[0001] 本发明属于生物领域，涉及Pipiserpin蛋白在蚊媒种群控制中的应用。

[0002] 蚊媒病目前仍然困扰着全世界的人口，每年造成数百万人死亡，比如疟疾、登革热、基孔肯雅、寨卡、西尼罗河热、日本脑炎和淋巴丝虫病等。近年来，随着全球变暖、全球化和城市化的进程发展，蚊媒疾病的威胁逐步攀升。预防和控制蚊传疾病的主要措施之一仍然为蚊媒控制。然而，作为蚊媒控制的主要方法，化学防制由于蚊抗药性的发展而受到阻碍，急需研发新的蚊媒防制方法。

[0003] 雌蚊卵巢发育和排卵时，需要破坏宿主皮肤来寻找血管吸食血液，而受伤的血管会触发宿主的血小板聚集、血液凝固和血管收缩等一系列止血过程。磷脂依赖性凝血凝血因子x(FXa)在凝血级联中起着核心作用，可以通过内外不同途径共同发挥作用，将X因子(FX)激活为FXa，促进随后的凝血酶生成和纤维蛋白形成。此外FXa还可以通过激活蛋白酶激活的受体，参与炎症和免疫调节。目前已经有三种针对FXa的生理抑制剂的相关报道：抗凝血酶、组织因子通路抑制剂(TFPI)和Z蛋白，且已经从蜱、黑蝇、百舌鸟、水蛭和蚊等吸血动物中克隆并表达出一些FXa抑制剂。1995年，Stark和James发现传播黄热病毒的埃及伊蚊中存在抗凝血剂，并证明它是一种新型的FXa特异性的蛋白酶抑制剂；2012年，Calvo等人报道了另一种也属于蛋白酶抑制剂丝氨酸家族的FXa抑制剂：来自白纹伊蚊的Alboserpin，并证明了Alboserpin可以通过结合肝素和膜磷脂拥有抗血栓活性。

[0004] 丝氨酸蛋白酶抑制剂可以控制蛋白质分解级联的意外触发，当级联被激活时，它们还可以调节相关信号的传播和抑制，因此丝氨酸蛋白酶抑制剂在许多生物过程中均占据核心位置。23个不同的丝氨酸蛋白酶抑制剂家族中，有12个是在昆虫中被发现，如Kunitz、alpha‑macroglobulin、Kazal和serpin家族。节肢动物的丝氨酸蛋白已被确认可以参与调节多种生物功能，包括繁殖、发育、分泌和免疫。但其在蚊摄食、病原体传播和潜在蚊媒防制中的作用研究鲜有报道。

[0005] 本发明的目的是提供新型Xa抑制剂Pipiserpin蛋白在蚊媒种群控制中的应用。

[0006] 本发明的目的可通过以下技术方案实现：

[0007] Xa抑制剂Pipiserpin的编码基因在制备蚊媒种群控制制剂中的应用,Xa抑制剂Pipiserpin的编码基因具有SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。

[0008] Xa抑制剂Pipiserpin蛋白在制备蚊媒种群控制制剂中的应用,Xa抑制剂Pipiserpin蛋白具有SEQ ID No.2所示的氨基酸序列。

[0009] 作为本发明的一种优选，所述的蚊媒种群控制制剂为Pipiserpin蛋白的抗血清。

[0010] Xa抑制剂Pipiserpin蛋白在备蚊媒种群控制中的应用,Xa抑制剂Pipiserpin蛋白具有SEQ ID No.2所示的氨基酸序列。

[0011] 作为本发明的一种优选，所述的Xa抑制剂Pipiserpin蛋白用于接种动物，以产生抗血清，用于蚊媒防制和蚊媒病防控。

[0012] 有益效果：

[0013] 本发明克隆表达了一种新型Xa抑制剂Pipiserpin,其抗血清可以抑制蚊卵巢发育，降低孵化率，由于蚊以动物血液为食，本发明中Pipiserpin蛋白可用于接种动物，以产生抗血清，用于蚊媒防制和蚊媒病防控。附图说明

[0014] 图1 Pipiserpin蛋白表达及纯化

[0015] 图2 Pipiserpin蛋白抗血清与蚊蛋白提取物进行Western印迹分析鉴定[0016] 图3 Pipiserpin蛋白抗血清降低蚊卵孵化率

[0017] 图4 Pipiserpin蛋白抗血清抑制蚊卵泡发育具体实施例

[0018] 实施例1 Pipiserpin基因的获得方法：

[0019] 以淡色库蚊基因组cDNA为模板，进行PCR扩增，得到Pipiserpin基因的全长序列；

[0020] ①提取RNA:从5只雌蚊(1‑3日龄)中提取蚊RNA，提取RNA选用试剂为TRIzol试剂(美国赛默飞世尔科技)。

[0021] ②合成cDNA:根据操作说明，我们用PrimeScript RT试剂盒(日本宝日医生物科技)合成cDNA。

[0022] ③PCR扩增：以蚊cDNA为模板，通过PCR扩增Pipiserpin。

[0023] 根据致倦库蚊的FX介导的抗凝血剂基因设计PCR引物(EI收录号:XM_001848396.1)。

[0024] Pipiserpin上游引物：5’‑ATGCTTCGTTGCTTGTTA‑3’，

[0025] Pipiserpin下游引物：5’‑ACAAGTCACAAAATTTCTAC‑3’

