空间诱变高产纤维素酶的里氏木霉菌株
专利汇可以提供空间诱变高产纤维素酶的里氏木霉菌株专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 提供了一种空间诱变高产 纤维 素酶的里氏木霉菌株，属于 微 生物 突变技术领域。本发明优选里氏木霉Rw-X1菌株搭载“神舟九号”进行空间诱变，经过精心筛选培育出能够高产 纤维素 酶的里氏木霉（Trichodermareesei）TG-C521菌株，该菌株已于2014年8月25日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCCNo.9537。本发明利用特殊环境使菌种的遗传形状发生改变，优选出正变异、 稳定性 遗传的菌株，此菌株用于生产纤维素酶，其 滤纸 酶活 力 比里氏木霉Rw-X1菌株提高25.83%~34.49%，环保无污染，具有广阔的工业应用前景。，下面是空间诱变高产纤维素酶的里氏木霉菌株专利的具体信息内容。
1.高产纤维素酶的里氏木霉菌株，其特征在于：该菌株为里氏木霉（Trichoderma reesei）TG-C521菌株，已于2014年8月25日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC No.9537。
2.如权利要求1所述的高产纤维素酶的里氏木霉菌株，其特征在于：它是将里氏木霉Rw-X1菌株经过空间诱变的方法处理后筛选得到的。
3.如权利要求1或2所述的高产纤维素酶的里氏木霉菌株的空间诱变筛选方法，其特征在于，它包括以下步骤：
1）将里氏木霉Rw-X1菌株转接于PDA斜面培养基，培养120h，用无菌水清洗孢子，过滤，离心洗涤后用无菌的20%脱脂牛奶制备孢子悬浮液，冻干，制得孢子冻干粉，搭载“神州九号”飞船进行空间诱变；
2）将所述空间诱变后的孢子冻干粉进行稀释，涂布于纤维素-刚果红筛选培养基，
28~30℃，培养36~48h，待长出单菌落，通过对比透明圈与菌落直径比值大小进行初筛；
3）将所述初筛得到的菌株通过摇瓶发酵培养测定酶活力的方法，筛选得到高酶活力菌株；接着将所述高酶活力菌株经6~8次传代培养验证其遗传稳定性，并结合多批次摇瓶发酵以及发酵罐放大实验，验证其发酵稳定性，得到高产纤维素酶的菌株。
4.如权利要求3所述的高产纤维素酶的里氏木霉菌株的空间诱变筛选方法，其特征在于：所述步骤3）摇瓶发酵的培养基质量百分比组成为，微晶纤维素1~2%，乳糖2~4%，葡萄糖
0.1~0.2%，玉米浆1~2%，酵母粉0.5~1.0%，硫酸铵0.2~0.4%，磷酸二氢钾0.6~1.2%，氯化钙
0.05~0.1%，微量元素0.05~0.1%，余量为水，初始pH值为4.5~4.8。
5.如权利要求4所述的高产纤维素酶的里氏木霉菌株的空间诱变方法，其特征在于：
所述微量元素的质量配比组成为，钼酸铵0.04%，硫酸锌0.2%，硫酸亚铁0.3%，硫酸锰0.1%，氯化钴0.15%，硫酸铜0.1%。
6.如权利要求3所述的高产纤维素酶的里氏木霉菌株的空间诱变筛选方法，其特征在于：所述步骤3）摇瓶发酵的培养条件是：温度28~32℃，摇床转速180~220r/min，接种量为
10~12%，发酵培养时间为6~7d。
7.如权利要求3所述的高产纤维素酶的里氏木霉菌株的空间诱变筛选方法，其特征在于：所述步骤3）发酵罐放大实验的工艺条件为：将经过所述多批次摇瓶发酵筛选得到的菌株种子液以8~10%（v/v）的接种量接入发酵基础培养基中，接种0~10h，通气比为1：
0.6~1.5，搅拌转速200~350r/min，培养温度30~32℃；接种10h以后，通气比为1：1.5~2.0，搅拌转速200~500r/min，培养温度28~30℃；还原糖的含量达到0.3%（w/w）以下时，开始进行补料，补料培养基的加入速率为每小时补料量为发酵基础培养基的0.8~1.5%（v/v），溶氧值为40~60%（v/v），发酵周期为6~7d；所述发酵基础培养基的组成与所述摇瓶发酵培养基的组成相同。
