使用种子包衣中的巴氏杆菌孢子防治线虫的材料和方法
阅读：0发布：2021-03-14
专利汇可以提供使用种子包衣中的巴氏杆菌孢子防治线虫的材料和方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 提供了一种新颖且有利的用于防治 植物 病原和/或土栖 线虫 的材料和方法，所述的方法通过将有效量的巴氏杆菌孢子附着在 种子 上并将种子传递到线虫所在的 位置 。，下面是使用种子包衣中的巴氏杆菌孢子防治线虫的材料和方法专利的具体信息内容。
1.一种防治植物病原和/或土栖线虫的方法，包括将巴氏杆菌组合物附着于种子上，所述的巴氏杆菌组合物包含有效量的巴氏杆菌孢子；并将该种子播种。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述的巴氏杆菌组合物，当应用于种子时，浓度变化
6 9
范围是从约10 到约10 个孢子/粒种子。
3.如权利要求1所述的方法，其中所述的巴氏杆菌组合物进一步包含液体或固体载体。
4.如权利要求3所述的方法，其中所述的固体载体选自干燥粉末、可湿性粉末、可湿性颗粒、干燥颗粒、微粒、聚合物基质和浆料。
5.如权利要求4所述的方法，其中所述的固体载体包含颗粒。
6.如权利要求4所述的方法，其中所述的固体载体为聚合物基质，所述的聚合物基质选自聚丙烯酰胺，淀粉，粘土，硅土，矾土，土壤，沙子，聚脲，聚丙烯酸酯，以及上述物质的任意组合。
7.如权利要求1所述的方法，其中粘附剂被施用到种子上，并且其中所述的粘附剂选自聚醋酸乙烯酯，聚醋酸乙烯酯共聚物，聚乙烯醇，聚乙烯醇共聚物，甲基纤维素，羟甲基纤维素，羟甲基丙基纤维素，糊精，藻酸盐，糖浆(molasses)，聚乙烯吡咯烷酮，多糖(polysaccharides)，蛋白质，脂肪，油类，多糖(polysaccharide)，阿拉伯胶，明胶，糖浆(syrups)，以及上述物质的任意组合。
8.如权利要求1所述的方法，其中所述的巴氏杆菌孢子选自穿刺巴氏杆菌(Pasteuria penetrans)，分枝巴氏杆菌(Pasteuria ramose)，李氏巴氏杆菌(Pasteuria thornei)，寄生巴氏杆菌(Pasteuria nishizawae)，以及上述菌种的任意组合。
9.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述的植物病原和/或土栖线虫选自花生根结线虫(Meloidogyne arenaria)，短体线虫(Pratylenchus brachyurus)，肾形线虫(Rotylenchulus reniformis)，刺线虫(Belonolaimus longicaudatus)，以及上述线虫的任意组合。
10.如权利要求1所述的方法，其中所述的种子选自四季豆，西红柿，棉花，玉米，大豆，小麦，大麦，稻，油菜，以及上述植物的任意组合的种子。
11.如权利要求1所述的方法，其中所述的种子进一步包含次要的农业上有益的成分，所述的次要的农业上有益的成分选自杀虫剂，除草剂，杀菌剂，肥料和生物防治试剂。
12.一种至少部分表面包衣有巴氏杆菌组合物的种子，其中所述的巴氏杆菌组合物包含有效量的用于线虫防治的巴氏杆菌孢子。
使用种子包衣中的巴氏杆菌孢子防治线虫的材料和方法
背景技术
[0003] 由于植物寄生线虫造成的农作物损失据估计超过1000亿美元。防止这种损害成为一个重大的挑战。随着熏蒸剂甲基溴的即将减少，开发和注册新的用于线虫防治的合成化合物迫在眉睫。因此，需要有其他选择。
[0004] 植物病原线虫特别难以控制，因为他们体外覆盖着一层厚厚的、防渗的角质层，或虫体壁，并且具有极少数的感觉神经元。由于许多害虫防治化合物是作为神经毒素使用，植物病原线虫暴露的低数量的神经元减少了杀线化合物的有效目标面积，并且已经导致具有极高的神经毒性的杀线化合物的开发。
