刺梨多糖及其制备方法、应用 |
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| 申请号 | CN202311451410.3 | 申请日 | 2023-11-03 | 公开(公告)号 | CN117164739B | 公开(公告)日 | 2024-02-02 |
| 申请人 | 伟龙食品有限公司; | 发明人 | 朱毅; 李忍; 卢星淼; 罗春林; 穆香静; | ||||
| 摘要 | 本 发明 提供了一种刺梨多糖及其制备方法、应用，涉及刺梨多糖的技术领域，包括以下步骤：（a）刺梨干粉溶液进行超高压提取，得到提取液；其中，超高压提取的pH为4~8，提取的压 力 为200~600MPa，提取的时间为3~15min；（b）步骤（a）的提取液经离心后取上清液进行脱蛋白处理，过滤，沉淀，得到刺梨多糖。本发明解决了传统刺梨多糖提取工艺中存在的提取成本高、提取效率低，以及获得的刺梨多糖的抗 氧 化能力差和药理效果不佳的技术问题，达到了大大减少提取时间、有效增加刺梨多糖的提取效率和得率、节省提取成本、避免刺梨果中热敏感性成分的损失和破坏，以及获得的刺梨（硒）多糖的抗氧化活性高和硒含量高的技术效果。 | ||||||
| 权利要求 | 1.一种刺梨多糖，其特征在于，所述刺梨多糖为刺梨多糖RRP或刺梨硒多糖SeRRP； |
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| 说明书全文 | 刺梨多糖及其制备方法、应用技术领域[0001] 本发明涉及刺梨多糖的技术领域，尤其是涉及一种刺梨多糖及其制备方法、应用。 背景技术[0002] 刺梨果实中的维生素C含量最为丰富，可达2000 3000mg/100g鲜重，远高于其他水~果，大约是草莓的40倍、番茄的100倍以及猕猴桃的20倍，被称为“维C之王”；除此之外，刺梨果实中含有多糖、黄酮以及SOD等多种生物活性质，其中，刺梨多糖是刺梨中重要的活性成分。研究表明，刺梨多糖具有抗氧化、降血糖、抗疲劳、提高免疫力和调节肠道菌群等多种功能。同时，富硒的刺梨鲜果中也会存在硒含量更多的刺梨硒多糖，其降血糖、降血脂以及抗氧化能力比普通刺梨多糖更好。 [0003] 虽然刺梨多糖具有如此多的药理效果，但是由于刺梨多糖的提取技术比较落后，提取成本高、提取效率低且刺梨多糖得率不高，获得的刺梨多糖抗氧化能力差，难以达到良好的药理效果。现有技术CN109400734A公开了一种刺梨多糖及其制备方法与应用，通过水提醇沉的方法制备刺梨多糖，多糖得率为3.57%；经过体外发酵实验，该刺梨多糖可以促进乙酸、丙酸和丁酸等短链脂肪酸的生成，促进乳酸菌和双歧杆菌有益菌的生长，可以作为益生元；同时该刺梨多糖还可以抑制α‑葡萄糖甘酶活性，用于肠道疾病和糖尿病的辅助治疗健康食品或药物中。此外，现有技术CN105061621A公开了一种刺梨多糖的超声提取方法，虽然能够显著提高多糖的得率和提取效率，但是其在过程中进行了水浴加热和酶解，在一定程度上会影响刺梨多糖和相关营养成分，如硒含量，也会严重影响其抗氧化能力。因此，研究并优化刺梨多糖的提取工艺具有重要的意义。 [0004] 有鉴于此，特提出本发明。 发明内容[0005] 本发明的目的之一在于提供一种刺梨多糖的制备方法，能够对刺梨果中的多糖进行有效地提取和分离，不仅具有重现性好、提取效率高、提取时间短以及提取成本低的特点，而且能够减少对刺梨果中热敏感性成分的损失和破坏，从而使得到的刺梨多糖的抗氧化活性更好，得到的刺梨硒多糖的硒含量更高。 [0006] 本发明的目的之二在于提供一种刺梨多糖，该刺梨多糖的单糖组分稳定，水溶性好，组分配比独特，具有高的抗氧化活性，能够提高肠道微生物的多样性，调节肠道菌群；同时，刺梨硒多糖的硒含量更高，药理效果更显著。 [0007] 本发明的目的之三在于提供一种刺梨多糖的应用，能够实现较高的营养价值和市场价值，应用效果突出。 [0008] 为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案： [0009] 第一方面，一种刺梨多糖的制备方法，包括以下步骤： [0010] （a）刺梨干粉溶液进行超高压提取，得到提取液； [0011] 所述超高压提取的pH为4 8；~ [0012] 其中，所述超高压提取的压力为200 600MPa，所述超高压提取的时间为3 15min；~ ~ [0013] （b）步骤（a）的提取液经离心后取上清液进行脱蛋白处理，过滤，沉淀，得到所述刺梨多糖。 [0014] 进一步的，所述超高压提取的料液比为1：5 25g/mL；~ [0016] 进一步的，所述超高压提取的压力为500MPa，所述超高压提取的时间为12min； [0017] 优选地，所述刺梨多糖的得率为7.98 ± 0.09%。 [0018] 进一步的，所述刺梨干粉的制备方法包括以下步骤： [0019] 刺梨果经去籽和清洗后再进行干燥和粉碎，过筛，得到所述刺梨干粉； [0020] 优选地，所述刺梨果包括普通刺梨鲜果和富硒刺梨鲜果中的至少一种； [0021] 优选地，所述过筛的方式包括过60 100目筛。~ [0022] 进一步的，所述离心的转速为5000 7000r/min，离心的时间为5 15min；~ ~ [0023] 优选地，所述脱蛋白处理之前还包括将上清液进行浓缩的步骤，从而得到第一浓缩液； [0024] 优选地，所述脱蛋白处理的方式包括Sevage法脱蛋白； [0025] 优选地，所述Sevage法脱蛋白的Sevage溶剂包括氯仿和正丁醇的混合溶液； [0026] 优选地，所述混合溶液中氯仿和正丁醇的体积比为4：1； [0027] 优选地，所述第一浓缩液与所述Sevage溶剂的体积比为3：1。 [0028] 进一步的，所述过滤之前还包括将脱蛋白处理后的上清液进行浓缩的步骤，从而得到第二浓缩液； [0029] 优选地，所述过滤的方式包括利用大孔树脂进行过滤； [0030] 优选地，利用大孔树脂进行过滤的温度为35℃，过滤的时间为12h； [0031] 优选地，所述大孔树脂包括聚酰胺树脂； [0032] 优选地，所述第二浓缩液与所述大孔树脂的体积比为6：1。 [0033] 进一步的，所述沉淀的方式包括醇沉法； [0034] 优选地，所述沉淀之后还包括将沉淀物进行干燥的步骤； [0035] 优选地，所述干燥的方式包括冷冻干燥； [0036] 优选地，所述冷冻干燥的温度为‑80℃。 [0037] 第二方面，一种如上述任一项所述的制备方法制备得到的刺梨多糖。 [0038] 进一步的，所述刺梨多糖包括如下组分： [0040] 优选地，所述古罗糖醛酸、甘露糖醛酸、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、甘露糖、葡萄糖、半乳糖、氨基半乳糖、鼠李糖、岩藻糖、核糖以及阿拉伯糖的摩尔比为0.04：0.81：2.88：194.17：2.44：13.05：38.44：1.06：4.18：1.00：6.36：161.98； [0041] 优选地，所述刺梨多糖包括刺梨硒多糖； [0042] 优选地，所述刺梨硒多糖中古罗糖醛酸、甘露糖醛酸、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、甘露糖、葡萄糖、半乳糖、氨基半乳糖、鼠李糖、岩藻糖、核糖以及阿拉伯糖的摩尔比为0.25：1.51：4.86：19.20：8.47：45.64：62.26：0.97：5.63：1.00：21.78：251.04。 [0043] 第三方面，一种如上述任一项所述的刺梨多糖在饼干、果冻以及糖果的休闲食品中的应用。 [0044] 与现有技术相比，本发明至少具有如下有益效果： [0045] 本发明提供的刺梨多糖的制备方法，通过超高压技术优化了刺梨多糖的提取工艺，相比传统的提取工艺和超声提取方法，本发明的工艺通过超高压的提取方法大大减少了刺梨多糖的提取时间，增加了刺梨多糖的提取效率和得率，有效节省了提取成本。在各工艺参数的协同配合下，本发明的方法能够使刺梨多糖的得率达到7.98 ± 0.09%，显著高于传统提取方法；同时，超高压技术作为非热加工提取方法，能够有效减少刺梨果中热敏感性成分的损失和破坏，得到的刺梨（硒）多糖的抗氧化活性更好，硒含量更高，能够达到312.43‑1μg kg ，是普通刺梨多糖的28.40倍。 [0046] 本发明提供的刺梨多糖，该刺梨多糖的单糖组分稳定，水溶性好，组分配比独特，具有较好的体外抗氧化活性，能够提高肠道微生物的多样性，调节肠道菌群；同时，刺梨硒多糖的硒含量更高，药理效果更显著。 [0048] 为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。 [0049] 图1为本发明一种实施方式提供的超高压提取时的料液比与刺梨多糖得率的关系图； [0050] 图2为本发明一种实施方式提供的超高压提取时的pH值与刺梨多糖得率的关系图； [0051] 图3为本发明一种实施方式提供的超高压提取时的提取压力与刺梨多糖得率的关系图； [0052] 图4为本发明一种实施方式提供的超高压提取时的提取时间与刺梨多糖得率的关系图； [0053] 图5为本发明一种实施方式提供的超高压提取时的乙醇溶剂浓度与刺梨多糖得率的关系图； [0054] 图6为本发明试验例3得到的刺梨多糖和刺梨硒多糖的紫外吸收光谱； [0055] 图7为本发明试验例4得到的刺梨多糖和刺梨硒多糖的红外吸收光谱； [0056] 图8为本发明试验例6得到的刺梨多糖和刺梨硒多糖的浓度与DPPH自由基清除率的关系图； [0057] 图9为本发明试验例6得到的刺梨多糖和刺梨硒多糖的浓度与ABTS自由基清除率的关系图； [0058] 图10为本发明试验例6得到的刺梨多糖和刺梨硒多糖的浓度与SOD活性的关系图。 具体实施方式[0059] 下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。 [0060] 根据本发明的第一个方面，提供了一种刺梨多糖的制备方法，包括以下步骤： [0061] （a）刺梨干粉溶液进行超高压提取，得到提取液； [0062] 超高压提取的pH可以为4 8，其典型但非限制性的pH例如为4、5、6、7、8；~ [0063] 其中，超高压提取的压力可以为200 600MPa，其典型但非限制性的压力例如为~200MPa、300MPa、400MPa、500MPa、600MPa；超高压提取的时间可以为3 15min，其典型但非限~ 制性的时间例如为3min、5ming、7ming、9min、11min、13min、15min； [0064] （b）步骤（a）的提取液经离心后取上清液进行脱蛋白处理，过滤，沉淀，得到刺梨多糖。 [0065] 本发明提供的刺梨多糖的制备方法，通过超高压技术优化了刺梨多糖的提取工艺，相比传统的提取工艺和超声提取方法，本发明的工艺通过超高压的提取方法大大减少了刺梨多糖的提取时间，增加了刺梨多糖的提取效率和得率，有效节省了提取成本。同时，超高压技术作为非热加工提取方法，能够有效减少刺梨果中热敏感性成分的损失和破坏，‑1得到的刺梨（硒）多糖的抗氧化活性更好，硒含量更高，能够达到312.43μg kg ，是普通刺梨多糖的28.40倍。 [0066] 在一种优选的实施方式中，步骤（a）中，超高压提取的料液比可以为1：5 25g/mL；~ 其中，超高压提取的提取溶剂包括但不限于50 70%乙醇，例如可以为50%乙醇、55%乙醇、60%~ 乙醇、65%乙醇、70%乙醇，但不限于此。 [0067] 在一种优选的实施方式中，超高压提取的料液比可以为25g/mL，超高压提取的pH可以为6，超高压提取的压力可以为500MPa，超高压提取的时间可以为12min。 [0068] 在各工艺参数的协同配合下，本发明的制备方法不仅能够使刺梨多糖的得率达到7.98 ± 0.09%，显著高于传统提取方法，而且能够有效减少刺梨果中热敏感性成分的损失和破坏，得到的刺梨（硒）多糖的抗氧化活性更好，硒含量更高。 [0069] 在一种优选的实施方式中，刺梨干粉的制备方法（刺梨原料处理）包括以下步骤： [0070] 刺梨果经去籽和清洗后再进行干燥和粉碎，之后进行过筛，得到刺梨干粉；刺梨果包括但不限于普通刺梨鲜果和富硒刺梨鲜果中的至少一种。 [0071] 本发明的刺梨原料处理：采摘刺梨鲜果，低温运输，以g和mL分别为质量和体积单位，刺梨鲜果经去籽、清洗以及晾干后，再进行粉碎和过筛，之后密封干燥保存，得到刺梨干粉。 [0073] 在一种优选的实施方式中，刺梨粉碎后过筛的方式可以为过60 100目筛，其典型~但非限制性的过筛目数例如为60目、65目、70目、75目、80目、85目、90目、95目、100目，更有利于进一步提高后续超高压提取刺梨多糖的效果。 [0074] 在一种优选的实施方式中，步骤（b）中，离心的转速可以为5000 7000r/min，其典~型但非限制性的转速例如为5000r/min、5500r/min、6000r/min、6500r/min、7000r/min；离心的时间可以为5 15min，其典型但非限制性的时间例如为5min、7min、9min、11min、13min、~ 15min。 [0075] 本发明的离心转速及其时间更有利于进一步提高刺梨多糖的提取效果，进一步保证刺梨多糖的提取效率和得率。 [0076] 在一种优选的实施方式中，步骤（b）中，脱蛋白处理之前还包括将上清液进行浓缩的步骤，从而得到第一浓缩液，例如可以浓缩至原体积的1/4左右，但不限于此，更有利于提高脱蛋白处理的效果。 [0077] 在一种优选的实施方式中，脱蛋白处理的方式包括但不限于Sevage法脱蛋白；其中，Sevage法脱蛋白的Sevage溶剂包括但不限于氯仿和正丁醇的混合溶液，氯仿和正丁醇的体积比例如可以为4：1，但不限于此，更有利于提高Sevage法脱蛋白的处理效果。 [0078] 在本发明中，第一浓缩液与Sevage溶剂的体积比可以为3：1，更有利于进一步提高Sevage法脱蛋白的处理效果。 [0079] 在一种优选的实施方式中，步骤（b）中，过滤（脱色处理）之前还包括将脱蛋白处理后的上清液进行浓缩的步骤，从而得到第二浓缩液，例如可浓缩至原体积的1/4，但不限于此，更有利于提高过滤（脱色处理）效果。 [0080] 在一种优选的实施方式中，过滤（脱色处理）的方式包括但不限于利用大孔树脂进行过滤；其中，大孔树脂过滤的温度可以为35℃，过滤的时间可以为12h，但不限于此，更有利于进一步提高过滤的脱色效果。 [0081] 在一种优选的实施方式中，大孔树脂包括但不限于聚酰胺树脂；其中，第二浓缩液与大孔树脂的体积比可以为6：1，但不限于此，更有利于进一步提高过滤的脱色效果，脱色后的刺梨多糖滤液更有利于后续的沉淀提纯。 [0082] 在一种优选的实施方式中，步骤（b）中，沉淀的方式包括但不限于醇沉法，例如可以向脱色后的刺梨多糖滤液中加入无水乙醇进行醇沉，但不限于此，更有利于进一步提高醇沉效果。 [0083] 在一种优选的实施方式中，醇沉后可以在4℃的温度下静置24h，然后进行离心，例如可以以5000r/min的转速离心10min，但不限于此，之后取沉淀物，更有利于进一步提高沉淀的效果。 [0084] 在一种优选的实施方式中，沉淀之后还包括将沉淀物进行干燥的步骤，从而得到刺梨多糖；其中，干燥的方式包括但不限于冷冻干燥，其温度可以为‑80℃，但不限于此，更有利于进一步提高刺梨多糖的冷冻干燥效果。 [0085] 一种刺梨多糖的典型的制备方法，包括以下步骤： [0086] 1）刺梨原料处理：采摘刺梨鲜果，低温运输至实验室，以g和mL分别为质量和体积单位，刺梨鲜果经去籽、清洗以及晾干后，再进行粉碎，之后过60目筛，密封干燥保存，得到刺梨干粉； [0087] 2）将得到的刺梨干粉溶解于乙醇溶剂中形成溶液，采用NaOH和HCl调节溶液体系的pH，并调节料液比，之后进行超高压提取，得到提取液； [0088] 其中，超高压提取时的料液比、pH值、提取压力、提取时间以及乙醇溶剂浓度分别与刺梨多糖得率的相关性如图1、图2、图3、图4以及图5所示； [0089] 由图1可知，超高压提取过程中，当料液比为20g/mL时，刺梨多糖的得率最高；过高或过低的料液比均会对刺梨多糖的得率产生不利影响； [0090] 由图2可知，刺梨多糖在酸性环境中溶解度较低，而在接近中性的环境有利于多糖的溶出；考虑到pH为6时，刺梨多糖的得率与pH为7和8时的差异性较小，因此可以选择pH为6作为优选的提取条件； [0091] 由图3可知，当超高压提取压力为500Mpa时，刺梨多糖的得率最高；过高或过低的提取压力均会对刺梨多糖的得率产生不利影响； [0092] 由图4可知，当超高压提取时间为12min时，刺梨多糖的得率最高；过长或过短的提取时间均会对刺梨多糖的得率产生不利影响； [0093] 由图5可知，当乙醇溶剂浓度为60%时，刺梨多糖的得率最高；过高或过低的醇含量均会对刺梨多糖的得率产生不利影响； [0094] 