克鲁维酵母在动物饲料的固态发酵中也具有较大的发展潜力。固态发酵有发酵底物来源广泛、设备要求简单、能耗低、废液少等优点，但也存在发酵周期长、培养基很难做到完全无菌、物料堆积容易导致局部过热等问题。 发明内容[0005] 本发明的目的在于提供一种耐热型马克斯克鲁维酵母菌株的筛选方法，筛选得到一株耐热马克斯克鲁维酵母菌株，并将其应用于动物饲料的固态发酵中,以解决上述背景技术中提出的问题。 [0006] 为实现上述目的，本发明提供如下技术方案： [0007] 一种耐热型马克斯克鲁维酵母菌株的筛选方法，包括如下步骤： [0009] S2：秤取10g酒糟样品，加入90mL无菌水，磁力搅拌20min，用无菌水进行梯度稀释； [0010] S3：取100μL样品稀释液在YPD培养基平板上涂布，40℃静置培养48h，挑选菌落形态符合且生长较好的酵母菌株，通过多次划线纯化菌株，得到的纯种菌株进行鉴定和保藏； [0011] S4：通过18s rDNA测序，序列在NCBI数据库上进行比对分析，菌株鉴定为马克斯克鲁维酵母菌株，命名为TBY2。 [0012] 进一步地，所述YPD培养基包括YPD固体培养基和YPD液体培养基。 [0013] 进一步地，所述YPD固体培养基的制备过程包括： [0014] 取10g酵母膏，20g蛋白胨，20g葡萄糖，用1000mL蒸馏水溶解，再加入20g琼脂粉充分混匀，121℃高压灭菌20min，培养基冷却至45℃左右，在超净工作台中分装至培养皿中，冷却凝固后将培养基平板倒置备用。 [0015] 进一步地，所述YPD液体培养基的制备过程包括： [0016] 取10g酵母膏，20g蛋白胨，20g葡萄糖，加入1000mL蒸馏水加热溶解，将培养基分装至试管中，121℃高压灭菌20min，冷却后备用。 [0017] 进一步地，对马克斯克鲁维酵母菌株进行温度耐受性测试： [0018] 将马克斯克鲁维酵母TBY2接种到YPD固体培养基平板上进行活化，平板划线得到单克隆菌落，挑取一个菌落接种到YPD液体培养基中，置于摇床30℃，150rpm震荡培养24h得到种子液，得到的种子液以1‰的比例转接至新的YPD液体培养基中，分别在不同温度梯度下培养24h。 [0019] 进一步地，所述马克斯克鲁维酵母菌株的固态发酵方法包括： [0020] 发酵原料：取麸皮400份，棕榈粕500份，豆粕100份混合均匀，备用； [0021] 菌种活化：将冷冻保藏的TBY2菌株接种到YPD固体培养基上，置于生化培养箱中30℃恒温培养48h，得到活化的菌种； [0022] 酵母种子液制备：挑取TBY2菌株单菌落接种到YPD液体培养基中，置于摇床中30℃，150rpm震荡培养24h，得到TBY2菌株种子液； [0023] 固态发酵：TBY2菌株种子液以2％的接种量接种到混合好的发酵原料，再加入740份水搅拌均匀，分装至发酵袋中，置于37培养48h，即得发酵饲料； [0024] 酵母计数：在固态发酵开始之时，取适量酵母种子液，另外在固态发酵的0h，24h，48h分别取10g发酵样品，加入90mL无菌水，磁力搅拌20min，酵母种子液和发酵样品水溶液用无菌水进行梯度稀释，通过平板菌落计数法测定酵母活菌数。 [0025] 与现有技术相比，本发明的有益效果是： [0026] 1.马克斯克鲁维酵母菌株普遍都能在40℃条件下生长，其中部分菌株可耐受50℃以上的温度，使其更方便用于高温发酵，高温发酵一方面可以大幅降低冷却成本及染菌风险，另一方面，纤维素酶、木聚糖酶、果胶酶等的最适作用温度一般为45‑55℃，高温发酵有助于提高这些酶的催化效率。 [0027] 2.马克斯克鲁维酵母还具有较高的生长速率，在40℃时生长速率可达OD 0.86‑0.99/h，远高于其他酵母，可以迅速增殖得到大量细胞，提高生产效率。 [0028] 3.除了葡萄糖以外，马克斯克鲁维酵母还可以利用其他糖类作为单一碳源进行生长，包括果糖、木糖、阿拉伯糖、半乳糖、乳糖和菊糖等，因此以这些糖类为主要成分的低值农业及食品工业副产物可以作为碳源应用于马克斯克鲁维酵母的发酵。以这些副产品作为部分底物进行发酵，有助于减少环境污染，降低饲料成本，推动养殖产业可持续发展。 具体实施方式[0029] 下面将结合本发明的实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。 [0030] 一种耐热型马克斯克鲁维酵母菌株的筛选与鉴定方法，包括： [0031] 将1kg酒糟样品添加富集培养基，在37℃下固态发酵7‑15天，然后秤取10g酒糟样品，加入90mL无菌水，磁力搅拌20min，用无菌水进行梯度稀释，取100μL样品稀释液在YPD培养基平板上涂布，40℃静置培养48h，挑选菌落形态符合且生长较好的酵母菌株，通过多次划线纯化菌株，得到的纯种菌株进行鉴定和保藏。