[0005] 此外，因为植物病原线虫存在于土壤或植物根部，所以将植物病原线虫暴露给防治试剂是难以实现的，并且使得地下水层处于来自毒性化合物的污染的危险中。基于神经毒素的杀线剂的使用已经被证明污染地下和地表水。因此，出于公众健康的原因，许多这些化合物正在从市场上退出。
[0006] 栽种前对土壤进行熏蒸是一种广泛采用的防治线虫的方法。甲基溴是使用最广泛的熏蒸剂之一，但由于其具有破坏臭氧性能，被提名停止使用。此外，这种土壤熏蒸法的实施不加选择地杀死土壤中的有机体，面临着在除去致病有机体的同时除去有益微生物的危险。因此，一种环境友好的、有效的杀线虫剂是迫切需要的。
[0007] 巴氏杆菌(Pasteuria)于1888年首次被Metchnikoff(Annales de l’Institut ndPasteur 2：165-170)描述为水蚤的一种寄生细菌。随后，Cobb(2 ed.Hawaiian Sugar Planters Assoc.，Expt.Sta.Div.Path.Physiol.Bull.5：163-195，1906) 描 述 了 线 虫Dorylaimus bulbiferous的巴氏杆菌侵染。
[0008] 细菌的生命周期包括一个阶段，该阶段中内孢子在土壤中粘结至线虫的角质层。随后，穿刺巴氏杆菌(P.penetrans)在线虫体内增殖，并且经过几个形态变化阶段，包含菌丝形态以及菌体形态，最终形成新的内孢子。当线虫解体时内孢子被释放。
[0009] 细菌在线虫体内的生长会减少或抑制线虫排卵，从而严重地限制了线虫繁殖的速率。宿主作物的经济损失通常是由线虫繁殖的第一子代造成的，并且这种损失可以通过巴氏杆菌降低植物根部区域子代线虫浓度而避免。
[0010] 虽然使用巴氏杆菌来防治线虫先前已经被提出，但是许多因素，包括未达最佳的传递选项限制了这种线虫防治策略的应用。使用巴氏杆菌菌株防治线虫的常规方法包括将细菌以游离形态(例如Stirling G.R.1984.“Biological control of Meloidogyne javanica with Bacillus penetrans”，Phytopathology，74：55-60)或以固体和液体制剂的形式(例如美国专利US5,248,500)应用于植物和土壤中。然而，尽管细菌对植物病原线虫具有高度地选择性，但是它们只有与线虫接触才能产生杀虫的效果。当这些细菌直接应用于土壤时，需要大量的细菌，并且它们必须与土壤很好地混合，这实质上增加了使用细菌的成本。
发明内容
[0012] 本发明提供了一种新颖的、有利的用于防治植物病原线虫和/或其他土栖线虫(soil-dwelling nematodes)的材料和方法，该方法是通过向土壤传递一种组合物，该组合物包含有效量的附着于种子上的巴氏杆菌孢子(Pasteuria spores)。
[0013] 当播种本发明所述的种子时，巴氏杆菌孢子将会转移到种子周围的土壤中。已经发现，当实施本发明的方法时，孢子接着附着到种子周围以及最终地从种子发育成的任何植物周围的植物病原线虫和/或其他土栖线虫上，侵染该线虫，在该线虫体内生长并再生成孢子，降低该线虫的繁殖力，和/或杀死该线虫。
[0014] 本发明所述的方法可以用于控制或降低由线虫侵染引起的损害，并且，在优选的实施方式中，能改善种子出苗、植物生长以及植物健康状况。
[0015] 本发明的一个方面提供了一种通过向线虫侵染的位置传递有效量的附着于植物种子上的巴氏杆菌孢子而对线虫进行防治的方法。
[0016] 本发明所述的巴氏杆菌孢子可以以游离孢子或者以制成的液体或固体组合物，微粒(particles)的浆体，或乳浊液形式应用于种子。在一种实施方式中，巴氏杆菌孢子被制成一种液体组合物。在另一种实施方式中，巴氏杆菌孢子被配制成一种固体组合物。合适的固体载体包括，但不限于固体聚合物基质、微粒(particles)、颗粒(granules)和粉末。在一种实施方式中，固体载体由颗粒组成。
