基因表达是细胞表型的主要决定因素，而DNA-蛋白相互作用则在很大程度上决定了基因表达样式。在工业微生物、实验模型、病原体中或为了解决人类疾病，改变基因表达以致影响表型是生物学和医学的主要目标。在本文中，基因组中的顺式调节序列(转录机的DNA成分)是具有吸引力的用于干预的靶标。与对付蛋白相比，对DNA起作用远远容易得多：测序高度自动化且相对便宜，并且DNA能容易操纵并易于扩增或合成。基于DNA的治疗也已涌现为一类令人激动的新治疗药物。与传统药物(天然产物或小分子)相比，DNA是一类具有吸引力的治疗药物，因为其能：
·通过理性方法设计，最简单的是通过研究序列数据来进行；
·规模化便宜制备，通过化学合成寡核苷酸或生物学复制来进行；
·预计具有低毒性，因为DNA是一种‘天然’化合物且其中或自身通常不会诱导免疫应答，并且特异性能通过基于DNA治疗的序列得到控制；
·大大降低了研发经费，因为缩短了常规药物开发的全部阶段(靶标鉴定、先导化合物发现、药物化学)。
因而，挑战就变成了如何鉴定关键的顺式调节元件。在基因组测序计划的同时所开发的技术和专门知识，例如利用DNA微阵列的大规模并行基因表达分析以及使用生物信息学来注释基因组数据库，皆不足以鉴定所有顺式调节元件或将功能归属于已知的那些顺式调节元件。在2003年，美国国家卫生研究院启动了ENCODE计划以编目人基因组中1％的顺式调节元件(Science(2004)306：636-640；Nature(2007)447：799-816)并开发高通量技术作为发现平台。该开发的方法包括使用染色质免疫沉淀反应，超灵敏地探查对体内DNA酶I消化的敏感性(使用DNA微阵列、高通量定量PCR和基因组文库)并开发用于生物信息检测的新算法。虽然这些技术具有大大加速顺式调节元件发现的潜力，但是它们未必会产生它们的功能特征：该计划的输出结果是这些元件的综合性编目。虽然从该项工作中，根据哪一种类型的反式作用因子结合它们，有可能获知大多数元件的组织特异性，以及它们与基因的距离和分类，但是其仍不足以确定元件的生物功能实际上是什么。对于所有这些方法而言，所共有的进一步的缺点在于它们依赖被测序的生物体的基因组。此外，利用对DNA酶I消化的超灵敏性的方法具有额外的缺点，即它们特异于真核细胞，因为在该环境中DNA酶I是染色质结构的探针，而在原核生物中则无可比较的结构存在。
此外，迄今尚无用于针对大量序列快速筛选可能的顺式调节序列的手段。
发明概述
本发明人通过提供用于在原核和真核生物中鉴定及表征顺式调节序列的新方法解决了本领域中的这些问题。
一种鉴定并表征各顺式调节元件功能的方式是使用转录因子诱饵(decoy)(TFD)。设计诱饵寡核苷酸以模拟转录因子结合位点并阻止后者与它们的关连基因组靶标结合，随之发生基因表达的改变。同样，它们代表了一种用于操纵DNA-蛋白相互作用的简单且通用的手段，其调节特定基因并因此决定表型。业已主要在真核系统中证实了它们的效用，在该系统中鞭策它们开发的是它们起新一类治疗剂作用的潜力(Mann&Dzau(2000)J.Clin.Investigation 106：1071-1075)。为此，诱饵寡核苷酸已被用于证实转录因子EF2抑制大鼠中平滑肌增殖(Morishita等(1995)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95：5855-5859)；阻断STAT3介导的癌增殖(Leong等(2003)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 100：4138-4143)；以及显示靶向cAMP应答元件能控制体内癌增殖(Park等(1999)J.Biol.Chem.274：1573-1580)。
然而，尚未开发能查询基因组片段或全基因组中序列的每一事件的大规模使用TFD的系统。按照实际情况来说，其应当需要合成非常大量的诱饵寡核苷酸以及涉及它们转染和对表型改变进行筛选的繁重实验程序。
这里描述的本发明通过开发基于质粒携带文库的系统解决了该需要，该系统能系统地测试大量序列以确定它们是否在基因组中充当顺式调节子，并将它们与特定表型效应相关联。我们在此将该系统称为“n[圈套]”(snare)。
此外，一旦发现相关顺式调节序列，那些序列可用于创建TFD，该TFD可用于改变基因表达并获得对表型的控制。出于数项原因，尽管诱饵被开发用于哺乳动物细胞，但是它们更好地适用于细菌中。在真核生物中让诱饵起作用可能存在问题，原因在于它们在血清和细胞核提取物中能快速降解(Chu&Orgel(1992)Nucl.Acids.Res.20：5857-5858)，诱饵的细胞摄取及其跨核膜迁移可能是无效的(Griesenbach等(2002)Gene Therapy 9：1109-1115)，以及某些处理能触发非特异性或毒性效应。在原核生物中使用诱饵回避了大多数的这些问题，因而它们能被证实是一种有效用于顺式作用调节序列例如控制特定基因和较大调节网络的转录因子结合位点快速鉴定的工具。该方法的一个成功的示范是使用富含AT的诱饵来改变蓝细菌中CO2应答基因的表达(Onizuka等(2003)FEBS Lett.542：42-46)。在该系统中，退火带有修饰的主链的互补寡核苷酸(包含硫代磷酸酯以减缓核酸酶降解)形成掺入之前鉴定的转录因子结合位点的双链诱饵寡核苷酸。将这些双链诱饵寡核苷酸直接加到其有效从中进入细胞的培养基中。然而，所报道的仅仅是一个实例，我们知道在该方法中已成功地尝试改变特定的原核性状。因此，在本领域中仍然需要将该诱饵方法学扩展到原核转录因子领域中，以从而改变广泛原核表型。此外，在本领域中还需要用于鉴定顺式作用调节因子的高通量方法，无论是在原核或在真核系统中。本专利公开内容提供了针对本领域的上述局限和需要的解决方案。
在一个具体的方面，本发明提供了用于增加细胞如细菌细胞对抗生素敏感性的新手段。
因此，在一方面本发明提供了诱饵多核苷酸在调控细胞抗生素抗性的方法中的应用，该方法包括：
(a)提供包含转录因子结合位点(诱饵序列)的诱饵多核苷酸；并
(b)将该多核苷酸导入细胞中，其中细胞包含可操作地连接包含转录因子结合位点的顺式调节序列的一种或更多种基因；
其中多核苷酸的导入减少了细胞中转录因子与顺式调节序列的结合并导致细胞中可操作地连接的一种或更多种基因表达的改变，从而调控细胞的抗生素抗性。
本发明还提供了：
-一种包含转录因子结合位点的诱饵多核苷酸，其中转录因子是原核生物或真核生物中一种或更多种抗生素抗性基因表达的调节子，以及其中诱饵多核苷酸中的结合位点不与基因可操作地连接。
-一种包含一个或更多个拷贝的单体序列的质粒，其中单体序列包含圈套序列，该圈套序列包含转录因子结合位点，以及其中结合位点不与基因可操作地连接。
-一种包含两个或更多个本发明的质粒的质粒文库，其中文库中的圈套序列共同包含原核生物或真核生物基因组DNA或基因组DNA片段中所有或基本上所有的顺式调节序列；
-一种包含两个或更多个本发明的质粒的质粒文库，其中每个质粒中的圈套序列都包含长度n个核苷酸的随机化核苷酸序列，其中基本上所有的长度n个核苷酸的核苷酸序列都呈现在文库中；
-一种制备具有两个或更多个拷贝的单体序列的质粒的方法，该方法包括：
(1)提供包含如下的环状寡核苷酸：
(i)目标测试序列；和
(ii)适用于滚环扩增的引物的结合位点；
其中单体序列包含(i)和(ii)；
(2)使用环状寡核苷酸作为模板进行滚环扩增，从而提供包含单体序列重复的多核苷酸；以及
(3)将该多核苷酸克隆入质粒载体中；
-一种由基因组DNA样品制备质粒文库的方法，其中每个质粒都包含一个或更多个拷贝的单体序列，以及其中每条单体序列都包含来源于基因组DNA的圈套序列；该方法包括：
(1)提供双链基因组DNA样品；
(2)片段化基因组DNA；
(3)将衔接头连接到来自(2)的DNA片段的每一末端上，其中每一衔接头包含：
(iii)用于固定DNA片段的手段(means)；
(iv)在与该识别位点隔开一段距离切割的第一限制酶的识别位点；和
(v)第二限制酶的识别和切割位点；
(4)任选地除去未连接的衔接头；
(5)用第一限制酶消化带有衔接头的片段，从而产生两条衔接片段，其中每条衔接片段包含：
(vi)衔接头；和
(vii)包含如下的DNA片段：较短的链，和较长的链，其中较长的链包含圈套序列；
(6)固定(5)中产生的衔接片段；
(7)变性该片段以提供单链片段；
(8)通过将互补寡核苷酸连接到衔接头来再建第二限制酶识别位点并用第二限制酶消化该衔接片段，从而产生包含如下的衔接头-圈套片段：
(viii)衔接头片段；和
(ix)单链圈套序列；和
(9)从固定状态释放(8)中产生的衔接头-圈套片段；以及
(10)将该衔接头-圈套片段克隆入质粒载体中；
-一种制备质粒文库的方法，其中每个质粒都包含两个或更多个拷贝的单体序列，以及其中每条单体序列都包含长度n个核苷酸的随机化核苷酸序列，该方法包括：
(1)提供包含如下的环状寡核苷酸：
(i)长度n个核苷酸的随机化序列；和
(ii)适用于滚环扩增的引物的结合位点；
其中单体序列包含(i)和(ii)；
(2)使用环状寡核苷酸作为模板进行滚环扩增，从而提供包含单体序列重复的多核苷酸；以及
(3)将该多核苷酸克隆入质粒载体中；
-根据本发明的方法制备的质粒或质粒文库；
-一种包含外源诱饵多核苷酸的细胞，该多核苷酸包含不与基因可操作地连接的转录因子结合位点(诱饵序列)；其中该细胞包含可操作地连接包含转录因子结合位点的顺式调节序列的一种或更多种基因；以及其中该诱饵多核苷酸导致细胞抗生素抗性改变。
-包含本发明的质粒或质粒文库的一种或多种宿主细胞；
-一种鉴定蛋白-DNA复合物中一个或更多个蛋白结合位点边界的方法，该方法包括：
1.提供蛋白-DNA复合物；
2.用如下的进行消化：
a.具有非特异性DNA切口能力的酶；和
b.5’-3’外切核酸酶；以及
3.相对于DNA链上已知固定点，测定(2)中的每条DNA链中产生的5’缺失的位置；
-一种鉴定原核或真核一种或更多种基因表达的顺式作用调节子的方法，包括：
1.提供本发明的质粒文库；
2.将该质粒文库导入宿主细胞中，其中该宿主细胞包含可操作地连接一种或更多种基因的目标顺式调节序列，该一种或更多种基因的表达可直接或间接测定；以及
3.在质粒文库存在和不存在下，直接或间接测定该一种基因(或多种基因)的表达；
-一种改变原核细胞中一种或更多种基因表达的方法，该方法包括：
(a)提供包含原核转录因子结合位点的多核苷酸，其中该结合位点不与多核苷酸中基因可操作地连接；和
(b)将该多核苷酸导入细胞中；
其中该细胞包含可操作地连接顺式调节序列的一种或更多种基因，该顺式调节序列包含转录结合位点或与转录因子结合位点竞争转录因子结合；
以及其中：
(i)多核苷酸包含根据本发明的质粒或质粒文库；
(ii)多核苷酸包含多于一个拷贝的结合位点；
(iii)多核苷酸包含多个同向重复的结合位点；
(iv)多核苷酸包含附加到结合位点上的额外的序列；
(v)多核苷酸包含至少一个二级结构元件；
(vi)多核苷酸包含环状双链DNA；
-一种改变原核或真核细胞中一种或更多种基因表达的方法，该方法包括：
(a)提供包含原核或真核转录因子结合位点的多核苷酸，其中该结合位点不与多核苷酸中基因可操作地连接；和
(b)将该多核苷酸导入细胞中；
其中该细胞包含可操作地连接顺式调节序列的一种或更多种基因，该顺式调节序列包含转录结合位点或与转录因子结合位点竞争转录因子结合；
以及其中该顺式调节序列是一种通过本发明方法鉴定的顺式调节序列；
-一种改变真核细胞中一种或更多种基因表达的方法，该方法包括：
(a)提供包含真核转录因子结合位点的多核苷酸，其中该结合位点不与多核苷酸中的基因可操作地连接；和
(b)将该多核苷酸导入细胞中；
其中该细胞包含可操作地连接顺式调节序列的一种或更多种基因，该顺式调节序列包含转录结合位点或与转录因子结合位点竞争转录因子结合；
以及其中多核苷酸包含根据本发明的质粒或质粒文库；
-一种根据本发明的方法制备的细胞；
-用于治疗细菌感染的诱饵多核苷酸，其中该多核苷酸包含转录因子结合位点以及该结合位点不与基因可操作地连接；
-诱饵多核苷酸用于治疗细菌感染的应用，其中该多核苷酸包含转录因子结合位点以及该结合位点不与基因可操作地连接；
-诱饵多核苷酸在制备用于治疗细菌感染的药物中的应用，其中该多核苷酸包含转录因子结合位点以及该结合位点不与基因可操作地连接。
因此，在本专利公开内容的本发明的一个实施方案中，我们提供了一种将诱饵法与简单的体内足迹法相结合以快速鉴定候选的顺式作用调节基序的方法。通过将这些序列掺入哑铃状诱饵寡核苷酸中，该环状形式抑制了外切和内切核酸酶降解[Ahn等(2003)Biochemical Biophysical Res.Comm.310：1048-1053]，并通过在体内测试它们对表型的影响，从而实现了它们的功能验证。
在根据本发明的另一个实施方案中，我们证实了使用通过应用足迹法鉴定的诱饵寡核苷酸，我们能显著地改变链霉菌中抗生素产生水平。
在根据本发明的一个进一步的实施方案中，我们证实了在治疗方法中利用原核诱饵的能力，借此使得对万古霉素具有抗性的致病细菌在治疗窗口中再次对抗生素敏感。
因此，本发明人提供了一种通用筛选系统，借助于该系统，鉴定了任何基因组中的顺式作用调节元件，以及来源于以该方式鉴定的这样元件的序列以一种如下的方式用于改变所选择的表型，该方式类似于根据通过本发明别的实施方案所阐明的而被证实。
本发明人还已修改并扩展了诱饵寡核苷酸技术用于原核生物，并证实了增加抗生素产生的能力。
此外，本发明人已证实了诱饵寡脱氧核苷酸可被应用以有利地克服正在治疗的病原体中的抗生素抗性。
本发明的其他实施方案、效用和细节可通过对完整公开内容的回顾而得以领会，所述完整的公开内容包括在此提供的具体实施例以及所附的权利要求书，包括它们的等价物。
附图简述
图1。n[圈套]质粒的构建和测试。该方案还可用于产生由随机寡核苷酸制成的‘通用’n[圈套]文库，或来自片段化的基因组的种特异性文库。
图2。提供了n[圈套]质粒如何能用于影响基因表达的图示。通过标准手段将n[圈套]质粒导入靶定细胞(如原核生物)中，并通过对其标记进行选择确保其稳定增殖，该标记通常是编码对抗生素的抗性的基因。当这样导入细胞中时，n[圈套]质粒通过从基因组启动子滴定掉转录因子“B”以减轻下游基因的转录阻遏，从而能影响靶定基因的表达(如水平框“D”，右上所示的)。
图3。n[圈套]方法的示范。n[圈套]质粒能以伴有表型改变的可预测的方式调控基因表达的控制。这些质粒较诱饵生产更便宜且更易于转化入细胞中，提供了更持久的效果，并且至关重要的是它们使文库法能发现关键调节元件。
图4。创建定制n[圈套]质粒文库过程的一部分：将基因组片段转变为短单链核苷酸。以DNA中每条顺式调节序列都应呈现在文库中的这样一种方式，由大片DNA创建n[圈套]质粒文库。
图5。n[圈套]质粒文库可用于获得被靶定表型例如抗生素产生的控制。在通过接合将文库成员导入后，在增加的肉桂霉素产生的基础上选择克隆(右)。
图6。应用n[圈套]以对抗抗生素抗性的更多细节。该图中的示意图显示了当关于该机制的遗传途径未知时，n[圈套]质粒文库如何用于鉴定控制抗生素抗性的顺式调节序列。
图7。被开发以鉴定n[圈套]质粒文库中顺式调节元件的报道构建体。在该图中，靶定的来自肉桂链霉菌(S.cinnamoneous)产生菌株的肉桂霉素生物合成簇的cin7基因的启动子被用于驱动编码对抗生素卡那霉素的抗性的neo基因的表达。
图8。使用通用报道系统和定制n[圈套]文库检测肉桂霉素产生的负顺式调节子。一种简单的改变使得该报道系统能检测正调节，即创建由嵌合报道基因组成的盒，其中掺入葡萄糖激酶基因(glkA)的编码序列，受靶定的启动子所驱动。
图9。文库杂交以鉴定候选克隆。为与能真实地干扰转录的n[圈套]质粒区分构成相当大一部分总信号的‘背景’成员，使用标准方法开发了文库杂交策略。
图10。使用通用报道系统和定制n[圈套]文库进行杂交筛选，检测来自独立重复操作的候选物以检测能调节肉桂霉素产生的顺式调节子。在该实例中，用报道菌株测试两个独立的肉桂链霉菌文库，并且使用来自每个文库的96个最大卡那霉素抗性克隆为每个克隆(F1和F2)和两个探针组(P1和P2)制备包含n[圈套]质粒的滤膜。所有通过交叉杂交(F1对P2以及F2对P1)鉴定的克隆都被认为是有力候选物，并给予在两次交叉杂交实验中所共有的那些(画红圈)以优先权。
图11。大肠杆菌(Escherichia coli)K12基因组n[圈套]文库的限制性消化分析证实了其具有预期的序列特性。用EcoRI消化此质粒混合物以再生用于创建n[圈套]文库的片段，并对这些文库进行MmeI消化以证实构建已运转的分子生物学：正如所料，插入片段是大尺寸的且这些插入片段在用MmeI完全消化下瓦解为30bp单体。
图12。在无遗传网络先验知识下n[圈套]文库用于操纵表型。该过程重复四次并且每次均测定细胞生存力。
图13。体内T7外切核酸酶/DNA酶I定位操作方案的图解概要。该足迹法中T7外切核酸酶和DNA酶I的新组合容许检测启动子区中所有DNA-蛋白复合物边界，而不仅仅是那些最接近所选择的限制性位点的边界。
图14。actII-orf4启动子中候选调节基序的T7外切核酸酶/DNA酶I定位。
(A)在可见的放线菌紫素产生之前的时间点(箭头指示的)，从生长于丰富(R5)培养基的培养物中收获天蓝色链霉菌(S.coelicolor)M145细胞。(B)如图13中所描述的，在两条链上定位了边界，并且在12％非变性PAGE的大小分析、接着DIG标记产物的化学发光检测后确定了它们的位置。(C)显示推定的顺式调节元件位置(相对于在定位方案中使用的引物)的actII-orf4启动子的序列。
图15。平板测定法证实了诱饵寡核苷酸能影响天蓝色链霉菌中抗生素产生。滤纸片用诱饵溶液或作为对照的缓冲液(如所示的)饱和并施加到覆盖SNA培养基的天蓝色链霉菌M145菌苔上。
图16。诱饵寡核苷酸的摄取和稳定性。用含诱饵溶液转染活跃生长的细胞并通过定量实时PCR(qrt-PCR)评价寡核苷酸的摄取及其稳定性。
图17。诱饵介导的在R5液体培养基中培养的培养物中放线菌紫素产生的增加。在用(A)无诱饵对照或用(B)A24.5诱饵转染(箭头指示的)前天蓝色链霉菌M145培养20小时。
图18。诱饵介导的在SMM液体培养基中培养的培养物中放线菌紫素产生的增加。对用(A)模拟转染的对照和(B)诱饵A24.5处理的培养物获得的数据进行比较，揭示了诱饵寡核苷酸引起放线菌紫素产生显著增加。
图19。SCO5812缺失导致R5琼脂上放线菌紫素产生不足以及SMMS琼脂上十一烷基灵菌红素过度产生。M145(平板左侧)和M145ΔSCO5812(平板右侧)在(A)R5琼脂培养基或(B)SMMS琼脂培养基上划线接种并分别温育72小时和96小时。
图20。提供了转录因子诱饵(TFD)法抗击抗生素抗性的应用。该示意图示范了TFD如何用于对抗致病细菌中已知的抗性机制。对规定的抗生素万古霉素的抗性用作一个例子。
图21。万古霉素基因的结构。来自Hong等2004Molecular Microbiology52：1107-1121。
图22。寡核苷酸诱饵vanH5环化的证据。将寡核苷酸在100pmol/ul终浓度下重悬于T4DNA连接酶缓冲液(如酶厂商New England Biolabs提供的)和400U T4DNA连接酶中并在16℃温育不同时间。
图23。显示了用及不用递增水平的vanH5诱饵温育万古霉素抗性细菌的作用。天蓝色链霉菌M600株在液体MMCGT培养基(Molecular Microbiology52：1107-1121)中培养，通过记录培养物在430nm的吸光度(细胞密度)测定该生长并作为温育时间的函数绘图。
图24。显示了使用SEQ ID NO：24和25中引物和适当的载体底物获得的扩增产物(实施例7.2)。
图25和26。显示了如实施例8(a)和8(b)中所分别描述的，在用VAN转录因子诱饵序列或阴性对照(CON)处理后，在万古霉素存在下屎肠球菌(E.faecium)生长的生长曲线。
图27。来自Poole(2005)J.Antimicrobial Chemother.56，22-24的表1和2的拷贝，分别列出了由外排介导的对非氟喹啉抗生素和氟喹啉抗生素的抗性。右栏中的参考文献编号指在该文献中所给出的参考文献编号。
序列简述
SEQ ID NO：1-包含AfsR结合位点的诱饵寡核苷酸(实施例1)。
SEQ ID NO：2-连接多核苷酸R-T7，其包含通常所用引物T7的部分互补物(实施例1)。
SEQ ID NO：3-包含AfsR结合位点的寡核苷酸并用于在实施例1中创建环化的诱饵序列。
SEQ ID NO：4和5-双链衔接分子每条链的序列(实施例2)
SEQ ID NO：6-Bbv互补寡核苷酸(实施例2)。
SEQ ID NO：7-包含NotI位点和随机化核苷酸序列的寡核苷酸，这里每个随机化核苷酸都表示为“n”(实施例4)。
SEQ ID NO：8-12-基于顺式调节序列A24.1、A24.2、A24.3、A24.4和A24.5分别设计的诱饵寡核苷酸(实施例5)。
SEQ ID NO：13-基于打乱顺序的A24.5序列设计的诱饵寡核苷酸(实施例5)。
SEQ ID NO：14-20-如在实施例5中用于定量PCR的PCR引物。
SEQ ID NO：21-包含磷酸化VanR结合位点的vanH5诱饵寡核苷酸(实施例6)。
SEQ ID NO：22和23-如实施例7.1中所描述的，用于从pGEMT-Easy载体扩增靶序列的寡核苷酸引物。
SEQ ID NO：24和25-如实施例7.2中所描述的，在哑铃状诱饵生产中用于从pGEMT-Easy载体扩增靶序列的寡核苷酸引物。
SEQ ID NO：26-用于实施例8(a)和8(b)中的VAN诱饵序列，其包含控制屎肠球菌中VanA型抗性诱导的调节元件。
发明详述
如在此所更详细描述的，本发明人已设计了用于鉴定、表征和靶向原核生物和真核生物中顺式调节序列的方法和组合物。
顺式调节序列或元件通常指其出现在一种或更多种基因的上游(5’)或下游(3’)及发挥调控一种或更多种基因表达的功能的核苷酸序列。通常，顺式调节序列包含调节给定基因转录的蛋白(转录因子)的结合位点。该蛋白与序列的结合直接或间接导致对基因表达的调控。例如，结合的蛋白可与另一为恰当(correct)位置中蛋白锚定和转录所需的结合附近区域的蛋白相互作用，或可抑制另一为转录所需的蛋白的结合。通常，该顺式调节序列或元件存在于基因的启动子区中，但并不罕见的是在原核生物中，顺式调节序列被定位在它们所影响的基因的上游或下游好几百个碱基对的位置处。在真核生物中，顺式调节序列能在远处作用以影响基因表达，通常大约是1-2kb，但还知道有超过100kb至1Mb起作用的序列。
顺式调节序列可以是阻遏的(当结合转录因子时抑制或减少基因转录)或激活的(当结合转录因子时激活或增加基因转录)。因此，结合顺式调节序列的转录因子可以是负效应子(阻抑蛋白)或正效应子(激活物)。
在例如顺式调节序列影响分离的基因，其又影响靶向基因的表达的情况下，通过间接效应还改变了某些基因的表达。这可例如通过如下而发生：导致对靶定基因是其一部分的调节网络的改变，或由于更全局的影响，例如导致靶定基因表达改变的冲击-应答(shock-response)。
