一种针刺小鼠肿瘤模型的构建方法以及针刺调节免疫的应用
阅读：692发布：2020-05-12
专利汇可以提供一种针刺小鼠肿瘤模型的构建方法以及针刺调节免疫的应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及 肿瘤 动物模型技术领域，具体公开一种针刺小鼠肿瘤模型的构建方法以及针刺调节免疫的应用。所述针刺小鼠肿瘤模型的构建方法包括如下步骤：小鼠肿瘤模型，造模成功的模型小鼠随机分成电针组和假电针组，电针组针刺双侧足三里，隔天1次电针干预，时间为20-40分钟，共干预9次，假电针组不进行任何干预。本发明研究发现电针干预可以有效抑制 肺 癌小鼠肿瘤体积和重量，针刺具有直接的抑癌效应，且其抑瘤作用与全身免疫系统的调节、以及增加肿瘤区域免疫细胞的浸润杀伤肿瘤细胞有关。，下面是一种针刺小鼠肿瘤模型的构建方法以及针刺调节免疫的应用专利的具体信息内容。
1.一种针刺小鼠肿瘤模型的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：小鼠肿瘤模型，造模成功的模型小鼠随机分成电针组和假电针组，电针组针刺双侧足三里，隔天1次电针干预，时间为20-40分钟，共干预9次，假电针组不进行任何干预。
2.根据权利要求1所述针刺小鼠肿瘤模型的构建方法，其特征在于，电针干预具体方法如下：小鼠膝关节下外侧，腓骨小头下3.5mm处取穴，于造模后第4天施以干预，电针参数为：
频率2Hz，空载电压1V，调制脉冲为连续波，每次干预时间为30分钟。
3.根据权利要求1所述针刺小鼠肿瘤模型的构建方法，其特征在于，所述小鼠肿瘤模型具体是指小鼠肺癌模型。
4.根据权利要求1-3任一所述针刺小鼠肿瘤模型的构建方法，其特征在于，所述小鼠肺癌模型的构建方法如下：5周龄健康雄性C57BL/6小鼠适应性生长一周，取对数生长期的肺癌LLC细胞，重悬细胞，调整细胞密度至1×107个/mL～3×107个/mL，注射器取0.1～0.2ml细胞混悬液，注入小鼠右颈背部皮下。
5.权利要求1-3任一所述方法构建的模型在研究电针/针刺调控肿瘤的发生机制中的应用，所述调控肿瘤是指对肿瘤瘤体的抑制作用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述抑制作用是指抑制肿瘤的生长，包括抑制肿瘤体积和重量。
7.一种应用于动物实验非治疗目的的抑制在体肿瘤生长的方法，其特征在于，包括采用电针针刺足三里穴位进行干预的步骤，隔天1次电针干预，时间为20-40分钟，共干预9次。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，电针干预具体方法如下：膝关节下外侧，腓骨小头下3.5mm处取穴，于造模后第4天施以干预，电针参数为：频率2Hz，空载电压1V，调制脉冲为连续波，每次干预时间为30分钟。
9.一种应用于动物实验非治疗目的的个体免疫调节的方法，其特征在于，包括采用电针针刺足三里穴位进行干预的步骤，隔天1次电针干预，时间为20-40分钟，共干预9次；电针干预具体方法如下：膝关节下外侧，腓骨小头下3.5mm处取穴，于造模后第4天施以干预，电针参数为：频率2Hz，空载电压1V，调制脉冲为连续波，每次干预时间为30分钟。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述免疫调节具体是指：上调外周CD8+T细胞、CD4+T细胞和NK细胞的比例；增加肿瘤内部CD8+T细胞的浸润，同时增强瘤内CD8+T细胞和CD4+T细胞的功能和活性，从而发挥整体免疫调节作用。
一种针刺小鼠肿瘤模型的构建方法以及针刺调节免疫的应用
