T1/T2双弛豫铂-氧化铁-金纳米颗粒及制备方法
阅读：1036发布：2020-12-10
专利汇可以提供T1/T2双弛豫铂-氧化铁-金纳米颗粒及制备方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开一种T1/T2双弛豫铂- 氧 化 铁 -金纳米颗粒制备方法，利用靶向CXCR4的多肽修饰T1/T2双弛豫铂-氧化铁-金耦合纳米颗粒，本发明所制备的Pt-Fe3O4-Au 纳米粒子 通过控制油酸与五羰基铁的摩尔比，可以实现同分异构体的定向合成，能够提高纳米粒子双 哑铃 结构的 稳定性 ，并实现稳定的T1／T2双增强模态，在此 基础 上制备的CXCR4-Pt-Fe3O4-Au异三聚体纳米粒子具有优秀的磁学性能，良好的 生物 相容性 及对三阴性 乳腺癌 的高靶向性，为早期诊断三阴性乳腺癌提供了新的手段，可用于制备三阴性乳腺癌靶向 造影剂 。，下面是T1/T2双弛豫铂-氧化铁-金纳米颗粒及制备方法专利的具体信息内容。
1.一种T1/T2双弛豫铂-氧化铁-金纳米颗粒的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
1）合成Pt纳米颗粒：
在氮气氛围下，将1-十八烯、油酸胺、油酸按体积比10:1:1的比例进行混合；加入质量比为1:1的二价乙酰丙酮铂与二价乙酰油胺；真空条件下加热至100-120℃，氩气氛围下继续加热至180-200℃，再加入五羰基铁溶液（与二价乙酰丙酮摩尔比为1：4）得到混合液，加热至190-220℃，反应1h；冷却到室温，离心，异丙基醇清洗得纳米颗粒，正己烷溶剂二次纯化，乙醇清洗；
2）合成氧化铁离子保护保护基团封闭Pt区的Pt-Fe3O4双哑铃结构纳米颗粒：
将1-十八烯和油酸按20：1-40：1的体积比混合均匀，90-120℃条件下，用氮气流持续脱气20-30分钟；在氮气氛围下，加入五羰基铁（油酸/无羰基铁的摩尔比：1.5/1-3/1），10-
20min后，注入摩尔比为：1:1-2:1的油酸胺和Pt纳米颗粒种子，所得溶液在250-300℃条件下反应15-20min，冷却到室温；乙醇及正己烷纯化分离得纳米颗粒；
3）定向合成同分异构体Pt-Fe3O4-Au异三聚体纳米颗粒：
将1-十八烯和油胺按20:1-20：3的体积比混合均匀，加入氯金酸搅拌，加温至60-100℃；氮气保护下，加入步骤2）制备的铂-氧化铁纳米颗粒（与氯金酸摩尔比为1:1），加热1.5-
2.5小时，冷却到室温；利用异丙醇纯化清洗，得Pt-Fe3O4-Au纳米粒子。
2.一种T1/T2双弛豫CXCR4单抗修饰的铂-氧化铁-金耦合纳米颗粒制备方法，具体步骤包括：
1）将权利1所制备的Pt-Fe3O4-Au纳米粒子水溶性羧基功能化：
将权利1所制备的Pt-Fe3O4-Au纳米粒子溶于氯仿；将质量比1:1的多巴胺DMF溶液、无水碳酸钠混合，加入DB-HNT氯仿溶液（与多巴胺DMF溶液体积比1:1-1:2）室温下搅拌均匀；
将质量比为1:2:25-1:2:50的EDAC、NHS和羧基功能化的叠氮聚乙二醇氯仿溶液混合搅拌均匀，加入到Pt-Fe3O4-Au纳米粒子氯仿溶液；正己烷纯化洗涤两次后，氮气流下干燥溶解在水中，通过微米滤膜过滤后离心，浓缩洗涤后溶解于水中，加入质量比1:20:2-1:20:4的硫酸铜、抗坏血酸和氨基功能化的炔基PEG，搅拌2h后，离心，洗涤浓缩后溶于碳酸氢钠缓冲液中，加入与抗坏血酸和氨基功能化的炔基PEG质量比为1:1的琥珀酰亚胺酯-钆-DOTA，搅拌2小时后，离心，洗涤浓缩，得水溶性羧基功能化的Pt-Fe3O4-Au纳米粒子，备用；
2）制备靶向性CXCR4-Pt-Fe3O4-Au异三聚体纳米粒子：