8.如权利要求7所述的高产纤维素酶的里氏木霉菌株的空间诱变筛选方法，其特征在于：所述补料培养基的质量配比组成为，乳糖15~20%，玉米浆2~3%，硫酸铵0.6~0.8%，磷酸二氢钾0.4~0.6%，硫酸镁0.1~0.3%，氯化钙0.05~0.1%，吐温80 0.03~0.05%，微量元素
0.2~0.5%，pH值为4.0~4.5。
9.如权利要求8所述的高产纤维素酶的里氏木霉菌株的空间诱变方法，其特征在于：
所述微量元素的质量配比组成为，钼酸铵0.04%，硫酸锌0.2%，硫酸亚铁0.3%，硫酸锰0.1%，氯化钴0.15%，硫酸铜0.1%。
10.如权利要求1或2所述的高产纤维素酶的里氏木霉菌株，其特征在于：所述里氏木霉（Trichoderma reesei）TG-C521菌株可用于生产纤维素酶。
空间诱变高产纤维素酶的里氏木霉菌株
技术领域
背景技术
发明内容
2）初筛：将所述空间诱变后的孢子冻干粉进行稀释，涂布于纤维素-刚果红筛选培养基，28~30℃，培养36~48h，待长出单菌落，通过对比透明圈与菌落直径比值大小进行初筛；
3）复筛：将所述初筛得到的菌株通过摇瓶发酵培养测定酶活力的方法，筛选得到高酶活力菌株；接着将所述高酶活力菌株经6~8次传代培养验证其遗传稳定性，并结合多批次摇瓶发酵和发酵罐放大实验，验证其发酵稳定性，得到高产纤维素酶的菌株。
具体实施方式
1）初筛：将经空间诱变后的孢子冻干粉，用无菌生理盐水进行梯度稀释，使孢子浓度为
3
10 个/mL，取稀释后的样品0.05mL，涂布于无菌的纤维素-刚果红筛选培养基（121℃，灭菌30min），28℃，培养36h，挑选出透明圈/菌落直径较大的菌株1000株；其中，所述纤维素-刚果红筛选培养基的组成统一为：微晶纤维素10g，葡萄糖2g，琼脂18g，刚果红0.2g，Mandels无机营养盐1000mL，pH值自然；
2）复筛：将步骤1）挑选得到的1000株菌株，分别接入PDA斜面培养基，待孢子铺满斜
7
面，用无菌生理盐水洗下孢子，配制成10 个/mL的孢子悬浮液，分别以10%的接种量（v/v）接入三角瓶产酶培养基（50mL/250mL的装液量）中，于28℃，180r/min，培养6d，筛选得酶活力明显提高的菌株10株；接着对10株菌株分别进行6次传代培养，并进行多批次三角瓶发酵性能测定，最终筛选得到1株遗传性能稳定、发酵性能稳定且高产的产纤维素酶菌株；其中，所述三角瓶产酶培养基的质量百分比组成为微晶纤维素1%，乳糖2%，葡萄糖0.1%，玉米浆1%，酵母粉0.5%，硫酸铵0.2%，磷酸二氢钾0.6%，氯化钙0.05%，微量元素0.05%，pH值为
4.5，余量为水；
滤纸酶活力(FPA)单位统一定义如下：在pH4.8、50℃条件下，每分钟降解底物生成
1.0μmoL葡萄糖所需的酶量。
7
待孢子铺满斜面，用无菌生理盐水洗下孢子，配制成10 个/mL的孢子悬浮液，以10%（v/v）的接种量接入液体种子培养基中，于29℃、180r/min条件下，培养24h，制备种子液；
②发酵培养：将步骤①制备的种子液以8%（v/v）的接种量接入50L发酵罐（3000mL/5000mL的装液量）中，接种后0~10h，通气比1：0.6，搅拌转速200r/min，培养温度
30℃；10h之后，通气比1：1.5，搅拌转速200r/min，培养温度28℃；还原糖含量为0.3%以下时开始进行补料，补料培养基的质量配比组成为乳糖15%，玉米浆2%，硫酸铵0.6%，磷酸二氢钾0.4%，硫酸镁0.1%，氯化钙0.05%，吐温80 0.03%，微量元素0.2%，pH值为4.0，余量为水，其加入速率为240mL/h，溶氧量为40%（v/v），发酵周期为6d；其中，所述液体种子培养基及发酵基础培养基的组成与步骤2）所述三角瓶产酶培养基的组成相同；
本实施例的上述步骤中，所述微量元素的质量配比组成均为，钼酸铵0.04%，硫酸锌
0.2%，硫酸亚铁0.3%，硫酸锰0.1%，氯化钴0.15%，硫酸铜0.1%。