3）将得到的提取液进行离心，之后取上清液，得到刺梨多糖提取液，再将其浓缩至原体积的1/4，得到第一浓缩液； [0095] 4）将得到的第一浓缩液与Sevage溶剂可以按体积比3：1混合，进行脱蛋白处理，之后收集脱蛋白后的上清液，可以收集两次； [0096] 5）合并两次脱蛋白后的上清液后，再将其浓缩至原体积的1/4，得到第二浓缩液，然后加入大孔树脂进行脱色处理，得到脱色后的刺梨多糖滤液； [0097] 其中，第二浓缩液与大孔树脂的体积比可以为6：1，过滤脱色的温度可以为35℃，时间可以为12h； [0098] 6）向脱色后的刺梨多糖滤液中加入乙醇，并可以在4℃的温度下静置24h，之后可以在5000r/min的转速下离心10min，取沉淀，得到沉淀物； [0099] 7）将得到的沉淀物在‑80℃的温度下冷冻干燥，得到刺梨多糖。 [0100] 相较于传统刺梨多糖提取工艺，本发明提供的工艺方法能够大大减少提取时间，增加刺梨多糖的提取效率和得率，显著高于传统提取方法，且使用更少的提取溶剂，节省提取成本；同时，本发明方法提取的刺梨多糖单糖组分稳定，水溶性好，组分配比独特，具有出色的抗氧化活性，因此能够有效提高肠道微生物的多样性，调节肠道菌群；此外，本发明的工艺方法还能够对在富硒刺梨的刺梨硒多糖进行提取，能够减少刺梨果中热敏感性成分的‑1损失和破坏，得到的刺梨硒多糖抗氧化活性更好，硒含量更高，能够达到312.43μg kg ，是普通刺梨多糖的28.40倍。 [0101] 根据本发明的第二个方面，提供了一种如上述任一项所述的制备方法制备得到的刺梨多糖。 [0102] 在一种优选的实施方式中，所述刺梨多糖包括如下组分：古罗糖醛酸、甘露糖醛酸、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、甘露糖、葡萄糖、半乳糖、氨基半乳糖、鼠李糖、岩藻糖、核糖以及阿拉伯糖，其质量百分比依次为0.01%，0.21%，0.75%，50.52%，0.59%，3.15%，9.28%，0.4%，1.02%，0.22%，1.28%，32.59%；其摩尔比为0.04：0.81：2.88：194.17：2.44：13.05：38.44： 1.06：4.18：1.00：6.36：161.98。 [0103] 在一种优选的实施方式中，刺梨多糖可以为刺梨硒多糖。 [0104] 在一种优选的实施方式中，刺梨硒多糖中古罗糖醛酸、甘露糖醛酸、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、甘露糖、葡萄糖、半乳糖、氨基半乳糖、鼠李糖、岩藻糖、核糖以及阿拉伯糖的质量百分比依次为0.07%，0.43%，1.38%，5.45%，2.23%，12.02%，16.4%，0.40%，1.50%，0.24%，4.78%，55.10%；其摩尔比为0.25：1.51：4.86：19.20：8.47：45.64：62.26：0.97：5.63：1.00： 21.78：251.04。 [0105] 本发明提供的刺梨多糖，该刺梨（硒）多糖的单糖组分稳定，水溶性好，组分配比独特，具有较好的体外抗氧化活性，能够提高肠道微生物的多样性，调节肠道菌群；同时，刺梨硒多糖的硒含量高，药理效果显著。 [0106] 根据本发明的第三个方面，提供了一种如上述任一项所述的刺梨多糖在饼干、果冻以及糖果的休闲食品中的应用。 [0107] 虽然市场上目前已经出现了刺梨果汁产品和刺梨保健产品，但是刺梨多糖在休闲食品中的应用并不多见。本发明制备得到的刺梨多糖和刺梨硒多糖均具有较好的体外抗氧化活性，能够提高肠道微生物的多样性，调节肠道菌群，将其应用于刺梨饼干、刺梨果冻以及刺梨糖果等的休闲食品中，不仅能够丰富市场上休闲食品的品类，还能够赋予其部分的营养功能，因此具有较高的市场应用价值。 [0108] 由此可见，本发明提供的刺梨多糖的应用，不仅能够丰富市场上休闲食品的品类，而且还能够赋予其部分的营养功能，具有较高的营养价值和市场应用价值，应用效果突出。 [0109] 下面通过实施例对本发明作进一步说明。如无特别说明，实施例中的材料为根据现有方法制备而得，或直接从市场上购得。 [0110] 实施例1 [0111] 一种刺梨多糖RRP的制备方法，包括以下步骤： [0112] 1）刺梨原料处理：采摘 “贵农5号” 刺梨鲜果，低温运输至实验室，以g和mL分别为质量和体积单位，经去籽和清洗后再进行干燥，其中，干燥为鼓风干燥，干燥温度低于65℃，之后粉碎并过60目筛，密封干燥保存，得到刺梨干粉； [0113] 2）称取5g刺梨干粉溶解于浓度60%的乙醇溶剂中形成溶液，得到料液，再用NaOH和HCl调节料液 pH值为6，同时调节料液为25g/mL，之后进行超高压提取，其中，超高压提取的时间为12min，超高压提取的压力为500Mpa，得到提取液； [0114] 3）将步骤 2）得到的提取液进行离心，其中，离心的转速为5000r/min，离心的时间为10min，之后取上清液，得到刺梨多糖提取液，再将其浓缩至原体积的1/4，得到第一浓缩液； [0115] 4）将步骤 3）得到的第一浓缩液与Sevage溶剂按体积比3：1混合，其中，Sevage溶剂为氯仿和正丁醇按体积比4：1混合的混合溶液，进行脱蛋白处理，之后收集上清液，收集两次脱蛋白处理后的上清液； [0116] 5）合并脱蛋白处理后的上清液后，再将其浓缩至原体积的1/4，得到第二浓缩液，然后加入大孔树脂进行过滤脱色处理，其中，大孔树脂为聚酰胺树脂，第二浓缩液与大孔树脂的体积比为6：1，过滤的温度为35℃，过滤的时间为12h，得到脱色后的刺梨多糖滤液； [0117] 6）向脱色后的刺梨多糖滤液中加入乙醇进行沉淀，在4℃的温度下静置24h，在5000r/min的转速下离心10min，取沉淀，得到沉淀物； [0118] 7）沉淀物在‑80℃的温度下进行冷冻干燥，得到刺梨多糖RRP； [0119] 刺梨多糖RRP的得率为7.98%。 [0120] 实施例2 [0121] 一种刺梨硒多糖SeRRP的制备方法，包括以下步骤： [0122] 1）刺梨原料处理：采摘富硒刺梨鲜果，低温运输至实验室，以g和mL分别为质量和体积单位，经去籽和清洗后再进行干燥，其中，干燥为鼓风干燥，干燥温度低于65℃，之后粉碎并过60目筛，密封干燥保存，得到刺梨干粉； [0123] 需要说明的是，本实施例中的富硒刺梨鲜果是在“贵农5号”品种的基础上通过叶面喷施硒肥而得到的； [0124] 2）称取5g刺梨干粉溶解于浓度60%的乙醇溶剂中形成溶液，得到料液，再用NaOH和HCl调节料液pH值为6，同时调节料液为25g/mL，之后进行超高压提取，其中，超高压提取的时间为12min，超高压提取的压力为500Mpa，得到提取液； [0125] 3）将步骤 2）得到的提取液进行离心，其中，离心的转速为5000r/min，离心的时间为10min，之后取上清液，得到刺梨多糖提取液，再将其浓缩至原体积的1/4左右，得到第一浓缩液； [0126] 4）将步骤 3）得到的第一浓缩液与Sevage溶剂按体积比3：1混合，其中，Sevage溶剂为氯仿和正丁醇按体积比4：1混合的混合溶液，进行脱蛋白处理，之后收集上清液，收集两次脱蛋白处理后的上清液； [0127] 5）合并脱蛋白处理后的上清液后，再将其浓缩至原体积的1/4，得到第二浓缩液，然后加入大孔树脂进行过滤脱色处理，其中，大孔树脂为聚酰胺树脂，第二浓缩液与大孔树脂的体积比为6：1，过滤的温度为35℃，过滤的时间为12h，得到脱色后的刺梨多糖滤液； [0128] 6）向脱色后的刺梨多糖滤液中加入乙醇进行沉淀，在4℃的温度下静置24h，在以5000r/min的转速下离心10min，取沉淀，得到沉淀物； [0129] 7）沉淀物在‑80℃的温度下进行冷冻干燥，得到刺梨硒多糖SeRRP。 [0130] 刺梨硒多糖SeRRP的得率为7.65%。 [0131] 实施例3 [0132] 一种刺梨多糖RRP的制备方法，包括以下步骤： [0133] 1）刺梨原料处理：采摘 “贵农5号” 刺梨鲜果，低温运输至实验室，以g和mL分别为质量和体积单位，经去籽和清洗后再进行干燥，其中，干燥为鼓风干燥，干燥温度低于65℃，之后粉碎并过60目筛，密封干燥保存，得到刺梨干粉； [0134] 2）称取5g刺梨干粉溶解于浓度60%的乙醇溶剂中形成溶液，得到料液，再用NaOH和HCl调节料液 pH值为8，同时调节料液为15g/mL，之后进行超高压提取，其中，超高压提取的时间为15min，超高压提取的压力为600Mpa，得到提取液； [0135] 3）将步骤 2）得到的提取液进行离心，其中，离心的转速为7000r/min，离心的时间为15min，之后取上清液，得到刺梨多糖提取液，再将其浓缩至原体积的1/4，得到第一浓缩液； [0136] 4）将步骤 3）得到的第一浓缩液与Sevage溶剂按体积比3：1混合，其中，Sevage溶剂为氯仿和正丁醇按体积比4：1混合的混合溶液，进行脱蛋白处理，之后收集上清液，收集两次脱蛋白处理后的上清液； [0137] 5）合并脱蛋白处理后的上清液后，再将其浓缩至原体积的1/4，得到第二浓缩液，然后加入大孔树脂进行过滤脱色处理，其中，大孔树脂为聚酰胺树脂，第二浓缩液与大孔树脂的体积比为6：1，过滤的温度为35℃，过滤的时间为12h，得到脱色后的刺梨多糖滤液； [0138] 6）向脱色后的刺梨多糖滤液中加入乙醇进行沉淀，在4℃的温度下静置24h，在5000r/min的转速下离心10min，取沉淀，得到沉淀物； [0139] 7）沉淀物在‑80℃的温度下进行冷冻干燥，得到刺梨多糖RRP； [0140] 刺梨多糖RRP的得率为7.75%。 [0141] 实施例4 [0142] 一种刺梨多糖RRP的制备方法，包括以下步骤： [0143] 1）刺梨原料处理：采摘 “贵农5号” 刺梨鲜果，低温运输至实验室，以g和mL分别为质量和体积单位，经去籽和清洗后再进行干燥，其中，干燥为鼓风干燥，干燥温度低于65℃，之后粉碎并过60目筛，密封干燥保存，得到刺梨干粉； [0144] 2）称取5g刺梨干粉溶解于浓度60%的乙醇溶剂中形成溶液，得到料液，再用NaOH和HCl调节料液 pH值为4，同时调节料液为25g/mL，之后进行超高压提取，其中，超高压提取的时间为9min，超高压提取的压力为200Mpa，得到提取液； [0145] 3）将步骤 2）得到的提取液进行离心，其中，离心的转速为6000r/min，离心的时间为10min，之后取上清液，得到刺梨多糖提取液，再将其浓缩至原体积的1/4，得到第一浓缩液； [0146] 4）将步骤 3）得到的第一浓缩液与Sevage溶剂按体积比3：1混合，其中，Sevage溶剂为氯仿和正丁醇按体积比4：1混合的混合溶液，进行脱蛋白处理，之后收集上清液，收集两次脱蛋白处理后的上清液； [0147] 5）合并脱蛋白处理后的上清液后，再将其浓缩至原体积的1/4，得到第二浓缩液，然后加入大孔树脂进行过滤脱色处理，其中，大孔树脂为聚酰胺树脂，第二浓缩液与大孔树脂的体积比为6：1，过滤的温度为35℃，过滤的时间为12h，得到脱色后的刺梨多糖滤液； [0148] 6）向脱色后的刺梨多糖滤液中加入乙醇进行沉淀，在4℃的温度下静置24h，在5000r/min的转速下离心10min，取沉淀，得到沉淀物； [0149] 7）沉淀物在‑80℃的温度下进行冷冻干燥，得到刺梨多糖RRP； [0150] 刺梨多糖RRP的得率为7.38%。 [0151] 实施例5 [0152] 一种刺梨多糖饼干，制备原料按重量份数计包括：刺梨多糖粉1 10份、低筋小麦面~粉30 45份、黄油20 30份、蜂蜜5 10份、赤藓糖醇2 3份、甘露糖醇2 3份、去离子水25 40份、~ ~ ~ ~ ~ ~ 全蛋液10 30份、全脂奶粉10 20份、小苏打0.06 0.22份以及食盐0.05 0.12份。 ~ ~ ~ ~ [0153] 本实施例的刺梨多糖饼干通过以下方法制备得到： [0155] 将刺梨多糖粉与低筋小麦面粉预先搅拌混匀，加入鸡蛋混合液中，搅拌均匀；挤出饼干面坯，烘烤，烘烤后的饼干在室温下自然冷却，待饼体逐步变硬后，拣出烤焦、不规则的饼干，选择带有衬托的防潮性能良好包装袋内进行封口包装。 [0156] 实施例6 [0157] 一种刺梨多糖果冻，制备原料按重量份数计包括：白砂糖9 11份、刺梨多糖粉4 8~ ~份、脱脂奶粉2 5份、氯化钾0.2 0.3份、魔芋胶0.1 0.2份、卡拉胶0.15 0.25份、柠檬酸0.2~ ~ ~ ~ ~ 0.4份、柠檬酸钠0.01 0.1份、乳酸0.10 0.2份、苹果酸0.001 0.1份、羧甲基纤维素钠0.2~ ~ ~ ~ 0.5份、果胶0.05 0.15份以及浓缩水果汁0.10 0.3份，余量为水。 ~ ~ [0158] 实施例7 [0159] 一种刺梨多糖糖果，通过以下制备方法制备得到： [0161] 将造好的粒过40目筛后干燥，其中，干燥温度为60 70℃、干燥时间为3 4h，然后将~ ~1%的硬脂酸镁和适量的薄荷脑加入整粒中混匀，再用三角形冲模压片机，压片成形，得到刺梨多糖糖果，之后放在紫外线下照射15 20min，然后及时包装。 ~ [0162] 试验例1 [0163] 对实施例1得到的刺梨多糖RRP和实施例2得到的刺梨硒多糖SeRRP进行分子量的测定，结果见表1。 [0164] 测定方法：采用高效液相色谱仪来测定两种多糖的分子量分布，将两种5mg的多糖‑1样品SeRRP和RRP分别溶于5mL的磷酸盐缓冲液，配制成浓度为1mg mL 的多糖溶液，用0.22μm的水膜过滤，滤液备用； [0165] 普鲁兰系列葡聚糖标准品（4.32 × 103Da，1.26 × 104Da，7.38 × 104Da，1.26 5 5 5 ‑1 × 10Da，2.89 × 10Da，4.96 × 10Da）通过磷酸盐缓冲液配制成浓度为1mg mL 的标准溶液，进样量20 μL，上样进行检测分析； [0166] 仪器工作条件为：安捷伦1200系列高效液相色谱系统；色谱柱为Tsk gel G‑3000 PWXL7.8 × 300 mm和Tsk gel G‑5000 PWXL7.8 × 300 mm串联使用；流动相为含有0.02M ‑1NaCl的磷酸盐缓冲液（5mM，pH 7.0），流速0.5mL min 。 [0167] 表1 SeRRP和RRP的分子量 [0168] [0169] 注：Mn、Mp、Mw和Mz分别为数均分子量、峰位分子量、重均分子量和平均分子量[0170] SeRRP分子量分布情况：8.2 ×103 3.0 ×104Da（83.9%），3.0 ×104 2.0 ×105Da~ ~5 6 （13.5%），2.0 ×10 1.5 ×10（2.6%）； ~ [0171] RRP分子量分布情况：1.5 ×103 1.4 ×104Da（76.3%），1.4 ×104 9.0 ×104Da~ ~4 5 （18.7%），9.0 ×10 2.4 ×10Da（5.0%）。 ~ [0172] 试验例2 [0173] 对实施例1得到的刺梨多糖RRP和实施例2得到的刺梨硒多糖SeRRP进行单糖组成分析，结果见表2。 [0174] 采用离子色谱法来研究SeRRP和RRP的单糖组成：将5mg的多糖样品SeRRP和RRP分别溶于4mL的2M三氟乙酸中，随后转移到10mL安瓿瓶中，通入氮气后用酒精喷灯使其密封；将其放入110℃的电热恒温干燥箱中反应6h，反应结束后将SeRRP和RRP的水解产物用旋转蒸发仪减压蒸发干燥，用50%的甲醇洗涤3次，以完全除去三氯乙酸，干燥后的水解产物用 1mL的超纯水溶解，过0.22μm的水膜后进行离子色谱分析；同时对单糖标准品进行色谱分‑1 析，检测条件：柱温30℃，洗脱液0.2M的NaOH溶液，流速0.6mLmin ，进样量20μL。 [0175] 由表2可知，SeRRP是一种富含阿拉伯糖的典型杂多糖，由古罗糖醛酸、甘露糖醛酸、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、甘露糖、葡萄糖、半乳糖、氨基半乳糖、鼠李糖、岩藻糖、核糖以及阿拉伯糖共十二种单糖组成，其质量百分比为：0.07%，0.43%，1.38%，5.45%，2.23%，12.02%，16.4%，0.40%，1.50%，0.24%，4.78%，55.10%；摩尔比为：0.25：1.51：4.86：19.20： 8.47：45.64：62.26：0.97：5.63：1.00：21.78：251.04。 [0176] 由表2可知，RRP的单糖组成与SeRRP相同，其质量百分比为：0.01%，0.21%，0.75%，50.52%，0.59%，3.15%，9.28%，0.4%，1.02%，0.22%，1.28%，32.59%；摩尔比为：0.04：0.81： 2.88：194.17：2.44：13.05：38.44：1.06：4.18：1.00：6.36：161.98。 [0177] 表2SeRRP和RRP的单糖组成 [0178] [0179] 试验例3 [0180] 对实施例1得到的刺梨多糖RRP和实施例2得到的刺梨硒多糖SeRRP进行紫外分析，‑1方法为用超纯水配制浓度为1.0 mg mL 的SeRRP和RRP多糖溶液，使用分光光度计在室温下 240 600 nm范围内对两种多糖溶液进行扫描，同时同超纯水做空白以去除基线，结果如图6~ 所示。 [0181] 由图6可知，两种多糖在260 280nm范围内有较强吸收峰，说明其含有蛋白质和核~酸等杂质；SeRRP在此范围内的吸光度强于RRP，表明SeRRP中的蛋白质和核酸含量高于RRP，这和前面得到的SeRRP糖含量较低一致。 [0182] 试验例4 [0183] 对实施例1得到的刺梨多糖RRP和实施例2得到的刺梨硒多糖SeRRP进行红外分析，方法为在干燥环境中将5mg的多糖样品SeRRP和RRP分别与适量的KBr混合，于玛瑙研钵中研磨均匀，随后将其压制成1 mm厚的薄片；再将制好的压片置于傅里叶红外光谱仪上4000~‑1 500cm 的范围内进行扫描，结果如图7所示。 [0184] 由图7可知，富硒没有改变刺梨多糖的主体结构，SeRRP和RRP表现为相似的特征吸‑1 ‑1收峰；3383 cm （3397 cm ）处出现强的吸收峰，可能是‑OH或氨基中的‑NH伸缩振动引起‑1 ‑1 ‑1 的；2925 cm （2926 cm ）处出现的吸收峰，可能与‑CH的伸缩振动有关；1722 cm （1739 ‑1 ‑1 cm ）处出现的吸收峰，归因于C=O的伸缩振动，说明在两种多糖中存在醛基；1607 cm‑1 ‑1 ‑1 （1613 cm ）处出现的吸收峰，可能是由于C=C或者N‑H的伸缩振动；1408 cm （1409 cm ）处出现的吸收峰是由于C=C的振动引起的，说明两种多糖存在糖醛酸，属于酸性多糖。 [0185] 试验例5 [0186] 对实施例1得到的刺梨多糖RRP和实施例2得到的刺梨硒多糖SeRRP进行多糖含量和硒含量测定；采用苯酚硫酸法测定SeRRP和RRP中的多糖含量，结果为SeRRP多糖含量为36.94%，RRP中多糖含量为40.55%；采用原子荧光光度法测定两种多糖中的硒含量，结果表‑1 ‑1 明：RRP中的硒含量为11.00μg kg ，SeRRP中的硒含量为312.43μg kg ，是RRP的28.40倍。 [0187] 试验例6 [0188] 对实施例1得到的刺梨多糖RRP和实施例2得到的刺梨硒多糖SeRRP进行体外抗氧化实验。 [0189] 实验方法：分别称取4mg的维生素C以及多糖样品SeRRP和RRP，采用超纯水定容到‑110mL，制成得到浓度为400 μg mL 的溶液，随后将其稀释至浓度为20、40、80、160、240、320 ‑1 μg mL ，用于测定其对DPPH自由基和ABTS自由基的清除率； [0191] SeRRP和RRP的DPPH自由基的清除率结果如图8所示，从中可知，在实验浓度范围内，维生素C（VC）对DPPH自由基的清除率均达到92%以上，最高可达到95.19±0.25%，显著高‑1于SeRRP和RRP（p<0.05）；SeRRP和RRP的IC50（半抑制浓度）分别为40.49 μg mL 和59.96 μg ‑1 ‑1 mL ；当多糖浓度在20 80μg mL 时，SeRRP的清除率显著高于RRP（p<0.05），但是当浓度高‑1 ~ ‑1 于160μg mL 时（包括160μg mL），SeRRP的清除率低于RRP。 [0192] SeRRP和RRP的ABTS自由基的清除率结果如图9所示，从中可知，维生素C（VC）、SeRRP以及RRP对ABTS自由基抑制作用具有剂量依赖性，在实验浓度范围内，三种样品对自由基的抑制率顺序为维生素C>SeRRP>RRP；维生素C对ABTS自由基的清除率随浓度增加呈现先急速上升，后基本保持不变的趋势，清除率可达98.07±0.96%，远高于SeRRP和RRP；SeRRP和RRP则对ABTS自由基的清除率随浓度的增加而不断增加；SeRRP的抑制率显著高于RRP（p<‑1 ‑1 ‑10.05）；两种多糖的IC50分别为275.88 μg mL 和443.63 μg mL ；当浓度为400 μg mL 时，SeRRP和RRP的抑制率最高，分别为66.67±0.30%，50.31±0.51%，说明SeRRP的抗氧化能力高于RRP，可能是SeRRP中的硒含量较高，也有可能是硒的存在改变了刺梨多糖的组成成分和结构，造成了其在抗氧化活性的差异。 [0193] SeRRP和RRP的SOD活性相关结果如图10所示，从中可知，两种多糖的SOD活性与浓‑1 ‑1度呈剂量关系，当多糖浓度为50μg mL 和200μg mL 时，RRP的SOD活性处于较高水平，当浓‑1 ‑1 度为100μg mL 或者高于200μg mL 时，SeRRP的SOD活性显著高于RRP（p<0.05）；当多糖浓‑1 ‑1 度为800μg mL 时，两种多糖的SOD活性最高，分别为26.82±0.32U mL ，16.82±0.28U mL‑1 。 [0194] 以上结果说明SeRRP的抗氧化能力高于RRP。 [0195] 试验例7 [0196] 对实施例1得到的刺梨多糖RRP和实施例2得到的刺梨硒多糖SeRRP进行肠道功能验证实验，主要探究刺梨硒多糖和刺梨多糖对镉暴露小鼠肠道菌群的影响。 [0197] 实验方法：56只7周龄SPF级雄性Balb/c小鼠在明暗交替各12h、温度为21 25℃、空~气湿度为45 65%的环境中适应性饲养一周后，随机分为7组，每组8只；每三天更换玉米芯垫~ 料，并补充纯净水和大小鼠生长繁殖饲料；配制生理盐水并经高温灭菌后密封存于4℃冰箱‑1 ‑1 中备用，用灭菌的生理盐水配制浓度为0.6 mg mL 的CdCl2溶液和浓度高度为10mg mL 的SeRRP、RRP抗坏血酸溶液；动物实验分组及给药剂量见表3； [0198] 每天上午9:00左右记录小鼠体重、摄食量和饮水量，并对Cd组、PCG组、SRPC组以及‑1RPC组小鼠腹腔注射3mg kg BWCdCl2，对CG组、SRP组以及RP组小鼠腹腔注射等量的生理盐‑1 水；晚上8:00左右对Cd组和CG组小鼠灌胃灭菌的生理盐水，PCG组小鼠灌胃100mg kg BW 抗‑1 ‑1 坏血酸，SRP和SRPC组小鼠灌胃100mg kg BW的SeRRP，RP和RPC组小鼠灌胃100mg kg BW的RRP； [0199] 实验周期为14天，在解剖前12h断食； [0200] 表3动物实验分组及给药剂量 [0201] [0202] 各实验组小鼠喂养14天后，在解剖前12 h禁食，眼球取血后脱颈处死，血液收集于采血管中，采血结束后于4℃冷冻离心机中3000r/min离心15 min，用移液枪（无菌无酶）吸取上层血清，置于无菌无酶的1.5 mL离心管中，储藏于‑80℃冰箱备用； [0203] 取各组小鼠盲肠于标记好的无菌冻存管中，在液氮中冷冻，解剖结束后置于‑80℃冰箱，并尽快用16S RNA扩增子测序检测盲肠内容物中的微生物结构；肾脏和肝脏解剖后迅速称重并记录，将左肾和左叶肝置于甲醛固定液中，右肾和右叶肝置于冻存管中，液氮冷冻，‑80℃冰箱保存备用； [0204] 用Illumina NovaSeq平台对7组小鼠的盲肠内容物进行高通量测序，测序得到的原始数据，经过拼接，并过滤掉低质量和短长度的序列后，得到有效数据； [0205] 为研究各组样本的物种组成，利用Uparse软件对所有样本的有效数据以97%的一致性进行OTU（Operational Taxonomic Units，操作分类单元）聚类；根据聚类得到的OTU结果，研究不同实验组间共有、特有的OTU，绘制花瓣图，各实验组共有的OTU数目为395，Cd、CG、PCG、SRP、SRPC、RP、RPC组独有的OTU数目分别为37、27、19、43、94、23、16，说明不同处理组对小鼠肠道菌群的OTU组成均有不同程度的影响； [0206] SeRRP和RRP处理对小鼠肠道微生物Alpha多样性的影响，Alpha多样性即对样本的复杂程度进行分析，选取OTU数量、shannon指数、simpson指数、chao指数、ACE指数和覆盖率来表征样品中物种分布的多样性和均匀程度，并直观展示测序序列的深度和数据量情况； [0207] 使用Qiime软件计算各实验组小鼠肠道微生物的Alpha多样性指数，如表4所示，OTU数目及观测到的物种数目，覆盖率可较为真实的反应样品的测序深度；由表4可知，各实验组小鼠的OTU数目与对照组（CG组）相比未存在显著性差异（p>0.05）；覆盖率均大于0.998，说明覆盖率良好，样本序列未被检出的概率很低，测序结果满足实验要求。 [0208] Chao指数和ACE指数反应样品中群落的丰富度，指数越大，丰富度越高。与对照组相比，Cd组相差不大，SRP组和SRPC组的chao指数和ACE指数较高，PCG组、RP组和RPC组较低，但均未达到显著性差异（p>0.05）。Shannon指数和Simpson指数用来表征群落内物种分布的多样性和均匀度，群落多样性越高，物种分布越均匀，则Shannon指数和Simpson指数越大。由表4可知，与CG组相比，RP组和RPC组的Shannon指数和Simpson指数均显著降低，表明刺梨多糖会显著影响正常小鼠和镉暴露小鼠肠道维生物的多样性和均匀度。 [0209] 以上结果表明，刺梨硒多糖和刺梨多糖能够增加小鼠肠道微生物的丰富度，显著影响其多样性和均匀度。 [0210] 表4 不同实验组小鼠肠道微生物Alpha多样性指数 [0211] [0212] 科分类学水平小鼠肠道菌群组成分析，各组小鼠的肠道微生物主要的科包括毛螺旋菌科（Lachnospiraceae）、Muribaculaceae、瘤胃菌科（Ruminococcaceae）、普雷沃氏菌科（Prevotellaceae）、理研菌科（Rikenellaceae）、拟杆菌科（Bacteroidaceae）、阿克曼菌科（Akkermansiaceae）、脱铁杆菌科（Deferribacteraceae）和丹毒丝菌科（Erysipelotrichaceae）；其中，毛螺旋菌科、Muribaculaceae和瘤胃菌科所占的比例较高，是实验组小鼠的共同优势菌科； [0213] 另外，在SRPC组中检测到1.26%的双歧杆菌科（Bifidobacteriaceae），在其他的组别中未检测到；对照组的各菌科的比例分别为：46.79%、21.76%、16.97%、0.90%、4.95%、3.75%、0.01%、0.55%、0.16%；与对照组相比，腹腔注射CdCl2后小鼠肠道微生物中毛螺旋菌科和阿克曼菌科的比例无明显变化，瘤胃菌科、理研菌科、脱铁杆菌科和丹毒丝菌科所占的比例增加，Muribaculaceae降低了33.04%；与Cd组相比，PCG组、SRPC组和RPC组中毛螺旋菌科、Muribaculaceae和瘤胃菌科所占比例调整至与正常组相近，说明抗坏血酸、刺梨多糖和刺梨硒多糖均可在科分类学水平上调节镉暴露小鼠的优势菌群。 [0214] 最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。 |
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