[0001] 本发明属于天然活性成分应用技术领域，具体涉及一种小球藻多糖及其在缓解高温应激损伤中的应用。

[0002] 小球藻是一类可食用单细胞绿藻，细胞直径大小大约在2μm 15μm之间，易于培养，~生长速度快，具有全面均衡的营养成分，在食品、饲料、医药等多个领域具有潜在的应用价值和良好的发展前景。随着人们对小球藻营养成分的深入研究，小球藻在食品中的应用也逐渐多元化，小球藻作为补充食品、营养保健品和药物被广泛销售，并被联合国粮食及农业组织命名为“绿色健康食品”。天然多糖在缓解氧化应激和发挥健康衰老方面的潜在应用引起了人们相当大的兴趣，而小球藻多糖是小球藻的主要生物活性化合物。将提取小球藻多糖添加到食品中，探究其生物效应，为小球藻单一活性成分的提取、鉴定、深加工奠定了基础。

[0003] 世界人口日益城市化，全球一半以上的人口已经生活在城市。由于城市热岛效应，城市人口尤其受到气温升高的影响。由于室外气象条件也会影响室内条件，特别是在没有空调的环境中，因此气温升高会给人们带来热应激，即使没有直接暴露在高温下也是如此。热应激会损害人们的健康，影响他们的幸福感和工作效率，并可能造成巨大的经济损失。随着全球气候变暖和极端高温的出现会引发的各种慢性压力，对生物体健康造成不可逆转的损伤。在极端或热应激条件下，脆弱人群可能会遭受一系列生理反应，这可能导致肾功能衰竭、神经功能损害、心血管功能衰竭，甚至导致热损伤和死亡。此外，与热相关的健康影响有热衰竭、皮疹和中暑、热射病等。频繁和强烈的高温也会诱发多器官功能障碍综合征，对人体健康构成威胁。因此，探究通过饮食补充缓解机体高温应激损伤，提高机体高温环境耐受能力，促进人类对热相关疾病的抵抗力对于捍卫人类健康至关重要。

[0004] 本发明的目的在于构建一种小球藻多糖及其在缓解高温应激损伤中的应用。

[0005] 为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供的技术方案是：一种小球藻多糖，所述小球藻多糖包含下列摩尔百分比的成分：5.3‑5.6%的甘露糖、3.5‑4.0%的葡萄糖醛酸、3.5‑4.0%的半乳糖醛酸、55‑61%的葡萄糖、15‑20%的半乳糖、9‑10%的木糖和0.1‑0.3%的岩藻糖。

[0006] 为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供的技术方案是：一种小球藻多糖在制备缓解和治疗高温应激损伤的药物中的应用。

[0007] 为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供的技术方案是：一种小球藻多糖在制备缓解和治疗高温应激损伤的食品中的应用。

[0008] 为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供的技术方案是：一种小球藻多糖在制备缓解和治疗高温应激损伤的饲料中的应用。

[0009] 为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供的技术方案是：一种小球藻多糖在制备缓解和治疗高温应激损伤的防暑产品中的应用。

[0010] 为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供的技术方案是：一种小球藻多糖在制备缓解和治疗高温应激损伤的保健品中的应用。

[0011] 由于上述技术方案运用，本发明与现有技术相比具有的优点是：本发明的小球藻多糖可以显著延长高温条件下果蝇的寿命，提高果蝇运动能力，增强抗饥饿能力，保护肠道完整性以及降低肠道活性氧水平，增强果蝇的抗逆性并缓解高温应激带来的损伤。此外，本发明证明了小球藻多糖对高温应激诱导的损伤具有调节作用，进而提高机体对高温环境的耐力，预防热相关疾病的发生，可用于制备抗高温、保护人体健康或修复高温应激损伤的保健食品或药物，并为后续研究小球藻多糖的进一步应用提供了基础和思路。
附图说明