CXCR4靶向肽经过EDC和NHS活化后得到活性酯，然后在水相中与步骤1）制备的水溶性羧基功能化的Pt-Fe3O4-Au纳米粒子表面的氨基进行连接，反应完毕后用PD-10凝胶柱进行纯化，得到CXCR4修饰的C-DB-HNT。
3.如权利要求1所述的Pt-Fe3O4-Au纳米粒子在制备T1/T2双增强造影剂中用途。
4.如权利要求2所述的CXCR4- Pt-Fe3O4-Au异三聚体纳米粒子在制备三阴性乳腺癌靶向造影剂中用途。
T1/T2双弛豫铂-氧化铁-金纳米颗粒及制备方法
技术领域
背景技术
[0002] 乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，严重威胁女性生理健康。目前，对雌激素受体(ER)，孕激素受体(PR)、以及人表皮生长因子受体2（HER2）阳性的乳腺癌的诊断和治疗已经有突破性的进展，通过靶向这些受体，可实现其特异诊断和个体化治疗，并已取得良好的效果。然而对于缺乏激素受体和HER2表达的三阴性乳腺癌（TNBC），因其缺乏特异性分子标志物，则早期难以实现准确诊断，同时由于缺乏特异性治疗药物导致其患者生存率不高。前期研究发现，C-X-C趋化因子受体4（CXCR4）在三阴性乳腺癌中具有较高的表达并且与其预后具有密切关系。
[0003] 目前，MRI在早期诊断乳腺癌中具备重大价值，但是现有的造影剂尚存在一些不足，现在的造影剂合成策略所得产物多为同一产物的不同同分异构体所组成，缺乏定向合成单一同分异构体产物的方案，同时临床所采用的造影剂缺乏靶向性，且仅为T1WI对比剂，缺乏T2WI的对比成像，对肿瘤的微结构缺乏较高的软组织对比度，因此对乳腺癌中的微钙化及其病理分型难以做出正确诊断，不能满足对三阴性乳腺癌的临床诊断需求。因此，目前迫切需求开发一种实现同分异构体可控的，同时具有T1/T2增强效果，实现高亲和力和高敏感性的靶向CXCR4受体成像的新型纳米粒子的化学合成策略，以实现对三阴性乳腺癌的早期精确诊断。
[0004] 发明内容：本发明提供了一种T1/T2双弛豫铂-氧化铁-金耦合纳米颗粒（简称DB-HNT）（图1），通过合成靶CXCR4的多肽修饰的双哑铃结构的T1/T2双弛豫铂-氧化铁-金耦合纳米颗粒（简称为CM-DB-HNT）可以用于乳腺癌的靶向诊断，为早期诊断三阴性乳腺癌提供新的思路和依据。
[0005] 本发明进一步公开了定向合成同分异构体T1/T2双弛豫铂-氧化铁-金耦合纳米颗粒的制备方法，利用靶向CXCR4的多肽对T1/T2双弛豫铂-氧化铁-金耦合纳米颗粒进行修饰颗粒。
[0006] 本发明所述的一种T1/T2双弛豫铂-氧化铁-金纳米颗粒的制备方法，其特征在于包括以下步骤：1）合成Pt纳米颗粒：
在氮气氛围下，将1-十八烯、油酸胺、油酸按体积比10:1:1-20:1:1的比例进行混合；加入质量比为1:1的二价乙酰丙酮铂与二价乙酰油胺；真空条件下加热至100-120℃，氩气氛围下继续加热至180-200℃，再加入五羰基铁溶液（与二价乙酰丙酮摩尔比为1：4）得到混合液，加热至190-220℃，反应1h；冷却到室温，离心，异丙基醇清洗得纳米颗粒，正己烷溶剂二次纯化，乙醇清洗；
2）合成氧化铁离子保护基团封闭Pt区的Pt-Fe3O4双哑铃结构纳米颗粒：
将1-十八烯和油酸按20：1-40：1的体积比混合均匀，90-120℃条件下，用氮气流持续脱气20-30分钟；在氮气氛围下，加入五羰基铁（油酸/无羰基铁的摩尔比：1.5/1-3/1），10-
20min后，注入摩尔比为1:1-2:1的油酸胺和Pt纳米颗粒种子，所得溶液在250-300℃条件下反应15-20min，冷却到室温；乙醇及正己烷纯化分离得纳米颗粒；
3）定向合成同分异构体Pt-Fe3O4-Au异三聚体纳米颗粒：