技术领域
[0001] 本发明涉及技术肿瘤动物模型技术领域，具体地说，是一种针刺小鼠肿瘤模型的构建方法以及针刺调节免疫的应用。
背景技术
[0002] 目前已经有广泛的研究表明针刺可以对抗肿瘤的癌性痛，以及化疗后的各种副作用。但是针刺本身对肿瘤的影响的研究几乎没有涉及。近年来有限的研究提示针刺可以抑制肿瘤的生长，改善肿瘤患者的情绪，但其内在机制尚不清楚。介于此，我们预实验已经表明针刺对肿瘤的生长具有一定的抑制效应，并在在针刺镇痛研究中还发现针刺具有良好的情绪调节效应。因此针对此科学问题展开，通过研究揭示针刺抗肿瘤的潜在效应机制。
发明内容
[0003] 本发明的第一个目的是针对现有技术中的不足，提供一种针刺小鼠肿瘤模型的构建方法。
[0004] 本发明的第二个目的在于，提供如上所述的模型的用途。
[0005] 本发明的第三个目的在于，提供一种应用于动物实验非治疗目的的抑制在体肿瘤生长的方法。
[0006] 本发明的第四个目的在于，提供一种应用于动物实验非治疗目的的个体免疫调节的方法。
[0007] 为实现上述第一个目的，本发明采取的技术方案是：
[0008] 一种针刺小鼠肿瘤模型的构建方法，包括如下步骤：小鼠肿瘤模型，造模成功的模型小鼠随机分成电针组和假电针组，电针组针刺双侧足三里，隔天1次电针干预，时间为20-40分钟，共干预9次，假电针组不进行任何干预。
[0009] 在上述针刺小鼠肿瘤模型的构建方法中，优选所述电针干预具体方法如下：小鼠膝关节下外侧，腓骨小头下3.5mm处取穴，于造模后第4天施以干预，电针参数为：频率2Hz，空载电压1V，调制脉冲为连续波，每次干预时间为30分钟。
[0010] 在上述针刺小鼠肿瘤模型的构建方法中，优选所述小鼠肿瘤模型具体是指小鼠肺癌模型。
[0011] 在上述针刺小鼠肿瘤模型的构建方法中，优选所述小鼠肺癌模型的构建方法如下：5周龄健康雄性C57BL/6小鼠适应性生长一周，取对数生长期的肺癌LLC细胞，重悬细胞，7 7
调整细胞密度至1×10个/mL～3×10个/mL，注射器取0.1～0.2ml细胞混悬液，注入小鼠右颈背部皮下。
调整细胞密度至1×10个/mL～3×10个/mL，注射器取0.1～0.2ml细胞混悬液，注入小鼠右颈背部皮下。
[0012] 为实现上述第二个目的，本发明采取的技术方案是：
[0013] 如上任一所述方法构建的模型在研究电针/针刺调控肿瘤的发生机制中的应用，所述调控肿瘤是指对肿瘤瘤体的抑制作用。
[0014] 在上述应用中，优选所述抑制作用是指抑制肿瘤的生长，包括抑制肿瘤体积和重量。
[0015] 为实现上述第三个目的，本发明采取的技术方案是：
[0016] 一种应用于动物实验非治疗目的的抑制在体肿瘤生长的方法，包括采用电针针刺足三里穴位进行干预的步骤，隔天1次电针干预，时间为20-40分钟，共干预9次。
[0017] 在上述抑制在体肿瘤生长的方法中，优选所述电针干预具体方法如下：膝关节下外侧，腓骨小头下3.5mm处取穴，于造模后第4天施以干预，电针参数为：频率2Hz，空载电压1V，调制脉冲为连续波，每次干预时间为30分钟。
[0018] 为实现上述第四个目的，本发明采取的技术方案是：
[0019] 一种应用于动物实验非治疗目的的个体免疫调节的方法，包括采用电针针刺足三里穴位进行干预的步骤，隔天1次电针干预，时间为20-40分钟，共干预9次；电针干预具体方法如下：膝关节下外侧，腓骨小头下3.5mm处取穴，于造模后第4天施以干预，电针参数为：频率2Hz，空载电压1V，调制脉冲为连续波，每次干预时间为30分钟。
[0020] 在上述个体免疫调节的方法中，优选所述免疫调节具体是指：上调外周CD3+/CD8+T细胞、CD3-/NKp46+NK细胞，下调CD3+/NKp46+NKT细胞发挥整体免疫调节作用。