[0012] 图1为高效液相色谱法检测小球藻多糖中单糖成分：图2为补充/不补充小球藻多糖对果蝇寿命的影响；
图3为补充/不补充西小球藻多糖对果蝇运动能力的影响；
图4为补充/不补充小球藻多糖对果蝇饥饿胁迫影响；
图5为补充/不补充小球藻多糖果蝇肠道通透性的影响;
图6为补充/不补充小球藻多糖对果蝇肠道ROS水平的影响；
图7为补充/不补充小球藻多糖对果蝇应激相关途径基因的影响。其中，*P<
0.05；**P<0.01；***P<0.001；****P<0.0001。

[0013] 以下由特定的具体实施例说明本发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本实施例所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点及功效。

[0014] 请参阅图1‑7。须知，本说明书所附图式所绘示的结构、比例、大小等，均仅用以配合说明书所揭示的内容，以供熟悉此技术的人士了解与阅读，并非用以限定本发明可实施的限定条件，故不具技术上的实质意义，任何结构的修饰、比例关系的改变或大小的调整。提供以下实施例以便更好地理解本发明，而非限制本发明。以下实施例中的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的实验材料如无特殊说明，均为常规生化试剂商店购买所得。

[0015] 以下实施例所述试剂或材料若无说明，均为市售。

[0016] 实施例1：一种小球藻多糖及其在缓解高温应激损伤中的应用实验动物：野生型Canton‑S品系黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）为实验室保存。将新羽化的雄性果蝇分别置于温度为25℃和31℃，相对湿度为60%，12小时光照‑12小时黑暗循环的培养箱中培养，喂食补充/不补充小球藻多糖的培养基，处理相应时间后进行实验测定。

[0017] 果蝇培养基的配制：对照组培养基配方为玉米粉10g、大豆粉1g、白糖1.45g、红糖4g、酵母2.5g、琼脂0.92g和去离子水100mL混合煮沸后，冷却至60 70℃后，加入防腐剂2mL~
（对羟基苯甲酸甲酯10g、无水乙醇100mL、丙酸25mL）。实验组中加入与对照组去离子水等体积的小球藻多糖溶液，实验组中小球藻多糖的浓度为2%。

[0018] 本实施例涉及的各实验试剂均为市售分析纯。

[0019] 一、小球藻多糖的制备。

[0020] 小球藻粉是从西安森冉生物工程有限公司获得。所述的小球藻粉，采用方法是培养物经截留孔径为0.1 0.3μm的微滤膜过滤浓缩后进行喷雾干燥制得，产品的执行标准号~是GB/T29602。

[0021] 称取100g的小球藻粉末溶解在2000mL的蒸馏水中，在60℃的预处理超声水浴中用240w超声30分钟。之后，将混合物在90℃下水提2小时，过滤取滤渣重复水提2次，离心取上清后真空浓缩以除去蒸馏水，然后用在4℃条件下，用4倍的95%乙醇醇沉过夜，抽滤后进行脱蛋白，并用蒸馏水透析以除去小分子。经离心冷冻干燥后，即得小球藻多糖。小球藻粉末密封储存于干燥器中备用。

[0022] 采用超声辅助热水浸提的方法获得小球藻多糖。以D‑葡萄糖作为标准品，用苯酚‑硫酸法测定总糖含量为76%; 以牛血清白蛋白为标准，参照考马斯亮蓝法测定多糖中的蛋白质为4.01%; 以半乳糖醛酸为标品，测定总糖中的糖醛酸含量为14%。

[0023] 二、高效液相色谱法检测小球藻多糖中的单糖成分及其含量以L‑鼠李糖、D‑阿拉伯糖、D‑木糖、D‑甘露糖、D‑葡萄糖、D‑半乳糖和D‑果糖作为标准品。对标准品和小球藻多糖进行高效液相色谱（图1）检测。经检测小球藻多糖含有甘露糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、木糖和岩藻糖，摩尔百分比分别为5.45%、
3.82%、3.78%、58.81%、18.34%、9.61%、0.2%。

[0024] 三、补充/不补充小球藻多糖对果蝇寿命的影响整个实验过程分别是在正常温度（25℃）和高温（31℃）条件下进行。以普通培养基中培养的果蝇作为对照组，小球藻多糖培养基中培养的果蝇作为实验组。分别随机收集对照组和实验组羽化了2 3天的雄性果蝇，每组中雄果蝇各200只。每隔2 3天更换一次培养~ ~
基，并记录果蝇的死亡数量。