将1-十八烯和油胺按20:1-20：3的体积比混合均匀，加入氯金酸搅拌，加温至60-100℃；氮气保护下，加入步骤2）制备的铂-氧化铁纳米颗粒（与氯金酸摩尔比为1:1-1:2），加热
1.5-2.5小时，冷却到室温；利用异丙醇纯化清洗，得Pt-Fe3O4-Au纳米粒子。
在氮气氛围下，将1-十八烯、油酸胺、油酸按体积比10:1:1-20:1:1的比例进行混合；加入质量比为1:1的二价乙酰丙酮铂与二价乙酰油胺；真空条件下加热至100-120℃，氩气氛围下继续加热至180-200℃，再加入五羰基铁溶液（与二价乙酰丙酮摩尔比为1：4）得到混合液，加热至190-220℃，反应1h；冷却到室温，离心，异丙基醇清洗得纳米颗粒，正己烷溶剂二次纯化，乙醇清洗；
2）合成氧化铁离子保护基团封闭Pt区的Pt-Fe3O4双哑铃结构纳米颗粒：
将1-十八烯和油酸按20：1-40：1的体积比混合均匀，90-120℃条件下，用氮气流持续脱气20-30分钟；在氮气氛围下，加入五羰基铁（油酸/无羰基铁的摩尔比：1.5/1-3/1），10-
20min后，注入摩尔比为1:1-2:1的油酸胺和Pt纳米颗粒种子，所得溶液在250-300℃条件下反应15-20min，冷却到室温；乙醇及正己烷纯化分离得纳米颗粒；
3）定向合成同分异构体Pt-Fe3O4-Au异三聚体纳米颗粒：
将1-十八烯和油胺按20:1-20：3的体积比混合均匀，加入氯金酸搅拌，加温至60-100℃；氮气保护下，加入步骤2）制备的铂-氧化铁纳米颗粒（与氯金酸摩尔比为1:1-1:2），加热
1.5-2.5小时，冷却到室温；利用异丙醇纯化清洗，得Pt-Fe3O4-Au纳米粒子。
[0007] 本发明提供的一种T1/T2双弛豫CXCR4单抗修饰的铂-氧化铁-金耦合纳米颗粒制备方法，具体步骤包括：1）将Pt-Fe3O4-Au纳米粒子水溶性羧基功能化：
将本发明所制备的Pt-Fe3O4-Au纳米粒子溶于氯仿；将质量比1:1的多巴胺DMF溶液、无水碳酸钠混合，加入DB-HNT氯仿溶液（与多巴胺DMF溶液体积比1:1-1:2）室温下搅拌均匀；
将质量比为1:2:25-1:2:50的EDAC、NHS和羧基功能化的叠氮聚乙二醇氯仿溶液混合搅拌均匀，加入到Pt-Fe3O4-Au纳米粒子氯仿溶液；正己烷纯化洗涤两次后，氮气流下干燥溶解在水中，通过微米滤膜过滤后离心，浓缩洗涤后溶解于水中，加入质量比1:20:2-1:20:4的硫酸铜、抗坏血酸和氨基功能化的炔基PEG，搅拌2h后，离心，洗涤浓缩后溶于碳酸氢钠缓冲液中，加入与抗坏血酸和氨基功能化的炔基PEG质量比为1:1的琥珀酰亚胺酯-钆-DOTA，搅拌2小时后，离心，洗涤浓缩，得水溶性羧基功能化的Pt-Fe3O4-Au纳米粒子，备用；
2）制备靶向性CXCR4-Pt-Fe3O4-Au异三聚体纳米粒子：
CXCR4靶向肽经过EDC和NHS活化后得到活性酯，然后在水相中与步骤1）制备的水溶性羧基功能化的Pt-Fe3O4-Au纳米粒子表面的氨基进行连接，反应完毕后用PD-10凝胶柱进行纯化，得到靶向性CXCR4-Pt-Fe3O4-Au异三聚体纳米粒子。
将本发明所制备的Pt-Fe3O4-Au纳米粒子溶于氯仿；将质量比1:1的多巴胺DMF溶液、无水碳酸钠混合，加入DB-HNT氯仿溶液（与多巴胺DMF溶液体积比1:1-1:2）室温下搅拌均匀；
将质量比为1:2:25-1:2:50的EDAC、NHS和羧基功能化的叠氮聚乙二醇氯仿溶液混合搅拌均匀，加入到Pt-Fe3O4-Au纳米粒子氯仿溶液；正己烷纯化洗涤两次后，氮气流下干燥溶解在水中，通过微米滤膜过滤后离心，浓缩洗涤后溶解于水中，加入质量比1:20:2-1:20:4的硫酸铜、抗坏血酸和氨基功能化的炔基PEG，搅拌2h后，离心，洗涤浓缩后溶于碳酸氢钠缓冲液中，加入与抗坏血酸和氨基功能化的炔基PEG质量比为1:1的琥珀酰亚胺酯-钆-DOTA，搅拌2小时后，离心，洗涤浓缩，得水溶性羧基功能化的Pt-Fe3O4-Au纳米粒子，备用；