[0021] 本发明实验发现电针干预可以有效抑制Lewis肺癌小鼠肿瘤体积和重量，针刺具有直接的抑癌效应。免疫系统的失调与肿瘤的发展密切相关，本发明的实验结果显示累计电针刺激以后，电针可通过上调外周CD3+/CD8+T细胞、CD3-/NKp46+NK细胞，下调CD3+/NKp46+NKT细胞发挥整体免疫调节作用。同时增加CD3+/CD8+T细胞、CD3+/CD8+/IFN+T细胞、CD3+/CD8+/CD107αT细胞、CD3+/CD8+/PD-1/CD107αT细胞在肿瘤组织中的浸润，发挥抑癌效应。本发明的上述发现可作为一种成熟的针刺小鼠肿瘤模型，用于研究明确针刺/电针对于各种不同肿瘤的调节作用，并可进一步研究针刺抑制不同肿瘤的调节作用机制。本发明的针刺具有直接的抑癌效应的这一发现，为体外干预抑制肿瘤生长提供新的技术手段，也可用于实验室非治疗目的的抑制在体肿瘤生长或进行荷瘤动物个体免疫调节。附图说明
[0022] 图1.两组小鼠肿瘤体积比较。注：EA：电针组，Sham：假电针组；单位：mm3。
[0023] 图2.两组小鼠肿瘤重量比较。注：EA：电针组，Sham：假电针组。
[0024] 图3.两组小鼠脾脏T细胞亚群比较。注：EA：电针组，Sham：假电针组。
[0025] 图4.两组小鼠肿瘤组织T细胞亚群比较注：EA：电针组，Sham：假电针组。
具体实施方式
[0026] 下面结合具体实施方式，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明记载的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
[0027] 实施例针刺对常规荷瘤小鼠和应激状态下荷瘤小鼠的非小细胞肺癌皮下肿瘤生长的影响，明确针刺在肿瘤调控中的作用
[0028] 一、实验材料
[0029] 1.实验动物及细胞
[0030] SPF级C57BL/6小鼠、雄性、4-5周龄，体质量18-22g，由上海斯莱克实验动物有限公司提供，许可证号SCXK(沪)2010-0002。饲养于上海中医药大学实验动物中心。饲养环境为12h昼夜节律变换，室温22±2℃，湿度在60％～70％。小鼠Lewis肺癌细胞(Lewis lung cancer cell line，LLC)，为鼠源性的非小细胞肺癌细胞株，由中国科学院上海细胞库提供。
[0031] 2.试剂
[0032] 胎牛血清(购自Gibco)、DMEM培养液(购自ThermoFisher Scientific)、红细胞裂解液(购自Biolegend)。抗体：其中CD45.2(APC-cy7)、CD3(FITC)、CD4(BV605)、CD8(BV510)、NKP46(BV650)、PD-1(BV421)、CD107A(PE)、IFN-gamma(PE-cy7)、granzymeb(AF700)均购自BD Pharmingen；Foxp3(APC)购自eBioscience。戊巴比妥钠(国药集团化学试剂有限公司)。
[0033] 3.仪器
[0034] 电针仪(华佗牌，SDZ-V型，苏州医疗用品厂有限公司)，针灸针(中研太和，北京中研太和医疗器械有限公司)，游标卡尺(上海美耐特实业有限公司)。流式细胞仪(BACKMAN COULTER,CytoFlex LX)。
[0035] 二、实验方法
[0036] 1.动物模型的建立
