[0001] 本发明属于生物技术领域，具体涉及肠乳杆菌ATCC 49335或视黄酸在调节肠道免疫及炎症状态产品制备中的应用。

[0002] 肠道免疫的稳态对维持健康必不可少。在生理情况下，肠道免疫系统能够耐受共生菌，并与共生菌互作，介导免疫系统的正常发育。在病理条件下，许多的病原体，如肠道病毒、细菌等，能通过黏膜入侵机体，造成局部或全身的感染。此外，黏膜免疫也参与了炎症和肿瘤的发生发展。目前，越来越多的证据表明肠道菌群在维持肠道内环境稳定，包括维护肠道粘膜免疫保持适当的反应的方面，具有重要的作用。

[0003] 炎症性肠病（IBD）是一种特发性肠道炎症性疾病，伴随着肠道菌群的失衡和肠道免疫反应的异常。近年来，IBD在我国发病率不断攀升，正显著威胁着我国人民的身体健康。由于其易复发的特点，也给医疗系统带了较重的负担。鉴于肠道菌群在维持肠道内环境稳态方面的重要作用，补充益生菌及相关制剂成为了缓解肠道炎症的潜在手段。

[0004] Th17细胞是一种CD4+辅助性T淋巴细胞亚群，主要存在于肠道、皮肤和肺中。一方面Th17通过分泌炎症因子，清除胞外病原体；另一方面Th17的异常激活，介导了自身免疫反应，参与了炎症性肠病、多发性硬化症、类风湿性关节炎等多种自身免疫性疾病的发生发展。在炎症性肠病中，Th17细胞通过分泌IL17A、IL17F等相关因子，诱导促炎介质的表达、引起组织浸润和破坏。

[0005] 血清淀粉样蛋白A（SAA）是一类急性期反应蛋白，其长期表达会加重肿瘤、炎症等疾病状态。在炎症性肠病患者的肠道炎症组织和血清中，均发现SAA水平的升高，并与疾病活动程度密切相关。机制上，SAA能提高Th17细胞关键转录因子RORγt的活性，从而加重炎症。综上所述，Th17与SAA是IBD的潜在治疗靶点。

[0006] 本发明的目的在于，提供肠乳杆菌（Lactobacillus intestinalis）ATCC 49335在调节结肠炎症状态产品制备中的应用。

[0007] 在采用上述技术方案的同时，本发明还可以采用或者组合采用如下技术方案：

[0008] 作为本发明的一种优选技术方案：所述产品为药品。

[0009] 作为本发明的一种优选技术方案：所述药品还包括药物载体和/或药学上可接受的辅料。

[0010] 作为本发明的一种优选技术方案：所述药品的剂型为丸剂、片剂、散剂、胶囊、颗粒剂、混悬剂、注射剂、口服液、灌肠剂或管饲制剂。

[0011] 肠乳杆菌ATCC 49335分离自大鼠肠道，是来自ATCC的肠乳杆菌标准菌株。

[0012] 本发明通过实验发现肠乳杆菌ATCC 49335提高肠道视黄酸水平，抑制C/EBPA及其下游的SAA，调控Th17细胞，从而维护肠道内环境稳态，调节肠道免疫功能。基于上述的独特功能，该菌或视黄酸可与其他手段协同或互补，可用于制备药物组合物，具有非常广泛的应用前景。此外，对肠乳杆菌丰度的检测，SAA、C/EBPA表达水平的检测、视黄酸水平的检测，可以用于评估肠道免疫调节功能产品或肠道炎症状态调节产品。附图说明

[0013] 图1为肠乳杆菌在小鼠慢性结肠炎症模型中炎症抑制效果图示，图中：A为肠炎症状活动评分，B和C为肠道挛缩情况典型图（B）和统计图（C），D和E为肠道炎症病理表现（D）和评分统计图（E），F和G为炎症因子iNOS（F）、Cox2（G）表达水平，H为脾脏重量统计图。

[0014] 图2为肠乳杆菌在小鼠慢性肠道炎症肠道屏障功能维护效果图示，图中：A为小鼠慢性结肠炎症肠道屏障相关染色及免疫组织化学检查的图片，B、C和D为相应的统计学分析。

[0015] 图3为肠乳杆菌在小鼠急性结肠炎症模型中炎症抑制效果图示，图中：A为肠炎症状活动评分，B和C为肠道挛缩情况典型图（B）和统计图（C），D和E为肠道炎症病理表现（D）和评分统计图（E），F和G为炎症因子iNOS（F）、Cox2（G）表达水平，H为脾脏重量统计图。

