技术领域
[0001] 本
发明涉及一种组织工程支架材料及其制备方法，特别是一种MGF或其E肽修饰的
纳米纤维修复支架及其制备方法。
背景技术
[0002] 组织工程学方法是目前修复组织缺损的常用方法，选择有效的生长因子是其中的关键环节之一。
力生长因子(Mechano-growth factor,MGF)是一种
应力敏感型生长因子，是生长因子-1(Insulin-like growth factor1，IGF-1)的选择性剪切变体，在受应力刺激或损伤的骨骼和肌肉等组织内均高表达。MGF可促进多种
细胞增殖和存活，参与损伤肌肉的修复和再生，并具有神经保护作用(Aperghis M,Johnson IP,Cannon J,Yang SY,Goldspink G.Different levels of neuroprotection by two insulin-like growth factor-I splice variants.Brain Res.2004;1009(1-2):213-8.)。MGF
治疗心肌梗死,能够降低永久缺血损伤面积和增加存活面积。利用力生长因子治疗心脏受损的羊，可恢复心肌功能，使梗死区域得到控制(Carpenter V,Matthews K,Devlin G,Stuart S,Jensen J,Conaglen J,Jeanplong F,Goldspink P,Yang SY,Goldspink G,Bass J,McMahon C.Mechano-growth factor reduces loss of cardiac function in acute myocardial infarction.Heart Lung Circ.2008;17(1):33-9.)。进一步研究发现MGF羧基端E结构域24肽(MGF-Ct24E)(酪
氨酸-谷氨酰胺-脯氨酸-脯氨酸-丝氨酸-苏氨酸-天冬氨酸-赖氨酸-天冬氨酸-苏氨酸-赖氨酸-丝氨酸-谷氨酰胺-精氨酸-精氨酸-赖氨酸-甘氨酸-丝氨酸-苏氨酸-苯丙氨酸-谷氨酸-谷氨酸-组氨酸-赖氨酸)也具有促进细胞增殖、存活以及
骨修复的功能，可以促进细胞表达胞外基质，强化细胞外围机制的功能，有望在应力不足的情况下补偿力学刺激的作用，因此MGF及MGF-Ct24E可作为组织工程一种理想生长因子。利用
静电纺丝技术制备纳米纤维基质，可使用多种材料，设备简单，成本低廉。所得纳米纤维基质结构与组织细胞外基质相似，能够为细胞(包括干细胞)的黏附和生长提供有利的微环境。结合力生长因子和静电纺丝技术优势，有望提供更为理想的组织工程支架。
发明内容
[0003] 本发明要解决的技术问题是构建一种交联MGF或MGF-Ct24E修饰的组织工程纳米纤维支架，目的是在满足一般组织工程纳米纤维支架要求
基础上，进一步利用MGF或MGF-Ct24E促进组织修复，特别是骨、肌肉和血管等组织的修复。
[0004] 为解决上述技术问题，本发明的MGF或MGF-Ct24E修饰的组织工程支架材料由聚L-乳酸(Poly L-lactic acid,PLLA)或聚己内酯(Polycaprolactone,PCL)或PLLA/PCL纳米纤维支架和MGF或MGF-Ct24E构成；其特征在于，利用静电纺丝技术制备PLLA、PCL或PLLA/PCL纳米纤维支架，通过肝素和交联分子聚乙二醇双胺(Poly(ethylene glycol)bis(amine),Di-NH2-PEG)将生长因子MGF或其E肽交联到纳米纤维支架上，形成MGF或MGF-Ct24E修饰的组织工程支架材料，以促进细胞粘附增殖和分化，促进组织修复。
[0005] 本发明中，PLLA、PCL或PLLA/PCL纳米纤维支架可采用常规的静电纺丝的方法制备，静电纺丝过程中可根据需要调节滚筒转速、
电压强度和注射速度等参数，获得各向同性或平行的纳米纤维支架，也可获得内层纳米纤维平行排列而外层纳米纤维各向同性的纳米纤维支架。PLLA、PCL或PLLA/PCL纳米纤维支架中纤维直径控制在0.1-1μm，具有三维微孔结构和良好的联通性。
[0006] 本发明还提供所述的MGF或其E肽修饰的组织工程支架材料的制备方法，具体步骤如下：
[0007] 1)利用静电纺丝技术制备PLLA、PCL或PLLA/PCL纳米纤维支架；
[0008] 2)将步骤1)得到的PLLA、PCL或PLLA/PCL纳米纤维支架浸泡在70-75%的
乙醇溶液中杀菌，然后使用
磷酸盐缓冲液(Phosphate buffered saline,PBS)冲洗3遍，每遍5min，再浸泡在0.01N NaOH中10min以增加表面反应羧基基团；