[0037] 1)配制细胞混悬液：5周龄健康雄性C57BL/6小鼠适应性生长一周，消化收集体外培养至对数生长期的肺癌LLC细胞，采用无血清DMEM培养液重悬细胞，调整细胞密度至1×107个/mL。2)动物麻醉：使用浓度为10mg/mL，剂量为40mg/kg的戊巴比妥钠将小鼠麻醉。3)动物剃毛：用剃毛器将麻醉后的小鼠右侧颈背部毛发剃除干净，充分暴露造模部位。4)进针：定位好后用1mL注射器抽取0.1mL细胞混悬液，平行入针，刺入小鼠右颈背部皮下，形成圆形小皮丘，注射完之后按压入针点，出针，3-4天成瘤。
[0038] 2.分组及治疗
[0039] 造模成功的小鼠随机分组，分为电针组和假电针组。以肿瘤接种当天为第0天，于造模后第4天施以干预。电针组隔天1次电针干预，参数为频率2Hz，空载电压为1V，调制脉冲为连续波，时间为30min。针刺双侧足三里，根据《实验针灸学》确定穴位，足三里位于小鼠膝关节下外侧，腓骨小头下3.5mm处取穴，共治疗9次。假电针组和电针组束缚方式相同，采用小鼠固定装置固定，不予任何干预，30min。
[0040] 3.细胞培养
[0041] LLC细胞株使用含10％胎牛血清的DMEM培养液，在5％CO2、37℃培养箱中培养，每2-3天传代一次。
[0042] 具体操作方法如下：1)将PBS、胰酶、DMEM培养液放入37℃水浴锅内预热，约十分钟左右。2)显微镜下观察培养皿中LLC细胞生长情况，细胞长到80％-90％密度可以传代。3)用吸液器吸掉培养皿中旧的培养液，加2mL 1×PBS洗涤，轻晃培养皿，再吸去PBS。4)加入400μL 1×胰酶消化细胞2-3分钟，晃动培养皿，使充分消化。5)加入2mL DMEM终止消化，移液器吹打数次。6)将培养皿中细胞悬液收集至新的15mL离心管中，在离心机中离心5min，24℃，1000r。7)离心后吸去上清，15mL离心管中加入1mL DMEM培养液重悬。8)培养皿中加入9mL DMEM，按1：3传代。
[0043] 4.观察指标与检测方法
[0044] 肿瘤体积：造模后第6天开始，每3天检测一次肿瘤体积，肿瘤体积计算方法：V＝(Length×width2)/2。
[0045] 肿瘤瘤重：造模后第21天对小鼠进行安乐死处理，取肿瘤组织称重，同时收集脾脏，连同相应的新鲜肿瘤组织制备细胞悬液。
[0046] 抑癌率的测定：抑癌率(％)＝(1-电针组平均瘤重/假电针组平均瘤重)×100％。
[0047] 制备小鼠脾脏细胞悬液：1)取小鼠新鲜脾脏组织放置于200目无菌滤网，将滤网放置无菌6孔板孔中，加入2mL无菌1640培养液润湿；2)取1支1mL注射器针芯(无菌)轻轻碾压脾脏，使脾脏完全破裂；3)取一张新的100目滤网将脾细胞悬液再次过滤并转移至新的15mL离心管中。4)4℃250×g离心5min，弃上清。5)使用1×PBS缓冲液洗涤脾细胞悬液两次。6)用5mL 1×红细胞裂解液重悬脾细胞，冰上静置5min。7)向上述管中加入10mL 1×PBS溶液终止红细胞裂解反应。8)4℃250×g离心5min，弃上清。9)使用含1％FBS的1×PBS溶液重悬脾细胞，取50μL细胞悬液进行流式抗体染色。10)4℃250×g离心5min，弃上清；11)向上述管中加入800μL 1×对聚甲醛进行固定；12)4℃250×g离心5min，弃上清；13)向上述管中加入
500μL 1×破膜液；14)4℃250×g离心5min，弃上清；15)向上述管中加入抗体进行流式抗体染色；16)4℃250×g离心5min，弃上清；17)使用500μL 1×PBS缓冲液重悬细胞，转移至新的管中；18)流式上机检测各通道荧光强度。
500μL 1×破膜液；14)4℃250×g离心5min，弃上清；15)向上述管中加入抗体进行流式抗体染色；16)4℃250×g离心5min，弃上清；17)使用500μL 1×PBS缓冲液重悬细胞，转移至新的管中；18)流式上机检测各通道荧光强度。