[0017] 在优选的实施方式中，所述的巴氏杆菌组合物通过包衣、喷雾到种子上、或附着在种子上、与种子接触或与种子混合的方式与种子发生关联。在一种实施方式中，巴氏杆菌组合物通过包衣至少部分种子表面面积而进行应用。
[0018] 在一种实施方式中，植物种子首先用粘附剂(adherent)处理，该粘附剂可以粘附巴氏杆菌孢子和/或包含孢子的组合物。粘附剂可以是，例如，一种胶和/或一种或多种聚TM合物或共聚物。粘附剂的例子包括但不限于，胶(比如ELMERS 胶)；聚醋酸乙烯酯；硅树脂材料；以及天然的无机材料(比如硅胶和粘土)。
[0019] 本发明的另一方面提供了一种种子，该种子至少在其部分表面包衣有巴氏杆菌组合物，其中巴氏杆菌组合物包含有效量的用于线虫防治的巴氏杆菌孢子。
附图说明
[0020] 图1表示从包衣有用于线虫防治的巴氏杆菌的种子发育成的植物的健康状况；
[0021] 图2表示土壤中巴氏杆菌孢子与线虫的附着状况；
[0022] 图3表示从包衣有用于线虫防治的巴氏杆菌的种子发育成的植物的高度。
具体实施方式
[0023] 本发明提供了一种有效防治植物病原线虫和/或其他土栖线虫的材料和方法，该方法通过利用包衣有巴氏杆菌孢子的植物种子实现有效防治线虫的目的。
[0024] 有利地，巴氏杆菌产生内孢子，该内孢子具有独特的、有用的性能，可以附着到植物病原线虫和其他土栖线虫上，侵染该线虫，在该线虫中生长并再生成孢子，降低该线虫的繁殖力，和/或杀死该线虫。。
[0025] 本发明的一个方面是提供防治线虫的方法，该方法是通过向线虫侵染的位置传递有效量的作为植物种子包衣材料的巴氏杆菌组合物而达到防治线虫的目的。
[0026] 本发明作为种子包衣材料传递的巴氏杆菌可以削弱线虫侵染植物的能力。因此，在优选的实施方式中，本发明所述的处理方法能够控制或减少由线虫侵染引起的损害，由此改善种子出苗、植物生长和/或植物健康状况。
[0027] 本发明所述的巴氏杆菌孢子可以在活体内在活宿主内产生(例如Verdeho，S.，和R.Mankau，1986，Journal of Nematology，18：635)，或在活体内在活宿主组织不存在的情况下产生(例如美国专利US 5,094,954)。在一种具体的实施方式中，本发明的巴氏杆菌孢子采用例如在美国专利US7067299和US6919197中描述的发酵技术制备得到。
[0028] 各种各样的巴氏杆菌类菌种均适用于线虫的防治。在一种实施方式中，活性成分包含有效量的用于防治根结线虫的穿刺巴氏杆菌孢子。在其他的实施方式中，活性成分包含有效量的巴氏杆菌孢子，该巴氏杆菌孢子选自分枝巴氏杆菌(Pasteuria ramose)，李氏巴氏杆菌(Pasteuria thornea)，Pasteuria usage，寄生巴氏杆菌(Pasteuria nishizawae)，上述菌种的任意组合，此外还有有待确定的新的杀线虫种类。
[0029] 巴氏杆菌孢子的杀线虫有效量可以变化，取决于各种因素，包含但不限于：植物种类，种子的表面面积，载体的类型，其他活性成分的存在与否，制剂方法，传递途径，巴氏杆菌的种类，目标线虫的种类，以及线虫侵染或损害植物的严重程度。
[0030] 在此使用的“杀线虫有效量”是指能杀死，防治，或侵染线虫；延迟线虫生长或繁殖；减少线虫数量；和/或降低由线虫引起的对植物的损害的巴氏杆菌孢子量。一般而言，5 12
孢子的有效量的变化范围是从约1×10 到1×10 (或更多)个孢子/粒种子。优选地，孢
6 9
子浓度为约1×10 到约1×10 个孢子/粒种子。
孢子的有效量的变化范围是从约1×10 到1×10 (或更多)个孢子/粒种子。优选地，孢