2）制备靶向性CXCR4-Pt-Fe3O4-Au异三聚体纳米粒子：
CXCR4靶向肽经过EDC和NHS活化后得到活性酯，然后在水相中与步骤1）制备的水溶性羧基功能化的Pt-Fe3O4-Au纳米粒子表面的氨基进行连接，反应完毕后用PD-10凝胶柱进行纯化，得到靶向性CXCR4-Pt-Fe3O4-Au异三聚体纳米粒子。
[0008] 本发明所述的Pt-Fe3O4-Au纳米粒子在制备T1/T2双增强造影剂中用途。
[0009] 本发明所述的CXCR4- Pt-Fe3O4-Au异三聚体纳米粒子在制备三阴性乳腺癌靶向造影剂中用途。
[0010] 本发明的积极效果在于：提供了定向合成同分异构体和CXCR4- Pt-Fe3O4-Au异三聚体纳米粒子的方法，本发明所制备的Pt-Fe3O4-Au纳米粒子通过控制油酸与五羰基铁的摩尔比，可以实现同分异构体的定向合成，能够提高纳米粒子双哑铃结构的稳定性，并实现稳定的T1／T2双增强模态，在此基础上制备的CXCR4- Pt-Fe3O4-Au异三聚体纳米粒子具有优秀的磁学性能，良好的生物相容性及对三阴性乳腺癌的高靶向性，为早期诊断三阴性乳腺癌提供了新的手段，可用于制备三阴性乳腺癌靶向造影剂。
附图说明
附图说明
[0011] 图1为本发明CM-DB-HNT示意图；图2为本发明CM-DB-HNT透射电子显微镜图像；
图3 纳米颗粒分布均匀，粒径为12.45±1.21nm；
图4为本发明ZETA电势及水合粒径测试结果： DB-HNT纳米颗粒表面电势和水合粒径分别为-11.8mV±1.25mV、 20nm±0.98nm；
图5为本发明磁学性能测试：弛豫率r1值与弛豫率r2值分别为61.67±0.82mM-1s-1、
181.49±1.57 mM-1s-1；
图6为本发明CXCR4靶向多肽质谱鉴定结果；
图7为本发明体外不同浓度C-DB-HNT在96孔板中的T1和T2成像测试（纳米颗粒以Fe浓度为标准）；
图8为本发明体外细胞实验相差显微镜测试：不同浓度的CM-DB-HNT纳米颗粒处理24小时后的细胞形态PBS处理的细胞相比，没有明显的区别；
图9为本发明普鲁士蓝染色实验：CM-DB-HNT纳米颗粒明显被人乳腺癌肿瘤细胞吞噬，且随着吞噬数量随着CM-DB-HNT纳米颗粒的浓度(0.05-0.8mg／L)增加而增多；
图10为本发明透视电子显微镜（TEM）测试： CM-DB-HNT纳米颗粒被细胞吞噬进入细胞质内。
图3 纳米颗粒分布均匀，粒径为12.45±1.21nm；
图4为本发明ZETA电势及水合粒径测试结果： DB-HNT纳米颗粒表面电势和水合粒径分别为-11.8mV±1.25mV、 20nm±0.98nm；
图5为本发明磁学性能测试：弛豫率r1值与弛豫率r2值分别为61.67±0.82mM-1s-1、
181.49±1.57 mM-1s-1；
图6为本发明CXCR4靶向多肽质谱鉴定结果；
图7为本发明体外不同浓度C-DB-HNT在96孔板中的T1和T2成像测试（纳米颗粒以Fe浓度为标准）；
图8为本发明体外细胞实验相差显微镜测试：不同浓度的CM-DB-HNT纳米颗粒处理24小时后的细胞形态PBS处理的细胞相比，没有明显的区别；
图9为本发明普鲁士蓝染色实验：CM-DB-HNT纳米颗粒明显被人乳腺癌肿瘤细胞吞噬，且随着吞噬数量随着CM-DB-HNT纳米颗粒的浓度(0.05-0.8mg／L)增加而增多；
图10为本发明透视电子显微镜（TEM）测试： CM-DB-HNT纳米颗粒被细胞吞噬进入细胞质内。
具体实施方式