[0009] 3)先用PBS冲洗PLLA、PCL或PLLA/PCL纳米纤维支架3遍，每遍5min，再使用蒸馏
水冲洗PLLA、PCL或PLLA/PCL纳米纤维支架3遍，每遍5min；
[0010] 4)配制20mg/mL1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基
碳二亚胺
盐酸盐(N-(3-Dimethylaminopropyl)-N-ethylcarbodiimide hydrochloride crystalline,EDC)和10mg/mL N-羟基硫代琥珀酰亚胺(N-Hydroxysulfosuccinimide sodium salt,sulfo-NHS)的溶液备用；
[0011] 5)将PLLA、PCL或PLLA/PCL纳米纤维支架浸泡于步骤4)得到的溶液中30min，再用PBS冲洗3遍，每遍5min；
[0012] 6)配制含20mg/mL EDC、10mg/mL sulfo-NHS和20mg/mL聚乙二醇双胺Di-NH2-PEG的溶液备用；
[0013] 7)将PLLA、PCL或PLLA/PCL纳米纤维支架浸泡于步骤6)得到的溶液中30min，再用PBS冲洗3遍，每遍5min；
[0014] 8)配制含100mg/mL EDC和50mg/mL sulfo-NHS的溶液备用；
[0015] 9)配制25mg/mL肝素的溶液备用；
[0016] 10)将步骤8)和步骤9)得到的溶液按照1:4的比例混合，充分混匀，使用1N NaOH将混合溶液的pH调整为7；
[0017] 11)将PLLA、PCL或PLLA/PCL纳米纤维支架浸泡于步骤10)得到的溶液中3-4h，用PBS冲洗3遍，每遍5min；
[0018] 12)配制
质量浓度为1%的甘氨
酸溶液备用；
[0019] 13)将PLLA、PCL或PLLA/PCL纳米纤维支架浸泡于步骤12)得到的溶液中30min，用PBS冲洗3遍，每遍5min；
[0020] 14)配制浓度为100-1000ng/mL MGF或MGF-Ct24E溶液备用；
[0021] 15)将PLLA、PCL或PLLA/PCL纳米纤维支架浸泡于步骤14)得到的溶液中12h，用PBS冲洗3遍，每遍5min。
[0022] 优选地，步骤1)所述的PLLA、PCL或PLLA/PCL纳米纤维支架制备方法，是以六氟异丙醇为
溶剂配制质量浓度为8-20%的PLLA、PCL或PLLA/PCL溶液，以磁力搅拌器充分搅拌后备用。吸3-4mL上述溶液于医用
注射器中，静电纺丝滚筒接收器上包裹一层
锡纸，调节滚筒转速为20-800r/min、电压强度为5-15kV，以0.5-2mL/h的注射速度将PLLA、PCL或PLLA/PCL溶液电纺到滚筒接收器的锡纸上，获得PLLA、PCL或PLLA/PCL纳米纤维
薄膜，将薄膜从锡纸上取下静置24h得到PLLA、PCL或PLLA/PCL纳米纤维支架备用。
[0023] 优选地，步骤1)所述的PLLA、PCL或PLLA/PCL纳米纤维支架制备成纤维直径为0.3-0.5μm，孔隙率为80%-95%。
[0024] 优选地，步骤4)、6)、8)和9)所述的溶液以pH为5.5、浓度为0.5mol/L的2-(N-吗啉代)乙磺酸溶液作为溶剂。
[0025] 优选地，步骤12)所述的甘氨酸溶液以PBS作为溶剂。
[0026] 优选地，步骤14)所述的MGF或MGF-Ct24E溶液以PBS作为溶剂。
[0027] 优选地，步骤15)所述的浸泡过程在4℃条件下进行。
[0028] 综上所述，本发明的MGF或其E肽修饰的组织工程支架材料是在静电纺丝技术制备PLLA、PCL或PLLA/PCL纳米纤维支架上利用肝素和Di-NH2-PEG交联MGF或MGF-Ct24E获得的。与现有的组织工程支架材料相比，交联了MGF或MGF-Ct24E的纳米纤维支架可促进细胞粘附、增殖和分化，促进骨、肌肉、血管等组织的修复，这也是本发明提出的关键。本发明提供的MGF或其E肽修饰的组织工程支架材料具有良好的
生物相容性，以MGF或其E肽作为生长因子，利用它在细胞粘附、增殖和分化上的促进作用，
加速组织修复速度和质量。同时，将MGF或其E肽固定于材料表面，有利于保持蛋白的结构和功能性。本发明提供的MGF或其E肽修饰的组织工程支架材料可不预种