对顺式调节序列处蛋白结合的调控可提供一种调控细胞中基因表达的有用手段。进行该调控的一种方式是提供诱饵核苷酸序列。诱饵序列包含转录因子结合位点，其包含细胞中的天然或内源顺式调节序列或与细胞中的天然或内源顺式调节序列竞争关连转录因子结合。通过减少转录因子与天然序列的结合，诱饵改变了其表达通常受细胞中的顺式调节序列调节的基因的表达。这样的改变可提供一种有用的表型如原核细胞代谢物产生或抗生素抗性改变。如在此所使用的诱饵功能指序列以该方式与顺式调节序列竞争关连转录因子结合的能力。
本发明人已开发出用于鉴定与细胞转录因子结合位点竞争转录因子结合、改变细胞基因表达的序列的新手段，可因此提供新的顺式调节序列和诱饵序列。
n[圈套]质粒
在此所描述的方法是对业已用于调控体内表达的‘诱饵’寡核苷酸技术在真核生物中的已知应用进行重要的改变。诱饵寡核苷酸的逻辑是简单的且与所有生物系统相关：宣称通过干扰转录因子与它们的关连位点的结合进行遗传控制。我们通过提供用于遗传调节分析的通用且高通量的工具对该技术加以改进。通过开发一种克隆诱饵序列同聚体以创建高拷贝‘n[圈套]’质粒的方法，第一种改进涉及进行质粒携带方法。这些质粒易于导入所有细菌中并通过正选择保持，巧妙避开了诱饵方法的主要缺陷，即寡核苷酸可能难以导入细胞中并可对外切核酸酶敏感，从而给出相对短的半衰期。
用于创建n[圈套]质粒的分子生物学方案概述在图1中给出。n[圈套]质粒如何影响基因调节的概述在图2中给出。n[圈套]质粒功效的示范在图3中给出，这里其通过导入来自抗生素合成正多效调节子AfsR的已知顺式调节序列，用于除去天蓝色链霉菌中抗生素产生。
1.n[圈套]质粒的设计
创建质粒携带形式的诱饵寡核苷酸而非诱饵自身供鉴定顺式调节生物活性使用的优点包括：
1.制造成本：以下描述的分子生物学方案简单牢靠，并可用于来自不同来源的合成寡核苷酸或DNA片段。由于质粒自我复制，无需产生大量的质粒。因此与创建大量带有可能的核苷酸主链昂贵修饰的诱饵寡核苷酸的潜在需要比较，这是有利的；
2.对降解的抗性：与诱饵相比，质粒显示对核酸酶体内降解很小的敏感性；
3.保持质粒浓度：由于质粒是自我复制(并可具有控制它们细胞内浓度或拷贝数的机制)且能视需要进行正选择，因此n[圈套]质粒的半衰期在理论上是无限期的；
4.广宿主范围：在实施例1中，使用了能容易地在大肠杆菌(为了易于遗传操作)和天蓝色链霉菌中转化并增殖的‘穿梭质粒’。本领域技术人员已知多种容许广细菌宿主范围转化的质粒；
5.可使用独特的n[圈套]质粒测试顺式调节序列的组合：相容的质粒能潜在地用于测定使用两种或更多种n[圈套]质粒的同步处理是否具有协同效应。
因此，在一方面本发明提供了一种适合于测试已知或推定的顺式调节序列的可能的诱饵功能，或用于筛选新的顺式调节序列(其可充当诱饵序列)的质粒。该质粒被称为n[圈套]质粒。
n[圈套]质粒的使用原理图解于图2中。质粒包含“圈套”序列(在该图中示以多拷贝)。如果“圈套”包含与细胞的顺式调节序列竞争转录因子结合的转录因子结合位点，则将该n[圈套]质粒导入细胞中会导致转录因子滴定掉细胞的顺式调节序列并落在圈套上。这可作为在细胞中其表达受顺式调节序列调节的一种或更多种基因表达的改变或细胞表型的改变得以检测。因此，基因表达或表型输出改变指示了该圈套包含具有诱饵功能的序列，以及该质粒可用于鉴定或证实顺式调节序列的功能。
一般而言，n[圈套]质粒包含质粒载体和插入片段序列(该插入片段包含圈套)。将圈套序列掺入质粒中解决了本领域中诱饵降解的问题，并容许在细胞中稳定保持诱饵(以及对基因表达的任何影响)。
插入片段序列包含一个或更多个拷贝的单体序列(其包含圈套)。因此，插入片段可包含(例如)1-200条单体序列。通常，存在2或更多个拷贝，例如2-200个拷贝，如至少10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180或190个拷贝。例如，可以是5-200、5-150、5-100、10-150、10-50、5-50、5-40、10-40、5-30个拷贝。例如，可以是30个拷贝的单体序列。质粒通常包含单体的同聚物。通常，它们是多个拷贝的单体，例如单体序列的多个同向重复。提供多个拷贝的单体(以及如此的圈套)增加诱饵的滴定效力。
单体序列包含圈套序列。圈套包含如在此所描述的要被测试或用作顺式调节或诱饵功能的核苷酸序列。
例如，圈套可包含已知或推定的顺式调节序列，诱饵序列，要被测试诱饵功能的序列的片段如基因组片段，例如启动子片段，或随机化核苷酸序列，或顺式调节序列的组合(如2、3、4或更多条顺式调节序列)。可制备包含来源于基因组或基因组片段的所有序列(或顺式调节序列)并基本上覆盖该基因组或基因组片段的所有序列(或顺式调节序列)的圈套序列的n[圈套]质粒文库。还可制备其中圈套序列包含给定长度(长度“n”个核苷酸)的随机化核苷酸序列的n[圈套]质粒文库。优选地，所有或基本上所有可能的长度n的序列都呈现在文库中。这些文库可用于筛选鉴定包含细胞的顺式调节序列和/或与该细胞的顺式调节序列竞争转录因子结合的序列，以及因此鉴定新的顺式调节和诱饵序列。
通常，圈套中的转录因子结合位点不与基因如圈套或圈套质粒中的基因可操作地连接。在这种意义上，该结合位点分离自其一种或多种关连基因。圈套中的结合位点还可分离自其关连启动子中的其它元件。在一种情况下，单体序列不包含基因。
除圈套之外单体可包含额外的序列。通常，这样的额外的序列来源于用于产生圈套和/或质粒插入片段的方法。例如，单体可包含衔接头序列，例如当根据在此方法对定制n[圈套]文库产生“定制”圈套时通常产生的衔接头序列。该衔接头序列可包含例如一种或更多种限制酶的识别和/或切割位点。
单体可包含提供了引物结合位点的核苷酸序列，所述引物例如在单体或包含多个单体的插入片段生产中使用的引物。
例如，当使用在此描述的滚环扩增法制备质粒插入片段时，单体通常包含相应于用于滚环复制的引物如T7引物的结合位点的片段。
包含随机化圈套序列的单体通常还包含一个或多个区的恒定序列。例如，n个核苷酸的随机化圈套序列可侧接恒定序列区。可选地，恒定序列的中央核心可侧接随机化核苷酸序列区。
单体的长度可以是例如多达1000个核苷酸，例如多达900、800、700、600、500、400、300、200、100、90、80、70、60、50、40、30、20、15或10个核苷酸。通常，单体的长度在例如10-100、10-50、20-75、30-60、30-50、35-55如35-54个核苷酸范围内。例如，单体的长度可以是30、40或50个核苷酸。
单体的圈套部分大小范围通常可为10-30个核苷酸，例如10-25、10-20、15-20个，如15、16、17、18、19或20个，例如19个核苷酸。
衔接头序列可包含例如5-30个核苷酸，例如5-25、5-20、5-15或5-10个核苷酸，如10、11、12、13、14或15个核苷酸。
通常，n[圈套]质粒中的插入片段包含一个或更多个拷贝的如在此所描述的单体。当该插入片段包含多个重复的单体时，这些单体可串联重复。
质粒载体中的插入片段可包含，例如约1.5kb，例如1-2kb，例如1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7或1.8kb。然而，任何容许质粒在合适的宿主细胞中稳定保持并有效用于本发明方法中的合适的插入片段大小皆可使用。
通常，单个质粒中所有单体的序列都是相同的。
用于n[圈套]质粒中的质粒载体可适用于原核或真核宿主。例如，载体可适用于原核宿主例如细菌宿主，如放线菌宿主。例如，质粒载体可适用于链霉菌或大肠杆菌菌株，例如天蓝色链霉菌如A3(2)(或M145或M600株)、大肠杆菌、浅青紫链霉菌(Streptomyces lividans)或肉桂链霉菌的一种或更多种。适合的宿主进一步描述在此。
通常，载体是广宿主范围载体和/或穿梭载体并因此可在多于一种的宿主中保持并增殖。质粒可以是一种接合质粒。这容许通过接合容易地从一个细胞转移到另一个细胞中。
优选地，质粒是自主复制的。通常，质粒是高拷贝数质粒。例如，质粒可保持在例如20-100个拷贝/细胞，例如20、30、40、50、60、70、80、90或95或100个拷贝/细胞。高拷贝数增加了圈套中诱饵序列的滴定效力。
通常，n[圈套]质粒包含复制起点。合适的起点是本领域已知的。通常，质粒额外地包含一种或更多种可检测的标记基因，例如一种或更多种编码抗生素抗性的基因，如编码安普霉素抗性的aac基因。标记基因的表达使得能对质粒在宿主细胞中的保持进行筛选。
合适的质粒载体的实例包括例如pIJ86。合适的载体是本领域已知的。
单体或圈套序列可包含在此描述的和/或根据在此描述的方法鉴定的顺式调节序列或诱饵序列。
例如，质粒中转录因子结合位点可包含调节一种或更多种基因表达的顺式调节序列或与之竞争转录因子结合，该一种或更多种基因在代谢物产生中起作用。代谢物可以是例如抗生素、酶或药物。抗生素可以是例如放线菌紫素、十一烷基灵菌红素或肉桂霉素。
例如，圈套可包含AfsR蛋白(天蓝色链霉菌中抗生素合成的多效调节子)的结合位点。AfsrR结合位点以粗体示于SEQ ID NO：1中(实施例1)。因此，单体可包含SEQ ID NO：1。因此，如在实施例1中，单体可以是SEQ ID NO：1的双链形式。在一个实例中，可以有30个重复的单体和/或质粒可包含穿梭载体pIJ86。因此在一方面，本发明涉及根据实施例1中的方法制备的n[圈套]质粒。
在另一个实例中，圈套可包含天蓝色链霉菌actII-orf4启动子中的顺式调节序列，例如在此所描述的顺式调节阻抑序列，或与这样的序列竞争转录因子结合的序列。例如，顺式调节序列可包含在此鉴定的序列A24.1、A24.2、A24.3、A24.4或A24.5。在一方面，单体可包含在此描述的SEQ ID NO：8-12之一或SEQ ID No：13。
质粒中的转录因子结合位点可包含调节一种或更多种基因表达的顺式调节序列或与之竞争转录因子结合，该一种或更多种基因在决定抗生素抗性中起作用，例如任何一种或更多种在此所列的基因。
例如，圈套可包含VanR转录因子结合位点，例如位于如屎肠球菌或天蓝色链霉菌的vanH启动子中的VanR结合位点，或与这样的位点竞争的序列。30bp VanR结合位点的一个实例示于(用大写字母表示的)SEQ ID NO：21中，以及另一实例提供于SEQ ID NO：26中，其包含肠球菌的VanR结合位点。在一个实例中，单体可包含SEQ ID NO：21或SEQ ID NO：26或与目标细胞中天然VanR结合位点竞争VanR转录因子结合的它们的变体。例如，变体可包含另一种或株中的天然VanR结合位点。
质粒中的转录因子结合位点可包含调节一种或更多种基因表达的顺式调节序列或与之竞争转录因子结合，该一种或更多种基因在决定溶剂耐受性如丁醇耐受性中起作用。
圈套可包含来源于或分离自基因组或基因组片段的序列。基因组片段可包含编码特定目标功能或表型的一种或更多种基因，所述特定目标功能或表型如代谢物例如抗生素(如肉桂霉素、放线菌紫素、十一烷基灵菌红素)的产生、对特定溶剂如丁醇或毒素的耐受性、对特定抗生素的抗性、或任何其他目标功能或表型。圈套可包含例如来源于或分离自这样的基因的启动子区或周围序列的序列，该周围序列例如较启动子远离基因的序列，如远离多达200bp更多大。
如在此所描述的，圈套可包含与该序列竞争转录因子结合的序列。例如，圈套可包含来源于包含肉桂霉素生物合成基因簇的肉桂链霉菌基因组片段的顺式调节序列或诱饵序列。制备这样的圈套的方法描述于此。如在此所描述的，圈套可包含来自肉桂链霉菌cin7启动子的顺式调节序列或与该序列竞争转录因子结合的序列。
圈套可包含来源于或分离自展示溶剂耐受性的原核生物如具有丁醇耐受性的大肠杆菌K12的基因组或基因组片段的序列。特别是，圈套可包含来源于编码溶剂耐受性或其表达与溶剂耐受性相关的基因的启动子的顺式调节序列，或与这样的顺式调节序列竞争转录因子结合的序列。用于制备这样的圈套的方法描述于此。
圈套可包含来源于或分离自展示抗生素抗性的原核生物基因组或基因组片段(通常该片段包含编码抗性的基因)的序列(如顺式调节序列或诱饵序列)。基因组片段可包含编码抗生素抗性的一种或更多种基因。圈套可包含来自编码抗生素抗性的基因启动子的顺式调节序列，或与这样的序列竞争转录因子结合的诱饵序列。可靶向任何目标抗生素抗性。例如，针对如下的抗生素抗性：已知为如下的抗生素类：氨基糖苷类(例如卡那霉素和庆大霉素(gentamycin))；糖肽类(例如万古霉素)；β-内酰胺类，其包括青霉素类(例如氨苄青霉素、羧苄青霉素和青霉素)，β-内酰胺酶抑制剂及组合(例如哌拉西林(piperacillin)和他唑巴坦(tazobactam))，头孢菌素类(例如头孢吡肟(cefepime))，碳青霉烯类(例如美罗培南(meropenem))，单菌胺类/单环β-内酰胺类(例如氨曲南(Aztreonam))；多肽类抗生素(例如多粘菌素B(polymixcinB))；喹啉类(例如左氧氟沙星(levaquin))；氟喹啉类(例如环丙沙星(ciprofloxacin))；磺胺类(例如菌特灵(Bactrim))；四环素类(例如四环素)；大环内酯类和酮内酯类(ketolides)(例如阿奇霉素(azithromycin))；噁唑烷酮类(oxazolidinones)(例如利奈唑胺(linezolid))；硝基咪唑类(例如甲硝唑(metronidazole))；硝基呋喃类(例如呋喃妥因(nitrofurantoin))；链阳菌素类(streptogramins)(例如达福普汀(dalfopritsin))；环状脂肽类(例如达托霉素(daptomycin))；林可酰胺类(lincosamides)(例如克林霉素(clindamycin))以及各种抗生素，氯霉素，利福平(rifampicin)，异烟肼(isoniazid)，乙胺丁醇(ethambutol)，特拉万星(telvancin)，替考拉宁(teicoplanin)，奥利万星(oritavancin)，达巴万星(dalbvancin)，甲氧苄啶(trimethoprim)/磺胺甲噁唑(sulfamethoxazole)，磷霉素(fosfomycin)，呋喃妥因(nitrofurantoin)和替加环素(tigecycline)以及斯沃(Zyvox)。
例如，针对如下的抗生素抗性：已知为如下的抗生素类：氨基糖苷类(例如卡那霉素)；碳青霉烯类(例如美罗培南)；头孢菌素类(例如头孢吡肟)；糖肽类(例如万古霉素)；青霉素类(例如氨苄青霉素、羧苄青霉素和青霉素)；多肽抗生素(例如多粘菌素B)；喹啉类(例如左氧氟沙星)；磺胺类(例如菌特灵)；四环素类(例如四环素)；以及各种抗生素，氯霉素、利福平、斯沃和达托霉素。
n[圈套]质粒文库
已描述了创建能确定单一顺式调节元件功能活性的n[圈套]质粒，我们在此概括可发现并表征这些序列的方法，包括通过使用n[圈套]质粒文库的方法，即一种与高通量筛选相容的方法学。
该方法学的总体目标是开发一种新方法以快速鉴定原核和真核基因的顺式作用调节子，在这种情况下创建了能在体内修饰表达的工具。该方法容许剖析大规模调节网络。在我们对遗传调节机制的认识中预期的进展会随着微阵列转录组学分析的突破而并行前进。
该工作以不同于现有技术例如创建基因敲除或插入诱变的方式鉴定了遗传修饰基因并确定了途径。那些方法通常鉴定反式作用调节子(例如转录因子)。通过鉴定顺式作用因子，该技术巧妙避开了与这些传统方法相关的问题：冗余-由于转录调节固有复杂性所致，意味着可在同一位点上结合多于一个的转录因子；极化效应-诱变可影响同一个转录单位中位于突变位点3’的基因表达；高成本和周转时间-产生并确认单个基因敲除可能需要数周到数年(取决于物种)，并且进行饱和诱变是一项冗长且昂贵的规程；种特异性-在此所描述的方法在所有实验系统中具有潜在效用，预计通用‘诱饵’文库可应用于定位大多数物种中的调节。
在实施例1中，通过开发一种克隆诱饵序列同聚体以创建高拷贝‘n[圈套]’质粒的方法，我们证实了对诱饵技术的实质改进，报道了对质粒携带法进行的改变。这些质粒易于导入许多菌种中并通过正选择保持，巧妙避开了诱饵方法的主要缺陷，即寡核苷酸可能难以导入细胞中并且对外切核酸酶敏感，从而给出相对短的半衰期。在另一种修改和改进中，我们创建了由详述于实施例2中的全基因组的片段或描述于实施例4中的来源于随机化寡核苷酸的序列组成的n[圈套]文库。这些办法容许全面收集要被并行筛选的调节元件，其较局限于按序测试规定序列的诱饵用于筛选目的的应用是一种非常强有力的手段。以下，在实施例3中，利用抗生素产生的调节的报道系统作为模型用于一个示范性的实施方案中来针对文库中的正和负调节子进行选择。
图4是显示如何构建定制n[圈套]质粒文库过程的一部分的示意图。
图5显示了使用n[圈套]文库检测能上调肉桂链霉菌抗生素肉桂霉素产生的顺式调节元件的实验方法。
图6提供了应用n[圈套]以对抗抗生素抗性的更多细节。
n[圈套]质粒文库作为开发工具
基因表达以及伴随的表型效应主要受控于DNA-蛋白相互作用。力图了解并控制基因表达通常更强调操纵转录机的蛋白组分，即反式作用因子例如转录因子，而非它们结合的DNA序列(顺式调节元件)。与反式作用因子相反，靶向顺式调节元件具有如下优点：其较对靶定蛋白进行遗传缺失更易于将寡核苷酸转染入细胞中；使用寡核苷酸能更适合于高通量分析；使用顺式作用元件巧妙避开了调节网络冗余的问题，这里通过结合相同顺式调节序列的另一转录因子的活性补偿了一特定转录因子的缺失。然而，诱饵法的潜在瓶颈在于鉴定候选序列。
为了该目的，通过自基因组片段创建文库并测试以观察是否所得到的文库的成员能施行对通过包含在该片段上的基因合成的产物的控制，从而证实了n[圈套]载体的效用。此外，检测了文库创建的分子生物学；以证实该文库是足够复杂的且具有预期的相同序列同向重复的分子结构。这些成功之处被进一步开发以创建具有广泛且通用应用的强有力筛选方法。
因此如上所述，本发明还涉及n[圈套]质粒文库。根据本发明的方法，该质粒文库可用于在原核生物或真核生物中筛选新的顺式调节序列和诱饵序列。使用n[圈套]文库来筛选容许对多条序列高通量筛选具诱饵功能。
文库中质粒的圈套序列可来源于基因组片段或基因组DNA。因而，该文库可包含代表或覆盖基本上所有基因组片段或基因组序列的圈套序列。该类质粒文库在此称为定制n[圈套]文库。可选地，文库中质粒的圈套序列可包含长度“n”个核苷酸的随机化序列。因而，该文库可包含基本上每一条可能的如在此所描述的长度“n”的核苷酸序列。这样的文库在此被描述为通用n[圈套]文库。
定制n[圈套]质粒文库
通常，圈套来源于基因组片段或基因组DNA(原核或真核生物的)。例如，原核生物例如细菌，如链霉菌，例如肉桂链霉菌、浅青紫链霉菌或天蓝色链霉菌，或者大肠杆菌的基因组或基因组片段。
文库所来源的基因组或基因组片段可包含编码特定目标功能或表型例如代谢物如抗生素(如肉桂霉素、放线菌紫素、十一烷基灵菌红素)的产生、对特定溶剂或毒素的耐受性、对特定抗生素的抗性或任何其他目标功能或表型的一种或更多种基因。圈套可包含来源于或分离自这样的基因的启动子区的序列。与圈套序列相关的合适的基因和功能/表型业已描述于上。
因此，基因组DNA或片段可包含在代谢物产生中起作用的一种或更多种基因，如在代谢物是抗生素、酶或药物的情况下，或者在决定抗生素抗性中起作用的一种或更多种基因，或者在决定溶剂耐受性中起作用的一种或更多种基因。
可通过检测编码功能或表型的基因的水平转移入异源细胞，鉴定包含编码特定功能或表型的一种或更多种基因的基因组片段。
可通过生物信息学分析鉴定包含编码特定功能或表型的一种或更多种基因的基因组片段。可选地，其可通过功能筛选这样的片段的集合而得以鉴定。
用于制备定制n[圈套]文库的方法描述于此。
通用文库
在通用文库中，圈套通常包含长度n个核苷酸的随机化核苷酸序列。文库可包含代表所有或基本上所有长度n个核苷酸序列的排列的圈套。一般而言，n可以是范围5-50，例如10-50，例如20-40，如25-35，如6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个核苷酸。
在这样的文库中的单体可额外包含恒定序列。因此，随机化序列(可变区)可在一侧或两侧侧接恒定区。可选地，单体可包含侧接可变区的规定的核心序列。核苷酸偏爱可导入可变区中。例如，在合适的情况下，可变区可包含更高的GC偏爱，如在文库用于筛选其中DNA展示高GC偏爱的生物体中顺式调节序列的情况下。
在一个实例中，圈套包含随机化的9核苷酸序列(n＝9)。n[圈套]质粒中的单体可包含SEQ ID NO：7的寡核苷酸序列。用于产生通用n[圈套]文库的方法描述于此。
制备n[圈套]质粒的方法
一般而言，如在此所描述的n[圈套]质粒可通过包括如下的方法制备：
-提供包含一个或更多个拷贝的单体序列的多核苷酸；和
-克隆该多核苷酸入合适的质粒载体中。
单体的组成如在此关于n[圈套]质粒所描述的。合适的质粒载体也已被描述。
包含一个或更多个拷贝的单体序列的多核苷酸可通过包括如下的方法提供：
(1)提供包含如下的环状寡核苷酸：
(i)目标测试序列(图1中的B)；和
(ii)适用于滚环扩增的引物的结合位点(图1中的A)；
其中单体序列包含(i)和(ii)；以及
(2)使用环状寡核苷酸作为模板进行滚环扩增，从而提供包含单体序列重复的多核苷酸。
该方法的步骤(1)可进一步包含通过PCR扩增滚环扩增产物并分离所需尺寸的多核苷酸片段，例如，包含30-50个重复的单体序列的片段。这可通过如PAGE分析得以进行。
环状寡核苷酸可通过包括如下的方法制备：
-提供包含如下的线型单链寡核苷酸：目标测试序列(i)和适用于滚环扩增的引物的结合位点(ii)；
-通常在通用连接寡核苷酸存在下，如使用Taq连接酶环化该寡核苷酸；
-任选地用外切核酸酶消化残留的线型DNA；和
-如使用PAGE回收单体环状寡核苷酸。
适用于滚环扩增的引物是本领域已知的。例如，可使用T7引物。
用于进行滚环扩增的方法是本领域已知的。例如，可使用BstI聚合酶。
在一个实例中，使用与用于滚环扩增相同的引物如T7引物进行滚环扩增产物的PCR扩增。
一般而言，单体中的测试序列(i)包含如在此所描述的圈套序列。
如在此所描述的，圈套序列可分离自基因组DNA，如分离自全基因组，或分离自基因组片段。圈套序列一旦被分离，就可通过上述方法用于形成n[圈套]质粒。因此，可制备来源于基因组或基因组片段的n[圈套]质粒文库(如在此所描述的定制文库)。
一种用于自基因组或基因组片段制备圈套序列的方案图解于图4中。通常，一种方法包括：
(1)提供双链基因组DNA样品；
(2)片段化基因组DNA；
(3)将衔接头连接到来自(b)的DNA片段的每一末端上，其中每一衔接头包含：
(iii)用于固定DNA片段的手段；
(iv)在与该识别位点(如下游(3’)的)隔开一段距离切割的第一限制酶的识别位点；和
(v)第二种酶的识别和切割位点；
(4)任选地除去未连接的衔接头；
(5)用第一限制酶消化带有衔接头的片段，从而产生两条衔接片段，其中每条衔接片段包含：
(vi)衔接头；和
(vii)包含如下的DNA片段：较短的链：和较长的链(如具有3’突出端)，其中较长的链包含圈套序列；
(6)固定(5)中产生的衔接片段；
(7)变性该片段以提供单链片段；