3
10 个/mL，取稀释后的样品0.05mL，涂布于无菌的纤维素-刚果红筛选培养基（121℃，灭菌30min），30℃，培养42h，挑选出透明圈/菌落直径较大的菌株1000株；其中，所述纤维素-刚果红筛选培养基的组成统一为：微晶纤维素10g，葡萄糖2g，琼脂18g，刚果红0.2g，Mandels无机营养盐1000mL，pH值自然；
2）复筛：将步骤1）挑选得到的1000株菌株，分别接入PDA斜面培养基，待孢子铺满斜
7
面，用无菌生理盐水洗下孢子，配制成10 个/mL的孢子悬浮液，分别以10%的接种量（v/v）接入三角瓶产酶培养基（50mL/250mL的装液量）中，于28℃，180r/min，培养6d，筛选得酶活力明显提高的菌株10株；接着对10株菌株分别进行7次传代培养，并进行多批次三角瓶发酵性能测定，最终筛选得到1株遗传性能稳定、发酵性能稳定且高产的产纤维素酶菌株；其中，所述三角瓶产酶培养基的质量百分比组成为微晶纤维素1.5%，乳糖3%，葡萄糖0.15%，玉米浆1.5%，酵母粉0.8%，硫酸铵0.3%，磷酸二氢钾0.8%，氯化钙0.08%，微量元素0.08%，pH值为4.6，余量为水；
滤纸酶活力(FPA)单位统一定义如下：在pH4.8、50℃条件下，每分钟降解底物生成
1.0μmoL葡萄糖所需的酶量。
7
待孢子铺满斜面，用无菌生理盐水洗下孢子，配制成10 个/mL的孢子悬浮液，以10%（v/v）的接种量接入液体种子培养基中，于29℃、180r/min条件下，培养24h，制备种子液；
②发酵培养：将步骤①制备的种子液以8%（v/v）的接种量接入50L发酵罐（3000mL/5000mL的装液量）中，接种后0~10h，通气比1：1.0，搅拌转速280r/min，培养温度
30℃；10h之后，通气比1：1.8，搅拌转速350r/min，培养温度30℃；还原糖含量为0.3%以下时开始进行补料，补料培养基的质量配比组成为乳糖18%，玉米浆2.5%，硫酸铵0.7%，磷酸二氢钾0.5%，硫酸镁0.2%，氯化钙0.08%，吐温80 0.04%，微量元素0.4%，pH值为4.2，余量为水，其加入速率为360mL/h，溶氧量为50%（v/v），发酵周期为6d；其中，所述液体种子培养基及发酵基础培养基的组成与步骤2）所述三角瓶产酶培养基的组成相同；
本实施例的上述步骤中，所述微量元素的质量配比组成均为，钼酸铵0.04%，硫酸锌
0.2%，硫酸亚铁0.3%，硫酸锰0.1%，氯化钴0.15%，硫酸铜0.1%。
3
10 个/mL，取稀释后的样品0.05mL，涂布于无菌的纤维素-刚果红筛选培养基（121℃，灭菌30min），30℃，培养48h，挑选出透明圈/菌落直径较大的菌株1000株；其中，所述纤维素-刚果红筛选培养基的组成统一为：微晶纤维素10g，葡萄糖2g，琼脂18g，刚果红0.2g，Mandels无机营养盐1000mL，pH值自然；
2）复筛：将步骤1）挑选得到的1000株菌株，分别接入PDA斜面培养基，待孢子铺满斜
7
面，用无菌生理盐水洗下孢子，配制成10 个/mL的孢子悬浮液，分别以10%的接种量（v/v）接入三角瓶产酶培养基（50mL/250mL的装液量）中，于28℃，180r/min，培养6d，筛选得酶活力明显提高的菌株10株；接着对10株菌株分别进行8次传代培养，并进行多批次三角瓶发酵性能测定，最终筛选得到1株遗传性能稳定、发酵性能稳定且高产的产纤维素酶菌株；
其中，所述三角瓶产酶培养基的质量百分比组成为微晶纤维素2%，乳糖4%，葡萄糖0.2%，玉米浆2%，酵母粉1.0%，硫酸铵0.4%，磷酸二氢钾1.2%，氯化钙0.1%，微量元素0.1%，pH值为
4.8，余量为水；
滤纸酶活力(FPA)单位统一定义如下：在pH4.8、50℃条件下，每分钟降解底物生成
1.0μmoL葡萄糖所需的酶量。
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