技术领域
[0001] 本
发明涉及组织工程和微纳制造技术领域，尤其涉及一种可悬浮皮肤组织工程纳米纤维支架及其制备方法。
背景技术
[0002] 皮肤是人体的重要器官之一，在60天内即可完全更新一次。皮肤不仅能使人体免受污物或细菌的侵袭，也能保持人体内的
水分不致流失。当大面积的皮肤受到严重的烧伤或损害，医生必须立即输入液体并保护伤口，如果仅是皮肤的浅层受损，新皮肤会再生。如果病人受到了严重的烧伤，皮肤就不能靠自己修复。长期以来，人们对严重的皮肤缺损创面，只能靠切取自体正常部位的皮肤移植修复，尽管能治愈创面，但在取皮部位却留下了新的创伤，常常导致疤痕增生，甚至因取皮过深，供皮区难以自愈，形成水疱，反复溃疡。遇到大面积严重烧伤的病人，如果其正常皮肤所剩无几，缺乏自体皮源及时封闭创面，常常引起创面及全身严重的感染等一系列并发症，有可能危机生命。因此，国际医学界一直试图在体外制造一种皮肤代用品，用来更换人体损坏的皮肤组织。
[0003] 组织工程作为一个新兴的边缘学科为烧伤科和整形美容科急需的理想皮肤替代物提供一个很好的解决办法。其核心就是建立细胞与
生物材料的三维空间
复合体，即具有生命
力的活体组织，用以对病损组织进行形态、结构和功能的重建并达到永久性替代。组织工程的基本原理和方法是将体外培养扩增的正常组织细胞，
吸附于一种
生物相容性良好并可被
机体吸收的三维支架上形成复合物，将细胞-三维支架复合物植入机体组织、器官的病损部分，细胞在三维支架逐渐被机体降
解吸收的过程中形成在形态和功能方面与相应器官、组织相一致的新的组织，而达到修复创伤和重建功能的目的。
[0004] 因此组织工程皮肤应运而生，成为组织工程中进展很快的学科，并且发展出成熟的产品。组织工程皮肤是由细胞或细胞外基质或由两者共同结合组成的皮肤产品，是应用生命科学和工程学的原理与技术将
种子细胞与适当的支架材料相结合构建出的用于修复、维护和改善损伤皮肤组织功 能和形态的生物替代物。
[0005] 皮肤组织工程研究分为三个环节:种子细胞、支架材料和体外重扩建技术。支架材料是皮肤组织工程的关键要素，是细胞获取营养、气体交换、废物排泄和生长代谢的场所，是新的具有形态和功能的皮肤组织
基础。其主要功能包括以下两点:1、为体外构建工程皮肤器官提供三维的细胞生长支架，使细胞间形成适宜的空间分布和细胞联系；2、提供特殊的生长和分化
信号，诱导细胞的定向分化和维持细胞分化。皮肤组织工程支架必须具有良好的生物兼容性、良好的
生物降解性、较大的孔隙率和
比表面积以及足够的力学性能。
[0006] 皮肤组织工程支架材料的研究及其优选是人工皮肤的重要研究内容之一，按化学性质可将其分为生物类与合成类。生物类皮肤组织工程支架材料主要有胶原和脱细胞真皮基质，前者是经典的人工皮肤支架材料，但它的缺点就是力学性能差，不易于手术操作；后者是目前研究的热点，美国已用脱细胞尸体皮或猪皮为支架材料制备了人工皮肤，它的优点是力学性能好，
抗原性低，缺点是材料来源非常有限且有传染某些
疾病的危险，限制了其应用。合成类皮肤组织工程支架材料主要是聚交酯、聚内酯、聚羟基烷酸酯、聚
碳酸酯类，但其最大的缺点是缺乏细胞识别信号，不利于细胞粘附及特异基因的激活。
发明内容
[0007] 有鉴于此，本发明的目的在于提供一种具有良好的生物相容性和
生物可降解性，较高的孔隙率和较好的力学性能，可以仿生细胞外基质环境，并且可以悬浮于培养液表面，能够长时间保持平直性和完整性，可以仿生皮肤细胞生长环境，有利于皮肤细胞的粘附、生长、迁移、增殖和分化的皮肤组织工程纳米纤维支架。