(8)通过将互补寡核苷酸连接到衔接头再建第二限制酶识别位点，并用第二限制酶消化该衔接片段，从而产生包含如下的衔接头-圈套片段：
(viii)衔接头片段；和
(ix)单链圈套序列；以及
(9)从固定状态释放衔接头-圈套片段。
(8)中产生的衔接头-圈套片段包含单链圈套序列和在用第二限制酶消化后残留的衔接头片段(相应于第二酶识别位点和连接圈套的衔接头末端之间的衔接头部分)。最后的n[圈套]质粒中(和上述测试序列(i))的单体应包含衔接头-圈套片段。
基因组DNA样品可来源于原核或真核细胞。基因组DNA样品可包含基因组片段或全基因组。该样品可来自于展示特定目标表型如产生特定代谢物、对特定抗生素抗性的细胞，例如天然株(如病原体)或临床分离株。例如，该样品可来自产生肉桂霉素的肉桂链霉菌，来自产生放线菌紫素、十一烷基灵菌红素的天蓝色链霉菌，来自展示对丁醇的耐受性的大肠杆菌K12，或来自展示对万古霉素的抗性的屎肠球菌或天蓝色链霉菌。该样品可来自细菌模型，如通过水平基因转移获得特定表型或功能的细菌模型。
通常，步骤(2)中产生的片段长约500bp，但可在例如100-1000bp范围内，如200-900、300-800、400-600bp，如150、250、350、450、550、650、750、850、950bp。任何合适的片段化方法皆可用于产生片段。优选地，该方法产生随机化或无偏爱的片段。例如，可使用超声处理。
步骤(2)中产生的片段可包含不同类型的末端-例如，平端、或者不同长度的5’或3’突出端。因此，片段化步骤(k)中产生的片段可被进一步处理以产生一群均一的片段，其中每条片段都具有相同的3’dNTP突出端一dA或dT。这可通过如下手段得以实现，例如用Taq聚合酶和合适dNTP处理以修复片段末端，如有必要，添加3’dNTP如dA突出端。
衔接头可通过任何合适的手段连接到该片段上。例如，衔接头可包含与每条片段的3’dNTP突出端互补的5’dNTP突出端。因此，例如，如果步骤(b)中产生的片段包含3’dA突出端，则衔接头可包含5’dT突出端。
在上述所列的方法中，衔接头包含一种用于固定DNA片段的手段。对于本发明方法而言，固定不是必需的，但是具有优点在于其降低了实验背景。衔接头可包含用于固定片段的任何合适的手段。例如，衔接头可包含(通常在远离DNA片段的末端)一对结合分子的一个成员，其中配对中的结合分子彼此结合，以及其中配对的另一成员可包含在合适的固定基质中。例如，配对中的结合分子可以是生物素和链霉亲合素。可使用生物素化衔接头，并且该衔接片段在链霉亲合素基质上被捕捉。
第一限制酶在其识别位点远处切割。例如，该酶可切割其识别位点的下游(3’)。其切割的距离决定了圈套序列的长度。对于圈套序列合适的长度描述于此。可被使用的酶的实例是MmeI。其他实例包括GsuI、BpmI及其同功异源酶(isochizomer)。更多的实例包括已知为切割它们的识别位点一边外侧的II型限制酶家族成员。在当前描述中，使用那些在3’侧上切割的酶以及优选那些在最大距离处切割的酶，通常15-25nt(评述于Gene(1991)100；13-26中)。导入的双链切割的特性并不关键，但在于此所描述的方法中使用了3’突出端。该方法可适应于使用5’突出端和平端切割。圈套的特性可因此被改变。例如，如果使用给出具有更长5’突出端的不对称产物的酶，其应有利于使5’突出端进入圈套中。还取决于识别位点(其通常是不对称的)如何放置于衔接头中，可使用在其识别位点的5’导入切割的酶。
第二限制酶在衔接头序列中切割。可使用的酶的实例包括Nt.Bbv.CI。已知其是一种产生切口的内切核酸酶并在该应用中用作在上链(top strand)中导入单链切口以容许回收圈套。然而，该方法可适用于大多数通常可获得的限制酶。可使用的酶的实例包括那些产生3’或5’突出端或产生平端断裂的酶。
一旦制备，可测试n[圈套]质粒文库其结构中的偏爱。通常，通过分离质粒，消化以释放插入片段，并进一步消化(如用第一限制酶)以分离单体序列来进行这样的测试。
定制n[圈套]质粒文库的创建描述于本发明的实施例中。在实施例2中，文库制备自肉桂链霉菌肉桂霉素生物合成基因簇，以及在实施例4中，文库制备自大肠杆菌K12基因组DNA。本发明涉及如在这些实施例中所制备的文库。
如在此所描述的，圈套序列可包含随机化核苷酸序列。通常，圈套包含长度“n”个核苷酸的随机化(或可变)核苷酸序列。一般而言，n的范围可以是5-50，例如10-50，例如20-40，如25-35，如6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个核苷酸。可制备其中圈套包含长度n的随机化序列的质粒文库。这样的文库是一种通用n[圈套]文库。
可使用本领域已知方法合成包含随机化序列(和任选的如所述的恒定序列)的寡核苷酸。通常，在制备用于n[圈套]通用文库的圈套中，制备包含所有或基本上所有可能的长度n的核苷酸序列的寡核苷酸。
可将核苷酸偏爱导入寡核苷酸的随机化(或可变)区中。例如，如果合适的话，可导入GC偏爱。
上述方法中的单体或目标测试序列(图1中的B)可包含这样制备的寡核苷酸。n[圈套]质粒可因而如所描述的进行制备。
实施例4描述了制备其中n＝9的通用n[圈套]文库。本发明涉及根据实施例4中的方法制备的文库。
在一方面，本发明涉及一种包含单体和/或圈套的n[圈套]质粒，该单体和/或圈套包含在此所描述的和/或根据在此所描述的方法鉴定的顺式调节序列或诱饵序列，包括任何在此所描述的和/或根据包括实施例的在此方法所制备的n[圈套]质粒或质粒文库。
宿主细胞
本发明还涉及包含如在此所描述的n[圈套]质粒或质粒文库的一种或多种宿主细胞。本发明进一步涉及包含如在此所描述的诱饵多核苷酸(诱饵分子)的一种或多种宿主细胞。特别是，本发明涉及这样的宿主细胞，由于质粒或诱饵多核苷酸的存在，其显示改变的基因表达和/或表型，如与不存在该质粒/诱饵分子的细胞相比，增加的代谢物或发酵产物如抗生素或酶的产生、增加的对溶剂的耐受性、增加的对一种或更多种抗生素的敏感性。
通常，通过合适的手段例如转化、转染或接合将质粒或质粒文库或多核苷酸导入细胞中。
用于本发明方法的宿主细胞可以是原核或真核的。例如，可使用原核生物如细菌细胞。宿主可以是例如放线菌类例如链霉菌物种，如天蓝色链霉菌，例如天蓝色链霉菌A3(2)、(M145或M600株)，浅青紫链霉菌，肉桂链霉菌或大肠杆菌。其他实例可包括其他革兰氏阳性细菌菌种，例如那些来自放线菌群(Actinobacteria)的菌种，例如来自分枝杆菌属(Mycobacterium)的细菌，例如致病细菌结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)、牛分枝杆菌(M.bovis)、非洲分枝杆菌(M.africanum)和田鼠分枝杆菌(M.microti)；麻风分枝杆菌(M.leprae)。革兰氏阳性细菌属的进一步的实例是梭菌属(Clostridium)，其包括致病细菌例如艰难梭菌(Clostridium difficile)(人病原体)、肉毒梭菌(C.botulinum)、产气荚膜梭菌(C.perfingens)和破伤风梭菌(C.tetani)，以及潜在工业用途的细菌例如丙酮丁醇梭菌(C.acetylbutylictum)、热解纤维梭菌(C.thermocellum)和扬氏梭菌(C.ljungdahlii)。其他革兰氏阳性细菌属可包括芽孢杆菌属(Bacillus)、李斯特氏菌属(Listeria)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、梭菌属(Clostridium)、棒状杆菌属(Corynebacterium)、链球菌属(Streptococcus)和肠球菌属(Enterococcus)。宿主细胞还可以是革兰氏阴性细菌，其包括肠杆菌科(Enterobacteriaceae)的属，包括人病原体，例如沙门氏菌(Salmonella)和大肠杆菌(Escherichia coli)。革兰氏阴性细菌属的其他实例可包括假单胞菌属(Pseudomonas)、鲍特氏菌属(Bordetella)、疏螺旋体属(Borrelia)、布鲁氏菌属(Brucella)、弯曲杆菌属(Campylobacter)、弗朗西斯氏菌属(Francisella)、嗜血菌属(Haemophillus)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、奈瑟氏菌属(Neisseria)、变形杆菌属(Proteobacteria)、立克次体属(Rickettsia)、弧菌属(Vibrio)、耶尔森氏菌属(Yersina)、莫拉氏菌属(Moraxella)、螺杆菌属(Helicobacter)、寡养单细胞属(Stenotrophomonas)、蛭弧菌属(Bdellovibrio)、醋酸细菌(acetic acidbacteria)、军团菌属(Legionella)、蓝细菌属(cyanobacteria)、螺体属(spirochaetes)、绿色硫细菌和绿色无硫细菌(green sulfur and green non-sulfurbacteria)以及许多其他属。重要的革兰氏阴性病原体包括引起性传播疾病(淋病奈瑟氏菌(Neisseria gonorrhoeae))、脑膜炎(脑膜炎奈瑟氏菌(Neisseriameningitidis))和呼吸症状(卡他莫拉氏菌(Moraxella catarrhalis))的球菌菌种。其他医学相关的革兰氏阴性细菌包括多种菌种。它们中的某些主要引起呼吸问题(流感嗜血杆菌(Hemophilus influenzae)、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiellapneumoniae)、嗜肺军团菌(Legionella pneumophila)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa))，主要引起泌尿问题(大肠杆菌、奇异变形杆菌(Proteus mirabilis)、阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)、粘质沙雷氏杆菌(Serratia marcescens))，以及主要引起肠胃问题(幽门螺杆菌(Helicobacterpylori)、肠炎沙门氏菌(Salmonella enteritidis)、伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphi))。宿主细胞还可包括真核生物例如酵母(其实例可包括：那些用于工业生产的酵母例如酵母属(Saccharomyces)(例如酿酒酵母(S.cerevisiae))、裂殖酵母属(Schizosacharromyces)(栗酒裂殖酵母(S.pombe))和甲醇酵母(methyltrophic yeast)毕赤酵母属(Pichia)[例如巴斯德毕赤酵母(P.pastoris)]和假丝酵母属(Candida)，以及多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)；致病酵母例如假丝酵母属[例如白色假丝酵母(C.albicans)和热带假丝酵母(C.tropicalis)]，以及隐球菌属(Cryptococci)[例如新型隐球菌(C.neoformans)]，真菌(其可包括：致病性真菌例如假丝酵母属、曲霉属(Aspergillus)[例如烟曲霉(A.fumigatus)和黄曲霉(A.flavus)]、隐球酵母属(Crptococcus)、组织胞浆菌属(Histoplasma)[例如荚膜组织胞浆菌(H.capsulatum)]、肺囊虫属(Pneumocystis)[例如耶氏肺囊虫(P.jirovecii)]和葡萄穗霉属(Stachybotyrus)[例如S.chartarum]；用于工业生产的真菌例如曲霉属(Aspergillus)[特别是黑曲霉(A.niger)和米曲霉(A.oryzae)])和链孢霉属(Neurospora)的成员，如粗糙链孢霉(N.crassa)，植物细胞和哺乳动物细胞，禽类细胞，或是处于细胞培养物中或是组织的一部分。
一般而言，宿主细胞与质粒载体相容。例如，细胞与质粒复制起点相容。该细胞通常是一种其中质粒可稳定保持并复制的细胞。宿主细胞还通常与质粒中任何可检测的标记基因相容，使得该基因能在细胞中表达，并且从而能对质粒成功导入并保持的细胞进行筛选。
宿主细胞可简单地被预期用于质粒或多核苷酸的操作。优选地，这样的菌株是一种能在实验室条件下容易地操作并保持的实验室菌株，如大肠杆菌。
可选地或另外地，宿主细胞可使用根据本发明的n[圈套]质粒文库来筛选顺式调节序列，和/或使用如在此所描述的n[圈套]质粒来测试推定顺式调节序列的诱饵功能。宿主细胞还可以是一种其中期望使用如在此所描述的n[圈套]质粒或其他诱饵分子改变基因表达的宿主细胞。
一般而言，宿主细胞包含目标顺式调节序列，即被筛选的或导入细胞中的诱饵序列意在竞争的顺式调节序列。通常，在细胞中的顺式调节序列可操作地连接一种或更多种基因，该一种或更多种基因的表达可被直接或间接检测。通常，细胞包含可操作地连接基因的含有顺式调节序列的启动子。可操作地连接意思是顺式调节序列和/或启动子以这样一种方式连接一种或更多种基因，使得该序列和/或启动子能发挥(在合适的条件下，如在必需转录因子的存在下)调节基因表达的功能。因此，当结合关连转录因子时，该顺式调节序列发挥调节(抑制或激活)一种或更多种基因的表达的功能。启动子可以是例如调节编码目标表型的基因(例如在此描述的任一基因或表型)的一种启动子。
可通过监测所连接基因的表达确定顺式调节序列在细胞中的功能。这可通过直接监测基因表达或通过监测与基因表达相关的特定表型表达来进行。例如，对功能的筛选可包含对给定代谢物或发酵产物，如抗生素例如肉桂霉素、放线菌紫素和/或十一烷基灵菌红素的产生的筛选；对针对特定抗生素如万古霉素的抗性的筛选；或对针对溶剂例如丁醇的耐受性的筛选。用于筛选的方法描述在此。
在一方面，质粒引起宿主细胞基因表达和/或表型改变，如增加抗生素合成，减少抗生素抗性，或增加细胞中溶剂耐受性。
宿主细胞可包含可操作地连接其天然(关连)基因的顺式调节序列(如包含该序列的启动子)，即连接至在其天然存在下该序列(或启动子)调节其表达的一种或更多种基因。因此，例如在目标顺式调节序列(或其天然启动子)调节编码代谢物(如抗生素或酶)产生的基因的情况下，宿主细胞可包含天然生产细胞。在目标顺式调节序列(或其天然启动子)调节编码抗生素抗性的一种或更多种基因的情况下，宿主细胞可包含天然的抗生素抗性株，如病原体或临床分离株。因此，细胞中的顺式调节序列可以可操作地连接一种或更多种基因，该一种或更多种基因的表达受处于其天然环境中的序列调节。
例如，如本发明实施例中所描述的，天蓝色链霉菌是放线菌紫素和十一烷基灵菌红素的一种天然生产者。业已报道这些抗生素的产生需要AsfR蛋白结合asfS基因上游的结合位点。当对包含AsfR结合位点的序列的存在筛选圈套时(或当导入与这样的序列竞争的诱饵序列时)，天蓝色链霉菌因此可用作宿主细胞。与天然细胞的AsfR结合位点竞争会导致减少的抗生素产生。
还如实施例中所描述的，肉桂链霉菌产生肉桂霉素抗生素。肉桂链霉菌可用作宿主以针对肉桂链霉菌肉桂霉素生物合成簇中基因的启动子中顺式调节序列的存在(或当导入与这样的序列竞争的诱饵时)筛选圈套。如在此所描述的通过监测转化株中肉桂霉素的产生，可针对与天然顺式调节序列的竞争进行筛选。
同样如所描述的，大肠杆菌K12包含编码丁醇耐受性的基因。大肠杆菌K12细胞可用于针对编码耐受性的基因的启动子中顺式调节序列的存在(或当使用与这样的序列竞争的诱饵时)筛选圈套。通过在不同浓度的丁醇存在下测定细胞生存力，可针对转化细胞中竞争序列的存在进行检定。
可选地，宿主细胞可包含给定细胞表型如代谢物产生或抗生素抗性的模型，如细菌模型。这样的模型包含可操作地连接天然基因但处于异源细胞中的目标顺式调节序列(如包含该序列的启动子)。换言之，顺式调节序列(及其天然启动子)和可操作地连接的基因并非内源地出现在细胞中。
通常，模型宿主细胞包含较天然菌株在实验室条件下更容易操作的细菌菌种或菌株，如非致病的或对基因转移更易感的细菌菌种或菌株。一般而言，在于此所描述的n[圈套]质粒或诱饵分子不存在下，基因表达受顺式调节序列(如在其启动子中的)调节。因此，细胞包含对于顺式调节序列以正常方式起作用所必需的成分，如结合该序列并抑制或激活基因表达的转录因子。
模式宿主细胞可包含已被导入该细胞中的携带顺式调节序列和基因的质粒，或者该顺式调节序列和基因可整合入宿主基因组中。模式宿主可包含含有顺式调节序列和基因的基因组片段，其中该片段已获得自天然细胞，如通过水平转移。
模式细胞可具有获得的赋予给定目标表型的基因，所述目标表型如代谢物产生、抗生素产生、抗生素抗性、溶剂耐受性，例如，模式菌株可通过编码表型如抗生素产生和/或抗生素抗性的基因水平转移获得特定表型。这样的模式菌株无须该编码基因的先验知识就能制备。其通过将来自天然菌株(展示目标表型)的DNA水平转移至模式菌株并通过对表型获得进行筛选而得以进行。
在细胞要成为定制n[圈套]文库宿主的情况下，该细胞可例如包含来自该文库所来源的基因组DNA或基因组片段(内源或通过基因获得)。
合适的宿主细胞是本领域已知的并描述于本文的实施例中。例如，实施例6描述了天蓝色链霉菌M600株，其是一种万古霉素抗性细菌模型。
报道细胞
宿主细胞可包含可操作地连接基因的目标顺式调节序列(或包含该顺式调节序列的目标启动子)，该基因的表达在其天然环境中不受该序列或启动子调节(非天然基因)。这样的基因称为报道基因。通常，报道基因可操作地连接包含目标顺式调节序列的启动子序列。
可通过测定报道基因的表达从而测定顺式调节序列的功能。通常，报道基因是一种其表达可容易地被检测并筛选到的基因。例如，报道基因可编码荧光化合物或抗生素抗性。报道基因的实例是萤光素酶或编码卡那霉素抗性的neo基因。在顺式调节序列(或启动子)天然控制具有不容易评价的表型的基因表达的情况下，这样的报道细胞是特别有用的。
在一个实施方案中，报道基因受转录因子(转录阻抑物)与目标顺式调节序列结合的负调节。这样的宿主细胞适用于筛选负调节(阻抑)它们的关连基因表达的顺式调节序列。在一个可选实施方案中，报道基因受转录因子(转录激活物)与顺式调节序列结合的正调节。这样的宿主细胞有用于筛选正调节它们的关连基因表达的顺式调节序列。
任何合适的宿主株都可用于该报道系统中。合适的菌株是本领域已知的并描述于此。适当时，选择不包含报道基因的基因组拷贝的菌株。类似地，报道菌株可通过在导入真实报道基因之前从基因组中靶向缺失用作报道基因的基因而被工程化。
报道基因和顺式调节序列(如在启动子中)可以是质粒携带的。可选地，报道基因和顺式调节序列(或启动子)可整合入宿主基因组中。例如，报道系统可于整合质粒如pSET152之上被导入宿主中。在该系统是质粒携带的情况下，质粒通常包含容许在宿主细胞中对质粒正选择的可检测的标记基因。例如，可检测的标记基因可编码抗生素抗性，如编码对安普霉素的抗性的aac基因。
本发明人已经开发出一种通用报道细胞系统，其可用于筛选例如在于此所描述的n[圈套]质粒文库或n[圈套]质粒中顺式调节序列的存在。该筛选细胞和方法容许在细胞生存力基础上筛选顺式调节序列的存在。对于在合适的培养条件下细胞生存力或生存而言，报道基因的表达是决定性的。在测定条件下，宿主细胞只有在与目标顺式调节序列(如在目标启动子中)竞争转录因子结合的序列已被导入细胞中的时候存活。该系统称为“死或活”筛选系统。该系统可以是自动化系统，并具有下列优点即其能用于筛选在液体培养基中培养的细胞。
当目标顺式调节序列起作用抑制可操作地连接的基因表达时，报道基因通常编码在合适的培养条件下对于细胞存活必需的产物。例如，报道基因可编码抗生素抗性，使得当宿主细胞在该抗生素存在下培养时，仅在抑制转录因子与连接该报道基因的顺式调节序列结合并容许报道抗生素基因表达的竞争序列存在的情况下有可能细胞存活。合适的抗生素抗性基因包括例如卡那霉素抗性基因neo。其容许检测被转录阻抑物结合的顺式调节序列。其他合适的基因是本领域已知的。
在该情况下，宿主细胞通常包含其他顺式调节序列起作用所必需的成分。该细胞通常包含(如表达)对于与顺式调节序列结合所必需的转录因子。宿主细胞可早已包含顺式调节序列，如包含该顺式调节序列的启动子。宿主细胞可包含该目标顺式调节序列所来源的基因组片段。
当顺式调节序列起作用激活可操作地连接的基因的表达时，报道基因编码在合适的培养条件下其对于细胞是致死的产物。这样的基因通常称为自杀报道基因。细胞仅在抑制或阻止转录因子结合连接报道基因的顺式调节序列的竞争序列存在下存活(在合适的培养条件下)。自杀报道基因的一个实例是例如葡萄糖激酶基因(glkA)。该基因将代谢物(2脱氧葡萄糖(DOG))转变为毒素。因此，当在DOG存在下培养时，glkA基因的表达对细胞是致死的。这容许检测被转录激活物结合的顺式调节序列。其他合适的基因是本领域已知的。
通常，在该系统中宿主并不另外表达报道基因，但是包含顺式调节序列起作用所必需的成分。该细胞通常包含如表达与顺式调节序列结合所必需的转录因子。在这样的系统中，在顺式调节序列处的任何活性应归因于来源于宿主细胞基因组的正转录因子(激活物)。通过在该背景中搜寻，有可能从宿主染色体中发现异源表达的正调节子。通过滴定这些激活物离开连接报道基因并结合诱饵序列如n[圈套]质粒，阻止了报道基因如glkA的表达，并且细胞存活，甚至当在DOG代谢物存在下生长时。
该死或活报道系统可适用于任何合适的顺式调节序列，例如那些在此描述和/或鉴定的任一顺式调节序列。例如，如实施例3中所描述的，可使用来源于肉桂链霉菌中肉桂霉素生物合成簇的cin7启动子。如实施例中所描述的，cin7启动子能可操作地连接编码卡那霉素抗性的neo基因。其可包含于整合质粒例如在实施例中使用的pSET152骨架中。质粒还携带合适的标记基因(编码安普霉素抗性的aac基因)。可将质粒导入或整合入额外携带肉桂霉素生物合成途径的浅青紫链霉菌宿主株(1326)中。这样的报道细胞适合于筛选例如来源于包含如在此所描述的肉桂霉素生物合成簇的肉桂链霉菌基因组或基因组片段的n[圈套]质粒文库。
可选地，cin7启动子能可操作地连接glkA报道基因，以及以相同的方式整合入整合质粒中。在这种情况下，合适的宿主株应当是缺少肉桂霉素生物合成簇和而且还缺少glkA基因的浅青紫链霉菌TK24株。
在一方面，本发明涉及根据本发明实施例描述并制备的报道细胞。鉴定和表征顺式调节序列的方法
使用本发明n[圈套]质粒的原理阐明于图2中。如果质粒中的圈套序列包含转录因子结合位点，该转录因子结合位点含有该质粒被导入的细胞中的顺式调节序列和/或与之竞争转录因子结合，则其可作为受该细胞中的顺式调节序列调节的基因表达的改变而被检测。因此，n[圈套]质粒可用于鉴定顺式调节和诱饵序列。质粒还可与包含已知诱饵序列的圈套一起使用以破坏细胞中基因表达。