[0012] 通过以下实施例进一步举例描述本发明，并不以任何方式限制本发明，在不背离本发明的技术解决方案的前提下，对本发明所作的本领域普通技术人员容易实现的任何改动或改变都将落入本发明的权利要求范围之内。
[0013] 实施例11、在氮气氛围下，在100ml容积的三颈烧瓶中通过磁力搅拌将1-十八烯（20ml）、油酸胺（20ml）、油酸（2ml）及二价乙酰丙酮铂（0.2g）制备呈混合溶液，将二价乙酰油胺（0.2g）加入其中。在真空条件下将溶液加热至120℃，然后在氩气氛围下继续加热至180℃，在此条件下，加入0.2ml五羰基铁溶液（浓度0.1Fe(CO)5/1ml正己烷）。将得到的混合液加热至190℃，在此条件下反应1h。冷却到室温后，通过离心分离及异丙基醇清洗，获得纳米颗粒。然后，将获得的颗粒再次分散入正己烷溶剂中，然后离心分离纳米颗粒，并用乙醇清洗。产物悬浮在包含1%油酸胺和1%油酸的4ml正己烷溶液中。
[0014] 2、1-十八烯（20ml）和油酸（1ml）混合后充分搅拌，所得混合液在120℃条件下，用氮气流持续脱气30分钟。在氮气氛围下，加入五羰基铁（0.14ml，1mmol），10min后，在此热溶液中注入油酸胺（97%，Acros）（1ml）和步骤1）所得Pt纳米颗粒种子（20mg，分散在2ml的正己烷溶液中），所得溶液在300℃条件下反应20min，之后去除加热罩冷却到室温。将60ml纯乙醇加入到上述所得溶液并进行离心，获得纳米颗粒沉淀。将所得纳米颗粒再次分散入正己烷，通过加入乙醇及离心获得纳米颗粒沉淀。重复此过程2次以纯化纳米颗粒。最终所得纳米颗粒分散入10ml正己烷溶液中。
[0015] 3、在20ml的玻璃小瓶中加入1-十八烯（10ml）和油胺（0.5ml），充分混匀后在强力磁搅拌下将氯金酸（40mg）加入，搅拌1min后将温度升至60℃。然后在氮气保护下将1ml之前合成好的铂-氧化铁纳米颗粒迅速加入上述溶液中加热2.5小时，得到紫灰色胶体溶液后，将混合物冷却到室温。然后加入40ml异丙醇并离心（5000转，5分钟）收集纳米颗粒，如此以异丙醇洗两次后将纳米颗粒溶解于氯仿中获得10mg/ml的DB-HNT。
[0016] 4、1ml多巴胺（2mg）DMF溶液和2mg无水碳酸钠，在充分搅拌下迅速加入上述制备的DB-HNT氯仿溶液中（1ml）并继续室温下搅拌2小时。然后将1mg EDAC，2mgNHS和2ml (50mg)羧基功能化的叠氮聚乙二醇（Azide-PEG-5000-COOH）氯仿溶液在室温下搅拌30分钟后加入到上述纳米颗粒氯仿溶液，室温下继续搅拌24小时。然后加入15ml正己烷改变溶液极性同时离心以析出纳米颗粒，收集纳米颗粒。再用正己烷洗涤两次后，然后在氮气流下干燥，并溶解在水中。将纳米颗粒水溶液通过0.22微米滤膜过滤后，加入30kDa超滤管离心，浓缩洗涤后溶解于水中，加入1mg硫酸铜，20mg抗坏血酸和2mg 氨基功能化的炔基PEG（ALK-PEG2-NH2），室温搅拌2h后，30kDa超滤管离心，洗涤浓缩后溶于碳酸氢钠缓冲液（pH8.5）中，加入1mg 琥珀酰亚胺酯-钆-DOTA（NHS-Gd-DOTA），在室温下搅拌2小时后，30kDa超滤管离心，洗涤浓缩备用。
[0017] 5、将50ulCXCR4（浓度0.5mg/ml）单抗溶于100mlPH6.8的PBS缓冲溶液中，再加入30mg的NHS及200mg的EDC，活化30min钟。然后加入4）所得产物，室温下PD-10凝胶柱纯化4h，即制成CXCR4修饰的CM-DB-HNT。
[0018]实施例2：