[0016] 图4为肠乳杆菌在小鼠结肠炎症模型中Th17分化抑制效果图示，图中：A至F为慢性结肠炎症模型结果，其中，A为通过流式细胞术典型图，B为流式细胞术结果统计图，C为IL17‑A水平酶联免疫吸附测定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）结果，D和E为Th17相关基因表达水平检测结果，F为免疫组织荧光的结果；G至H为急性结肠炎症模型结果，其中，G为流式细胞术结果统计图，H为Th17相关基因表达水平检测结果。

[0017] 图5为肠乳杆菌在小鼠结肠炎症模型肠道上皮细胞及NCM460细胞系中下调SAA表达效果图示，图中：A至B为急性结肠炎症模型小鼠结果，其中，A为SAA免疫组织化学染色结果，B为分离的肠道上皮细胞SAA基因表达水平检测结果；C为NCM460细胞SAA基因表达水平检测结果。

[0018] 图6为肠乳杆菌在小鼠结肠炎症模型肠道上皮细胞及NCM460细胞系中通过下调C/EBPA表达下调SAA表达效果图示，图中：A为荧光素酶报告基因检测结果；B为结肠炎症模型小鼠C/EBPA编码基因（Cebpa）表达检测结果；C和D为NCM460细胞C/EBPA基因转录水平检测（C）和蛋白水平检测（D）结果。

[0019] 图7为肠乳杆菌提高小鼠结肠炎症模型粪便视黄酸浓度效果图示。图为结肠炎模型小鼠粪便中视黄酸浓度的检测结果。

[0020] 图8为视黄酸在小鼠急性结肠炎症模型中炎症抑制、Th17分化抑制效果图示，图中：A为肠炎症状活动评分，B为肠道挛缩情况统计图，C为肠道炎症病理评分统计图，D至F为相关基因表达水平检测，G为流式细胞术结果统计图。

[0021] 图9为肠乳杆菌丰度在溃疡性结肠炎病人（UC病人）中与IL17A等基因相关性的图示，图中：A为检测队列粪便样本基因组DNA肠乳杆菌相对丰度检测结果，B为肠乳杆菌丰度与以上所述的肠乳杆菌调控过程的相关基因之间相关性分析结果。

[0022] 参照附图和具体实施例对本发明作进一步详细地描述。

[0023] 实验部分

[0024] 1. 细菌培养

[0025] 肠乳杆菌（ATCC 49335）培养在MRS培养基中37°C下培养。

[0026] 2. 小鼠结肠炎症模型

[0027] 本实验选择6‑8周C57BL/6雄性小鼠，并在无特定病原体条件下饲养和实验。小鼠被随机分配到各组，每组5‑6只。实验开始前，对所有小鼠进行了3天的抗生素处理（即在饮水中添加2 mg/mL氨苄青霉素、2 mg/mL新霉素、1 mg/mL万古霉素和2 mg/mL甲硝唑），并恢复2‑3天。

[0028] 对于慢性结肠炎，小鼠进行3轮DSS干预。每轮干预为在其饮用水中添加2% DSS持9
续5天，后改为14天普通水。在慢性炎症造模期间，每只小鼠每天口服灌胃1×10CFU肠乳杆菌（肠乳杆菌组）或200 μl PBS（未造模组和PBS组），其中细菌悬浮于PBS中。对于急性结肠炎，每只小鼠预先进行如上口服灌胃处理，后于饮用水中添加3% DSS持续7天，期间继续每日灌胃干预。

[0029] 造模期间每天观察和记录小鼠肠道炎症疾病活动指数。疾病活动指数主要通过小鼠体重减轻（0，无；1，1%‑5%；2，5%‑10%；3，10%‑20%；4，>20%）、粪便情况（0，正常大便；2，稀便；4，腹泻）和直肠出血（0，正常；2，少量血液；4，肉眼血液）三个方面进行评分。

[0030] 3. 小鼠结肠炎症病理分析

[0031] 取0.5 cm左右的小鼠结直肠组织于10%福尔马林中固定过夜，蜡块包埋，切片，并用苏木精和伊红（H&E）染色。两名研究人员以盲法独立评估肠道炎症的程度：炎症严重程度（0，无；1，轻度；2，中度；3，重度），炎症浸润（0，无；1，粘膜；2，粘膜和粘膜下层；3，透壁）和隐窝损伤（0，无；1，基底1/3；2，基底2/3；3，隐窝丢失；4，隐窝和表面上皮破坏），然后将每只动物的分数相加以获得总分。