因此，对于多种不同的目的，本发明的n[圈套]质粒可以多个使用。如上，使用定制n[圈套]文库，n[圈套]质粒文库可用于对如在基因组DNA片段中的推定的顺式调节序列进行筛选。n[圈套]质粒可用于对特定序列测试诱饵功能。在任一这些方法中，如果n[圈套]质粒中的圈套能从宿主中存在的顺式调节序列中滴定掉转录因子(如通过基因表达或宿主细胞表型改变所确定的)，则圈套序列被鉴定为包含顺式调节序列或与顺式调节序列竞争转录因子结合的序列。因此，使用该方法鉴定的序列还可用作诱饵序列，以及在一方面，该方法可被认为是鉴定诱饵序列和分子的方法。包含诱饵序列的n[圈套]质粒可用于调控宿主细胞中基因表达和/或表型。
因此，在一方面本发明提供了用于鉴定和/或表征顺式调节和诱饵序列的方法。一般而言，这样的方法包括：
1.提供如在此所描述的n[圈套]质粒或n[圈套]质粒文库；
2.将该n[圈套]质粒或质粒文库导入宿主细胞中，其中该宿主细胞包含可操作地连接一种或更多种基因的目标顺式调节序列，该一种或更多种基因的表达可直接或间接测定；和
3.在n[圈套]质粒或质粒文库存在和不存在下，测定该一种基因(或多种基因)的表达或表型改变。
用于该方法中的n[圈套]质粒或n[圈套]质粒文库可以是如在此所描述的。每个质粒中的圈套都包含要被测试竞争功能的序列。
一般而言，宿主细胞包含可操作地连接一种或更多种基因的目标顺式调节元件(如包含顺式调节元件的启动子)，所述基因的表达可直接或间接监测或测定。例如，可通过测定特定的一种或更多种基因的表达或通过监测所述一种或更多种基因编码的特定表型来监测该表达。
在此已描述了适用于本发明方法的宿主细胞并包括，例如天然株、临床分离株、实验室模型和报道细胞。可使用在此描述的“死或活”报道筛选系统。
在本文的实施例1和2中，证实了诱饵-寡核苷酸法可适用于质粒形式，包括证实了使用文库来鉴定规定序列的顺式调节子是可行的。该基于n[圈套]文库的方法的反复操作的一个可能的局限在于其可能不被最优化适合于错综或复杂表型改变的调节子。在多数情况下，表型改变可能不是容易可检测的，并且可能需要复杂的打分系统，例如通过层析分析定量代谢物产生。在表型打分标准化的情况下，这对于创建报道系统而言应当是明显的优势，使得n[圈套]文库筛选得以加速，以至其能以高通量实施。
实施例2中采用的方法，即针对表型改变筛选所有文库成员的一个可能的技术局限是需要实际铺板或培养全文库的所有成员，因此留下了一个对可筛选多少的集落以及如此可调查的DNA的量的实践上的限制。调查会产生具有＞100 000个成员的文库的基因组大片段(其相当于大约25kb序列)并不可行。如下所述，在本发明人开发的系统中所使用的两种报道基因都赋予了具有包含候选顺式调节元件的n[圈套]质粒的细胞以生存力。因此，简单地通过让大多数不包含候选质粒的细胞死亡，通过生存力选择容许在液体培养物中快速富集候选序列。
因此，本发明人已通过开发基于通用报道基因的测试系统，使在此描述的n[圈套]文库法适用于解决这些问题。在这种反复操作中，负和正调节子通过它们对编码抗生素抗性(图7)或如图8中所示的代谢物敏感性(自杀报道基因)的报道基因的作用而得以检测。将靶启动子导入报道基因盒(reportercassettes)中以容许检测负调节(转录阻抑物)或正调节(转录激活物)。该方法解决了需要可评价的表型的问题，由于在正常的情况下每个报道基因都会导致细胞死亡，因此只有当来自该文库的n[圈套]质粒通过滴定掉转录因子来解除该细胞死亡，才使得细胞能生长。因此，对两种报道基因的选择都依赖于细胞存活，其大大加速了筛选进程。该系统的另一个特征是这样的死或活筛选能容易地自动化进行，从而作为快速、综合性或高通量筛选的基础。还有可能鉴定控制在它们的天然环境中不具有易于可评价的表型的启动子的调节序列。
通过任何合适的手段在本发明方法中将质粒或质粒文库导入宿主细胞。该合适的手段是本领域已知的。如果n[圈套]质粒是接合的，则该质粒可通过接合导入。还可使用其他手段例如转染/转化。
通常，之后如在此所描述的通过选择质粒上可检测的标记基因如抗生素抗性基因的表达，对宿主细胞监测质粒的稳定增殖。在选择表达特定标记的细胞的条件下，如在抗生素存在的情况下培养细胞。
优选地，该方法包括使用一种或更多种合适的对照。例如，这样的对照包括未用质粒处理的宿主细胞、已导入空质粒载体的宿主细胞和已导入包含打乱顺序的推定的顺式调节序列的n[圈套]质粒的宿主细胞。
一旦将质粒导入细胞中，就针对可操作地连接目标顺式调节序列(或启动子)的一种或更多种基因的表达筛选细胞。将在圈套序列(在n[圈套]质粒中)存在下的表达与该圈套不存在下的表达相比。产生测试基因表达改变(如细胞表型改变)的克隆被选作可能包含顺式调节序列。分离来自这些克隆的DNA，并分离推定的顺式调节序列(或诱饵序列)。
可通过任何合适的方法进行对基因表达改变的筛选。筛选可包含检测或测量基因的表达产物，如通过分析基因产物的功能，或可包含测定与基因表达相关的宿主细胞表型的改变。
例如，可通过测定给定代谢物的表达，如该代谢物的量(或存在或不存在)或代谢物的功能，监测编码代谢物如抗生素产生的基因表达的改变。
例如，放线菌紫素和十一烷基灵菌红素是有色抗生素。放线菌紫素是蓝色的以及十一烷基灵菌红素是红色的。因此，这些抗生素的表达可容易地通过比色技术进行监测。
可通过使用指示细菌菌株和合适的平板测定法监测某些代谢物或抗生素的产生。例如，可通过使用指示菌株枯草芽孢杆菌以及合适的培养基如固体R2YE琼脂的平板测定法检测肉桂霉素的产生。细胞通常在已接种指示菌株的琼脂平板上培养。通过反应程度例如杀死指示菌株，如通过琼脂平板上晕圈的直径，测定抗生素的表达。
抗生素抗性基因或表型如万古霉素抗性、卡那霉素抗性的表达可通过在抗生素存在下培养宿主细胞并测定对抗生素的敏感性而得以测定。通常，还在抗生素不存在下培养细胞作为对照。
类似地，编码溶剂耐受性如丁醇耐受性的基因可通过在溶剂存在下培养细胞而得以监测(还通常在溶剂不存在下培养细胞作为对照)。
在某些情况下，对相关基因表达的筛选包含在合适的培养条件下测定宿主细胞生存力。例如，当一种或更多种基因编码抗生素抗性时，筛选可包含在抗生素存在下培养细胞并测定细胞是否存活。在包含“死或活”报道宿主细胞的筛选中，在给定的培养条件下，细胞只有在导入细胞中的n[圈套]质粒包含能与目标顺式调节序列竞争的序列时才能存活的。因此，筛选细胞包含了在其中报道基因(可操作地连接目标顺式调节序列的基因)的表达对宿主细胞生存力起决定作用条件下培养细胞，并分离活细胞。
本发明方法可包含在如在此所描述的液体培养基中培养宿主细胞，例如如果待测定的细胞表型是细胞生存力的话。其可具有如下优势，即仅少量细胞留待分析。
筛选可包含使用在此所述的DNA扣除技术。在相关基因表达影响细胞生存力(在合适的培养条件下)的情况下，其可能是特别有用的。
通常，DNA扣除步骤包含从具有给定表型的细胞和不具有该表型的细胞中扣除一群DNA。
例如，在某些情况下，导入包含竞争顺式调节序列的序列会导致宿主细胞变得在合适的培养条件下不能生存。这可能是这样的情况，即如果例如目标顺式调节序列激活抗生素抗性基因表达或抑制致死基因(在特定培养条件下表达产物致死)表达。当竞争顺式调节序列被导入细胞中时，如处于n[圈套]质粒的圈套中，该竞争序列滴定转录因子并导致抗生素抗性基因表达减少或致死基因表达。
通常(a)在其中具有顺式调节序列破坏表达的细胞无法存活的条件下；和(b)在其中细胞会存活的条件下培养转化细胞。从这两种培养物中分离DNA群(通常在导入DNA如n[圈套]质粒或质粒插入片段的分离和/或扩增后)，并进行扣除(如通过杂交)。则有可能测定培养物(a)中细胞缺少并包含可能的竞争顺式调节序列的DNA。
例如，如果研究中的表型是抗生素抗性，则导入宿主细胞中的目标顺式调节序列，如处于n[圈套]质粒的圈套中的目标顺式调节序列，可恢复对抗生素的抗性。(a)在抗生素存在下；和(b)在抗生素不存在下培养转化细胞。在抗生素存在下，包含目标顺式调节序列的细胞会死亡。从两种培养物中分离DNA，并例如通过PCR扩增分离包含圈套序列的核酸。通过扣除圈套序列群，有可能分离那些抗生素处理的样品缺少的。
在一方面，富集的圈套序列群可然后再克隆并重复选择过程。
一旦已分离展示改变基因表达或表型的细胞，则分离来自这些细胞的DNA。通常，分离被导入细胞中的DNA，如n[圈套]质粒DNA和/或质粒插入片段。然后可测定导致改变的表达并包含可能的顺式调节(或诱饵)序列的圈套。这可通过例如PCR扩增得以进行。
当本发明的方法包含使用n[圈套]质粒文库时，该方法可额外包含一个或更多个进一步的步骤。
例如，该方法可包含文库杂交步骤。由于这些富集分选操作中使用的文库的复杂性，罕有完全由期望序列组成的样品产生。一般而言，在富集的样品中存在的假阴性背景需舍弃并不转入进一步分析。文库杂交策略被设计成能通过检测为筛选过程的所有独立重复所共有的n[圈套]质粒，从而做这样的工作，逻辑性在于如果在上述背景存在下于独立重复中检测到携带相同序列的质粒，则那些质粒应当是转入进一步分析的质粒。图9中给出了该方法的概要。
通常，当使用文库杂交策略时，进行x次独立重复的上述筛选方法(包括步骤(1)、(2)和(3))。例如，x可以是2、3、4、5、6、7或8。
在每次重复中，如所描述的选择产生基因表达/表型改变的克隆。自克隆分离质粒DNA并标记以创建合并的探针样品(P)。例如，可通过随机引发PCR标记质粒DNA，如使用本发明实施例中的DIG-标记的dUTP分子。
还将克隆以容许各集落相区分的浓度置于合适的培养基上。通常，在该阶段，采集每个集落的样品并进一步培养以提供质粒DNA源，如果在稍后阶段需要的话。
从每个集落中提取总DNA并例如通过杂交固定在合适的基质如尼龙膜上。将来自每个集落的DNA放在基质上可编址位置处。然后将每一基质分别与每一探针组杂交。通常选择共有多于一个重复的样品用于进一步分析。
因此，例如如果x＝4，则制备4个探针组和4个基质如4张尼龙膜。将这4个探针组P1、P2、P3和P4的每一个与4张滤膜F1、F2、F3和F4的每一张杂交。P1与F1的杂交产生了每个样品均得到检测的色谱图。与P1杂交的F2、F3或F4样品应是用于进一步分析的潜在候选物。集落杂交的探针样品越多，则该克隆就越可能作为候选物。
自杂交(如P1与F1)还可用于检测筛选中假阳性。
本发明的方法可进一步包括重复选择过程一次或更多次，使得选择得以反复。因此，选自第一次筛选的克隆可用于再次转化宿主细胞并重复筛选。
在此所描述的n[圈套]文库法可用于鉴定具有重要医学结果的影响细菌表型的顺式调节序列，这样的重要医学结果的一个实例是阻止感染人的致病细菌中抗生素抗性机制的诱导(图6)。该图中的示意图显示当不知道关于该机制遗传途径的情况时，n[圈套]质粒文库如何用于鉴定控制抗生素抗性的顺式调节序列。在该实例中，通过水平基因转移将赋予抗生素抗性的基因迁移至便利的细菌宿主例如天蓝色链霉菌或大肠杆菌中，以创建便利的细菌模型。这无需通过针对抗生素抗性获取筛选何种基因的先验知识就可做到。类似的机制会将相同的抗性基因迁移至临床检测到的致病菌株中。n[圈套]质粒文库创建自携带抗性基因的基因组片段、天然抗性株或临床分离株的全基因组、或来自随机寡核苷酸以创建可想象地包含每条可能的顺式调节序列的通用文库。将这样的文库导入细菌模型中并针对增加的对靶定抗生素的敏感性筛选转化体。这通过表型直接打分或通过使用已建立的DNA-扣除技术来完成。取决于系统的复杂性，该过程单次或反复进行以鉴定单一顺式调节序列或这样的序列的混合物，然后用于合成或制备相应的TFD。接着，于进入合适的动物模型例如小鼠模型之前，在抗性株或临床分离株上验证这些TFD，这里通过处理感染对仅用抗生素处理具抗性的致病菌株的动物测试诱饵的有效性。
如上所述，基因组生物学、基因表达样式以及复制时机主要受控于DNA-蛋白相互作用，并且定位这些相互作用可能是试图控制基因的先决条件。微阵列分析可产生全基因组概观以鉴定哪些基因被表达，但迄今未有在类似规模上鉴定决定表达样式的蛋白(反式调节子)和它们的关连结合位点(顺式调节元件)的技术。本文实施例4和这里描述的本发明的实施方案解决了该不足并开发了我们现在的技术以形成一种能快速鉴定整个基因组中顺式调节元件以描绘遗传网络并主张对它们的控制的通用工具。根据本发明该方面的方法，鉴定了整个基因组中控制靶定基因表达的调节元件。作为快速且通用的描绘调节网络的系统，该工具具有产生黄金标准数据以支持驱向系统生物学的潜力，以及在界定基于知识的遗传工程的区域及加速病因遗传变异的定位中的效用。
在某些情况下，存在支撑靶定表型的遗传机制先验知识，如肉桂霉素簇中已知的启动子。更普遍的是，知道很少关于遗传网络以及支撑靶定表型的它们的调节的信息。例如，在临床出现的病原感染中的许多抗生素抗性机制在遗传水平上未被了解，该事实成为了开发解决该问题的处理方案的严重障碍。同样地，在工业生物技术范围内，能有利地改变细菌复杂特性而无需遗传决定子先验知识的技术应当是有价值的。该技术的一个实例是在生物燃料生产过程中工程化细菌为溶剂耐受的以改善其在发酵糖类中的效率。在此给出了本发明技术临床和工业应用的实例。
为证实该方法在无遗传途径先验知识下检测顺式调节元件的功效，本发明人使用n[圈套]文库来增加大肠杆菌中的丁醇耐受性(实施例4)。文库之一是使用如实施例2中所描述的类似技术来源于大肠杆菌全基因组的。另一种文库是可想象地由每种可能的9个核苷酸序列或任何这样的期望长度的同向(direct)拷贝组成的‘通用n[圈套]’文库。使用类似于实施例2中所描述的方法制备通用n[圈套]文库用于创建单AfsR n[圈套]质粒，例外的是取代所具有的含带有规定顺式调节序列的中心区段的寡核苷酸序列，改为插入随机序列(以及在该阶段，序列长度可控)。在通过测量针对增加浓度的溶剂的生存力给靶定表型打分的意义上，使用这样的n[圈套]文库来检测丁醇耐受性的新顺式调节子的方法类似于实施例3中所描述的。
通过针对与一种或更多种转录因子的结合直接筛选文库，如在此所描述的和/或根据本文方法制备的n[圈套]质粒文库还可用于鉴定顺式调节序列。
本发明鉴定并表征顺式调节元件的方法可进一步包括使用定位法，该方法使用了如在此所描述的足迹法和外切核酸酶的组合。
定位顺式调节序列边界的方法
在一方面，本发明提供了一种定位DNA中蛋白结合位点的边界的方法。该方法可用于更精确地定位上述结合位点的边界。
该方法可用于定位顺式调节序列的边界。该方法可与在此描述用于鉴定并表征顺式调节序列的方法如使用如在此所描述的n[圈套]质粒或质粒文库的方法相结合。通过提供更精确的关于顺式调节元件以及因此的蛋白调节子例如转录因子结合位点的序列信息，该方法对于设计诱饵寡核苷酸是有用的，当该诱饵寡核苷酸被导入合适的细胞中时，会与细胞中的顺式调节序列竞争蛋白调节子结合。
本发明的方法在改良的足迹法中使用了具有非特异性DNA切口能力的酶或化学试剂(如DNA酶I)与5’-3’外切核酸酶(如T7外切核酸酶)的组合。DNA酶I的代用品应包括用高锰酸钾或羟化物类产生的自由基对细胞的处理。可被使用的合适的外切核酸酶的另一个实例应是λ外切核酸酶。该方案被设计成能定位每条DNA链上的蛋白-DNA复合物的5’边界，并因此限定了复合物中包含顺式调节元件的受保护的DNA区。DNA酶I将切口导入复合物周围的DNA中。这些用作5’-3’外切核酸酶的5’-3’外切核酸酶活性底物。这两种酶的联合作用标定了每条DNA链上蛋白-DNA复合物的5’边界。因此，本发明的方法具有如下优点，即其能检测给定区域如启动子区中DNA-蛋白复合物的所有边界，而不仅仅是那些最接近限制性位点的边界。
本发明定位方法的原理图解于图13中。该方法通常包括：
1.提供蛋白-DNA复合物；
2.使用如下的进行消化
a.具有非特异性DNA切口能力的酶，如DNA酶I；
b.5’-3’外切核酸酶(T7外切核酸酶)；
c.任选地，切割DNA-蛋白复合物的可能位置的短距离上游的限制酶；
在actIIorf4基因的情况下，其被确定为SacI；和
3.相对于DNA链上已知固定点，测定(2)中的每条DNA链中产生的5’缺失的位置。
蛋白-DNA复合物可以是任何目标复合物。在一个实例中，该方法用于定位DNA启动子区中蛋白-DNA复合物的边界，如在顺式调节序列处蛋白-DNA复合物的边界。在一个实例中，蛋白-DNA复合物可以是调节原核生物或真核生物中一种或更多种抗生素抗性基因表达的转录因子-DNA复合物。在另一个实例中，该方法可用于定位本发明实施例中的天蓝色链霉菌actII-orf4启动子中蛋白-DNA结合位点。
可在目标转录状态过程中进行定位，例如如果目标顺式调节元件涉及抑制，即结合转录阻抑物，则在抑制过程中进行定位，或如果目标顺式调节序列结合转录激活物，则在启动子激活表达过程中进行定位。
因此，例如，在一方面，在当细胞中基因表达已知被抑制或激活时的阶段，定位可在体内进行(如使用新鲜收获的细胞)。通常，培养细胞并在适当的转录阶段分离。细胞可用去污剂进行透化处理，其容许酶进入细胞。因此，如果要被定位的蛋白-DNA复合物起抑制给定基因或表型表达的功能，则在当基因表达或表型被抑制时这一刻测试蛋白-DNA复合物。相反地，如果要被定位的蛋白-DNA复合物起激活给定基因或表型表达的功能，则在当基因表达或表型被激活时这一刻测试蛋白-DNA复合物。通常，可对细胞监测给定基因或表型的表达，并在适当阶段分离。
例如，如果目标顺式调节序列(在蛋白-DNA复合物中)在抑制抗生素产生中起作用，以及该抗生素产生已知出现在细胞生长晚期，则培养该生产细胞并在该生长晚期前收获。
细胞可以是原核或真核细胞。在一个实例中，细胞是原核细胞，如细菌细胞。例如，可使用放线菌例如链霉菌物种，如天蓝色链霉菌，例如天蓝色链霉菌A3(2)、(M145或M600株)，浅青紫链霉菌，肉桂链霉菌或大肠杆菌。
通常，如本发明实施例中在此所描述的，以经验为主确定在该方法中要被使用的非特异性酶(DNA酶I)和外切核酸酶(如T7)的量。
对于所有复合物，使用在DNA-蛋白复合物的可能位置的上游限制性位点处切割的限制酶(c)产生了寡核苷酸可在随后的捕捉和扩增步骤中退火至其上的标准的5’末端。
一旦完成(2)中的消化，就回收被消化的核酸。消化在每条DNA链产生了5’缺失。通过确定每条链上这些5’缺失的位置，如相对于链上已知固定点，则有可能精确定位DNA上的蛋白结合位点。
一种确定每条链上5’缺失的位置的方法如下。一旦回收，通过加热或用碱溶液如1M NaOH处理对该消化的DNA进行变性，并与包含目标结合位点的互补DNA链杂交。例如，互补DNA可包含启动子片段(包含目标顺式调节序列)。可使用启动子的PCR片段。一般而言，互补DNA链在一末端包含接头。然后可使用结合启动子或接头的标记的引物进行扩增反应，如PCR。
然后，例如通过PAGE或其他方法如毛细管电泳确定标记的扩增产物的大小。一般而言，尽管未知蛋白-DNA复合物的精确边界，但是可从该数据中确定大概位置，并因此确定包含目标蛋白结合位点的DNA区的序列。例如，由于启动子区的序列将会知道，因此将标记片段的大小以及引物结合位点的位置与包含蛋白结合位点的DNA区的序列比较，就有可能确定蛋白-DNA结合复合物的5’边界在DNA序列中的精确位置。
以相同方式，但使用在相反末端处带有接头的DNA链定位相反DNA链上的边界。
通常，互补DNA链被固定。例如，接头可提供在固体基质上固定。例如，接头可被生物素化用于固定到链霉亲合素基质。固定化的优点在于能从总的消化的DNA样品中容易地分离消化的目标DNA链。
在一方面，本发明涉及一种鉴定原核或真核基因的基因表达的顺式作用调节子的方法，其包含如下任一或两者：
(a)进行受保护核酸序列的定位；
(b)提供n[圈套]分子文库，其中所述文库包含代表来自所述原核生物或所述真核生物基因组的所有可能的调节序列的序列，以及(i)鉴定结合所述文库的因子或(ii)将所述n[圈套]分子文库导入生物体中，其能指示与当所述n[圈套]分子不导入时相比的差异的靶基因激活或抑制。该方法可在体内进行。在该方法是体内方法的情况下，其可用细菌来进行并可包含将该细菌与有效量的DNA酶1及T7外切核酸酶接触，使得为转录因子所保护的调节序列保持完整，而所述细菌基因组的其余部分被破坏。
一旦根据本文的方法进行鉴定，顺式调节序列就可用于筛选测定法以鉴定转录因子。
调控基因表达和/或表表型的方法
在此的n[圈套]质粒和方法可用于鉴定并表征与细胞中给定顺式调节序列竞争关连转录因子结合的序列。
这样的序列可用于制备诱饵序列。诱饵序列模拟了调节蛋白(如转录因子)的天然结合位点(顺式调节序列)。当导入包含顺式调节序列的合适的宿主细胞(通过在此所描述的方法或其他方法)时，诱饵序列与细胞中的顺式调节序列竞争关连转录因子结合。
当这样的竞争发生时，伴随的是其表达受该顺式调节序列调节的基因的表达的改变。这可导致对细胞表型例如在此所描述的抗生素产生、抗生素抗性、溶剂耐受性的调控。
应当理解根据在此所描述的方法导致基因表达或表型改变的n[圈套]质粒可在本发明方法中用作诱饵分子。根据在此所描述的方法鉴定为与顺式调节序列竞争转录因子结合的圈套序列可用作诱饵序列。
因此，在一方面，本发明涉及用于调控细胞中基因表达和/或表型的方法，包括使用诱饵序列。
一般而言，一种根据本发明用于调控一种或更多种基因表达的方法包括：
(a)提供包含转录因子结合位点(诱饵序列)的多核苷酸；和
(b)将该多核苷酸导入细胞中，其中细胞包含可操作地连接顺式调节序列的一种或更多种基因，该顺式调节序列包含转录因子结合位点或与该转录因子结合位点竞争转录因子结合。
一般而言，多核苷酸中诱饵序列(转录因子结合位点)不与基因可操作地连接。转录因子结合位点可以自关连启动子的任何其它元件分离。
包含诱饵序列的多核苷酸可被称为诱饵多核苷酸。
诱饵多核苷酸可包含质粒载体。例如，诱饵多核苷酸可包含如在此所描述的和/或根据在此所描述的方法制备的n[圈套]质粒。
诱饵多核苷酸可包含多于一个拷贝的诱饵序列。该多核苷酸可包含含有多个拷贝的诱饵序列多聚体分子。例如，1-1000个拷贝。通常，存在2个或更多个拷贝，例如2-1000个拷贝，如至少10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800或900个拷贝。例如，可以是10-200、10-150、20-120、20-100、30-100、30-80、30-50、30-40个拷贝。例如，可存在30个拷贝的诱饵序列。通常，存在多个拷贝的诱饵，例如多个同向重复的诱饵序列。
诱饵多核苷酸可包含附加到诱饵序列上的额外的序列。通常，该额外的序列导致增加的由于外切和/或内切核酸酶作用而对诱饵序列降解的抗性。诱饵多核苷酸可包含至少一个二级结构元件。通常，该二级结构导致增加的由于外切和/或内切核酸酶作用而对诱饵序列降解的抗性。诱饵多核苷酸可包含修饰的碱基或糖以赋予更大的核酸酶抗性。诱饵多核苷酸可包含在该多核苷酸末端的2’OH核苷酸或胺，以减少或抑制外切核酸酶活性。在一方面，诱饵多核苷酸可包含线型寡核苷酸。诱饵多核苷酸可包含环状双链DNA(所谓的哑铃状结构)。在一方面，诱饵多核苷酸可包含在分子一个或每一个5’末端的胆固醇修饰。
诱饵多核苷酸可包含以任何合适组合存在的任一或更多的上述特征。
当导入合适的宿主细胞中时，诱饵多核苷酸中的诱饵序列能与细胞中的顺式调节序列竞争转录因子结合，该转录因子结合内源顺式调节序列。可通过在此所描述的方法针对该功能筛选序列。诱饵序列与之竞争的顺式调节序列可以是任何在此描述和/或根据于此方法鉴定的顺式调节序列。
例如，顺式调节序列可以是一种调节对代谢物产生起作用的一种或更多种基因表达的序列，如在代谢物是抗生素(如放线菌紫素、十一烷基灵菌红素或肉桂霉素)、酶或药物的情况下。在细胞中代谢物产生可增加。