种子细胞，直接用于组织缺损部位；也可以先复合骨髓间充质干细胞等种子细胞，再植入组织缺损部位。用于制备MGF或其E肽修饰的组织工程支架材料的纳米纤维支架可选择不同材料，只要满足所要修复的要求即可。为简洁起见，本发明主要以PLLA、PCL或PLLA/PCL纳米纤维支架为例加以阐述，其他材料也可以采用相同的原理。
附图说明
[0029] 图1是本发明提供的MGF或其E肽修饰的组织工程支架材料的MGF交联示意图；
[0030] 图2是本发明提供的MGF或其E肽修饰的组织工程支架材料的MGF-Ct24E交联示意图；
[0031] 图3是本发明提供的修饰的组织工程支架材料的扫描
电子显微镜图；
[0032] 其中：1、MGF；2、肝素；3、Di-NH2-PEG；4、纳米纤维；5、MGF-Ct24E。
具体实施方式
[0033] 以下
实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
[0034] 图1和图2分别为本发明提供的MGF或其E肽修饰的组织工程支架材料的MGF和MGF-Ct24E交联示意图。采用常规的静电纺丝的方法制备PLLA、PCL或PLLA/PCL纳米纤维支架，通过肝素2和交联分子Di-NH2-PEG将生长因子MGF或MGF-Ct24E交联到PLLA、PCL或PLLA/PCL纳米纤维支架里纳米纤维4上。
[0035] 以六氟异丙醇为溶剂配制质量分数为8-20%的PLLA、PCL或PLLA/PCL溶液，置于磁力搅拌器中搅拌均匀。使用10mL规格医用注射器吸取3-4mL PLLA、PCL或PLLA/PCL溶液，然后将该注射器安装于注射
泵中。根据滚筒接收器的大小裁减一
块矩形锡纸，固定于滚筒收集器表面上，开启滚筒使其转动，设置转速为20-800r/min。开启高压电源，调节电压强度为5-15kV。设置PLLA、PCL或PLLA/PCL溶液的注射速度为0.5-2mL/h，使得溶液在静
电场中喷出细丝，沉积在滚动的滚筒收集器上，轻轻地将沉积在锡纸上的纳米纤维薄膜取下，静置24h，得到PLLA、PCL或PLLA/PCL纳米纤维支架。图3为本发明提供的MGF或其E肽修饰的组织工程支架材料的扫描电子显微镜图。静电纺丝过程中可根据需要调节滚筒转速、电压强度和注射速度等参数，使纳米纤维支架中纳米纤维4为各向同性或平行，或者内层纳米纤维4平行排列而外层纳米纤维4各向同性。
[0036] 将PLLA、PCL或PLLA/PCL纳米纤维支架裁减为0.5-5cm×0.5-5cm矩形薄膜，先浸泡在70-75%的乙醇溶液中以杀灭细菌，再使用PBS冲洗3遍，每遍5min，然后将上述支架浸泡在0.01N NaOH中10min以增加表面反应羧基基团。使用PBS冲洗3遍，每遍5min，随后使用蒸馏水冲洗3遍，每遍5min。以pH为5.5、浓度为0.5mol/L的2-(N-吗啉代)乙磺酸溶液作为溶剂配置20mg/mL EDC和10mg/mL sulfo-NHS的溶液，将上述PLLA、PCL或PLLA/PCL纳米纤维支架浸泡于此溶液中30min，再使用PBS冲洗3遍，每遍5min。以pH为5.5、浓度为0.5mol/L的2-(N-吗啉代)乙磺酸溶液作为溶剂配制20mg/mL EDC、10mg/mL sulfo-NHS和20mg/mL Di-NH2-PEG的溶液，将纳米纤维浸泡于上述溶液中30min，使用PBS冲洗3遍，每遍5min。以pH为5.5、浓度为0.5mol/L的2-(N-吗啉代)乙磺酸溶液作为溶剂分别配制含100mg/mL EDC和50mg/mL sulfo-NHS的溶液以及含25mg/mL肝素2的溶液。将上述两种溶液按照1:4的比例混合，于摇床上摇晃30min充分混匀，用1N NaOH将上述混合溶液的pH调整为7。将PLLA、PCL或PLLA/PCL纳米纤维支架浸泡于上述混合溶液中3-4h，使用PBS冲洗3遍，每遍5min。配制质量浓度为1%的甘氨酸溶液，将PLLA、PCL或PLLA/PCL纳米纤维浸泡于上述溶液中30min，使用PBS冲洗3遍，每遍5min。配制浓度为500ng/mL MGF或MGF-Ct24E溶液，将PLLA、PCL或PLLA/PCL纳米纤维浸泡于此溶液中12h，使用PBS冲洗3遍，每遍5min，得到MGF或MGF-Ct24E修饰的PLLA、PCL或PLLA/PCL纳米纤维支架。
[0037] 本发明提供的MGF或其E肽修饰的组织工程支架材料是利用肝素和Di-NH2-PEG将MGF或其E肽交联到静电纺丝技术制备的PLLA、PCL或PLLA/PCL纳米纤维支架上获得的。利用MGF或其E肽对细胞增殖、迁移和分化的多种促进功能，加速组织修复速度和质量。制备方法简单且成本低，相比以往的组织工程支架材料有明显的优势。