[0032] 对于免疫组织化学，石蜡包埋的组织切片用抗MUC2抗体、抗Occludin抗体、抗ZO‑1抗体染色，并通过DAB染色进行标记，通过ImageJ进行数据比较分析。对于免疫荧光，石蜡包埋的组织用抗CD4和抗IL‑17A抗体染色。

[0033] 4. 肠道流式细胞术分析

[0034] 取2 cm左右结肠纵向剖开，去除肠内容物、脂肪和血管，剪成0.5 cm的小块，在含有1 mmol/L二硫苏糖醇和5 mM EDTA的D‑Hanks缓冲液中，37°C下摇床孵育20分钟。后将剩余的组织切碎成1‑2 mm的小块，在含有5%热灭活胎牛血清和1 mg/mL IV型胶原酶的Hanks缓冲液中，37°C摇床孵育30分钟。收集细胞悬液，并以200目过滤器过滤，离心，从而获得肠道固有层样本。依次用Fixable Viability Stain 510及表面抗体染色。用固定破膜缓冲液使细胞破核膜，并在室温下进行细胞内染色。

[0035] 5. 细胞系和细胞培养

[0036] 细胞系NCM460和HEK‑293T培养在DMEM完全培养基（DMEM培养基+10%胎牛血清+1%青霉素/链霉素）中，培养条件为37°C，5% CO2。在细菌与细胞共培养的实验中，NCM460细胞培养在不含青霉素/链霉素的完全培养基中，过夜贴壁后，以菌与细胞100：1的比例添加肠乳杆菌，共培养1天。

[0037] 6. 萤光素酶报告基因测定

[0038] 将人SAA1基因启动子区序列和SAA2启动子区序列，分别插入pGL3‑Basic多克隆位点中。将人C/EBPA基因编码序列插入pLVX‑puro中。用PolyJet在HEK‑293T细胞上转染相关质粒。72小时后，使用双荧光素酶报告分析试剂盒测量荧光素酶活性。

[0039] 7. 人结肠样本收集

[0040] 经浙江大学医学院附属邵逸夫医院医学伦理委员会批准，招募了23名健康对照及13名溃疡性结肠炎患者，经知情同意后，收集健康对照人群及患者结肠活检组织，立即保存在‑80°C冰箱中。

[0041] 8. 实时定量RT‑PCR

[0042] Trizol法提取组织总RNA，逆转录后，进行cDNA的定量实时PCR，内参基因为人ACTB或鼠Actb基因。

[0043] 9. DNA提取和细菌定量

[0044] 使用试剂盒提取粪便样本基因组DNA和组织样本gDNA。用定量实时PCR方法检测相应菌种丰度，内参基因为通用16S rRNA基因。

[0045] 10. 蛋白质印迹分析

[0046] 提取细胞或组织蛋白。使用SDS‑聚丙烯酰胺凝胶电泳凝胶分离蛋白质，并转印到PVDF膜上。封闭后，一抗4°C孵育过夜，然后在室温下用二抗孵育2小时，ECL化学发光成像。

[0047] 11. 视黄酸浓度测定

[0048] 粪便准确称量，加入150微升预冷的PBS，匀浆仪匀浆后，每管加入150微升预冷的乙腈，涡旋震荡，随后加入900微升预冷的叔丁基甲醚，涡旋震荡，‑20℃静置1小时，随后4℃ 9000rcf离心20分钟，取800微升上清，真空干燥。质谱检测时加入1毫升甲醇溶液，超声20分钟，震荡1分钟后，14000 g 4℃离心15分钟，取上清进样分析。高效液相色谱流动相：A液为
5%乙腈水溶液含20 mmol/L乙酸铵PH9.45，B液为100%乙腈。样品置于4℃自动进样器中，柱温40℃，流速400 µL/min，进样量5 µL。相关液相梯度如下：0‑0.1 min，B液维持在90%；1‑5 min，B液从90%线性变化到55%；5‑6 min，B液从55%线性变化到40%；6‑7.7 min，B液维持在
40%；7.7‑7.8 min，B液从40%线性变化到90%；7.8‑10 min，B液维持在95%。采用5500 QTRAP质谱仪（AB SCIEX）在正离子模式下进行质谱分析。5500 QTRAP APCI源条件如下：Source Temperature 550, Ion Source Gas1(GAS1): 40, Ion Source Gas2(GAS2): 50, 
Curtain Gas(CUR): 25, Nebulizer current(NC): 3.0。