顺式调节序列可以是一种调节在决定抗生素抗性中起作用的一种或更多种基因表达的序列。细胞中的抗生素抗性可减少。顺式调节序列可以是一种调节在决定溶剂(如丁醇)耐受性中起作用的一种或更多种基因表达的序列。细胞中的溶剂耐受性可增加。
例如，该顺式调节序列可包含编码AfsR蛋白(天蓝色链霉菌中抗生素合成的多效调节子)结合位点的序列。AfsrR结合位点以粗体示于SEQ ID NO：1中(实施例1)。
在另一个实例中，顺式调节序列可以是天蓝色链霉菌actII-orf4启动子中的一种顺式调节序列，例如顺式调节阻抑序列。例如，顺式调节序列可包含在此鉴定的序列A24.1、A24.2、A24.3、A24.4或A24.5。
在一个进一步的实例中，顺式调节序列可包含VanR转录因子结合位点，例如，位于如屎肠球菌或天蓝色链霉菌的vanH启动子中的VanR结合位点。30bp VanR结合位点的一个实例示于SEQ ID NO：21，以及另外一个实例示于SEQ ID NO：26。
顺式调节序列可以是一种起作用调节编码特定目标功能或表型的一种或更多种基因表达的序列，所述特定目标功能或表型例如代谢物例如抗生素(如肉桂霉素、放线菌紫素、十一烷基灵菌红素)产生、对特定溶剂或毒素耐受性、对特定抗生素抗性或任何其它目标功能或表型。通常，该序列会位于这样的基因的启动子区。
例如，顺式调节序列可调节肉桂链霉菌中肉桂霉素生物合成基因的表达，如来自cin7启动子的顺式调节序列。
顺式调节序列可调节编码溶剂耐受性基因的表达，例如在原核生物中，如大肠杆菌K12中的丁醇耐受性。
顺式调节序列可以是一种调节原核抗生素抗性基因表达的顺式调节序列，通常是来自编码抗生素抗性的基因的启动子的顺式调节序列。可靶向任何目标抗生素抗性。例如，针对如下的抗生素抗性：已知为如下的抗生素类：氨基糖苷类(例如卡那霉素)；碳青霉烯类(例如美罗培南)；头孢菌素类(例如头孢吡肟)；糖肽类(例如万古霉素和达托霉素)；青霉素类(例如氨苄青霉素、羧苄青霉素和青霉素)；多肽类抗生素(例如多粘菌素B)；喹啉类(例如左氧氟沙星)；磺胺类(例如菌特灵)；四环素类(例如四环素)；以及各种抗生素，氯霉素、利福平和斯沃。
在一方面，编码对抗生素抗性的一种或更多种基因编码提供对特定抗生素抗性的蛋白，或在某些情况下，编码提供对一类抗生素抗性的蛋白，例如以上所列的抗生素及抗生素类。这样的抗生素抗性基因可编码靶向特定机制或结构的抗生素或抗生素类的蛋白。通常这样的抗性基因是通过细菌在暴露于抗生素后所获取的。
在一方面，抗生素抗性基因可包括一种或更多种下列基因或基因类型：
受VanR转录因子调节的vanHAX操纵子基因，其在多种细菌中存在，包括肠球菌(Enterococcus)(如粪肠球菌(E.faecalis)、屎肠球菌(E.faecium))、葡萄球菌(Staphylococcus)(如金黄色葡萄球菌(S.aureus))(Courvalin(2006)Clin.Infect.Dis.42，S25)，并已报道在其他致病细菌中罕见(Werner(2008)FutureMicrobiol.3，547)。这些基因在表达时提供了对抗生素万古霉素的VanA型抗性。靶向vanHAX基因的诱饵序列包含天然VanR结合位点(例如SEQ ID NO：21或SEQ ID NO：26中的天然VanR结合位点)或天然位点变体，其与目标细胞中的天然位点竞争VanR结合。
那些编码β-内酰胺酶的基因导致对β-内酰胺类抗生素(具体是青霉素类、头孢菌素类、头霉素类和碳青霉烯类)抗性。这些基因在包含已知为广谱-β-内酰胺酶(ESBL)的β-内酰胺酶亚类的革兰氏阴性感染中是医学上特别重要的，该广谱-β-内酰胺酶(ESBL)出现在包括弗氏柠檬酸杆菌(C.freundi)、铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)的细菌中，以及越来越多地出现在肺炎克雷伯氏菌(K.pneumonia)、大肠杆菌(E.coli)和沙门氏菌(Salmonella spp.)中。对于目前所发现的β-内酰胺酶的综述可见于Paterson(2005)Clin.Microbiol.Rev.18，657中。
主要类型的β-内酰胺酶、生物体的实例和它们所影响的抗生素以及负责的基因如下：TEM β-内酰胺酶，最通常为TEM-1基因编码，在大多数革兰氏阴性细菌包括大肠杆菌、肺炎克雷伯氏菌、流感嗜血杆菌和淋病奈瑟氏菌中影响氨苄青霉素抗性，尽管业已鉴定了大量的140种TEM型酶(George(2005)N.Eng.J.Med.352，380)；SHV β-内酰胺酶，最通常为SHV-5和SHV-12编码，其引起例如在肺炎克雷伯氏菌中的氨苄青霉素抗性(Paterson(2003)Antimicrob.Agents Chemother.47：3554)；CTX-M β-内酰胺酶，引起例如在大肠杆菌和肠道沙门氏菌(S.enterica)中的对头孢氨噻肟和其他肟基(oxyimino)-β-内酰胺酶(例如头孢他啶、头孢曲松或头孢吡肟)的抗性，已描述了40种CTX-M酶(Canton(2008)Clin.Microbiol.Inf.14：134)；OXA β-内酰胺酶，引起例如在肠杆菌如大肠杆菌和肺炎克雷伯氏菌以及铜绿假单胞菌中的对苯唑西林和氯唑西林的抗性；抑制剂抗性β-内酰胺酶，例如见于如大肠杆菌和肺炎克雷伯氏菌中的TEM-β-内酰胺酶的变体，其对calvulinic酸和其他抑制剂具抗性；见于包括肠杆菌属菌种的许多革兰氏阴性细菌中的AmpC-β-内酰胺酶，给予对头孢菌素类的广谱抗性；编码对头霉素类、头孢菌素类和碳青霉烯类抗性的碳青霉烯酶类，该类型的β-内酰胺酶可分成IMP-型(存在于革兰氏阴性细菌，特别是假单胞菌属和不动杆菌属中)、VIM(一个实例是主要见于铜绿假单胞菌中并编码对除单菌胺类之外的所有β-内酰胺类抗性的VIM-2显性变体)和KPC(编码肺炎克雷伯氏菌中碳青霉烯抗性)。
在那些编码积极从细菌中外排抗生素的外排泵的基因中存在5个主要的超家族(Poole(2007)Ann.Med.39：162)：主要易化子(MFS)、ATP结合盒(ABC)、小多药抗药性(SMR)、抗性结节(RND)和多药及毒物外排(MATE)。那些受这些外排系统每一种所影响的抗生素、负责的基因以及它们最通常出现的生物体在Poole(2005)J.Antimicrobial Chemother.56，20的表1中给出并示于图27。医学上重要的抗性基因包括：通常为Mef(A)基因所编码的大环内酯抗性，例如在链球菌(Pozzi(2004)Curr.Drug Targets Infect.Disord.4，203)和革兰氏阴性细菌中；MsrD编码的酮内酯抗性，例如在肺炎链球菌(Daly(2004)J.Clin.Microbiol.42：3570)中；例如为如在铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯氏菌和肠道沙门氏菌中描述的Cml/CmlAB外排系统编码的氯霉素抗性(Schwarz(2004)FEMS Microbiol.Rev.28：519)；为假单胞菌中MexCD-OprJ所编码的红霉素抗性(Tauch(2003)Mol.Genet.Genomics 268，：570)；为革兰氏阴性细菌中的Tet家族-通常是TetA、TetB、TetC、TetD、TetE、Tet30和Tet39(Roberts(1996)FEMS Microbiol.Lett.19：1和Butaye(2003)Int.J.Antimicrob.Agents 22：205)以及革兰氏阳性细菌中的TetK和TetL(Butaye(2003)Int.J.Antimicrob.Agents 22：205)所编码的四环素抗性；为AcrAB-TolC所编码的流感嗜血杆菌中的β-内酰胺和氨基糖苷类抗性(Rosenberg(2000)J.Bac.182：1754)。来自MATE超家族的外排泵赋予了对氟喹啉类等的抗性，以及那些负责的基因业已在大肠杆菌(NorE，Morita[1998]Antimicrob.Agents Chemother.42：1178)、淋病奈瑟氏菌(NorM，Roquette-Loughlin[2003]J.Bac 185：1101)、流感嗜血杆菌(HmrM，Xu[2003]Microbiol.Immunol.47：937)、铜绿假单胞菌(PmpM，He[2004]J.Bac.186：262)、艰难梭菌(CdeA，Kaatz[2005]Antimicrob.Agents Ther.49：1857)、金黄色葡萄球菌(MepA，Kaatz[2005]Antimicrob.Agents Ther.49：1857)和大肠杆菌(AcrAB，Nishino[2001]J.Bac.183：5803)中得到鉴定。
那些基因编码对氨基糖苷类(例如链霉素、卡那霉素、妥布霉素、阿米卡星)的抗性。抗性通常为产生修饰抗生素的酶的基因所编码，该修饰最通常为N-乙酰化(氨基糖苷乙酰基转移酶，AAC)、腺苷酰化(氨基糖苷核苷酸转移酶，ANT)或O-磷酸化(氨基糖苷磷酸转移酶，APH)(Shakil[2008]J.Biomedical Sci.15：5)。这样的基因的实例见于革兰氏阴性和革兰氏阳性细菌中：AAC(6’)-Ie APH(2”)-Ia赋予肠球菌和葡萄球菌中广谱氨基糖苷抗性(Hedge[2001]J.Biol.Chem.276：45876)；AAC(3)家族是最大的(Sunada[2003]J.Antibiot.(Tokyo)52：809)以及，例如赋予肠球菌中广谱氨基糖苷类抗性(Draker[2004]Biochem.43：446)；ant(2”)和ant(4”)基因编码革兰氏阴性细菌中对庆大霉素和妥布霉素的抗性，同时ant(4’)和ant(6)和ant(9)在革兰氏阳性细菌中也如此(Jana[2006]Appl.Microbiol.Biotechnol.70：140)；在革兰氏阳性生物体中，aph(3’)基因广泛分布并赋予对广谱氨基糖苷类的抗性，尤其在葡萄球菌和肠球菌中(McKay[1996]Antimicrob.Agents.Chemother.40：2648)。
此外，ermB基因牵涉确定对红霉素类，例如希舒美/阿奇霉素的抗性，特别是在链球菌感染中(Richter[2005]Clin.Infect.Dis.41：599)。
在一方面，本发明方法可用于靶向调节任何一种或更多种上述抗性基因或基因类型的表达，如编码β-内酰胺酶的基因、编码氨基糖苷修饰酶的基因的表达，以从而改变对相应抗生素的抗性，如在上列的菌株中。可如在此所描述的鉴定并测试用于靶向调节基因的诱饵序列。
诱饵序列可包含顺式调节序列自身或，例如保留必要的竞争功能的其变体或片段。顺式调节序列可包含任一在此所描述和/或根据任一在此所描述的方法所鉴定的那些顺式调节序列。诱饵序列可包含如在此所描述的和/或如在此所鉴定的圈套序列，或其保留必要的竞争功能的变体或片段。
可基于细胞中天然转录因子结合位点制备用于靶向特定基因集合如抗生素抗性基因的诱饵序列。例如，序列可获得自发表的文献。在一方面，测试诱饵序列可包含内源结合位点或天然位点的共有序列或变体或片段。
然后，可对测试诱饵序列评估诱饵功能。通常，如在此所描述的，诱饵序列被制备为诱饵多核苷酸。将诱饵多核苷酸导入包含给定转录因子结合位点的宿主细胞中，该给定转录因子结合位点可操作地连接其表达可直接或间接检测的一种或更多种基因。例如，筛选可包含直接测试受调节基因的表达，或测试与该基因表达相因果联系的表型。导致一种或更多种基因表达改变的诱饵序列被认为具有诱饵功能。
在此描述了用于测试诱饵功能，如使用n[圈套]质粒、报道系统的合适的方法。
还可通过使用n[圈套]质粒文库的在此所描述的方法和/或用于鉴定蛋白结合位点的边界的方法确定测试诱饵序列。这些方法可用于研究细胞中表型的遗传基础。例如，研究临床分离株中抗生素抗性的遗传基础。
诱饵多核苷酸可包含任一在此描述的诱饵序列以及还可包含如所描述的额外的序列。
诱饵多核苷酸可包含任一在实施例中描述的诱饵序列和/或诱饵多核苷酸。因此，例如，包含AfsR结合位点的诱饵多核苷酸可包含实施例1的n[圈套]质粒或包含于其中的圈套，或形成环状诱饵哑铃状诱饵结构的SEQ ID No.3的寡核苷酸。诱饵多核苷酸可包含如实施例2或3中导致肉桂霉素产生上调所鉴定的n[圈套]质粒或包含于其中的圈套。诱饵多核苷酸可包含如实施例4中导致丁醇耐受性增加所鉴定的n[圈套]质粒或包含于其中的圈套。诱饵多核苷酸可包含任一在实施例5中所描述的SEQ ID No.8、9、10、11或12。诱饵多核苷酸可包含形成环状哑铃状诱饵的SEQ ID No.21的寡核苷酸，或SEQID NO：26，或VanR结合位点的物种变体。
可通过任何合适的方法制备诱饵多核苷酸。例如，可如实施例7.2中所描述的，使用合适的引物通过PCR制备哑铃状诱饵。每条引物通常包含会形成哑铃状结构的茎环的一部分。这样的引物的实例在SEQ ID NO：24和25中给出。使用引物的PCR扩增通常继之以扩增产物的限制性消化以及连接形成闭环哑铃状体。
可选地，可如实施例7.3中所描述的，通过限制性消化质粒制备哑铃状体。消化后进行连接以形成闭环哑铃状结构。
本发明方法可用于改变原核或真核细胞中的基因表达。在一方面，当该方法应用于真核细胞时，诱饵多核苷酸包含如在此所描述的n[圈套]质粒和/或该诱饵序列与根据在此所述的方法鉴定的顺式调节序列竞争和/或该诱饵序列包含根据在此所述的方法鉴定的顺式调节序列或其变体或片段。
可通过任何合适的手段将诱饵多核苷酸导入宿主细胞。例如，转化、转染、接合。例如，在多核苷酸包含接合质粒的情况下，可通过接合导入。诱饵多核苷酸如环状哑铃状结构可通过转染导入细胞。细胞可存在于液体培养物中并将诱饵添加到液体中。可选地，细胞可在固体培养基上培养并由浸透诱饵且覆盖在培养基上的吸水纸片转染诱饵。通常，将诱饵多核苷酸添加至培养基并为细胞所吸收。在细胞于固体培养基上培养的情况下，可将诱饵多核苷酸添加至滤纸片上并自该滤纸片为细胞所吸收。渗透性缓冲液可用于帮助转染。
在一方面，诱饵多核苷酸的转染可包含使用胆固醇。特别是，该方法可使用在一个或两个5’末端处带有胆固醇修饰的线型诱饵多核苷酸。该修饰据信利于细胞摄取。
诱饵可额外地被标记，如用可检测的标记例如荧光染料，如Cy5在5’末端进行标记。这将利于监测细胞中的摄取和保持。
如实施例7.1中所描述的，可使用胆固醇和/或可检测地标记的引物制备胆固醇和/或可检测地标记的诱饵。
将诱饵多核苷酸转染入细胞中可包含使用R9-胆固醇，其由附在9个D-精氨酸的线型链上的胆固醇分子组成(Kim W.J.等，Mol.Ther 200614：343-350)。
一般而言，监测诱饵多核苷酸在细胞中的摄取和/或保持。例如，质粒诱饵可包含可检测的标记如编码抗生素抗性的标记，其容许对质粒的存在进行正选择并监测质粒增殖。也可通过qrt-PCR监测诱饵多核苷酸的存在。
一般而言，导入诱饵的细胞是那些包含该诱饵竞争转录因子结合的可操作地连接其表达要被调控的基因的顺式调节序列(通常为包含该序列的启动子)的细胞。合适的宿主细胞描述于此。通常，在该方法用于改变细胞表型的情况下，宿主细胞在诱饵不存在下展示表型。可在一系列的细胞中筛选用于改变医学或治疗相关表型如用于增加抗生素敏感性的诱饵。例如，可首先在表型的细菌模型如抗生素抗性模型中测试诱饵，然后在例如病原体或临床分离株中进一步验证。如在此所描述的，可在动物模型中进一步验证诱饵。
一旦诱饵多核苷酸导入细胞中，通常针对基因表达的调控筛选细胞。可直接或间接进行筛选。针对细胞中基因表达和/或表型的调控的筛选方法描述于此，与用于鉴定顺式调节序列的方法相关。
在一个进一步的方面，可将多于一条的诱饵多核苷酸导入细胞中以改变表型。例如，可使用n[圈套]质粒的组合，如果质粒是相容的话。
在一方面，在此描述的方法是体外方法。
在此所描述的用于调控表型的方法具有多种应用，例如在工业中和在治疗学中。
该方法可用于改变工业中重要的细胞的表型，例如增加有用代谢物的产生。因此，在一方面本发明提供了一种调控(增加或减少)细胞中代谢物产生的方法，包括在此所描述的方法。通常，在该方法中目标顺式调节序列调节编码代谢物产生所必需的蛋白的基因的表达。
在一方面，顺式调节序列包含任一在此鉴定的A24.1、A24.2、A24.3、A24.4或A24.5。本发明涉及一种调控抗生素产生的方法，包括使用任一在此鉴定的A24.1、A24.2、A24.3、A24.4或A24.5，如A24.1、A24.3、A24.5，例如A24.5，或使用与上述任一竞争转录因子结合的诱饵分子。本发明进一步涉及一种调控抗生素产生的方法，包括使用任一的SEQ ID NO 8-12。
该方法还可用于使细胞如细菌细胞对抗生素更敏感。因此，本发明进一步提供了一种调控(增加或减少)细胞如细菌细胞的抗生素敏感性的方法，包括在此描述的方法。通常，在该方法中，目标顺式调节序列调节编码抗生素抗性必需蛋白的基因的表达。
因此，在一方面，本发明提供了诱饵多核苷酸用于调控细胞抗生素抗性的应用。一般而言，该调控由细胞中一种或更多种抗生素抗性基因表达的改变引起。该作用可特异于特定的抗生素或在某些情况下特异于抗生素类。
一般地，细胞包含可操作地连接顺式调节序列的一种或更多种基因，该顺式调节序列包含转录因子结合位点，以及诱饵多核苷酸包含具有相同的结合位点的诱饵序列或与细胞结合位点竞争转录因子结合的位点。将该多核苷酸导入细胞中减少了转录因子与细胞中的顺式调节序列的结合并导致细胞中一种或更多种基因表达的改变，从而调控细胞的抗生素抗性。
通常，细胞中靶定的顺式调节序列调节如在此所描述的一种或更多种抗生素抗性基因的表达。诱饵破坏了基因表达的调节，从而导致细胞中抗生素抗性的改变(如减少)。
细胞可以是抗性实验室模型或天然抗性株，如病原体或临床分离株。合适的细胞描述于此。
在一方面，本发明可涉及一种用于改变除蓝细菌中CO2应答基因的表达水平之外的原核生物表型的方法，其包括提供包含过量编码原核转录因子所结合序列的核酸的诱饵，其中根据在此所描述的方法鉴定所述序列，使得所述诱饵刚一接触所述原核生物，转录因子就被竞争性抑制与所述原核生物基因组中其关连结合位点的结合。
本发明还可涉及一种用于改变除蓝细菌中CO2应答基因的表达水平之外的原核生物表型的方法，其包含提供一种包含过量编码结合原核转录因子的序列的核酸的诱饵，使得所述诱饵刚一接触所述原核生物，转录因子就被竞争性抑制与所述原核生物基因组中其关连结合位点的结合。诱饵可包含原核基因启动子的一部分。诱饵可包含来自原核基因如抗生素合成或调节基因启动子的转录因子结合位点。诱饵与转录因子的结合可引起原核生物对该原核生物在其他情况中有抗性的抗生素的敏感性。例如，原核生物在正常情况中可对抗生素万古霉素具有抗性，但是在所述诱饵存在下，该原核生物不再具有抗性。原核生物可以是病原体。可选地，诱饵与转录因子的结合导致增加的原核生物抗生素产生。
在一种情况下，当根据本发明方法要被改变的表型是抗生素抗性时，首先在实验室模型细胞或如在此所描述的报道细胞中测试推定的诱饵序列。然后通常在天然抗性细胞如病原体细胞或临床分离株中测试候选的诱饵序列。一般而言，该方法额外包含在合适的动物模型中测试候选的诱饵序列。例如，可使用小鼠模型。一般而言，用对仅采用抗生素治疗具抗性的致病菌株感染动物模型。
有时，当针对一组临床分离株测试诱饵序列(基于模式细菌菌种中的结合位点序列)时，可发现某些分离株屈折于该处理。在这样的情况下，可鉴定那些分离株并进行序列分析以确定在TFD所模拟的调节序列中是否存在任何变化。如果这样的话，可评估那些改变的出现并且创建包含大致与临床中它们的发生率成比例的模型和变体序列的TFD混合物(cocktail)。
本发明的诱饵多核苷酸具有多种应用，包括医学和兽医应用以及体外应用。
例如，增加对一种或更多种抗生素细胞敏感性的诱饵多核苷酸可用于治疗人或动物细菌感染，或在离体方法中用于杀死或抑制原核生物，如用于抗细菌清洁组合物。
通常在使用中，诱饵应与抗生素组合使用，使细胞对该抗生素更敏感。抗生素可与诱饵同时、或前后施用。抗生素和诱饵可在相同的或分开的组合物中施用。
因此，例如，靶向vanHAX操纵子的VanR调节以降低对万古霉素抗性的诱饵应通常与万古霉素抗生素组合使用。
诱饵用于治疗的特定感染或相关病症通常取决于诱饵所靶向的致病细胞。
例如，万古霉素抗性肠球菌(VRE)如屎肠球菌和粪肠球菌与腹部感染、皮肤感染、尿路感染、血液感染相关。因此，靶向VRE中万古霉素抗性基因的VanR调节的诱饵通常与万古霉素结合可用于治疗这样的感染。
例如，携带编码广谱β-内酰胺酶的基因的革兰氏阴性感染(例如大肠杆菌和肺炎克雷伯氏菌)显示了与泌尿道和肠严重感染相关的对青霉素的广谱抗性。在一方面，用设计成阻止或下调那些编码β-内酰胺酶的基因(例如CTM-X家族基因)表达的诱饵结合青霉素处理可用于治疗这样的感染。
在一方面，金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌或肺炎衣原体(C.pneumoniae)中mefA或ermB基因表达引起的并且明显可见耳喉感染的希舒美抗性可通过施用靶向在这样的生物体中mefA和ermB调节的诱饵，通常结合抗生素得以治疗。
在一方面，氟喹诺酮抗性感染例如引起肺炎的肺炎链球菌感染可通过靶向norA(编码外排泵的基因)调节的诱饵并结合施用抗生素得以治疗。
在一方面，大环内酯抗性，例如在引起肺炎的肺炎衣原体感染中克拉霉素(如Biaxin)抗性可通过施用靶向抗性基因ermB调节的诱饵结合抗生素得以治疗。
在一方面，靶向编码对β-内酰胺(例如青霉素，如力百汀(Augmentin))抗性的ampC基因的诱饵可用作一种针对由在医院注射抗生素引起的多种革兰氏阳性和革兰氏阴性医源性感染的疗法。
在一方面，本发明涉及一种包含诱饵多核苷酸和生理学上可接受的载体或赋形剂的药物组合物。该组合物可额外包含一种或更多种如所描述的抗生素。
用于治疗应用的可接受的载体或稀释剂是药学领域熟知的，并描述于例如Remington’Pharmaceutical Sciences，Mack Publishing Co.(A.R.Gennaro编.1985)中。可基于预期的给药途径以及标准的制药实践进行药学载体、赋形剂或稀释剂的选择。药物组合物可包含载体、赋形剂或稀释剂，或除此之外的任何合适的粘合剂、润滑剂、助悬剂、涂层剂、增溶剂。
诱饵可通过任何合适的手段施用，例如通过静脉内注射、表面施用或口服递药。如上，可与合适剂量的抗生素一起施用，该抗生素与诱饵同时或分别施用。
增加抗生素抗性的诱饵多核苷酸还可用于清洁组合物如消毒剂中，此外通常与使细胞对之更敏感的抗生素相结合和/或与一种或更多种抗细菌剂相结合。在一方面，本发明涉及这样的清洁组合物。
本发明进一步提供了一种包含如在此所描述的诱饵多核苷酸和一种或更多种抗生素或抗细菌剂的试剂盒，其中该诱饵和抗生素或抗细菌剂被组合用于杀死或抑制原核生物如细菌。
因此，在一方面本发明进一步涉及如在此所描述的和/或鉴定的诱饵多核苷酸在制备用于治疗受试者细菌感染的药物中的应用。本发明进一步涉及诱饵多核苷酸用于细菌感染治疗以及一种治疗受试者细菌感染的方法，包括施用如在此所描述的诱饵多核苷酸。