[0025] 结果显示：正常温度下(25℃)，补充小球藻多糖组的果蝇寿命与喂食正常培养基的果蝇寿命相比，有所延长但无统计意义（图2A）（P>0.05）,而在高温（31℃）条件下，与对照组相比，补充小球藻多糖的实验组果蝇寿命显著延长（图2B）（P<0.05）。上述结果表明，在高温条件下，小球藻多糖可缓解高温带来的损伤，显著地延长了果蝇的寿命。

[0026] 四、补充/不补充小球藻多糖对果蝇攀爬能力的影响收集新羽化2 3日龄雄蝇，用补充/不补充小球藻多糖的培养基处理10天后，将果~
蝇置于设备中适应后进行垂直攀爬测定，然后以1min的间隔敲击攀爬小瓶将果蝇置于瓶底，并进行视频记录，每组重复3次。通过计算3S内爬行超过5cm的果蝇数量来评估攀爬能力。在同一时间点独立重复实验六次，以减少昼夜节律可能产生影响。

[0027] 结果显示：在正常温度下（25℃），我们可以观察到（图3），补充/不补充小球藻多糖的果蝇攀爬能力无显著性差异(p>0.05)。在高温条件下（31℃），与正常温度（25℃）相比果蝇的运动能力显著下降（p<0.05）。然而高温应激下通过补充小球藻多糖的果蝇攀爬能力显著增加（p<0.05）。这些结果进一步表明，在生命过程中补充小球藻多糖可以缓解高温环境对机体造成的运动损伤。

[0028] 五、补充/不补充小球藻多糖对高温条件下果蝇饥饿能力的影响收集新羽化2 3日龄雄蝇，用补充/不补充小球藻多糖的培养基处理10天后，将每~
瓶20只果蝇转移到底部含有1%琼脂的小瓶中。每1 2h记录一次死亡果蝇数量，并绘制生存~
曲线。

[0029] 结果显示：在正常温度（25℃）和高温（31℃）的饥饿条件下，与对照组相比，补充小球藻多糖可显著增强果蝇的抗饥饿能力，延长果蝇的寿命（图4A和图4B）。这些结果表明，补充小球藻多糖可显著增强果蝇对饥饿的抵抗力。结果见图4。

[0030] 六、补充/不补充小球藻多糖对果蝇肠道通透性的影响随机收集新羽化2 3日龄的雄蝇分为4组，在正常温度（25℃）和高温条件（31℃）喂~
食补充/不补充小球藻多糖培养基的果蝇10天后，分别放入含有2.5%亮蓝培养基中，评估果蝇肠道屏障的完整性。

[0031] 结果显示：在高温条件下（31℃）,果蝇肠道受损严重，出现较严重的肠道泄漏情况。通过补充小球藻多糖，果蝇肠道完整性受到保护（图5）。结果表明，补充小球藻多糖可缓解高温应激对肠道的损伤，保护肠道的完整性。

[0032] 七、补充/不补充小球藻多糖对果蝇肠道ROS水平的影响随机收集2 3日龄的雄蝇分为4组，在正常温度（25℃）和高温（31℃）条件喂食补~
充/不补充小球藻多糖培养基的果蝇10天后，显微镜下提取5 7条果蝇肠道于1×PBS中，在~
室温下用1μL 30μM DHE染色肠道，立刻置于摇床上避光孵育5min，再用1×PBS中洗涤三次，每次置于摇床避光孵育5min。之后将肠道样品用4  ',6‑二脒基‑2‑苯基吲哚（DAPI）染色并在黑暗中静置孵育8min。甘油封片后于荧光显微镜下观察并拍照。观察处理10天后果蝇肠道的ROS水平。

[0033] 结果显示：对照组的肠道DHE荧光强度明显高于喂食小球藻多糖的实验组中肠道DHE荧光强度，尤其是在高温条件下（31℃），补充小球藻多糖的果蝇荧光强度显著降低，肠道ROS水平显著下降，使自由基得以及时清除，进而保护果蝇机体免受高温应激引起的氧化损伤。结果见图6。