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子浓度为约1×10 到约1×10 个孢子/粒种子。
[0031] 在此使用的“活性成分”是指一种物质，该物质对于杀死、防治、或侵染线虫或其他害虫；和/或延迟线虫或其他害虫的生长或繁殖；减少线虫或其他害虫的数量；和/或降低线虫或其他害虫对植物的损害是有用的。
[0032] 在此使用的“农业上有益的成分”是指一种物质，该物质在农业环境中是有用的或多产的，例如对于防治疾病、害虫(包括昆虫、寄生虫、病毒、真菌、细菌)和/或杂草是有用的；对于提高植物生长，植物健康状况，种子出苗，植物繁殖和/或果实生长的数量和质量是有用的。农业上有益的成分包括但不限于杀虫剂，除草剂，杀菌剂，肥料，以及生物防治试剂。
[0033] 在此使用的“惰性的或无活性成分”是指一种有助于操作或者改善农业制剂或组合物的效果的物质。惰性的或无活性成分包括但不限于载体、粘附剂(adherent)、分散剂、表面活性剂、液体稀释剂、粘结剂(binder)、填充剂、溶剂、润湿剂、粘着剂(sticker)、乳化剂、营养素、渗透剂、发泡剂、增溶剂、扩散剂以及缓冲剂。
[0034] 在某些实施方式中，巴氏杆菌组合物通过包衣、喷雾到种子上、附着在种子上、与种子接触或与种子混合的方式被应用于种子。在一种实施方式中，巴氏杆菌组合物通过包衣至少部分种子表面面积的方式附着于种子上。
[0035] 在一种具体的实施方式中，巴氏杆菌组合物通过下列步骤被应用于种子：a)将固体载体浸渍在巴氏杆菌组合物中以获得巴氏杆菌-载体混合物；和b)使种子与巴氏杆菌-载体混合物接触。
[0036] 本发明的另一个方面提供了用所述的巴氏杆菌组合物处理过的种子。一种实施方式提供了至少部分表面面积包衣有巴氏杆菌组合物的种子。在一种具体的实施方式中，巴6 9
氏杆菌处理过的种子具有从约10 到约10 个孢子/粒种子的孢子浓度。这些种子在每粒
10 11 12
种子上还可以含有更多的孢子，比如1×10 ，1×10 或者1×10 个孢子/粒种子。
氏杆菌处理过的种子具有从约10 到约10 个孢子/粒种子的孢子浓度。这些种子在每粒
10 11 12
种子上还可以含有更多的孢子，比如1×10 ，1×10 或者1×10 个孢子/粒种子。
[0037] 巴氏杆菌组合物的制备
[0038] 本发明所述的巴氏杆菌可以以游离的孢子或者以制成的液体或固体组合物、微粒的浆料或乳浊液的形式传递至种子。
[0039] 在一种实施方式中，巴氏杆菌孢子被制成一种液体组合物。内孢子悬浮在一种介质中，通过缓冲以维持所需要的pH值。优选地，pH值小于约6.0，更优选pH值小于约5.5，并且最优选pH值在约3.0至约5.0之间。可以使用的缓冲体系包含，但不限于邻苯二甲酸氢钾、醋酸、丁二酸和柠檬酸。可用于酸化培养基的试剂包括，但不限于盐酸、硫酸、醋酸和其他的有机酸。
[0040] 在另外一种实施方式中，巴氏杆菌制剂可以非必需地包含一种或多种氨基酸、盐、碳水化合物、维生素、以及其他的支持营养素。在一种具体的实施方式中，巴氏杆菌悬浮液可以包含下列一种或多种下列组分：葡萄糖、NaCl、酵母提取物、NH4H2PO4、(NH4)2SO4、丙三醇、缬氨酸、L-亮氨酸、L-谷氨酸、L-丙氨酸、L-缬氨酸、L-酪氨酸、L-色氨酸、乳酸、丙酸、丁二酸、苹果酸、柠檬酸、酒石酸氢钾、维生素溶液、矿物质溶液、木糖、来苏塘、和卵磷脂。在另一种具体的实施方式中，该悬浮液可以包含一种或多种下列组分：乳酸、丙酸、丁二酸、苹果酸、柠檬酸、酒石酸，和酵母提取物。
[0041] 在一种实施方式中，巴氏杆菌孢子被制成一种固体组合物。该固体悬浮体可以通过将巴氏杆菌孢子或巴氏杆菌悬浮液与固体载体混合制备得到。在一种实施方式中，固体组合物通过将固体载体浸渍于孢子悬浮液，随后干燥该固体组合物而获得。