本发明进一步涉及包含如在此所描述和/或鉴定的诱饵多核苷酸的组合物和药物。更进一步的方面包括联合疗法，其中将如在此鉴定和/或所述的诱饵多核苷酸与一种或更多种抗生素或其它抗细菌疗法相结合施用于受试者。
在更进一步的方面中，本发明涉及根据在此所描述的方法鉴定的顺式调节序列以及它们的应用，如在诱饵序列中的应用。特别是，本发明涉及在本发明实施例中鉴定的顺式调节序列，如包含在此鉴定的A24.1、A24.2、A24.3、A24.4或A24.5的顺式调节序列和包含它们的诱饵多核苷酸。本发明进一步涉及如在此所述和/或如在此所述的诱饵多核苷酸，如SEQ ID NO：3、8-12和21。
本发明进一步涉及在此描述的和/或根据在此描述的方法制备的任一n[圈套]质粒或质粒文库，包括那些在本发明实施例中制备的。
本发明进一步涉及包含如在此所描述的n[圈套]质粒和/或诱饵多核苷酸的宿主细胞。特别是，本发明涉及这样的宿主，其展示改变的基因表达和/或表型。例如，本发明涉及展示增加的给定代谢物如抗生素产生、增加的对抗生素敏感性或增加的对给定溶剂耐受性的宿主细胞，包括那些在本发明实施例中所制备的宿主细胞。
因此，在一方面，本发明涉及包含如在此所描述的诱饵多核苷酸的宿主细胞(例如那些在此描述的)，该诱饵多核苷酸包括如在此所描述的n[圈套]质粒或质粒文库。特别包括的是那些具有改变的对抗生素敏感性(如增加的敏感性)的以及根据本文方法制备的细胞。因此，在一方面，本发明涉及业已使用如在此所描述的诱饵多核苷酸使之对抗生素更加敏感的病原体或临床分离株。
本发明特定实施方案的进一步描述
在根据本发明的第一实施方案中，我们提供了一种用于鉴定顺式调节元件的通用方法。如同大多数好的科学一样，基因组测序计划较之所回答的提出了更多的问题。本质上其所传递的是生物体中所有基因的列表(基因组)，但是这却提出了在哪一时刻以及什么情况下这些基因哪些被使用(表达)的问题。这是一项重要的考虑，因为表达样式提供了基因功能以及鉴定那些负责重要特性(表型)的基因的线索。考虑到人细胞：均包含相同的基因，但表达样式则取决于(以及可能决定于)细胞是否来自肝或脑(组织特异性调节)。已开发出能描述基因表达样式以及能例如鉴定造成医学上重要的表型如对疾病的抗性的多组基因的新技术(微阵列技术)。基因组测序计划的承诺之一是这样的知识会帮助加速设计用于治疗疾病的新药物和策略。然而，需要新工具来识别该潜力。
由于我们现在具有鉴定决定表型的基因的能力，因此接下来的挑战就变成去获取对这些基因的控制，以及通过这样做，获取对表型表达的控制。对于我们的生物学认识(一般而言，鉴定用于药物的新靶标)这应当是十分重要的，并且还容许我们改善来自工业细菌的医学及商业上重要化合物(如所谓的发酵产物)的生产。发酵产物遍及食品、药品以及日益增加的工业用酶和燃料。与依赖于传统且环境昂贵的(石油)化学制造方法不同，从可持续来源(细菌)中获得这些产物是可取的目标。
基因通过专门蛋白即转录因子开关。这些转录因子具有双重功能：它们结合特定的DNA序列(调节元件)，通常接近于靶基因，并且它们改变了基因表达的可能性。较早的尝试聚焦于改变转录因子自身的性质或丰度。我们的方法在于靶向转录因子所结合的调节元件。我们所开发的一种策略是导入过量的这些调节元件(称为‘诱饵’)，使得竞争性阻止转录因子结合基因组形式，如此阻断了对下游基因的任何影响(参见下述与根据本发明的第二和第三实施方案有关的讨论)。在本发明的该实施方案中，我们构建了能快速测试鉴定具有期望效果的调节元件集合的诱饵文库(包含来自一个物种的所有调节元件，或具有所有可能的调节元件的通用版本)。该方法的关键部分在于构建通用‘报道系统’，使得不用在复杂现象中寻找改变，例如工业细菌增加的产量，而是通过导入的报道基因表达的改变监测成功的修饰，该报道基因表达赋予对抗生素的抗性且易于检测。该系统如此设计以至于筛选可在高通量下进行。因此，本发明的该方面代表了一种源于基因组时代的技术，其必须做到迅速地产生高质量数据且与全基因组相关。预计通用诱饵文库和通用报道系统的混合物迅速改善了生物技术制品的交付并且是一种无价的研究工具。
更具体地说，根据本发明的该实施方案，我们已修改该‘诱饵’寡核苷酸方法以控制原核生物中的遗传调节并有效控制天蓝色链霉菌中抗生素产生。然而，诱饵对降解敏感，而且该方法不适应高通量检验。我们在根据本发明的方法(参见实施例1-4)中解决了这两个问题。一般而言，利用DNA扩增的滚环机制，将寡核苷酸转变为一系列(约30个)的双链同向重复。将这些重复克隆入高拷贝穿梭载体(能在大肠杆菌和链霉菌中增殖)中并通过接合导入天蓝色链霉菌中。通过抗生素选择保持质粒。我们发现该系统较诱饵进行得更好：更大抑制了抗生素产生并且持续整个实验期间。业已修改了该构建文库的方法，使得通用文库能自合成的随机寡核苷酸制成，或种特异性文库自全基因组片段制成。为创建通用筛选系统，在异源表达常用宿主浅青紫链霉菌中创建了用于负选择和正选择的报道基因。将靶定的启动子克隆到决定对代谢物2-脱氧葡萄糖(DOG)的敏感性的卡那霉素抗性基因或glkA上游。在文库转化后，在液体培养物中针对增加的卡那霉素耐受性(检测负调节)或增加的对DOG敏感性(检测正调节)筛选转化体。由于选择在液体培养物中进行，因此大多数克隆丢失，仅留下少且易处理数目的克隆进行分析。开发了验证系统，其中来自独立筛选的克隆集合被测试以了解什么与其他集合成员交叉杂交。以这种方法有可能鉴定在文库中重现并且是序列分析的良好候选物的克隆。
在根据本发明的第二个实施方案中(参见实施例5)，我们使用诱饵寡核苷酸来研究天蓝色链霉菌A3(2)中蓝色-有色抗生素放线菌紫素的调节。该生物体包含(对于原核生物)相对大的基因组(8.7Mb)，具有复杂且适应性的基因调节样式，特别是与控制抗生素产生的发育和环境信号相关(Bibb(2005)Curr.Opin.Microbiol.8：205-215)。天蓝色链霉菌还是用于放线菌类的模式生物体，增加对该菌株中抗生素产生调节的了解程度可获悉用于实现增加这些生物体所产生的多种次生代谢物的新策略。许多这些化合物在医学中具有重要应用，例如作为抗生素，以及在农业中具有重要应用(Berdy(2005)J.Antibiot.58：1-26)，并且放线菌类依旧是新药物和酶的有利来源(Ward(2006)Curr.Opin.Microbiol.9：279-286)。
可能作为抗生素产生的复杂调节的结果，许多通过遗传筛选鉴定的多效突变体是条件性的；例如，relA无效突变体的不产生抗生素的表型是高度培养基依赖的(Chakraburtty(1997)J.Bacteriol.179：5854-5861)。营养条件性表型的出现暗示着遗传筛选可能低估了影响抗生素产生的调节因子数目。如果在所使用的条件下靶基因的激活可通过替代的转录因子或调节途径介导，则会错过真实转录因子的失活。诱饵的一个优点是它们鉴定并操纵控制基因表达的DNA-蛋白相互作用的序列成分，潜在地阻断了众多转录因子与单一位点的相互作用。在根据本发明的该实施方案中(参见实施例5)，我们证实了以一种与常规遗传筛选相互补的方式，相对容易靶向调节序列并且具有快速鉴定新调节基因的能力。
在根据本发明的第三个实施方案(参见实施例6)中，我们证实了诱饵寡脱氧核苷酸赋予在其他情况中对抗生素具抗性的细菌以对抗生素的敏感性的效用。本领域技术人员应当理解本发明该方面在所谓的包括在我们的医院中到处发现的“超级细菌(superbugs)”时代是极具重要性的。常常归因于滥用抗生素，这些所谓的超级细菌的发展具有产生世界性传染的可能性。然而，借助于本发明的该方面，本领域技术人员应当理解通过正确理解病原体取得对特定抗生素抗性的机制，就可在特定抗生素给药之前和/或同时使用根据本发明方法鉴定的诱饵寡核苷酸。
许多基因在多重水平上受控于调节因子与顺式调节位点的相互作用。所形成的核蛋白复合物可以组织特异性、发育阶段特异性或依赖于刺激物的方式如此作用。简言之，体内DNA-蛋白相互作用受生理决定，并代表了在两种动态成分之间的相互作用：构成反式作用环境的DNA-结合蛋白，以及顺式调节序列。虽然近年来我们的基因表达样式知识已有充分增加，但是这样的增加并没有与我们的控制影响特定细胞进程的特定基因的调节因子知识的相应增加相并头齐进。我们预计本文技术的应用可能给出对原核基因调节复杂性的新鲜见解并使它们被承认为是一种补充常规遗传分析的方法。
所有在此引用的文献均特此并入作为参考。
实施例
已一般地描述了本发明，包括其优选的实施方案和最佳方式，提供下列特定实施例结合进一步的描述以全面实现并延伸本发明的书面描述。然而，本领域技术人员应当理解本发明不应解释受限于特定的实施例。相反地，为了理解本发明范围的目的，应当参考附加于公开内容的权利要求书，包括其等价方案。
尽管大体上在此提及的大多数技术是本领域所熟知的，但是可特别参考Sambrook等，1989，Molecular Cloning：a laboratory manual。
实施例1
证实诱饵寡核苷酸质粒携带形式的创建以及它们在修饰表型中的效用
为完成该工作，首先需要的是开发能创建n[圈套]质粒的分子生物学方案。这样的质粒载体的一种期望的特征是其应当包含由相同的DNA片段的同向拷贝组成的区段。通常这些拷贝数为30，但可在1-1000的范围内变化，以及该重复序列的长度在35-54bp范围内，但可以更长，如多达1000bp。在以下给出的构建实例中，在该重复序列中，存在所有n[圈套]质粒所共有并且是制备方法结果的片段(27bp)。还在该实施例中的是选择质粒载体：(i)以容许大肠杆菌和天蓝色链霉菌的转化和增殖；(ii)以包含编码对抗生素安普霉素抗性的可选择的标记基因；和(iii)以保持细胞中的高拷贝数，通常接近100个拷贝/细胞。
创建含AfsR结合位点的n[圈套]质粒的方法
该方法的概要在图1中给出。合成具有如下嵌合结构的单链寡核苷酸：
(A)用于T7引物的退火位点，和(B)包含顺式调节序列或推定的顺式调节序列的区域。在通用连接寡核苷酸存在下，通过Taq连接酶作用环化寡核苷酸。在用外切核酸酶消化线型DNA后，从制备性丙烯酰胺凝胶中回收单体环。这些单体环随后在使用Bst聚合酶和T7引物的滚环机制扩增反应中用作模板。在PCR反应中再次使用相同的引物并在琼脂糖凝胶上分离产物。分离通常包含30-50个重复的高分子量片段并克隆入PCR载体，之后亚克隆入高拷贝穿梭载体形成n[圈套]质粒。为测定功能，将n[圈套]质粒转化入天然菌株或通用报道菌株中。该方案还可用于产生自随机寡核苷酸制成的‘通用’n[圈套]文库或自片段化的基因组制成的种特异性文库。n[圈套]质粒如何影响靶定基因表达的图解在图2中给出。在该图的左上，由于阻抑性转录因子(圈“B”)结合基因启动子中的顺式调节序列(水平条“C”)，因此该基因(水平条“A”代表的)转录失活。可通过多种技术确定构成转录因子结合位点的顺式调节序列的序列，所述技术包括生物信息学分析、启动子‘足迹法’或各种在此所描述的n[圈套]方法。将该序列掺入诱饵寡核苷酸中以影响基因表达，但在此显示以大量(通常30个)同向重复克隆入可选择的质粒中来创建n[圈套]质粒。质粒通常是一种‘穿梭’质粒，意味着其在大肠杆菌(用以易于遗传操作)以及所靶定的生物体中都能增殖；此外，质粒通常是‘高拷贝’，通常意味着在宿主细胞中其会产生接近100个自身的拷贝。通过标准手段将n[圈套]质粒导入所靶定的原核生物中，并通过针对其标记进行选择确保其稳定增殖，所述标记通常是编码对抗生素抗性的基因。因此当导入细胞时，n[圈套]质粒通过从基因组启动子上滴定掉转录因子“B”以解除下游基因(如水平框“D”所显示的，右上)的转录阻抑，从而能影响靶向基因的表达。
合成包含AfsR结合位点的诱饵寡核苷酸。其具有如下序列：
5’-磷酸酯-aat acg act cac tat agg ggcg gcc gc-3’SEQ.ID.1
这里AfsR结合位点以粗体示于序列中，用于NotI的限制性位点加下划线。合成在5’末端带有磷酸酯基团的寡核苷酸。
还合成了‘连接’核苷酸R-T7，如此称谓，原因在于其包含通常所用引物T7的部分互补物：
5’-ccc tat agt gag tcg tat tgc gg-3’SEQ.ID.2
将两种引物都以250pmol/μl的终浓度重悬于由1x Taq连接酶缓冲液(如厂商New England Biolabs所提供的)和50U Taq连接酶组成的反应缓冲液中。将混合物加热至95℃，持续10分钟，之后让其冷却至45℃，接着向该反应补充4U/ml Taq连接酶，并在45℃将该反应物温育过夜。
1μl的反应物被用作模板在温育混合物中用于滚环扩增(RCA)，该温育混合物由补充0.2mM dNTPs、70nM T7引物(互补于R-T7)和120U/μl Bst聚合酶(New England Biolabs)的1x Thermopol反应缓冲液(如厂商New EnglandBiolabs所提供的)组成。在60℃温育混合物过夜。
在于市售柱系统(Qiagen PCR纯化试剂盒)上清洁步骤后回收扩增的DNA，并将1μl该DNA用于标准的PCR反应，该PCR反应由补充0.2mMdNTPs、5％DMSO、25pmol T7引物和0.5U Taq聚合酶(Roche Diagnostics)的1x Taq聚合酶缓冲液(如厂商Roche Diagnostics提供的)组成。使用如下循环参数进行PCR：95℃，持续5min，然后25个如下顺序的重复：93℃持续15s、55℃持续15s、72℃持续2min，接着72℃持续2min。
反应产物通过1％琼脂糖/TBE凝胶电泳分析并通过透射溴化乙锭染色凝胶显影。
成功的制备表现为具有大约50bp重复长度的序列‘梯’以及足够量的具有1.5kb表观大小迁移的物质以容许纯化(相当于大约30个重复的50bp单体)。
一般而言，当进行该操作时，如果产物的尺寸主要是小的(小于500bp大小)，则首先重复扩增，改变PCR反应中所使用的模板量以及所采用的扩增循环数。结果无法产生期望大小的产物，一种代替的策略如下：对Bst扩增产物进行NotI部分消化，对片段进行大小分级以分离连接NotI相容的接头的1.5kb模板，以便容许在标准的连接介导的PCR反应(LM-PCR)中进有效扩增。
将1.5kb片段亚克隆入来自Promega的市售pGEMT-Easy载体，该载体配上3’T突出端用于有效克隆PCR产物。使用标准的分子生物学技术，在分离自pGEMT-Easy文库整分试样的DNA的EcoRI消化并经凝胶纯化后回收片段。然后，将收集的EcoRI片段亚克隆入在大肠杆菌和天蓝色链霉菌中都能复制的穿梭载体(在我们的例子中是pIJ86)中类似的限制性位点上。然后，使用标准方法通过接合将pIJ86-携带的n[圈套]片段导入天蓝色链霉菌中(Kieser等(2000)Practical Streptomyces Genetics.John Innes Foundation.)。
使用afsRn[圈套]质粒以改变天蓝色链霉菌中抗生素产生表型
AfsR是天蓝色链霉菌中抗生素产生的一种多效调节子，该基因的工程化缺失已表明其对天蓝色链霉菌中两种有色抗生素，放线菌紫素(其是蓝色的)和十一烷基灵菌红素(其是红色的)的产生必不可少(Hong等(1991)J.Bacteriology 173：2311-2318)。在afsS基因上游发现了充当AfsR结合位点的关键顺式调节序列(Lee等(2002)Molecular Microbiology 43：1413-1430)，其就是用于测试n[圈套]质粒的序列。这就是为什么诱饵(为了比较而平行制备的)或包含该位点的n[圈套]质粒通过滴定掉启动子活化性AfsR蛋白会预期抑制afsS表达，结果减少了两种有色抗生素的产生的原因。因此，对用作对照的未处理的天蓝色链霉菌、用包含AfsR位点的环化TFD(如上所述并示以粗体，使用了寡核苷酸：5’-磷酸酯-ata gcg ttg agc gaa cgt ttt tcgct caa cgc tat ag tttt ct-3’SEQ ID.3)处理的培养物以及用AfsR n[圈套]质粒转化的菌株监测三条生长曲线(图3)。在该图中，afsS的野生型启动子示于左上“A”，AfsR(椭圆形“B”)结合其关连位点(长方形“C”)激活调节基因的表达。右上的图“I”显示了培养物的生长曲线以及两种有色抗生素，放线菌紫素(Act)和十一烷基灵菌红素(Red)的产生；(左纵坐标＝抗生素产量，右纵坐标＝细菌生长，实线显示了细菌干重测量值，菱形代表了放线菌紫素(Act)产量以及正方形代表了十一烷基灵菌红(Red)产量)。图“II”显示了导入环状哑铃状诱饵(+诱饵；左中)，其提供了对AfsR结合的竞争，抑制了afsS编码的调节基因的表达，伴随着减少抗生素产生(右中图II)。包含顺式调节序列“C”同聚重复的n[圈套]质粒(左下)证实在抑制抗生素产生(n[圈套])中更有效，可能是因为对质粒的正选择，并且在整个实验过程中观察到了阻抑效应(图III，右下)。n[圈套]质粒能以伴有表型改变的可预测的方式调节基因表达的控制。这些质粒较诱饵生产更便宜且更易于导入细胞中，提供了更持久的效果，并且至关重要的是它们使文库法能发现关键调节元件。
因此，所总结的是，与对照培养物相比(图3，顶行)，在诱饵和n[圈套]处理的培养物中抗生素产生被抑制。然而，用诱饵处理，效果主要是暂时的，在48小时后恢复抗生素产生，而用n[圈套]处理，抑制效果则持续到实验过程之外。使用或以诱饵形式或掺入n[圈套]质粒中的打乱顺序形式的AfsR结合序列的对照实验未能明显抑制抗生素产生。这些观察结果支持了n[圈套]质粒能用于鉴定并表征顺式调节序列，以及在某些方面(稳定性以及表型被修饰的程度)中，它们较现存诱饵寡核苷酸技术更好的猜测。
实施例2
一种使用n[圈套]文库鉴定顺式调节元件的方法以及因此用于改变原核生物 或真核生物中表型的诱饵
在该实施例中，n[圈套]文库由分离自17.083kb肉桂霉素生物合成簇(Widdick和Bibb(2003)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 100：4316-4321)的短DNA片段制成，并将文库再导入肉桂链霉菌生产株中。使用平板测定法进行抗生素的检测，这里让生产株的菌落在覆盖接种报道菌株枯草芽孢杆菌接种物的软营养琼脂的琼脂平板上生长。在抗生素已杀死了指示菌株的地方，透明营养琼脂的晕圈看起来围绕着生产菌落，在其他地方由于菌株持续生长，因此营养琼脂看起来混浊。晕圈直径是所产生的肉桂霉素量的指示剂，以及在导入n[圈套]文库后，可用作针对过量产生的接合后体菌落的便利筛选。这样，就有可能确定是否文库成员能上调节抗生素产生，并作为发现工具针对能掺入TFD中的候选顺式调节元件扫描广大基因组片段，从而证实了该方法的效用。可延伸该方法的逻辑性以开发用于n[圈套]文库检测非常大量调查(包括全基因组)中候选序列的策略，这些方法的示范和它们潜在的应用讨论于随后的实施例中。然而，本领域技术人员应当理解该方法不限于该例证的具体说明，使用该方法学可类似地探明其他原核或真核表型以达到基本上任何目标性状的表型改变。
1.构建定制n[圈套]文库
产生这些片段方法的示意图示于图4中。以DNA中每条顺式调节序列都应呈现在文库中的这样一种方式，由大片DNA创建n[圈套]质粒文库。在该图中显示基因组DNA或基因组片段如生物合成簇通过超声处理得以片段化，并通过用Taq聚合酶和dNTPs处理修复游离末端以产生在DNA的3’末端带有单dA突出端的末端。向这些末端连接生物素化接头，其包含用于Nt.BbvCI(暗框)、MmeI(亮框)的限制性位点以及互补的5’dT突出端。从连接混合物中除去未连接的衔接头后，用MmeI消化修饰片段，MmeI是一种切割其识别位点下游第20/18个核苷酸、使将dT导入突出端的酶；所得到的分子由完整的生物素化衔接头加基因组DNA的19/17个核苷酸段组成，我们称为‘圈套’。在链霉亲合素包被的基质上捕捉这些分子并变性以使上链(包含19nt段)附着于珠子上。现将更多的寡核苷酸退火用于再创建Nt.BbvCI位点，以及随后用酶消化以释放由衔接头的一部分加圈套序列组成的DNA单链碎片。其用于随后的步骤中来创建n[圈套]文库。
1.1制备DNA片段
从之前其业已克隆入的粘粒中分离含大约17kb的肉桂霉素生物合成簇的DNA片段。对片段进行凝胶纯化并超声处理至500bp的平均长度(如通过在TBE/琼脂糖凝胶上电泳分析DNA整分试样所判断的)。在发生双链断裂的情况下，超声处理产生了端接不同长度的3’和5’突出端的DNA和平端DNA的非均一群体。为了将这些DNA转变为由带有3’dA突出端的末端组成的均一群体，用Taq聚合酶处理DNA。
1.2由基因组片段创建18个核苷酸长度的‘圈套’
术语‘圈套’用于指来源于用于创建n[圈套]质粒的基因组序列片段的DNA的短单链部分。
使用标准方法，制备下列序列的生物素化衔接头(这里P代表磷酸酯)并连接至已处理过的DNA片段：
Nt.BbvCI                    MmeI
5’-生物素-ggt ccg ggc cac ggt ggt cta cga gc aggt-3’SEQ ID.4
3’-agt cgg tcc agg ctg-P-5’SEQ ID.5
然后使用Qiagen PCR纯化试剂盒将DNA片段与未掺入的接头相分离并重悬于30μl洗脱缓冲液(10mM Tris.HCl pH8)中。接着，将已改变的DNA片段在37℃于200μl体积的包含20单位MmeI限制酶(New England Biolabs)的反应缓冲液(补充50μM S-腺苷甲硫氨酸的1x缓冲液4[New England Biolabs])中消化16小时。消化后，沉淀片段及在12％非变性丙烯酰胺凝胶上分离并分析条带。游离的衔接头明显可见，原因在于通过IIS型限制酶MmeI的基因组片段的不对称消化产生了衔接头加19/16nt突出端的更慢迁移物质。从凝胶上切下该条带并使用标准技术回收片段。在上链上的19nt是掺入作为候选物用于诱饵序列的n[圈套]质粒的遗传物质一部分。由于这些片段是生物素化的，因此它们被捕捉于包被有链霉亲合素的顺磁基质例如来自Dynal的M-280珠上。在0.5M NaOH中然后加热至80℃变性这些珠上的DNA，并在1x缓冲液4(New England Biolabs)中洗涤所得到的单链DNA。将100pmol如下序列的Bbv互补寡核苷酸(包含Nt.BbvCI位点，其带下划线)：
5’-gga cct ggc tga ggc tcg tag acc acc gtg gcc cgg acc-3’SEQ.ID.6退火至被捕捉的单链DNA，以便制备用于Nt.BbvCI的限制性位点。在消化前，充分洗涤珠子以除去任何未能连接的寡核苷酸。现在向混合物补充25U酶并在37℃温育反应4小时，之后将混合物加热至60℃持续15分钟变性带切口DNA。‘圈套’部分从珠上释放而其余部分保留(图4)。在于磁力架上捕捉珠子后，回收来自上清液的DNA并如之前所描述的使用类似的方法用于创建n[圈套]质粒。
2.使用n[圈套]质粒文库在抗生素肉桂霉素天然宿主中上调抗生素肉桂霉素产生