[0008] 具体的，为实现上述目的，本发明提供如下技术方案:
[0009] 本发明的可悬浮皮肤组织工程纳米纤维支架由纳米纤维膜和辅助
支撑两部分粘合在一起组成，所述的纤维膜材料为聚乳酸-羟基乙酸共聚物(简称PLGA)，所述的辅助支撑材料为聚丙烯(简称PP)。
[0010] 本发明的技术方案中纤维膜材料选用的聚乳酸-羟基乙酸共聚物，具有良好的生物相容性、无毒、良好 的成囊和成膜的性能，被广泛应用于制药、医用工程材料领域。实验证明聚乳酸-羟基乙酸共聚物
静电纺丝性能较好，便于通过静电纺丝制备纳米纤维。该共聚物由两种
单体乳酸和羟基乙酸聚合而成，通过调整单体比例可以改变聚乳酸-羟基乙酸共聚物的降解时间，实现可控降解。该材料具有良好的力学性能，所得纤维膜
抗拉强度较大，便于进行各种操作。
[0011] 本发明的技术方案中辅助支撑材料选用的聚丙烯，该材料无毒无味，除能被浓
硫酸、浓
硝酸侵蚀外，对其他各种化学
试剂都比较稳定，适合于医药领域。聚丙烯
密度小，是最轻的通用塑料，同时具有良好的力学性能，强度和硬度较高。利用该材料作为辅助支撑可以实现两个功能:实现纳米纤维支架可悬浮于液面；防止纤维膜
变形，实现较长时间纤维膜的平直性和完整性。
[0012] 本发明的可悬浮皮肤组织工程纳米纤维支架可满足皮肤细胞直接通过培养液获得所需营养，同时还可以
接触空气，能够仿生皮肤细胞天热生长环境。
[0013] 本发明也提供了一种制备上述可悬浮皮肤组织工程纳米纤维支架的方法，该方法基于静电纺丝原理，通过控制静电纺丝参数和选择不同接收装置来获得不同结构的纳米纤维膜，最后利用加热方法将纤维膜和辅助支架粘合在一起得到纤维支架，所用静电纺丝设备主要由供液装置、喷射装置、接收装置和高压电源四部分组成，具体的包括下述步骤:
[0014] (I)配备溶质为聚乳酸-羟基乙酸共聚物的静电纺丝溶液，待
溶剂溶解均匀后将其注入
注射器，
挤压排除其中残留的气体，直到喷头出现液滴；
[0015] (2)将注射器安装在微量注射
泵之上，调整推进
挡板位置压紧注射器，设定参数:
电极间距10〜20cm、
电压值4〜10KV、接收装置转速1000〜2000r/min后开始供液；
[0016] (3)打开电源
开关，升高电压并观察喷头尖端液滴的变化，当液滴开始发生形变时，缓慢增加电压值直到形成稳定喷射流；
[0017] (4)纺丝过程结束之后，将接收装置接地，消除残留静电电荷；
[0018] (5)除去接收装置上多余物质，然后把所需部分取下，得到纳米纤维膜；
[0019] (6)将所得纳米纤维膜裁剪成所需形状，聚丙烯辅助支撑放置在纳米纤维膜之上，沿着
外圈进行加热，把纳米纤维膜和辅助支架粘合在一起，最终获得可悬浮皮肤组织工程纳米纤维支架。
[0020] 步骤(I)中，所述静电纺丝溶液的溶剂选用体积比为4: I的四氢呋喃和乙酸
混合液。
[0021] 优选的，所述静电纺丝溶液的浓度为0.2g/ml〜0.4g/ml。
[0022] 步骤(2)中，供液装置实现静电纺丝溶液的精确供给，供液流量为20iU/h〜60u 1/ho
[0023] 所述的接收装置为平板、
转轴或旋转碟片。
[0024] 优选的，通过平板接收装置来获得排列无序的纳米纤维膜，转轴接收装置和旋转碟片接收装置来获得有序的纳米纤维膜。
[0025] 优选的，所述的喷射装置喷头内径为80 iim、IlOiim或160 ii m。