[0049] 12. 视黄酸干预的小鼠结肠炎症模型

[0050] 如实验部分“2.小鼠结肠炎症模型”所述，本实验选择6‑8周C57BL/6雄性小鼠，并在无特定病原体条件下饲养和实验。每只小鼠预先进行如上口服灌胃处理，后于饮用水中添加3% DSS持续7天，期间继续每日灌胃干预。对于视黄酸干预的急性结肠炎，将视黄酸溶解于羧甲基纤维素钠溶液中，每只小鼠预先进行处理一周，视黄酸干预组小鼠按每千克体重5毫克视黄酸进行灌胃，对照组小鼠以200微升等量的羧甲基纤维素钠溶液灌胃。后于饮用水中添加3% DSS持续7天，期间继每日如前灌胃干预。各项观察检测指标如实验部分“2.小鼠结肠炎症模型”、“3.小鼠结肠炎症病理分析”、“4.肠道流式细胞术分析”及“8.实时定量RT‑PCR”所述。

[0051] 实验讨论部分

[0052] 本发明使用硫酸葡聚糖钠盐（Dextran sulfate，DSS）构建了化学诱导的小鼠急性和慢性结肠炎症模型，相较于未造模组，DSS造模后小鼠对照组（PBS组）的肠道炎症情况明显加重、肠道屏障功能受损，说明造模成果（图1、图2、图3）。

[0053] 肠乳杆菌干预同样可以缓解肠道炎症症状表现。在慢性结肠炎小鼠模型中，肠乳杆菌（L. int组）干预可以缓解肠道炎症，表现为造模过程中更低的肠炎症状活动评分（图1中A所示）、更轻的肠道挛缩情况（图1中B和C所示）和病理损伤（图1中D和E所示）、以及更低的炎症因子水平（图1中F和G所示）；此外，肠乳杆菌干预对以脾脏重量为指标的结肠炎相关全身炎症情况也具有缓解作用（图1中H所示）。在急性结肠炎小鼠模型中，肠乳杆菌干预（L. int组）同样可以缓解肠道急性炎症（图3）。

[0054] 肠乳杆菌维护了肠道屏障功能，保护其免受结肠炎症的损伤。AB‑PAS染色可以显示出肠道黏液层，肠乳杆菌（L. int组）干预后，结肠炎症模型小鼠黏液层更为连续（图2中A所示）。MUC2是杯状细胞分泌的粘液蛋白，是构成粘液层的重要物质，肠乳杆菌干预后，结肠炎症模型小鼠粘蛋白染色面积增大，说明肠乳杆菌使小鼠杯状细胞增多、增大，粘液分泌增多（图2中A和C所示）。Occludin和ZO‑1是紧密连接蛋白，肠乳杆菌干预后，结肠炎症模型小鼠这两类蛋白染色面积增大，说明其蛋白表达增高（图2中A、C和D所示）。

[0055] 肠乳杆菌抑制Th17分化。通过肠道固有层细胞流式细胞术等多种手段发现并证明，肠乳杆菌（L. int组）能显著下调慢性肠道炎症模型中促进炎症的Th17细胞及其相关基因表达水平（图4中A至F所示）。在急性模型中也得到了类似的结果（图4中G和H所示）。

[0056] 肠乳杆菌下调了C/EBPA及SAA表达。血清淀粉样蛋白（SAA）能诱导Th17细胞的分化，可由肠道上皮细胞和固有层中的免疫细胞分泌。通过荧光素酶报告基因实验，我们证明了C/EBPA对SAA基因的转录水平调控（图6中A所示）。免疫组织化学染色定位分析和基因表达水平检测结果表明，肠乳杆菌（L. int组）能下调肠上皮SAA的表达（图5中A和B所示），并下调了C/EBPA的表达（图6中B所示）。以上结果也在NCM460细胞中得到验证（图5中C、图6中C和图6中D所示）。

[0057] 肠乳杆菌提高粪便视黄酸浓度（图7）。视黄酸同样具有缓解肠道炎症、抑制Th17分化、下调C/EBPA及SAA表达的功能（图8）。

[0058] 肠乳杆菌在人群中有潜在的应用价值。溃疡性结肠炎病人（UC病人）中丰度降低（图9中A所示），说明其有作为检测肠道炎症指标的应用价值。肠乳杆菌丰度与以上所述的肠乳杆菌调控过程的相关基因（IL17A、SAA1、SAA2、C/EBPA）之间存在明显的相关性（图9中B所示），说明其在人群中也存在类似的缓解炎症的调控作用。

[0059] 上述具体实施方式用来解释说明本发明，仅为本发明的优选实施例，而不是对本发明进行限制，在本发明的精神和权利要求的保护范围内，对本发明做出的任何修改、等同替换、改进等，都落入本发明的保护范围。