[0048] 制备肿瘤组织来源的细胞悬液：1)取无菌PBS对肿瘤组织进行清洗，去除肿瘤组织中残余血液和杂质；2)六孔板孔中加入HBSS溶液，应用高压灭菌后的眼科剪和眼科镊小心将肿瘤组织剪碎至1mm3左右；3)用移液器将含肿瘤组织的HBSS混悬液转移至新的50mL离心管中，分别加入20μL胶原酶和4μL DNA酶；4)将50mL离心管放入摇床孵育60min，避光，37°，转速200；5)将上述管中的混悬液转移至200目无菌滤网，将滤网放置无菌6孔板孔中，取1支1mL注射器针芯(无菌)轻轻碾压肿瘤组织，使肿瘤组织完全破裂；6)取一张新的100目滤网将肿瘤组织细胞悬液再次过滤并转移至新的15mL离心管中；7)4℃250×g离心5min，弃上清；8)使用1×PBS缓冲液洗涤肿瘤组织细胞悬液两次；9)用5mL 1×红细胞裂解液重悬，冰上静置5min；10)向上述管中加入10mL 1×PBS溶液终止红细胞裂解反应；11)4℃250×g离心5min，弃上清；12)使用含1％FBS的1×PBS溶液重悬细胞，取50μL细胞悬液进行流式抗体染色；13)4℃250×g离心5min，弃上清；14)向上述管中加入800μL 1×对聚甲醛进行固定；
15)4℃250×g离心5min，弃上清；16)向上述管中加入500μL 1×破膜液；17)4℃250×g离心
5min，弃上清；18)向上述管中加入抗体进行流式抗体染色；19)4℃250×g离心5min，弃上清；20)使用500μL 1×PBS缓冲液重悬细胞，转移至新的管中；21)流式上机检测各通道荧光强度。
15)4℃250×g离心5min，弃上清；16)向上述管中加入500μL 1×破膜液；17)4℃250×g离心
5min，弃上清；18)向上述管中加入抗体进行流式抗体染色；19)4℃250×g离心5min，弃上清；20)使用500μL 1×PBS缓冲液重悬细胞，转移至新的管中；21)流式上机检测各通道荧光强度。
[0049] 流式细胞术检测：1)调节FSC/SSC探测器(电压)，使细胞群得以清楚呈现，得到一独立离散的细胞族群，该细胞群不与其他族群、细胞碎片有重叠现象；2)Gating圈选，根据FSC/SSC的二维位图，圈出脾脏或肿瘤组织细胞混悬液中的淋巴细胞，选用多边形的Region，划定淋巴细胞P1区域；3)上样阴性对照管，调节各通道之间的电压，设立阴、阳性界限，调节阈值，去除细胞碎片的干扰；4)上样单染管，调节荧光补偿，使各通道间的荧光不相互干扰；5)圈出各个细胞群体，在P1中圈出P2-CD45.2，P3-CD3，P4-CD4，P5-CD8；6)收集实验数据，预设收集细胞数(G5里收集8000-10000个细胞)，上样待测样本；7)使用FlowJO软件进行数据分析。
[0050] 统计学分析：采用SPSS 20.0统计软件进行数据分析，数据用均数±标准差表示。肿瘤体积比较采用重复测量方差分析，继以Tukey进行两两比较。P<0.05为差异有统计学意义的标准。
[0051] 三、结果
[0052] 1.针刺对Lewis肺癌小鼠肿瘤体积的影响
[0053] 结果见图1。组间比较结果显示，造模后第15天开始，电针组(EA)肿瘤体积增长显著低于假电针组(Sham)(P<0.05)。
[0054] 2.针刺对Lewis肺癌小鼠肿瘤重量的影响
[0055] 结果见图2。电针干预至肿瘤接种后的第21天时，电针组瘤体重量低于假电针组，具体为：假电针组1592.3444±427.12505mg，电针组1196.9667±803.41639mg。电针组21d抑瘤率为8.55％。
[0056] 3.针刺对Lewis肺癌小鼠脾脏T细胞亚群的影响