1、在氮气氛围下，在100ml容积的三颈烧瓶中通过磁力搅拌将1-十八烯（40ml）、油酸胺（20ml）、油酸（2ml）及二价乙酰丙酮铂（0.2g）制备呈混合溶液，将二价乙酰油胺（200mg）加入其中。在真空条件下将溶液加热至120℃，然后在氩气氛围下继续加热至190℃，在此条件下，加入0.2ml五羰基铁溶液（浓度0.1Fe(CO)5/1ml正己烷）。将得到的混合液加热至160℃，在此条件下反应1h。冷却到室温后，通过离心分离及异丙基醇清洗，获得纳米颗粒。然后，将获得的颗粒再次分散入正己烷溶剂中，然后离心分离纳米颗粒，并用乙醇清洗。产物悬浮在包含1%油酸胺和1%油酸的4ml正己烷溶液中。
1、在氮气氛围下，在100ml容积的三颈烧瓶中通过磁力搅拌将1-十八烯（40ml）、油酸胺（20ml）、油酸（2ml）及二价乙酰丙酮铂（0.2g）制备呈混合溶液，将二价乙酰油胺（200mg）加入其中。在真空条件下将溶液加热至120℃，然后在氩气氛围下继续加热至190℃，在此条件下，加入0.2ml五羰基铁溶液（浓度0.1Fe(CO)5/1ml正己烷）。将得到的混合液加热至160℃，在此条件下反应1h。冷却到室温后，通过离心分离及异丙基醇清洗，获得纳米颗粒。然后，将获得的颗粒再次分散入正己烷溶剂中，然后离心分离纳米颗粒，并用乙醇清洗。产物悬浮在包含1%油酸胺和1%油酸的4ml正己烷溶液中。
[0019] 2、1-十八烯（20ml）和油酸（0.5ml）混合后充分搅拌，所得混合液在120℃条件下，用氮气流持续脱气30分钟。在氮气氛围下，加入五羰基铁（0.14ml，1mmol），10min后，在此热溶液中注入油酸胺（97%，Acros）（1ml）和步骤1）所得的纳米颗粒种子（20mg，分散在2ml的正己烷溶液中），所得溶液在300℃条件下反应20min，之后去除加热罩冷却到室温。将60ml纯乙醇加入到上述所得溶液并进行离心，获得纳米颗粒沉淀。将所得纳米颗粒再次分散入正己烷，通过加入乙醇及离心获得纳米颗粒沉淀。重复此过程2次以纯化纳米颗粒。最终所得纳米颗粒分散入10ml正己烷溶液中。
[0020] 3、在20ml的烧瓶中加入1-十八烯（5ml）和油胺（1.5ml），充分混匀后在强力磁搅拌下将25mg氯金酸加入，搅拌1min后将温度升至80℃。然后在氮气保护下将1ml之前合成好的铂-氧化铁纳米颗粒迅速加入上述溶液中加热2小时，得到紫灰色胶体溶液后，将混合物冷却到室温。然后加入40ml异丙醇并离心（5000转，5分钟）收集纳米颗粒，如此以异丙醇洗两次后将纳米颗粒溶解于氯仿中获得10mg/ml的DB-HNT。
[0021] 4、1ml多巴胺（2mg）DMF溶液和2mg无水碳酸钠，在充分搅拌下迅速加入1ml上述制备的DB-HNT氯仿溶液中并继续室温下搅拌2小时。然后将1mg EDAC，2mgNHS和2ml (50mg)羧基功能化的叠氮聚乙二醇（Azide-PEG-5000-COOH）氯仿溶液在室温下搅拌30分钟后加入到上述纳米颗粒氯仿溶液，室温下继续搅拌24小时。然后加入15ml正己烷改变溶液极性同时离心以析出纳米颗粒，收集纳米颗粒。再用正己烷洗涤两次后，然后在氮气流下干燥，并溶解在水中。将纳米颗粒水溶液通过0.22微米滤膜过滤后，加入30kDa超滤管离心，浓缩洗涤后溶解于水中，加入1mg硫酸铜，20mg抗坏血酸和2mg 氨基功能化的炔基PEG（ALK-PEG2-NH2），室温搅拌2h后，30kDa超滤管离心，洗涤浓缩后溶于碳酸氢钠缓冲液（pH8.5）中，加入2mg 琥珀酰亚胺酯-钆-DOTA（NHS-Gd-DOTA），在室温下搅拌2小时后，30kDa超滤管离心，洗涤浓缩备用。
[0022] 5、将50ulCXCR4（浓度0.5mg/ml）单抗溶于100mlPH7.2的PBS缓冲溶液中，再加入30mg的NHS及200mg的EDC，活化40min钟。然后加入4）所得产物，室温下PD-10凝胶柱纯化5h，即制成CXCR4修饰的CM-DB-HNT。