通过18s rDNA测序，序列在NCBI数据库上进行比对分析，菌株鉴定为马克斯克鲁维酵母菌株，命名为TBY2。 [0032] YPD固体培养基：取10g酵母膏，20g蛋白胨，20g葡萄糖，用1000mL蒸馏水溶解，再加入20g琼脂粉充分混匀，121℃高压灭菌20min。培养基冷却至45℃左右，在超净工作台中分装至培养皿中，冷却凝固后将培养基平板倒置备用。 [0033] YPD液体培养基：取10g酵母膏，20g蛋白胨，20g葡萄糖，加入1000mL蒸馏水加热溶解，将培养基分装至试管中，121℃高压灭菌20min，冷却后备用。 [0034] 将马克斯克鲁维酵母TBY2接种到YPD固体培养基平板上进行活化，平板划线得到单菌落，挑取一个菌落接种到YPD液体培养基中，置于摇床30℃，150rpm震荡培养24h得到种子液。得到的种子液以1‰(V/V)的比例转接至新的YPD液体培养基中，分别在不同温度梯度下培养24h，同时对3种商业酵母采用相同的处理方法作为对照，通过平板菌落计数法测定不同温度培养条件下不同菌株的活菌数，结果如表1所示。 [0035] 表1各菌株不同温度下培养的活菌数(107CFU/mL) [0036] [0037] 结果显示，TBY2菌株在42℃和47℃这两个温度条件下，活菌数的减少程度远小于其他3种菌株，这表明TBY2菌株相比其他三者具有更好的高温耐受性。 [0038] 马克斯克鲁维酵母菌株的固态发酵方法包括： [0039] 发酵原料：取麸皮400份，棕榈粕500份，豆粕100份混合均匀，备用。 [0040] 菌种活化：将冷冻保藏的TBY2菌株接种到YPD固体培养基上，置于生化培养箱中30℃恒温培养48h，得到活化的菌种。 [0041] 酵母种子液制备：挑取TBY2菌株单菌落接种到YPD液体培养基中，置于摇床中30℃，150rpm震荡培养24h，得到TBY2菌株种子液。 [0042] 固态发酵：TBY2菌株种子液以2％的接种量接种到混合好的发酵原料，再加入740份水搅拌均匀，分装至发酵袋中，置于37培养48h，即得发酵饲料。 [0043] 酵母计数：在固态发酵开始之时，取适量酵母种子液，另外在固态发酵的0h，24h，48h分别取10g发酵饲料，加入90mL无菌水，磁力搅拌20min，酵母种子液和发酵饲料水溶液用无菌水进行梯度稀释，通过平板菌落计数法测定酵母活菌数，所有样品活菌数如表2所示。 [0044] 表2样品中酵母活菌数 [0045] [0046] 将发酵饲料置于65℃烘箱中烘干水分，使用粉碎机粉碎样品，粉碎后样品过0.42mm试样筛，用凯氏定氮法测定发酵样品和对照样品中的粗蛋白含量，测定方法参照GB/T 6432‑2018，以未发酵的样品作为对照。采用直接干燥法测定样品中的水分含量，再据此计算出同等水分条件下发酵样品和对照样品的粗蛋白含量如表3所示。 [0047] 表3样品粗蛋白含量(按10％水分折算) [0048] [0049] 结果显示，在发酵过程中，发酵饲料的粗蛋白含量明显增加，发酵48h后的样品相比对照组粗蛋白含量提高了12％。 [0050] 使用发酵饲料在某公司开展饲喂试验，选择60头出生日龄一致、体重相近的“杜长大”育肥猪，随机分成试验组和对照组，每组30头猪，每5头猪一个栏舍饲养。对照组使用基础日粮，实验组使用10％的发酵饲料替代基础日粮中4％麸皮，5％棕榈粕，1％豆粕。试验期间，猪只全程正常采食、饮水和活动，定期进行消毒、免疫、驱虫保健等工作。记录试验猪的初重与末重，统计试验组和对照组消耗的饲料，计算试验猪的平均日采食量、平均日增重、料重比。发酵饲料对育肥猪生长性能的影响如表4。 [0051] 表4发酵饲料对育肥猪生产性能的影响 [0052] [0053] 结果显示，试验组的料重比相比对照组出现明显的减少，这说明在日粮添加马克斯克鲁维酵母发酵饲料有利于提高育肥猪的生产性能。马克斯克鲁维酵母菌株可应用在动物饲料领域，马克斯克鲁维酵母具有耐高温、生长速率高、适用底物广等特点，能在一定程度上克服固态发酵中的不利条件，降低生产成本,一方面，酵母将一部分大分子物质降解成生物利用率较高的小分子物质，改善了饲料的营养价值。另一方面，活性菌株及其产生的一些有益代谢产物，如氨基酸、维生素、多糖等，也会对猪只的生长和健康产生积极影响。 [0054] 以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。 |
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