[0034] 八、补充/不补充小球藻多糖对果蝇氧化应激相关基因的影响随机收集2 3日龄的雄蝇分为4组，在正常温度（25℃）和高温条件（31℃）喂食补~
充/不补充小球藻多糖培养基的果蝇10天后，提取总RNA。将得到的总RNA去除基因组RNA后（RT reagent Kit）得到mRNA  ,将 得到的mRNA用反转录试剂盒（TB Green qPCR Kit）反转录出cDNA。使用的qRT‑PCR方案如下：变性程序(95℃，5min)，然后40个循环，95℃持续10s，
60℃持续30s。在扩增阶段结束时进行熔解曲线分析；在95℃持续15s，60℃持续60s，95℃持续15s，以测试qRT‑PCR产物的特异性。使用Rp49作为内部参照，确定mRNA水平上各基因的表达，并使用2‑ΔΔCt方法计算mRNA的相对表达水平。使用GraphPad Prism 9软件进行数据绘图和分析，所有实验结果均表示为平均值±标准差(Mean±SD)。采用单因素方差分析(ANOVA)评估各组间的差异。*P＜0.05，**P＜0.01和***P＜0.001表示各组之间有统计学差异。每个实验至少重复3次。引物序列见表1。

[0035] 表1 基因引物序列Genes Forward Reverse
Rp49 AGGGTATCGACAACAGAGTG CACCAGGAACTTCTTGAATC
nrf2 AGCTTCTGTCGCATGGTTGA AGCCGTTGCTAACATGTCCA
ho ATGACGAGGAGCAGCAGAAG ACAAAGATTAGTGCGAGGGC
Sod1 CAAGGGCACGGTTTTCTTC CCTCACCGGAGACCTTCAC
结果显示：核因子‑红细胞2相关因子2/抗氧化反应素（Nrf2/ARE）是对抗氧化应激和损伤的最重要的抗氧化途径之一。为验证小球藻多糖可能通过Nrf2介导的信号通路发挥抗应激作用，使用qRT‑PCR方法测定了上游靶基因（nrf2）和下游靶基因（ho和sod1）的相对mRNA表达量。如图7所示，与正常温度条件下相比，果蝇暴露于高温后，nrf2、ho和sod1的mRNA 表达量显著降低（p<0.05），而补充小球藻多糖后，nrf2、ho和sod1的 mRNA相对表达量显著增加（p<0.05）。研究结果显示，高温条件下小球藻多糖可能通过上调抗氧化应激相关基因mRNA的表达，缓解高温应激诱导的损伤并发挥保护的作用主要依赖于Nrf2介导信号通路。

[0036] 综上所述，通过对果蝇生存率、运动能力、抗饥饿能力、肠道完整性、ROS水平以及抗氧化应激基因的表达水平分析，我们认为补充小球藻多糖可以通过减少高温诱导的氧化应激来对延长果蝇的寿命，缓解高温应激下的损伤。这可为解释果蝇在补充小球藻多糖时暴露于高温条件的果蝇寿命延长和延缓行为衰老的重要机制，拓展了小球藻多糖抗高温应激的科学功能和潜在机制，以支持其在保健品或药品中的应用。

[0037] 需要强调的是：本发明是小球藻多糖应用于缓解模式生物果蝇整个生命过程中高温应激损伤的首次发现，可应用于制备预防高温环境中对机体的氧化应激或缓解高温应激损伤的食品、保健品或药品，并为小球藻天然活性成分方向的研究提供一定的依据。

[0038] 实施例2：一种小球藻多糖及其在缓解高温应激损伤中的应用一种小球藻多糖及其在缓解高温应激损伤中的应用，超声辅助热水提取的小球藻多糖能够增强果蝇高温环境的抗逆性。

[0039] 小球藻多糖是超声辅助热水提取所得到，所述的小球藻多糖中总糖含量为76%，蛋白质为4.01%，糖醛酸含量为14%。

[0040] 所述的小球藻多糖经高效液相色谱检测，小球藻多糖主要由摩尔百分比分别为5.45%、3.82%、3.78%、58.81%、18.34%、9.61%、0.2%的甘露糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、木糖和岩藻糖组成。