通过接合将创建自肉桂霉素生物合成簇的n[圈套]文库导入肉桂链霉菌生产株中，并在R2YE琼脂上铺板(Kieser等(2000)Practical StreptomycesGenetics.John Innes Foundation)，并让其生长3天。在肉桂链霉菌未进行处理或用包含空载体(不包含同向重复)的供体菌株进行接合的情况下，进行平行对照实验。这些对照容许估计‘晕圈’大小的平均尺寸和分布，使得n[圈套]处理的样品中晕圈大小的测量值被用于确定统计学显著的过量生产株。在n[圈套]接合后体中晕圈大小增加的一个实例示于图5。当在固体R2YE培养基上铺板时，肉桂链霉菌分泌抗生素肉桂霉素到琼脂中，当生产菌落覆盖(指示)菌株培养物时，能杀死枯草芽孢杆菌细胞(左侧)。该晕圈直径用作所产生的肉桂霉素量的度量。通过导入含来源于17.083kb肉桂霉素生物合成簇的片段的n[圈套]文库增加了(肉桂霉素)产生。在通过接合导入文库成员后，基于增加的肉桂霉素产生选择克隆(右)。
使用该方法，有可能鉴定能上调抗生素产生的n[圈套]质粒，以及通过延伸发现控制产生的肉桂霉素生物合成簇中关键顺式调节序列。在一种应用中，在n[圈套]质粒中或掺入TFD中的这样的序列能用于操纵抗生素和其他工业上有价值的生物产品的产生。使用该方法，我们已能增加之前鉴定的放线菌来源的化合物的产生水平(图5)。这通常是天然产物商业开发的主要障碍，并且该技术通过激活或大大增加所谓的“隐藏的”次生代谢基因簇的表达(Zazopoulos(2003)Nat.Biotech.21：187-190)，从而适合于开发出放线菌类的全部商业潜力，或一般而言对于工业生物技术增加产率。因此，预计该平台技术有益于人和动物卫生保健，并且其示范了基因组测序和基因组学开发的合作利用。
实施例3
一种使用n[圈套]文库鉴定顺式调节元件的方法以及因此使用工程化的报道 系统用于修饰表型的诱饵
1.用n[圈套]文库和cin7报道菌株鉴定肉桂霉素产生的调节子
之前业已描述了肉桂霉素生物合成簇(Widdick和Bibb(2003)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 100：4316-4321)，并通过生物信息和遗传分析证实了某些鉴定的基因的作用。已知cin7基因之前加上控制编码短蛋白(cinA)的cinMXTH操纵子转录的启动子，该短蛋白(cinA)经酶转变产生肉桂霉素抗生素(SeanO’Rourke和Mervyn Bibb，未发表的数据)。我们创建了一种cin7启动子驱动的报道系统，并将该构建体导入携带整个肉桂霉素生物合成途径的浅青紫链霉菌菌株(1326株)中。为了示范该方法，通过接合将肉桂霉素定制n[圈套]文库(实施例2中描述的)导入菌株中，并针对在正常致死浓度的卡那霉素中的存活筛选接合后体。
2.用n[圈套]文库和基于报道基因的系统检测负调节的方法
如图7中所示，靶定基因(cin7)的启动子被置于赋予卡那霉素抗性的基因neo的上游。在该图中，来自肉桂链霉菌生产株的肉桂霉素生物合成簇的cin7基因的靶定启动子被用于驱动编码对抗生素卡那霉素抗性的neo基因的表达。cin7启动子中的顺式调节序列示为条“A”，转录阻抑物(椭圆形“B”)与其结合，使得下游neo基因无活性，从而该菌株对卡那霉素敏感。通常，通过利用整合载体将该嵌合基因导入生产株的基因组中。将在这种情况下创建自肉桂链霉菌基因组报道菌株分级DNA的定制n[圈套]文库导入，并针对对增加浓度的卡那霉素的抗性筛选转化体/接合后体。将那些更具抗性的细胞转入进一步分析。
因此，当在异源生产株浅青紫链霉菌1326的肉桂霉素生物合成簇中没有或很少转录时，cin7启动子是转录惰性的且宿主细胞对卡那霉素选择敏感，在低于5μg/ml的浓度下，细胞死亡出现在包含具有无启动子的编码对卡那霉素抗性的neo基因的质粒的菌株(Labes等(1997)Microbiology 143：1503-1512)。cin7-neo嵌合基因携带于整合质粒上(基于pSET152骨架Kieser等(2000)Practical Streptomyces Genetics.John Innes Foundation)，该质粒还携带编码对抗生素安普霉素抗性的aacC基因。我们通过本领域熟知方法将盒导入浅青紫链霉菌1326株(包含肉桂霉素生物合成簇)中以创建带有稳定整合入基因组中的嵌合基因的新菌株(MM14)。通过标准方法将如实施例2中所描述的制备的肉桂霉素-定制n[圈套]文库导入MM14中以产生该文库的孢子悬液。固定量孢子用于接种R3液体培养基(Shirahama等(1981)Agric.Biol.Chem.45：1271-1273)并监测在增加浓度的卡那霉素存在下的生长。通过从培养物中取出相同体积的整分试样并将这些整分试样涂布在琼脂平板(DNA琼脂)上以测定菌落形成单位/ml培养物以及来自其的活细胞百分数，从而测定每一浓度下细胞生存力。这些数据显示在该实验中，在650μg/ml卡那霉素下生存力低于0.01％，其被估计折合为在50ml培养物中的1200个菌落形成单位。这被认为是卡那霉素的最适浓度，因为对于那些具有增加的对抗生素抗性的细胞其大大富集了，产生易管理的细胞数目。在150μg/ml处的生存力为85％，建立了cin7-neo构建体的基线活性。
进行文库杂交步骤。在该实施例中，在四个独立的重复中，MM14株接合肉桂霉素定制文库。以经验为主确定卡那霉素对于每一重复的最适浓度。最后，将来自在最适浓度下存活的每一重复的96个克隆在R3培养基中培养，接着分成两份整分试样。从其中一份，使用标准方法自细胞提取质粒，务必要防止RNA或基因组DNA污染。然后，根据标准方法(Roche手册)使用DIG标记的dUTP分子通过随机引发PCR标记质粒DNA，以创建探针(Probe)样品。稀释另一份整分试样并以单个菌落能清楚可见的浓度涂布在DNA琼脂平板上。平板在30℃温育16小时，之后菌落仍保持蜡状稠度并尚未变硬。用牙签弄碎96个这样的菌落，首先用于制备在第二DNA平板(补充50μg/ml安普霉素)上的划线，然后在25μl二甲亚砜(DMSO)中混合，加热至95℃，持续10分钟，接着冷却以产生来源于克隆的总DNA溶液。对划线和DNA溶液编号，使得如果随后发现DNA样品含有候选n[圈套]质粒，则可容易回收能活的接合后体(MM14株加n[圈套]质粒)。
为鉴定真正能干扰转录的n[圈套]质粒(为将形成相当大部分的总信号的‘背景’成员与真正能干扰转录的n[圈套]质粒相区分)，开发了文库杂交策略。在该实施例中，使用标准方法，对来自每一重复的96个克隆的DNA样品进行处理并与尼龙膜杂交，各自具有可编址的位置。该推行策略示于图9中。对于每一重复，制备四张这样的滤膜(F1、F2、F3和F4，分别来源于每一重复)，然后分别与不同的探针杂交，使得最终所有的探针组都与每张滤膜杂交。P1和F1的杂交检测了每个样品都得到检测的色谱图。由于在文库中多次出现的n[圈套]序列相应地更亮，因此检测不被预期为同质的。在该实施例中，P1和P2与F3和F4的杂交检测了所有文库所共有的样品。这些样品应被认为是用于继续研究的有力候选物。
这样的筛选的示范性数据示于图10中。在该实施例中，用报道菌株测试两个独立重复的肉桂霉素文库，并且来自每一重复的96个最大卡那霉素抗性克隆用于制备包含每一重复(F1和F2)中的n[圈套]质粒的滤膜，及两个相应的探针组(P1和P2)。所有通过交叉杂交(F1对P2以及F2对P1)鉴定的克隆被认为是有力候选物，并给予在两次交叉杂交实验中所共有的那些(红圈)以优先权。所研究的6个克隆中3个克隆的序列鉴别了cin7启动子的一部分以及另两个围绕来自肉桂霉素簇中另一基因cinR(已被提议具有簇调节作用)的潜在顺式调节子周围。最后一个克隆序列未被鉴定并推测来源于浅青紫链霉菌染色体或是人工制造的。
在某些情况下，P1与F1杂交以及其它的自杂交实验能够检测由于例如真核文库中重复序列的富集所引起的假阳性克隆。由于这些假阳性克隆在文库中的丰度，因此它们会产生很强的信号，即大于可预期在文库中出现不止一次但并不是如重复DNA(该类型可占人基因组10％质量)一样出现许多次的真阳性。
3.使报道基因适合于检测正调节
通过创建由掺入受靶定启动子驱动的葡萄糖激酶基因(glkA)编码序列的嵌合报道基因组成的盒，一种简单的改变用于使报道系统能检测正调节。该酶将代谢物2-脱氧葡萄糖(DOG)转变为有毒的、磷酸化形式的化合物。因此，通过制备由连接glkA基因的cin7启动子组成的嵌合报道基因并将其稳定地整合入含glkA-缺失的浅青紫链霉菌菌株中，就提供了这样的报道系统(图8)。
在该实验环境中，使用浅青紫链霉菌TK24株。其不含有肉桂霉素生物合成簇(用于检测控制产生的负顺式调节元件的菌株也如此)，因而cin7启动子的任何活性均应归因于来源于浅青紫链霉菌基因组的正调节子。因此，通过在该背景中搜寻正顺式调节序列，应会从浅青紫链霉菌宿主的染色体中发现异源表达的上调节子。滴定这些正调节子离开cin7启动子并落在n[圈套]质粒上，阻止了glkA表达，从而细胞在DOG存在下生长。迄今已经做了相当多的工作，使用常规遗传筛选来检测这样的异源产生通用调节子，该异源产生可由转录机某些成分例如σ因子和翻译机成分的过量表达引起。此外，已知为SARP的一类转录因子(Butler等(2003)Appl.Microbiol.Biotechnol.61：512-516)已被鉴定，并且这些转录因子结合的顺式调节元件是用于该筛选的潜在靶标。以与之前所描述的相同的方式进行筛选，具有类似的优点：与高通量处理相容、标准化方法以及易于可评价的表型。
实施例4
一种使用n[圈套]文库鉴定顺式调节元件的方法以及因此用于在不定的遗传 系统中改变表型的诱饵
1.创建基因组n[圈套]文库
超声处理纯化的大肠杆菌K12株基因组DNA以给出500bp的平均尺寸。然后如实施例2中所描述的处理该片段：配上包含适宜的限制性位点的生物素化接头，消化以产生衔接头加19/17个核苷酸突出端，在链霉亲合素基质上被捕捉，之后限制酶切和变性以释放包含衔接头一部分加19个核苷酸突出端的单链DNA片段。然后，使用如实施例2中所描述的技术，将这些类型的分子用于创建n[圈套]质粒文库。
考虑到用于构建n[圈套]文库的基因组和片段的大小，一种版本的大肠杆菌K12基因组n[圈套]文库(以下称为‘K12文库’)估计具有1,560,000个成员，使用标准分析相应于高达99.8％的全基因组覆盖。因此如果在创建文库中不存在序列偏爱，则三个独立版本的K12文库就应当提供对基因组的完全覆盖。为了评估在文库中是否存在任何偏爱，从所述在液体培养中生长的整分试样中分离质粒。用EcoRI消化该质粒混合物以再生用于创建n[圈套]文库的片段，并对这些片段进行MmeI消化来证实已运转的构建分子生物学：正如所料，插入片段是大尺寸的且这些插入片段在MmeI完全消化下瓦解为30bp单体(图11)，而部分消化则产生具有30bp重复的多聚体大小的中间产物。质粒集合的测序清楚地证实了来源于衔接头的‘间隔’元件的序列以及该间隔在超过至少10个拷贝上保持得很好。正如所料，质粒集合的‘圈套’部分实质上是在19个位置的任何一个位置上具有很小核苷酸偏爱的随机序列。
2.创建通用n[圈套]文库
合成具有如下序列的寡核苷酸：
5’-磷酸酯-aat acg act cac tat agg  gnn nnn nnn ngc ggc cgc-3’SEQ.ID.7这里针对NotI的限制性位点显示带下划线，以及随机化核苷酸为‘n’所代表。在该实施例中，随机化核苷酸的数目为9，但该数目可以改变。还可以改变为可变区所编码的序列的类型，例如通过在该序列中包含恒定区(即侧接可变序列的规定的核心序列)，或通过向可变区中导入核苷酸偏爱(即通过规定60％的机会‘n’应当是dGTP或dCTP以创建具有更高GC含量的随机序列)。用该包含随机化序列的寡核苷酸创建n[圈套]质粒的方案，以及因此的通用n[圈套]文库都与实施例2中给出的相同。我们在此将这些来源于随机化寡核苷酸的n[圈套]文库称为通用文库。
发现一种版本的文库的滴度超过2百万。使用标准分析，这样滴度的文库会包含所有可能的9bp序列组合的置信度应为7.5x105。然而，感觉到不见得这样的文库会一直是真正通用的，因为由于许多原因某些序列会从文库中耗尽，例如集合中包含MmeI或NotI位点的那些序列或具有大量二级结构的序列及富GC序列的PCR偏爱。然而，应当理解所业已创建的具有可能性成为真正且全面的潜在的顺式调节序列集合以用于n[圈套]文库方法中。
3.使用n[圈套]文库检测具有未明确遗传网络的表型的顺式调节子的方法
用基因组n[圈套]文库或一种版本的通用文库转化大肠杆菌K12株并以液体培养物生长。当如通过读取培养物吸光度(0.4的A600读数)所估计的生长达到对数中期时，将整分试样用于接种没有补充溶剂或补充0.5％-5％不同浓度的丁醇的培养基。将该培养物进一步温育1小时，然后测定菌落形成单位以便计算细胞生存力。从其中生存力已减少10,000倍(至0.01％或更小)的培养物中分离细胞并在不含溶剂的培养基中洗涤，然后用于再接种无溶剂的新鲜培养基。重复该实验循环；该培养物生长至0.4的密度并用于接种补充增加浓度的丁醇的培养基。该过程重复4次，每次均测量细胞生存力(图12)。选择过程的反复操作(意味着在经丁醇一次传代后来自现有成员的文库被提取并用于转化大肠杆菌K12)增加了作为选择过程重复次数函数的生存力计数。没用K12n[圈套]文库处理的大肠杆菌被指定为‘0’(为实心菱形所代表)，那些具有1次处理的为实心正方形所代表，那些具有2次处理的则为实心三角形所代表，那些具有3次处理的为空心圆形所代表以及那些具有4次处理的为星号所代表。变得明显可见的是，当在高浓度丁醇存在下培养时，与由不带有n[圈套]插入片段的质粒骨架组成的对照转化或未转化的相比，用任何n[圈套]文库转化的细菌给出了基本上更高的细胞生存力计数。此外，变得明显可见的是该选择过程的反复操作增加了作为选择过程重复次数函数的生存力计数。
大肠杆菌K12常规文库较通用n[圈套]文库执行得更好，与该文库对该菌株基因组更具代表性相一致。
实施例5
用诱饵寡核苷酸操纵并了解天蓝色链霉菌A3(2)中抗生素产生
关于这一点业已描述的是一套鉴定牵涉表型控制的关键顺式调节序列的革新方法。该技术可普遍适用于所有生物体。接下来证实这些序列的知识可用于创建能体内修饰基因表达的工具。这些工具再次在所有生物体中起作用，但是下列实施例的焦点在于在原核生物中使用。调整转录因子诱饵法用于原核生物，并显示是一种动用n[圈套]方案产生的信息来开发能修饰基因表达的系统的有效方法。这两种方法的组合在此称为“调节工程化”。
在下文实施例中，通过新定位方法确定影响天蓝色链霉菌中抗生素产生的顺式调节序列，并将这些序列用于设计诱饵寡核苷酸。通过导入天蓝色链霉菌中并监测它们的摄取、稳定性和抗生素产生效果，从而测试诱饵。所使用的方法的完整描述在实施例7中给出。
1.定位actII-orf4启动子中的调节元件
通过体内DNA酶I/T7外切核酸酶定位研究控制actII-orf4表达的DNA-蛋白相互作用。该方法被开发来鉴定顺式作用调节元件的边界，使得推断的序列能用于设计诱饵寡核苷酸用于功能研究。该方法的图解概述在图13中给出。为定位DNA-蛋白复合物在天蓝色链霉菌基因组中特定位置处的体内边界，将高浓度的DNA酶I和T7外切核酸酶添加到新鲜收获的细胞。DNA酶I将‘切口’导入复合物周围的DNA中，然后用作T7外切核酸酶的5’-3’外切核酸酶活性的底物。因此，酶的联合作用标定了复合物的5’边界。从处理的细胞中回收DNA，并通过与掺入生物素化接头的启动子PCR片段的固定链杂交捕捉来自靶定启动子(actII-orf4)的片段。使用与生物素化接头杂交的第二DIG非放射性标记的引物(掺入地高辛，DIG[Roche])，通过进行PCR反应定位这群被捕捉的片段中边界的位置。通过PAGE和化学发光检测测定标记产物的大小。使用在相反末端带有生物素化接头的PCR产物，以类似方式定位了相反链上的边界。在12％聚丙烯酰胺凝胶电泳后对标记的PCR片段进行大小分级，并在化学发光检测后确定片段的存在和它们的大小。足迹法中T7外切核酸酶和DNA酶I的新组合容许检测启动子区中DNA-蛋白复合物的所有边界，而不仅仅是那些最接近所选择的限制性位点的边界。
由于我们的目标在于发现涉及actII-orf4表达抑制的调节元件，因此我们定位了在丰富液体培养基(R5)中转录下调的启动子。在这些条件下，阻抑物可占用启动子并阻止表达。通过测定细胞密度(培养物的A430)导出生长曲线，并测定两种有色抗生素(蓝色的放线菌紫素和红色的十一烷基灵菌红素[Kieser等(2000)Practical Streptomyces Genetics.John Innes Foundation]产量和actII-orf4的转录活性。后者已知在生长晚期被诱导，因此在放线菌紫素产生的视觉上可检测到的开始(图14A中箭头所指示的)之前收获用于定位的样品。在可见的放线菌紫素产生之前的时间点(箭头指示的)，从生长于丰富(R5)培养基的培养物中收获天蓝色链霉菌M145细胞。自始至终监测细胞生长(菱形)以及放线菌紫素(三角形)和十一烷基灵菌红素(圆形)产生。以经验为主确定消化所需的酶量，需要仔细优化DNA酶I浓度。例如，过量的DNA酶I导致信号透明度损失，原因在于在DNA-蛋白复合物中切割，而太少的酶对于定位是无效的。在大多数情况下每次反应250U T7外切核酸酶运作良好；如果酶不是高加工活性(processive)，也不是在最适缓冲液中进行消化，则必需添加过量的酶。如图13中所描述的，在两条链上定位边界，并在通过12％非变性PAGE的大小分析，继之以DIG标记产物的化学发光检测后确定它们的位置(图14B)，以及通过与标准尺寸梯比较，有可能确定转录沉默的actII-orf4启动子区中DNA-蛋白复合物的边界(图14C)。该actII-orf4启动子的序列显示了推定的顺式调节元件的位置(相对于在定位方案中所使用的引物方案)。加框区指示上游基因(actII-orf3)和actII-orf4自身的编码序列。用大写字母表示的序列标记了候选调节元件，上方显示它们的名字。加下划线序列指示对于actII-orf4启动子的-35和-10框，星号显示转录起始位点位置，以及会聚箭头指示存在于A24.4中的反向重复。
我们将通过这些区所界定的序列称为调节元件，总共看到了五个调节元件。该调节元件是标记为A24.1-A24.5(朝向转录起始位点)并且这些序列被用于设计在随后功能研究中使用的诱饵寡核苷酸。
2.在琼脂平板上快速筛选诱饵功能
我们开发了一种快速的基于琼脂平板的测定法来测试诱饵是否对抗生素产生具有任何作用。使用R2YE琼脂，原因在于其促进了两种有色抗生素在肉眼容易可检测到的水平上的产生。用稀释的孢子悬液接种平板并在30℃温育24小时，使得形成铺满的天蓝色链霉菌菌苔。在该阶段，十一烷基灵菌红素(其是红色)开始产生而放线菌紫素(其是蓝色)则没有产生。用处于0.5％琼脂糖中的薄层SNA覆盖平板，并在该放置前，如图15中所示的将小片Whatman纸(抗生素测定片)放在培养基上并用15μl 10pmol/μl诱饵寡核苷酸溶液或对照溶液饱和。滤纸片用诱饵溶液或作为对照的缓冲液(如所示的)饱和并施加到覆盖SNA培养基(软营养琼脂：0.5％Difco琼脂w/v)的天蓝色链霉菌M145菌苔上。由于细菌持续生长，因此增加的抗生素产生的出现可通过片中和周围早期积累的有色抗生素识别(在添加诱饵后48小时明显可见)。阴性对照(仅缓冲液或‘打乱顺序’形式的诱饵A24.5)并不显示过早的产生。所有样品均在包含0.5％(v/v)的发现改善转染效率的两种非离子型去污剂NP-40和Triton X-100的缓冲液中制备。对照由单独的缓冲液或A24.5诱饵序列被随机化的打乱顺序的诱饵寡核苷酸组成。平板进一步在30℃温育并定期检查以确定是否对抗生素产生的量或时机有任何影响。在浸透A24.5的片周围看见紫色/红色晕圈，而A24.3和诱饵A24.1-A24.4混合物程度较低(图15，48小时；尽管晕圈在分泌的十一烷基灵菌红素的背景上清楚可见，由于该分子用作pH指示剂，因此在较早时间点放线菌紫素呈红色)。为证实放线菌紫素合成已开始，在48小时处回收片，提取色素并用分光光度计定量；诱饵A24.5强烈激活了早期放线菌紫素产生，而A24.3和诱饵混合物则程度较低(数据未显示)。在对照片周围没有看到早期放线菌紫素产生。到96小时，全部的天蓝色链霉菌M145菌苔都产生大量的这两种抗生素(未显示)，在任一片周围无明显的生长带抑制。在早期时间点某些诱饵增加放线菌紫素产生的能力(可能是通过干扰阻抑物与actII-orf4启动子区中它们的识别位点的结合)证实了该方法的有效性并激励我们通过将诱饵导入在液体培养中生长的细胞中去进行更彻底的功能研究。
3.在液体培养中诱饵的摄取和稳定性
下一个要解决的问题是在液体培养物中诱饵是否能有效地导入菌丝体中，以及如果可以的话，其能坚持多久？在SMM培养基(Kieser等(2000)Practical Streptomyces Genetics.John Innes Foundation)中建立天蓝色链霉菌M145的六份液体培养物并培养至指数中期。通过轻度离心收集细胞并重悬于1/10原始体积的渗透性缓冲液(包含与平板测定法中所使用的相同浓度的去污剂)中，之后用不同量的诱饵A24.1(0mM、5mM、10mM、20mM、50mM和100mM)转染。在短暂的温育后，将细胞重悬于保留的培养基中并继续温育。使用设计成能扩增跨过在哑铃状诱饵形成中导入的连接部分的小片段(40bp)的引物，通过qrt-PCR测定诱饵寡核苷酸的摄取。参考标准曲线用于计算存在于细胞中的诱饵拷贝的绝对数目(在离心和两个洗涤步骤后)，并通过参考基因组对照校正该数目。为评价稳定性，在不同的时间点(0-72小时)提取整分试样。浓度超过20mM摄取率饱和。用20mM转染2小时达到最佳摄取，此后45％的诱饵进入细胞(图16)。用包含诱饵的溶液转染活跃生长的细胞，并通过定量实时PCR(qrt-PCR)估计寡核苷酸的摄取及其稳定性。在用20mM A24.1转染后，收获并洗涤细胞，之后使用qrt-PCR来评估保留在细胞中的诱饵拷贝，作为时间的函数。数据代表三次独立的测定值。在添加后72小时，可在细胞内检测到诱饵，36小时后22％(相当于一半进入了细胞)保留。由于当接近静止期时转染培养物，因此与由于稀释而损失相反，设想诱饵为内源核酸酶所缓慢降解。因此，诱饵能进入菌丝体并持续一段长时间，暗示该方法能用于改变液体培养物中的基因表达。
4.使用诱饵寡核苷酸控制抗生素产生