[0023] 实施例3：1、在氮气氛围下，在100ml容积的三颈烧瓶中通过磁力搅拌将1-十八烯（20ml）、油酸胺（20ml）、油酸（2ml）及二价乙酰丙酮铂（0.2g）制备呈混合溶液，将二价乙酰油胺（200mg）加入其中。在真空条件下将溶液加热至120℃，然后在氩气氛围下继续加热至200℃，在此条件下，加入0.2ml五羰基铁溶液（浓度0.1Fe(CO)5/1ml正己烷）。将得到的混合液加热至120℃，在此条件下反应1h。冷却到室温后，通过离心分离及异丙基醇清洗，获得纳米颗粒。然后，将获得的颗粒再次分散入正己烷溶剂中，然后离心分离纳米颗粒，并用乙醇清洗。产物悬浮在包含1%油酸胺和1%油酸的4ml正己烷溶液中。
[0024] 2、1-十八烯（20ml）和油酸（1.2ml）混合后充分搅拌，所得混合液在90℃条件下，用氮气流持续脱气30分钟。在氮气氛围下，加入五羰基铁（0.14ml，1mmol），10min后，在此热溶液中注入油酸胺（97%，Acros）（1ml）和步骤1）所得的纳米颗粒种子（20mg，分散在2ml的正己烷溶液中），所得溶液在300℃条件下反应20min，之后去除加热罩冷却到室温。将60ml纯乙醇加入到上述所得溶液并进行离心，获得纳米颗粒沉淀。将所得纳米颗粒再次分散入正己烷，通过加入乙醇及离心获得纳米颗粒沉淀。重复此过程2次以纯化纳米颗粒。最终所得纳米颗粒分散入10ml正己烷溶液中。
[0025] 3、 在20ml的烧瓶中加入1-十八烯（5ml）和油胺（0.75ml），充分混匀后在强力磁搅拌下将氯金酸（25mg）加入，搅拌1min后将温度升至100℃。然后在氮气保护下将1ml之前合成好的铂-氧化铁纳米颗粒迅速加入上述溶液中加热1.5小时，得到紫灰色胶体溶液后，将混合物冷却到室温。然后加入40ml异丙醇并离心（5000转，5分钟）收集纳米颗粒，如此以异丙醇洗两次后将纳米颗粒溶解于氯仿中获得10mg/ml的DB-HNT。
[0026] 4、1ml多巴胺（2mg）DMF溶液和无水碳酸钠（2mg），在充分搅拌下迅速加入1ml上述制备的DB-HNT氯仿溶液中并继续室温下搅拌2小时。然后将1mg EDAC，2mgNHS和4ml (100mg)羧基功能化的叠氮聚乙二醇（Azide-PEG-5000-COOH）氯仿溶液在室温下搅拌30分钟后加入到上述纳米颗粒氯仿溶液，室温下继续搅拌24小时。然后加入15ml正己烷改变溶液极性同时离心以析出纳米颗粒，收集纳米颗粒。再用正己烷洗涤两次后，然后在氮气流下干燥，并溶解在水中。将纳米颗粒水溶液通过0.22微米滤膜过滤后，加入30kDa超滤管离心，浓缩洗涤后溶解于水中，加入1mg硫酸铜，20mg抗坏血酸和2mg 氨基功能化的炔基PEG（ALK-PEG2-NH2），室温搅拌2h后，30kDa超滤管离心，洗涤浓缩后溶于碳酸氢钠缓冲液（pH8.5）中，加入1mg 琥珀酰亚胺酯-钆-DOTA（NHS-Gd-DOTA），在室温下搅拌2小时后，30kDa超滤管离心，洗涤浓缩备用。
[0027] 5、 将50ulCXCR4（浓度0.5mg/ml）单抗溶于100mlPH6.8的PBS缓冲溶液中，再加入30mg的NHS及200mg的EDC，活化40min钟。然后加入4）所得产物，室温下PD-10凝胶柱纯化6h，即制成CXCR4修饰的CM-DB-HNT。
[0028] 试验例1：CM-DB-HNT纳米颗粒的表征及体外细胞实验
1、采用本发明的方法制备CM-DB-HNT纳米颗粒，在制备程序中，Pt纳米颗粒是由1-十八烯（20ml）、油酸胺（20ml）、油酸（2ml）及二价乙酰丙酮铂（0.2g）、二价乙酰油胺（0.2g）在真空下加热至120℃，后在氩气下升温至185℃再与0.2ml五羰基铁溶液在190℃下正己烷中反应1h所制备，以此Pt纳米颗粒与1-十八烯（20ml）和油酸（1.2ml）及五羰基铁（0.14ml）反应制备铂-氧化铁纳米颗粒，在此基础上加入氯金酸（25mg），60℃下反应4h制备Pt-Fe3O4-Au纳米粒子，所得纳米粒子进行CXCR4单抗修饰。利用透视电子显微镜（TEM）、Zeta Plus电位分析仪、质谱分析仪分别分析所得纳米离子的粒径分布（图2、图3）、纳米粒子的ZETA电势及水合粒径（图4）及CXCR4靶向多肽的分子量（图6）。结果表明所制备的CM-DB-HNT的纳米粒子