[0041] 随机收集2 3日龄的雄蝇分为4组，每组10管，每管20只。在正常温度（25℃）和高温~条件（31℃）喂食补充/不补充小球藻多糖的培养基，每隔2 3更换一次新的培养基，记录死~
亡果蝇的数量，观察果蝇的寿命情况。

[0042] 随机收集2 3日龄的雄蝇分为4组，每组10管，每管20只。在正常温度（25℃）和高温~条件（31℃）喂食补充/不补充小球藻多糖的培养基10天后，将果蝇置于设备中适应后进行垂直攀爬测定，然后以1min的间隔敲击攀爬小瓶将果蝇置于瓶底，并进行视频记录，每组重复3次。通过计算3S内爬行超过5cm的果蝇数量来评估运动能力。在同一时间点独立重复实验六次，以减少昼夜节律可能产生影响。

[0043] 随机收集2 3日龄的雄蝇分为4组，每组5管，每管20只。在正常温度（25℃）和高温~条件（31℃）喂食补充/不补充小球藻多糖培养基的果蝇10天后，将果蝇转移至只含有1%琼脂的培养基中进行饥饿处理，每2小时记录一次果蝇死亡数量，观察果蝇的抗饥饿能力。

[0044] 根随机收集2 3日龄的雄蝇分为4组，每组5管，每管20只。在正常温度（25℃）和高~温条件（31℃）喂食补充/不补充小球藻多糖培养基的果蝇10天后，分别放入含有2.5%亮蓝培养基中，评估果蝇肠道屏障的完整性。

[0045] 随机收集2 3日龄的雄蝇分为4组，在正常温度（25℃）和高温条件（31℃）喂食补~充/不补充小球藻多糖培养基的果蝇10天后，显微镜下提取5 7条果蝇肠道于1×PBS中，在~
室温下用1μL 30μM DHE染色肠道，立刻置于摇床上避光孵育5min，再用1×PBS中洗涤三次，每次置于摇床避光孵育5min。之后将肠道样品用4  ',6‑二脒基‑2‑苯基吲哚（DAPI）染色并在黑暗中静置孵育8min。甘油封片后于荧光显微镜下观察并拍照。观察处理10天后果蝇肠道的ROS水平。

[0046] 随机收集2 3日龄的雄蝇分为4组，每组2管，每管25只。在正常温度（25℃）和高温~条件（31℃）喂食补充/不补充小球藻多糖培养基的果蝇10天后，提取总RNA。将得到的总RNA去除基因组RNA后（RT reagent Kit）得到mRNA  ,将 得到的mRNA用反转录试剂盒（TB Green qPCR Kit）反转录出cDNA，以核糖体蛋白49（rp49）的表达作为内参，RT‑PCR用于检测与应激相关途径中基因的mRNA水平的表达。

[0047] 球藻多糖缓解高温应激损伤方面的应用。本实施例采用超声辅助热水提取的方法提取小球藻多糖，并在正常温度（25℃）和高温（31℃）条件下喂养果蝇补充/不补充小球藻多糖的食物，测定其寿命、抗饥饿性和肠道活性氧（ROS）水平。结果表明补充小球藻多糖可以显著延长高温条件下果蝇的寿命，提高果蝇运动能力，增强抗饥饿能力，保护肠道完整性以及降低肠道活性氧水平，增强果蝇的抗逆性并缓解高温应激带来的损伤。此外，本发明证明了小球藻多糖对高温应激诱导的损伤具有调节作用，进而提高机体对高温环境的耐力，预防热相关疾病的发生，可用于制备抗高温、保护人体健康或修复高温应激损伤的保健食品或药物，并为后续研究小球藻多糖的进一步应用提供了基础和思路。

[0048] 以上所述者仅为用以解释本发明之较佳实施例，并非企图具以对本发明做任何形式上之限制，是以，凡有在相同之发明精神下所作有关本发明之任何修饰或变更，皆仍应包括在本发明意图保护之范畴。