将相应于所鉴定的调节元件的五种诱饵用于转染在R5或SMM液体培养基中生长的天蓝色链霉菌M145液体培养物。转染时间安排在actII-orf4表达之前，这样诱饵具有与它们的关连转录因子相互作用并潜在影响放线菌紫素产生的机会。对照实验类似于那些在平板测定法中所使用的，并由假转染操作或导入三种打乱顺序的诱饵(基于诱饵A24.1、A24.3和A24.5的序列)组成。在每次实验中，在转染后固定间隔测定培养物的生长以及有色抗生素的产量和actII-orf4的表达。没有一种诱饵改变细胞的生长，但某些对放线菌紫素的产生具有影响，以及在某些情况下，对十一烷基灵菌红素具有影响。在R5培养基中，在抗生素产量相对高的情况下，诱饵A24.5上调放线菌紫素产量，在96小时时间点增加产率95％(图17A和B)。在用(A)无诱饵对照或用(B)A24.5诱饵转染(箭头指示的)前天蓝色链霉菌M145生长20小时。在两种培养物中细胞生长(菱形)和所产生的十一烷基灵菌红素的量(圆形)相似，所看到的唯一不同之处在于放线菌紫素的积累(三角形)，在用诱饵A24.5处理后刺激该积累。数据代表三次独立测定的平均值以及长条显示了标准误差。诱饵A24.1和A24.3具有较温和的作用，导致两种有色抗生素上调。在所有放线菌紫素产生存在增加的处理中，actII-orf4表达的绝对水平也相应增加(通过qrt-PCR测定的；数据未显示)。因此，该结果很大程度与那些在平板上所看到的相一致，暗示诱饵的作用是特异且可预测的。还在SMM培养基(一种较R5支持较少抗生素产生的基本培养基)中测试诱饵。用诱饵A24.5转染导致放线菌紫素产生加倍(图18A和B)。比较用(A)假转染的对照和(B)诱饵A24.5处理的培养物获得的数据，揭示了诱饵寡核苷酸导致显著增加的放线菌紫素产生。该数据呈现于图17中并且是三次独立测定的平均值；长条显示了标准误差。在该培养基中，对于诱饵A24.1和A24.3也看到了放线菌紫素产生增加(数据未显示)。因此，诱饵充当便利工具以验证对actII-orf4启动子中顺式作用调节元件的鉴别，容许我们影响抗生素产生的开始。如上所指出的，一些诱饵还上调节了十一烷基灵菌红素产生，下文解决这种共调节的可能原因。
5.发现放线菌紫素产生的新修饰物
新定位技术和诱饵寡核苷酸的组合业已用于验证三种控制放线菌紫素调节基因actII-orf4表达的调节元件。我们接下来要问是否这些调节基序存在于任何其他基因的启动子区中；这样的基因是否还可能涉及抗生素产生的调节。用所有5条诱饵序列进行BLAST搜索鉴定了一条这样的基因。SCO5812包含与A24.1(一次运行14个中有10个)和A24.3(一次运行18个中有11个)的强匹配。该基因自身是一种可能的核糖核酸酶HII同源物，因而可具有与之前所鉴定的在抗生素产生中的多效突变体absB(SCO5572；Adamidis和Champness(1992)J.Bacteriol.174：4622-4628)类似的功能，该多效突变体absB是RNA酶III的同源物并被认为涉及转录物加工(Chang等(2005)J.Biol.Chem.280：33213-33219)。为确定SCO5812在抗生素产生中的该作用，如果有的话，我们从M145中缺失该基因并在R5和SMMS培养基上与亲本菌株比较(抗生素)产生(图19)。在该图中，M145(平板左侧)和M145ΔSCO5812(平板右侧)在(A)R5琼脂培养基或(B)SMMS琼脂培养基上划线并分别温育72小时和96小时。虽然SCO5812缺失戏剧性地减少了R5琼脂上放线菌紫素产生，但是其增加了SMMS上十一烷基灵菌红素产生。有趣的是注意到用A24.1或A24.3转染的细胞显示轻微的上调十一烷基灵菌红素产生，暗示结合这些位点的转录因子可能影响这两种抗生素生物合成基因簇的表达。所测试的诱饵之一，A24.4，其包含6bp反向重复(图14)，被发现在redD(十一烷基灵菌红素生物合成簇的途径特异性激活基因)(Takano等(1992)Mol.Microbiol.6：2797-2804)的启动子区中具匹配(12个中有8个)。该基序被预测为拟核蛋白IHF结合位点(基于与之前鉴定的位点的序列同源性)，提升了该位点在核蛋白复合物中具有结构作用而非直接影响转录的可能性。
6.总结
我们已使用新的技术来鉴定并验证了针对天蓝色链霉菌中抗生素产生阻抑物的结合位点。用诱饵寡核苷酸进行验证：这些调节元件拷贝的转染导致靶定基因去阻遏并增加了放线菌紫素产生。我们工作的意图在于证明诱饵寡核苷酸可以是一种在原核生物中快速描绘遗传网络的有价值的工具。其已成功了吗？在两重意义上其已成功了。所测试的五种诱饵中的三种显示预期的活性。近来，具有最强效应的诱饵A24.5已显示当启动子有活性时与TetR样转录调节子AtrA结合(Uguru等(2005)Mol.Microbiol.58：131-150)。使用亲和纯化来鉴定actII-orf4阻抑物的我们自己的工作已同样地鉴定了结合该位点的TetR样转录因子；我们的设想是由于诱饵A24.5在actII-orf4转录前添加，因此容许通过减少这些推定的阻抑物的结合而表达。
7.材料和方法
7.1菌株和生长条件
涉及链霉菌处理常规技术的标准文献是Kieser等(2000)PracticalStreptomyces Genetics.John Innes Foundation。通过热处理并于30℃在SMM或R5培养基中生长，带以连续摇动，让天蓝色链霉菌A3(2)M145株孢子同步萌发。如之前所描述的测定培养物的生长和放线菌紫素产生。R2YE和SNA用于诱饵诱导的抗生素产生的琼脂平板测定法。通过PCR寻靶实现SCO5812的缺失(Gust等(2003)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 100：1541-1546)。
7.2体内T7外切核酸酶作图
在用足迹法试剂处理前，向天蓝色链霉菌菌丝体片段培养物补充0.5mMCaCl2和50单位DNA酶I(以除去胞外DNA)并在30℃进一步温育15分钟。通过低速离心收获菌丝体并在补充5mM EDTA的TES缓冲液(13)中充分洗涤。对于DNA酶I足迹法，细胞在补充0.5％(v/v)NP-40和0.5％(v/v)Triton X-100的TES中洗涤，并在30℃温育15分钟。然后，在预热至30℃的DNA酶I消化缓冲液(DDB)中洗涤细胞，并用不同量的DNA酶I消化5分钟。通过添加等体积的终止缓冲液(50mM Tris.HCl，5mM EDTA，0.2％(w/v)SDS，10mg/ml蛋白酶K，pH8)并在55℃温育过夜终止反应。在两轮苯酚-氯仿提取后，乙醇沉淀核酸。用RNA酶A消化样品，之后再沉淀和定量。
7.3诱饵寡核苷酸研究
所使用的所有寡核苷酸的序列均列在表1中。合成诱饵寡核苷酸(Invitrogen)并用CircLigase(Epicentre)连接以创建哑铃状体(Mann和Dzau(2000)J.Clin.Investigation 106：1071-1075)。在20μl反应体积的补充50μMATP，2.5mM MnCl2，500U CircLigase的1x CircLigase缓冲液中混合100pmol每种诱饵寡核苷酸，并在60℃温育1小时。用过量的外切核酸酶I处理混合物以除去线型DNA，并沉淀残留的共价环。通过12％非变性凝胶电泳分析每一制备物来检查大多数产物是单价共价环。将样品以200pmol/μl重悬于TE(10mM Tris-HCl，pH 8.0，1mM EDTA)缓冲液中，10μl每种诱饵点在3mm抗生素测定片上，然后将片轻轻地压入已倾注24小时龄的在R2YE琼脂平板上生长的天蓝色链霉菌M145的汇合菌苔的SNA琼脂薄层中。抗生素产生的诱导会导致片周围着色局部增加。可选地，哑铃状诱饵寡核苷酸用于转染来自天蓝色链霉菌M145的指数生长的培养物的菌丝体。转染包括在等体积的补充0.5％(v/v)NP-40和0.5％(v/v)Triton X-100的TES缓冲液中洗涤细胞，然后将它们重悬于1/10它们原始体积的TES加去污剂中，并补充诱饵寡核苷酸。细胞在30℃温育15分钟带以轻柔混合，在保留的培养基中稀释并继续温育。在该处理后生长速率暂时减慢但不久后恢复。其后采集样品来评估两种有色抗生素即放线菌紫素和十一烷基灵菌红素(13)产生的量。同时提取样品用于RNA分析。
7.4基因表达和诱饵拷贝数分析
通过定量实时PCR(qrt-PCR)进行表达分析。如之前所述的进行cDNA的制备(Ryding等(2002)J.Bacteriol.184：794-805)。简言之，热变性1μgRNA(在70℃温育10分钟，然后置于冰上)并与处于20μl厂商推荐的缓冲液中的0.5U AVM逆转录酶(Amersham)、1mM dNTPs、25pmol定制引物混合。反应在三个相继的温度——45℃、50℃和55℃下温育各自30分钟。在20μlqrt-PCR反应物中4μl该反应物用作模板，该qrt-PCR反应物是在补充10％(v/v)DMSO和25pmol用于靶基因(actII-orf4)的定制正向和反向引物以及内标(SCO4742，一种保守的假定蛋白，在微阵列分析后发现其表达显示很小改变[http://www.biomedcentral.com/1471-2164/8/261/abstract])的Invitrogen的SYBRGreener反应混合物中制备的(表1)。在BioRad Chromo4机器上进行扩增和分析。使用SYBR-绿检测类似地进行诱饵拷贝数测定。引物被设计(表1)成能检测环化诱饵寡核苷酸，并通过超声处理菌丝体并与已知量的外切核酸酶处理的诱饵进行比较从而测定它们的拷贝数；通过参考存在的SCO4742拷贝数，针对样品中基因组数校正这些值。
7.5表1：寡核苷酸引物
每条诱饵寡核苷酸中的顺式调节序列皆带下划线。


实施例6
证实诱饵寡脱氧核苷酸可用于治疗环境中以克服病原体中抗生素抗性
图20中呈现了采用来鉴定能改变对万古霉素敏感性或实际上在遗传水平上业已表征的其他抗生素抗性机制的诱饵的大体方法。该示意图示范了TFD如何用于对抗致病细菌中的已知抗性机制。对规定的抗生素万古霉素的抗性用作例子。这出现在屎肠球菌(一种人病原体)和天蓝色链霉菌菌株中。在这两种细菌中，抗性为VanR蛋白所诱导的vanHAX操纵子编码。通过设计诱饵去干扰VanR与基因组中其关连位点的结合，有可能阻止vanHAX的诱导，如此使得细菌对万古霉素敏感。在该实施例中，在包含类似于病原体的抗性机制或通过水平基因转移移入模型中的真实机制的细菌(非病原体的)模型中，于功能上验证了诱饵。随后，在致病模型如临床分离株上测试诱饵并最终移入动物模型，例如感染万古霉素抗性肠球菌(VRE)或万古霉素抗性金黄色葡萄球菌的小鼠。应当理解该方法能应用于广范围的为这样的遗传开关所控制的细菌表型。这些应用包括但不应限于发现其他能使细菌对其他抗生素如青霉素、氯霉素、四环素、达托霉素等敏感的诱饵或诱饵组合。
天蓝色链霉菌中万古霉素抗性操纵子的结构示于图21(来自Hong等2004Molecular Microbiology 52：1107-1121)中。该万古霉素操纵子由箭头所示的四个操纵子组成。vanRS操纵子编码起感受万古霉素存在(直接或间接地)并诱导编码万古霉素抗性机制的vanHAX操纵子表达作用的二元调节系统。在检测到万古霉素时，vanHAX操纵子为在其启动子中结合的VanR的磷酸化形式所诱导，VanS又成为磷酸化VanR的激酶。我们预计我们的诱饵破坏磷酸化VanR与vanH启动子中位点的结合。
应当指出导致临床所见的某些万古霉素抗性感染的粪肠球菌中抗性基因的进化源被认为是产生万古霉素的放线菌。
所使用的vanH5诱饵的序列示于如下，磷酸化VanR的结合位点以大写字母表示：
5’-P-ata tctatatgaa gcgacgtggt cgatgagccg cagcg tttt cgctg CGG CTC ATCGAC CAC GTC GCT TCA TAT AGA tatag tttt ct-3’SEQ ID.NO.21
将寡核苷酸制备为如图22中所示的环状哑铃状诱饵。将该寡核苷酸在100pmol/ul终浓度下重悬于T4DNA连接酶缓冲液(如酶厂商New EnglandBiolabs所提供的)和400U T4DNA连接酶中，并在16℃温育不同时间。在温育期间，由于连接酶活性而形成茎-环结构的寡核苷酸可变成共价连接的单链‘环状’DNA分子。该环化程度取决于与连接酶的温育时间；最久的温育(16小时)导致近乎完全的转变。因此，在寡核苷酸与T4DNA连接酶温育0、1、2、4、6和16小时后(分别为a-f)，从每个反应中取出整分试样，热处理以灭活酶并通过乙醇沉淀回收DNA，之后6％聚丙烯酰胺凝胶电泳分析和用溴化乙锭染色显影。泳道a-f显示了缓慢迁移的线型单链DNA分子到更高速迁移的环状哑铃状闭环双链体的转变(泳道f)。
诱饵以‘环状哑铃状’构型(Ahn JD，Kim CD，Magae J，Kim YH，Kim HJ，Park KK，Hong S，Park K G，Lee IK，Chang YC(2003)Biochemical BiophysicalRes Comm 310：1048-1053)存在，尽管并不是必需的。可使用其他形式的寡脱氧核苷酸，包括但不限于例如(a)包含该序列的较长的双链寡脱氧核苷酸，使得在损失诱饵功能前外切核酸酶需要充分减少该寡核苷酸长度；(b)包含修饰的碱基或糖以赋予更大的核酸酶抗性的寡脱氧核苷酸；(c)附着于寡核苷酸末端的2′-OH核苷酸或胺，其会阻断外切核酸酶活性(其是所有哑铃状体所做的)；(d)小的环状双链DNA分子；或(e)包含多拷贝活性诱饵序列的多聚体分子。
实质上，所需要的是所使用的ODN具有为小茎环结构或其它序列所框入的掺入vanH启动子中靶定序列的双链区。对于环状哑铃状结构，将分子合成为线型寡核苷酸并通过与T4DNA连接酶温育环化。
显示将称为vanH5的诱饵导入天蓝色链霉菌M600株的液体培养物中的线图在图23中给出。天蓝色链霉菌M600株在液体MMCGT培养基(MolecularMicrobiology 52：1107-1121)上生长，通过记录430nm处培养物吸光度(细胞密度)测定生长，并作为温育时间的函数进行作图。监测四种培养物的生长：(1)什么都没有添加的培养基(菱形‘M600’)；(2)在0小时培养基补充亚致死浓度的20μg/ml抗生素万古霉素(正方形‘加20μg/ml VAN’)；与(2)中一样，但在温育20小时后诱饵寡核苷酸H5添加至64pM终浓度(三角形‘VAN加64pM H5’)；与(2)中一样，但在温育20小时后诱饵寡核苷酸H5添加至256pM终浓度(圆形‘VAN加256pM H5’)。
根据该数据，很明显在20ug/ml万古霉素存在或不存在(在培养过程开始时添加或未添加的)下，M600可比较好的生长，证实了该菌株具有对万古霉素的抗性。在20ug/ml万古霉素存在下，添加环化诱饵vanH5至64pM终浓度，具有几乎不可检测的效果，而添加至256pM则导致细胞在大约18小时的一段时间内停止生长。这段时间可通俗地称为“治疗窗”，在此诱饵进入细胞，干扰vanR调节子与vanH启动子的结合，从而阻止抗性机制诱导。在18小时后，我们从其它系统得到的证据暗示发生了诱饵降解(通过细胞中内切核酸酶)，其可以影响它们的功效。
至于为什么vanH诱饵看上去具有抑制细菌效应，我们认为这归因于改变细菌细胞壁阻止万古霉素作用的抗性机制。当万古霉素添加到培养物时，就是实验开始时。在20小时添加诱饵。在这一点上，细菌将生长出改变的细胞壁。在添加诱饵时，从该点直至诱饵耗尽，改变细菌细胞壁的能力被阻断。结果，尽管较老的细胞能坚持，但是致使任何新的细菌生长都对万古霉素敏感。在耗尽诱饵时，具有残留万古霉素抗性的坚持细胞能再次增殖。在万古霉素前添加诱饵效果会很小，因为抗性操纵子未开启。然而，我们预期同时施用诱饵ODN诱导杀细菌效应。
因此，该实施例证实了在TFD存在而非它们不存在的情况下天蓝色链霉菌对万古霉素的敏感性。这会为本领域技术人员接受为用于证实病原体如粪肠球菌中该作用的可接受的替代物。屎肠球菌van操纵子受相同机制(vanR结合vanH)诱导，即使两个系统之间在序列水平上同源性不非常高。本领域技术人员应当能容易地改变诱饵序列以用于该病原体中。
vanH5诱饵是一种能结合原核转录因子、使得该转录因子与原核生物基因组中其关连靶标结合减少或消除的寡脱氧核苷酸的实例。
2.设计TFD对抗病原体中的抗生素抗性
以上已讨论了TFD如何能用于恢复万古霉素敏感性的原理。对于负责基因未知的情况，使用本发明提供的通用n[圈套]文库或创建自病原体基因组DNA的定制文库。如图6中所示，文库或可在实验室条件下导入致病细菌中，或可将决定抗性的遗传元件克隆并导入非致病实验室菌株中用作模式系统，然后其可被转化。接着该细胞在所选择的抗生素不存在下培养和通过转化将文库导入细胞中，当以液体培养物存在时，立刻平分样品并添加抗生素到一半的样品中，继续温育。回收细胞群并通过PCR从质粒中扩增连环化的TFD。这两个群被相扣除以分离在抗生素处理的样品中缺少的TFD，以及因此那些赋予敏感性的TFD。再克隆该富集的TFD群并重复选择过程直至其足够富集能使细胞抗生素敏感的TFD。
这样的方法的潜在目标包括调查对许多临床处方的抗生素抗性的机制，以及未来的目标在于什么样的抗生素抗性开始限制它们的功效。会被考虑使用n[圈套]方法学调查并随后用TFD处理以失效抗生素抗性的现用抗生素的实例包括：那些来自已知为如下的抗生素类：氨基糖苷类(例如卡那霉素)；碳青霉烯类(例如美罗培南)；头孢菌素类(例如头孢吡肟)；糖肽类(例如万古霉素和达托霉素)；青霉素类(例如氨苄青霉素、羧苄青霉素和青霉素)；多肽类抗生素(例如多粘菌素B)；喹啉类(例如左氧氟沙星)；磺胺类(例如菌特灵)；四环素类(例如四环素)；以及各种抗生素，氯霉素、利福平、斯沃。
实施例7
7.1在链球菌溶血素-O存在下胆固醇标记TFD
使用寡核苷酸引物，其中一种具有5’胆固醇修饰以及另一种在其5’末端或其他地方具有类似修饰(例如荧光染料如Cy5，使得TFD的摄取能容易地测量)，通过PCR制备TFD。如果TFD之前已被克隆入载体(pGEMT-Easy)中，则引物被设计成能退火至立刻侧接插入片段的载体序列，例如：
SEQ ID NO：22 Chol_TEf：5’Cholesterol-TEG-ggc cgc cat ggc ggc cgc gggaat tc
SEQ ID NO：23Cy5_TEr：5’Cy5-AGG CGG CCG CGA ATT CAC TAGTG.
如果要被用于TFD的序列还未克隆，则其可直接合成(如果足够短的话)并退火形成TFD，或使用设计成能在TFD内退火的引物直接从基因组DNA扩增。
乙醇沉淀PCR产物并以500-1000ng/μl浓度重悬于TE缓冲液中。通常，使用96孔板进行抗生素敏感性测定，每个孔包含200ml肉汤。例如，在屎肠球菌情况下，该肉汤是补充0.2U/ml链球菌溶血素-O(Sigma)和5μg/ml万古霉素抗生素并接种屎肠球菌的万古霉素抗性株的BHI培养基(来自BectonDickinson)。
7.2通过PCR制备哑铃状体
哑铃状诱饵是共价闭合的单链DNA，特征在于包含靶定因子的结合位点的双链中心，侧接茎-环结构。茎-环通过阻止了否则会降解诱饵多核苷酸的外切核酸酶起作用稳定了诱饵。因此，由于它们的特征形状如此称呼哑铃状诱饵(DB)。
如7.1中所述，使用包含靶定结合位点的pGEMTEasy来源的质粒作为模板，通过PCR制备DB。用于扩增的引物是：
(SEQ ID NO：24)DBTEf：5’P-CTTGG TTTTT CCAAG AGAAGAGC ccg ccatgg cgg ccg cgg gaa ttc
(SEQ ID NO：25)DBTEr：P-CCG TCT TTT TGA CGG CGA AGA GCA GGCGGC CGC GAA TTC ACT AGT GA.
引物会形成茎-环的部分加下划线。用合适的载体进行扩增给出了图24中所示的DNA产物，其中DB中会结合转录因子的部分由‘NNN NNN’给出。该序列以粗体表示产生切口的限制酶Nt.BspQ1的结合位点。在图24的第二部分中，显示了用Nt.BspQ1消化PCR产物的结果；其将茎-环结构暴露为单链区，该单链区会形成茎-环并可随后通过用T4DNA连接酶处理进行连接以形成共价闭环和DB。
7.3通过限制性消化质粒制备哑铃状寡核苷酸
可选地，可通过将图24中所示的平端PCR产物克隆入合适的PCR克隆载体例如pGEMTEasy中，证实其身份和制备质粒而得以制造DB。然后消化质粒以释放插入物，该插入物额外用Nt.BspQ1消化以释放图24中第二部分所示的片段。这可类似地用T4DNA连接酶处理以便共价闭合DNA分子并形成DB。
该方法的优点在于当DB大量需要时在实践和经济上更能按比例放大。
7.4用R9-胆固醇剂转染
R9-胆固醇已被描述了其在真核细胞中帮助siRNA(或其他基于核酸的疗法)分子等转染的特性(美国专利：20070207966)。在此，我们描述其在用TFD转染不同细菌中的效用。
如之前所描述的合成R9-胆固醇，其由附着于9个D-精氨酸的线型链上的胆固醇分子组成(Kim W.J.等，Mol.Ther 200614：343-350)。将TFD与处于补充5％葡萄糖的基于TE的缓冲液中的增加量的R9-胆固醇混合。在室温下温育该混合物1小时，然后用于在转染中直接使用或通过琼脂糖凝胶电泳进行分析。通常，使用使得含DNA的复合物不在凝胶上跑的最少量的R9-胆固醇；即核酸主链的电荷已通过与聚精氨酸结合而被中和。胆固醇分子帮助TFD与细菌膜缔合并因此进入细胞。
在96孔板中，TFD/R9-胆固醇缀合物以不同浓度混合于200μl培养物中。例如，在屎肠球菌的情况下，该肉汤是补充0.2U/ml链球菌溶血素-O(Sigma)和5μg/ml万古霉素抗生素并接种屎肠球菌的万古霉素抗性株的BHI培养基(来自Becton Dickinson)。
实施例8
使用Van诱饵序列使屎肠球菌对万古霉素致敏
8(a)在链球菌溶血素-O存在下使用胆固醇标记的TFD
如实施例7.1中制备胆固醇/Cy5标记的诱饵多核苷酸。该测定法使用96孔板来进行，每个孔含200ml由补充0.2U/ml链球菌溶血素-O(Sigma)和5μg/ml万古霉素抗生素并接种屎肠球菌的万古霉素抗性株的BHI培养基(来自Becton Dickinson)组成的肉汤。
将1μl不同浓度的胆固醇/Cy5标记的诱饵添加到每个孔中，并在温育期间通过不时测量肉汤的吸光度监测它们对屎肠球菌的细菌生长的影响。平板在37℃温育带以摇动，并使用读板仪采集吸光度读数(在450nM处)。测试两种诱饵：VAN包含控制VanA型抗生素抗性诱导的调节元件；CON是不存在于屎肠球菌基因组中并用作阴性对照的诱饵序列。VAN诱饵序列的序列(克隆入pGEMT-Easy载体以创建用于使用Chol_TEf和Cy5_TEr引物的PCR扩增步骤的质粒的部分)是：
VAN TFD 5’AAA AAA GAA TCA TCA TCT TAA GAA ATT  CTT AGT CATTTA 3’(SEQ ID NO：26)
所得到的生长曲线示于图25中。所有的数据点都重复进行三次。显然在低至40nM的浓度下用VAN TFD处理使得屎肠球菌菌株对万古霉素再敏化，而CON阴性对照则无作用。用qPCR和荧光显微镜检术确认TFD的摄取。
8(b)用R9-胆固醇剂转染
该阵列使用96孔板，每个孔包含200ml培养物，由补充0.2U/ml链球菌溶血素-O(Sigma)和5μg/ml万古霉素抗生素并接种屎肠球菌的万古霉素抗性株的BHI培养基(来自Becton Dickinson)组成。
将1μl不同浓度的TFD/R9-胆固醇缀合物添加到每个孔中，并在温育期间通过不时测量肉汤的吸光度监测它们对细菌生长的影响。平板在37℃温育带以摇动，并使用读板仪采集吸光度读数(在595nM处)。测试两种哑铃状TFD：VAN包含控制VanA型抗生素抗性诱导的调节元件(包含与Seq.26相同的序列)；CON是不存在于屎肠球菌基因组中并用作阴性对照的诱饵序列(包含与实施例8(a)中CON相同的序列)。
所得到的生长曲线示于图26中。所有的数据点都重复进行三次。显然在低至40nM的浓度下用VAN TFD处理使得屎肠球菌菌株对万古霉素再敏化，而阴性对照则对细胞生长无负影响。