[0057] 结果见图3。电针干预至肿瘤接种后的第21天时，电针组与假电针组相比能够明显调节多种机体免疫细胞。其中CD3+/CD8+T细胞、CD3-/NKp46+NK细胞显著上调(P<0.05)，而CD3+/NKp46+NKT细胞显著下调(P<0.05)，且CD3+/CD4+T细胞也有上升的趋势。
[0058] 4.针刺对Lewis肺癌小鼠肿瘤组织T细胞亚群的影响
[0059] 结果见图4。电针干预至肿瘤接种后的第21天时，电针组与假电针组相比能够明显调节肿瘤组织中多种机体免疫细胞的浸润。其中CD3+/CD8+T细胞、CD3+/CD8+/IFN+T细胞、CD3+/CD8+/CD107αT细胞、CD3+/CD8+/PD-1/CD107αT细胞显著上调(P<0.05)。且CD3+/CD4+/CD107αT细胞、CD3+/CD4+/IFN+T细胞、CD3+/CD8+/PD-1/IFN+T细胞也有上升的趋势。
[0060] 以往的研究提示针刺在缓解癌性疼痛、改善放化疗不良反应、减少恶性肿瘤术后并发症等方面有一定的效果。本研究结果提示电针干预可以有效抑制Lewis肺癌小鼠肿瘤体积和重量，表明针刺具有直接的抑癌效应。免疫系统的失调与肿瘤的发展密切相关，而以往的研究提示针刺对免疫系统具有调节效应。本研究结果表明累计电针刺激以后，电针可通过上调外周CD3+/CD8+T细胞、CD3-/NKp46+NK细胞，下调CD3+/NKp46+NKT细胞发挥整体免疫调节作用。同时增加CD3+/CD8+T细胞、CD3+/CD8+/IFN+T细胞、CD3+/CD8+/CD107αT细胞、CD3+/CD8+/PD-1/CD107αT细胞在肿瘤组织中的浸润，发挥抑癌效应。
[0061] 上述结果表明，电针干预LLC肺癌模型小鼠肿瘤的生长，且电针“足三里”的抑瘤作用是通过对全身免疫系统的调节、以及增加肿瘤区域免疫细胞的浸润杀伤肿瘤细胞有关。
[0062] 以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。
| 标题 | 发布/更新时间 | 阅读量 |
|---|---|---|
| 一种针刺起绒面料及其针刺工艺方法 | 2020-05-11 | 649 |
| 一种针刺机冷却装置及方法 | 2020-05-13 | 794 |
| 一种夜光耐火纤维针刺织物制备方法 | 2020-05-13 | 238 |
| 针刺模拟手法治疗头 | 2020-05-11 | 992 |
| 用于制造针刺纤维结构的旋转针刺法和支承 | 2020-05-12 | 88 |
| 针刺穴位埋线疗法 | 2020-05-11 | 780 |
| 一种低阻力针刺方法 | 2020-05-12 | 998 |
| 针刺止塞及其制造方法 | 2020-05-12 | 680 |
| 一种针刺无纺土工布及其制备方法 | 2020-05-13 | 227 |
| 微电脑针刺手法测试仪 | 2020-05-12 | 149 |
高效检索全球专利专利汇是专利免费检索,专利查询,专利分析-国家发明专利查询检索分析平台，是提供专利分析，专利查询，专利检索等数据服务功能的知识产权数据服务商。
我们的产品包含105个国家的1.26亿组数据，免费查、免费专利分析。
分析报告
专利汇分析报告产品可以对行业情报数据进行梳理分析，涉及维度包括行业专利基本状况分析、地域分析、技术分析、发明人分析、申请人分析、专利权人分析、失效分析、核心专利分析、法律分析、研发重点分析、企业专利处境分析、技术处境分析、专利寿命分析、企业定位分析、引证分析等超过60个分析角度，系统通过AI智能系统对图表进行解读，只需1分钟，一键生成行业专利分析报告。
QQ群二维码
意见反馈
意见反馈