[0026] 每个PCR反应包含1个单位的Pyrobest Taq DNA聚合酶(日本宝日医生物科技)，10ng cDNA，0.4mM的FXa上下游引物，0.2mM dNTPs，以及相关缓冲液，终体积为50ul。扩增环境分别为98℃30秒，98℃10秒，60℃30秒，72℃40秒，延伸30个循环，在72℃延伸10分钟。

[0027] ④将扩增的PCR片段克隆到pGEM‑T Easy载体(美国普洛麦格生物技术)内，用载体特异性引物SP6和T7(美国普洛麦格生物技术)以及cDNA特异性引物进行核苷酸测序，并使用国家生物技术信息中心网站(http://ncbi.nlm.nih.gov)的比对工具BLAST和Clustal Omega(https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/)对序列进行分析。克隆得到的Pipiserpin基因，核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，在Genbank登录号为JQ936560.1。

[0028] 实施例2

[0029] 将权利要求1扩增的编码Pipiserpin的基因片段通过表达载体pET‑32a(德国玉博生物科技)在大肠杆菌株Rosetta TM 2(DE3)(德国玉博生物科技)中表达。在37℃条件下，加入0.5mM IPTG，诱导蛋白的表达。通过连续的Ni2+NTA‑琼脂糖色谱、快速蛋白质液体离子交换色谱(HisTrap FF crude美国通用医疗集团)纯化His6标记的Pipiserpin，从而纯化提取蛋白质。蛋白质的浓度用BCA蛋白质测定试剂盒(Pierce抗体美国)进行测定。蛋白质纯度由库马西染料(考马斯亮蓝；中国)染色的SDS凝胶评估。对照组为pET‑32a在大肠杆菌菌株Rosetta TM 2(DE3)中表达,结果见图1。

[0030] 实施例3制备小鼠抗Pipiserpin血清：

[0031] 对6周龄雌性BALB/c小鼠皮下注射50‑100ug纯化的Pipiserpin蛋白，免疫4次，使其产生针对Pipiserpin的抗体。同时设置pET‑32a的小鼠抗血清作为对照组。抗血清的滴度通过间接ELISA法测定。使用ELx800微板阅读器(BioTek，英国)读取OD 450nm(OD450)。当滴度高于1：50000时，收集最终的抗血清。抗血清与蚊蛋白提取物进行Western印迹分析鉴定,见过见图2。

[0032] 实施例4

[0033] 将羽化后2天的未进行交配的雌蚊和羽化后3天的未交配的雄蚊放在同一笼子里。交配两天后的雌蚊分为六组来进一步观察Pipiserpin对雌蚊的作用，六组分别用pET‑32a抗血清、免疫前血清、5ul、10ul、15ul和20ul的Pipiserpin抗血清(实施例3制备)混合的血液进行喂养，然后在排卵后48小时取出卵筏，进行单管孵育。在体视镜(OLYMPUS SZX2‑FOF,
1J13763,日本)下统计卵和幼虫的数量，并计算各个卵筏的孵化率(HR)。通过显微镜观察卵巢72h PBM和排卵后72小时未孵化的卵筏的胚胎发育情况，检查受精情况。同时计算各组的孵化率。结果表明，与免疫前血清组相比，服用Pipiserpin后孵化率明显下降。随着Pipiserpin抗血清浓度的增加，孵化率也相应下降。平均孵化率与Pipiserpin抗血清的量呈反比，各组间每个蚊卵的数量有明显的差异，而且空白组、pET‑32a抗血清组和预免疫血清组之间的孵化率和每个蚊卵的数量没有明显的差异(图3)。为了验证Pipiserpin是否在卵巢原始卵泡的发育中起作用，我们观察了服用Pipiserpin后卵泡的大小。结果显示，卵巢的生长明显受到抑制。而5ul、10ul、15ul、20ul Pipiserpin抗血清组蚊子的卵泡大小在72h PBM时比免疫前组蚊子小得多。随着Pipiserpin抗血清浓度的增加，卵巢的发育受到抑制的程度更为严重，平均卵泡大小与Pipiserpin抗血清的量呈反比。而空白组、PET‑32a抗血清组和预免疫血清组之间的卵泡大小没有明显差异(图4)。

[0034] 上述结果均表明，Xa抑制剂Pipiserpin可作为蚊媒防制的潜在靶标。在血液中加入Pipiserpin的抗血清后，可阻碍蚊卵巢发育，降低子代孵化率，进而减少蚊种群数量。由于蚊以动物血液为食，Pipiserpin可用于接种动物，以产生抗血清，用于蚊媒防制和蚊媒病防控。