[0026] 过程参数和外界环境对静电纺丝影响较大，为了获得稳定的纺丝过程，步骤(3)需要多次进行，多次重复步骤(3)来确定合适的喷头内径、电极间距和电压值。参数的选择可以依据经验值，静电纺丝时间在I小时以上。
[0027] 步骤(4)用来消除纳米纤维膜上静电电荷，由于静电纺丝需要高压
电场，纤维在静电纺丝过程中会积累大量静电荷，最终形成的纤维膜不方便操作，将接收装置接地，用于消除静电电荷。
[0028] 接收装置中间区域所得纤维膜结构最优，边缘会出现凌乱纤维束，这些结构在将纤维膜从接收装置取下的 过程中会吸附在纤维膜表面，因此需要通过步骤(5)来去除，以防影响纤维膜结构。
[0029] 与
现有技术相比，本发明的有益效果主要体现在以下几个方面:
[0030] 1、所得的纳米纤维支架具有良好的生物相容性和生物可降解性，适用于皮肤组织工程领域；
[0031] 2、所得的纳米纤维支架能够实现可控降解，通过选用不同合成比例聚乳酸-羟基乙酸共聚物得到不同降解周期；
[0032] 3、所得的纳米纤维支架通过静电纺丝方法制备，具有较高孔隙率和比表面积，纤维排列可以实现无序或有序等结构，能够仿生细胞外基质环境；
[0033] 4、所得的纳米纤维支架具有良好的力学性能，其强度和塑性足够，便于进行操作；
[0034] 5、所得的纳米纤维支架可悬浮于液面，可以长时间保持纤维膜的平直性和完整性，能够仿生皮肤细胞天然生长环境；
[0035] 6、所得的纳米纤维支架制备工艺简单，成本较低，易于广泛的应用。
附图说明
[0036] 为了更清楚地说明本发明
实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的有关本发明的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
[0037] 图1是本发明实施例1制备的排列无序的纳米纤维膜的扫描电镜图；
[0038] 图2是本发明实施例4制备的排列有序的纳米纤维膜的扫描电镜图。具体实施方式
[0039] 用于静电纺丝也即构成纳米纤维支架纤维膜的原材料为聚乳酸-羟基乙酸共聚物(poly(lactic-co_glycolic acid),简称PLGA), PLGA具有良好的生物相容性、生物降解性。聚乳酸-羟基乙酸共聚物由两种单体乳酸和羟基乙酸聚合而成，其降解程度随单体比例不同而有差异，乙交酯比例越大越易降解，通过调整单体比例，进而改变聚乳酸-羟基乙酸共聚物的降解时间。
[0040] 下面结合具体实例对本发明的技术方案做进一步的详细阐述。
[0041] 实施例1
[0042] 首先配置浓度为0.3g/ml的聚乳酸-羟基乙酸共聚物溶液，溶剂为体积比为4:I的四氢呋喃/乙酸混合液。溶液在室温下放置24小时，待溶质溶解均匀后通过静电纺丝制备纳米纤维膜。静电纺丝过程参数:电压为6000V ;电极间距为IOcm ;溶液供给流量为40 u 1/h ;接收转轴直径为20mm ;接收转速为2000r/min ;接收时间为1.5h。静电纺丝结束后将接收装置接地，待静电电荷消除后将纳米纤维膜从接收转轴取下，将所得纳米纤维膜裁剪为所需形状，本实例裁剪为圆形，最后通过加热将圆形纳米纤维膜和辅助支架粘合在一起，最终得到可悬浮皮肤组织工程纳米纤维支架。
[0043] 实施例2
[0044] 首先配置浓度为0.4g/ml的聚乳酸-羟基乙酸共聚物溶液，溶剂为体积比为4:I的四氢呋喃/乙酸混合液。溶液在室温下放置24小时，待溶质溶解均匀后通过静电纺丝制备纳米纤维膜。静电纺丝过程参数:电压为4000V ;电极间距为IOcm ;溶液供给流量为