12.45±1.21nm，粒径较小，具有良好的水溶性及分散性，容易被细胞摄取，且该纳米颗粒表面带负电，将降低与蛋白质等物质的非特异性吸引，能够更好的保证其生物相容性，同时图
6结果表明纳米粒子上所修饰的CXCR4单抗结构完整，具备靶向能力。
1、采用本发明的方法制备CM-DB-HNT纳米颗粒，在制备程序中，Pt纳米颗粒是由1-十八烯（20ml）、油酸胺（20ml）、油酸（2ml）及二价乙酰丙酮铂（0.2g）、二价乙酰油胺（0.2g）在真空下加热至120℃，后在氩气下升温至185℃再与0.2ml五羰基铁溶液在190℃下正己烷中反应1h所制备，以此Pt纳米颗粒与1-十八烯（20ml）和油酸（1.2ml）及五羰基铁（0.14ml）反应制备铂-氧化铁纳米颗粒，在此基础上加入氯金酸（25mg），60℃下反应4h制备Pt-Fe3O4-Au纳米粒子，所得纳米粒子进行CXCR4单抗修饰。利用透视电子显微镜（TEM）、Zeta Plus电位分析仪、质谱分析仪分别分析所得纳米离子的粒径分布（图2、图3）、纳米粒子的ZETA电势及水合粒径（图4）及CXCR4靶向多肽的分子量（图6）。结果表明所制备的CM-DB-HNT的纳米粒子
12.45±1.21nm，粒径较小，具有良好的水溶性及分散性，容易被细胞摄取，且该纳米颗粒表面带负电，将降低与蛋白质等物质的非特异性吸引，能够更好的保证其生物相容性，同时图
6结果表明纳米粒子上所修饰的CXCR4单抗结构完整，具备靶向能力。
[0029] 2、利用3.0T西门子Skyra磁共振，采用反转恢复序列在25℃条件下对样本进行扫描，计算系列浓度稀释样本的粒子浓度对应的r1弛豫率；采用多回波自旋回波序列测量r2弛豫率（图5和图7），图5结果表明CM-DB-HNT在很低的浓度下即可具有很高的弛豫率，图7表明CM-DB-HNT具备T1/T2增强效果。
[0030] 3、设置人正常乳腺上皮细胞经过PBS缓冲液（a）、不同浓度（10-100mg/L）的CM-DB-HNT纳米颗粒与人正常乳腺上皮细包共浴（b-f），24小时后利用相差显微镜测试，评估CM-DB-HNT的生物相容性（图8）。结果表明人正常乳腺上皮细胞并没有对CM-DB-HNT出现吞噬现象，同时人正常乳腺上皮细胞完整，表明所制备的CM-DB-HNT具有良好的生物相容性。
[0031] 4、制备呈浓度梯度(0.05-0.8mg／L)的CM-DB-HNT纳米颗粒溶液（a-f），与人乳腺癌肿瘤细胞共浴24h后，进行普鲁士蓝染色实验，用于评估纳米颗粒被肿瘤细胞摄取的情况（图9、图10）。结果发现所制备的CM-DB-HNT能够被人三阴性乳腺癌细胞吞噬，表明CM-DB-HNT具备靶向识别人三阴性乳腺癌细胞的能力，同时人三阴性乳腺癌细胞对CM-DB-HNT的吞噬随着CM-DB-HNT浓度的增加而增加，表现出所制备的纳米粒子在人三阴性乳腺癌细胞中有很好的富集作用。
[0032] 结论：定向合成的同分异构体Pt-Fe3O4-Au纳米粒子可以用于制备T1/T2双增强造影剂；
CXCR4-Pt-Fe3O4-Au异三聚体纳米粒子能够用于制备三阴性乳腺癌靶向造影剂。
CXCR4-Pt-Fe3O4-Au异三聚体纳米粒子能够用于制备三阴性乳腺癌靶向造影剂。
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