20 u 1/h ;接收 转轴直径为20mm ;接收转速为2000r/min ;接收时间为2h。静电纺丝结束后将接收装置接地，待静电电荷消除后将纳米纤维膜从接收转轴取下，将所得纳米纤维膜裁剪为所需形状，本实例裁剪为圆形，最后通过加热将圆形纳米纤维膜和辅助支架粘合在一起，最终得到可悬浮皮肤组织工程纳米纤维支架。
[0045] 实施例3
[0046] 首先配置浓度为0.2g/ml的聚乳酸-羟基乙酸共聚物溶液，溶剂为体积比为4:I的四氢呋喃/乙酸混合液。溶液在室温下放置24小时，待溶质溶解均匀后通过静电纺丝制备纳米纤维膜。静电纺丝过程参数:电压为10000V ;电极间距为20cm ;溶液供给流量为60 u 1/h ;接收转轴直径为20mm ;接收转速为2000r/min ;接收时间为lh。静电纺丝结束后将接收装置接地，待静电电荷消除后将纳米纤维膜从接收转轴取下，将所得纳米纤维膜裁剪为所需形状，本实例裁剪为圆形，最后通过加热将圆形纳米纤维膜和辅助支架粘合在一起，最终得到可悬浮皮肤组织工程纳米纤维支架。
[0047] 实施例4
[0048] 首先配置浓度为0.3g/ml的聚乳酸-羟基乙酸共聚物溶液，溶剂为体积比为4:I的四氢呋喃/乙酸混合液。溶液在室温下放置24小时，待溶质溶解均匀后通过静电纺丝制备纳米纤维膜。静电纺丝过程参数:电压为6000V ;电极间距为IOcm ;溶液供给流量为40 u 1/h ;接收装置为平板；接收转速为1000r/min ;接收时间为1.5h。静电纺丝结束后将接收装置接地，待静电电荷消除后将纳米纤维膜从接收转轴取下，将所得纳米纤维膜裁剪为所需形状，本实例裁剪为圆形，最后通过加热将圆形纳米纤维膜和辅助支架粘合在一起，最终得到可悬浮皮肤组织工程纳米纤维支架。
[0049] 实施例5
[0050] 首先配置浓度为0.3g/ml的聚乳酸-羟基乙酸共聚物溶液，溶剂为体积比为4:I的四氢呋喃/乙酸混合液。溶液在室温下放置24小时，待溶质溶解均匀后通过静电纺丝制备纳米纤维膜。静电纺丝过程参数:电压为6000V ;电极间距为IOcm ;溶液供给流量为40 u 1/h ;接收装置为旋转碟片；接收转速为1500r/min ;接收时间为1.5h。静电纺丝结束后将接收装置接地，待静电电荷消除后将纳米纤维膜从接收转轴取下，将所得纳米纤维膜裁剪为所需形状，本实例裁剪为圆形，最后通过加热将圆形纳米纤维膜和辅助支架粘合在一起，最终得到可悬浮皮肤组织工程纳米纤维支架。
[0051] 通过平板接收装置获得的纳米纤维膜排列无序，通过转轴接收装置和旋转碟片接收装置获得的纳米纤维膜则排列有序，从附图1和附图2的扫描电镜(SEM)图片可以很明显的看出。
[0052] 上述方法所得纳米纤维支架可以悬浮于培养液表面，能够长时间保持平直性和完整性，可以仿生皮肤细胞生长环境，有利于皮肤细胞的粘附、生长、迁移、增殖和分化，最终形成组织工程真皮。本发明的制备工艺简单，成本较低，易于广泛的应用。
[0053] 对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附
权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。
[0054] 此外，应当理解，虽然本
说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。