[0042] 合适的固体载体包括但不限于固体聚合物基质、微粒(particles)、颗粒(granules)和粉末。在一种实施方式中，该固体载体由颗粒所组成。在一种实施方式中，所述的巴氏杆菌组合物被制成乳浊液；在一种含水介质(例如水)中的微粒的浆料；可湿性粉末；可湿性颗粒(干燥可流动)；或干燥颗粒。在一个具体的实施例中，所述的固体载体为AXIS 的硅藻土颗粒和/或PROFILE 的绿色度粘土颗粒。
[0043] 本发明所述的巴氏杆菌组合物可以被制成，例如悬浮液，固体组合物，或含水浆料。活性成分的浓度的变化范围可以从约0.5wt％到约99wt％(w/w)，从约5wt％到约80wt％，从约10wt％到约75wt％，从约15wt％到约70wt％，从约20wt％到约65wt％，从约
25wt％到约60wt％，从约30wt％到约55wt％，从约35wt％到约50wt％。
25wt％到约60wt％，从约30wt％到约55wt％，从约35wt％到约50wt％。
[0044] 在另一种实施方式中，本发明所述的巴氏杆菌组合物被制成巴氏杆菌-颗粒混合6 8
物。巴氏杆菌孢子相对于颗粒的量值的变化范围可以从约1×10 到约7×10 个孢子/g颗
6 8 7 8
粒，从约5×10 到约5×10 个孢子/g颗粒，从约1×10 到约1×10 个孢子/g颗粒，或从
7 7
约3×10 到约5×10 个孢子/g颗粒。
物。巴氏杆菌孢子相对于颗粒的量值的变化范围可以从约1×10 到约7×10 个孢子/g颗
6 8 7 8
粒，从约5×10 到约5×10 个孢子/g颗粒，从约1×10 到约1×10 个孢子/g颗粒，或从
7 7
约3×10 到约5×10 个孢子/g颗粒。
[0045] 在一种具体的实施方式中，颗粒组合物通过将约3-5ml 2×107个孢子/ml的巴氏杆菌孢子悬浮液与约2g颗粒混合而获得。在一种更加具体的实施方式中，颗粒组合物通过将约5ml孢子悬浮液与约2g AXIS 颗粒混合而获得。在另一个更加具体的实施方式中，颗粒组合物通过将约3ml孢子悬浮液与约2g PROFILE 颗粒混合而获得。
[0046] 固体组合物的微粒可以是能够使巴氏杆菌孢子附着于植物种子的任何尺寸。
[0047] 在一种进一步的实施方式中，巴氏杆菌组合物进一步包含一种或多种常规的无活性或惰性成分，包括，例如粘附剂(adherents)、分散剂、表面活性剂、液体稀释剂、粘结剂(binders)、填充剂、溶剂、润湿剂、粘着剂(stickers)、乳化剂、营养素和缓冲试剂。
[0048] 常规的无活性或惰性成分包括，但不限于：常规的粘着剂；分散剂比如甲基纤维TM TM素(例如，METHOCEL A15LV或METHOCEL A15C，作为分散剂/粘着剂的组合试剂用于种TM TM
子处理中)；聚乙烯醇(例如ELVANOL 51-05)；卵磷脂(例如YELKINOL P)；聚合物分散剂(例如聚乙烯吡咯烷酮/醋酸乙烯酯PVPIVA S-630)；增稠剂(例如，粘土增稠剂如Van Gel B，用于增加微粒悬浮体的粘度并减少微粒悬浮液的沉淀)；乳浊液稳定剂；表面活性剂；防冻剂化合物(例如尿素)；染料；着色剂，等等。适用于本发明的另外的惰性成分可以在[McCutcheon′s，vol.1，″Emulsifiers and Detergents，″MC Publishing Company，Glen Rock，N.J.，U.S.A.，1996]中查到。适用于本发明的另外的惰性成分可以在[McCutcheon′s，vol.2，″Functional Materials，″MC Publishing Company，Glen Rock，N.J.，U.S.A.，1996]中查到。
子处理中)；聚乙烯醇(例如ELVANOL 51-05)；卵磷脂(例如YELKINOL P)；聚合物分散剂(例如聚乙烯吡咯烷酮/醋酸乙烯酯PVPIVA S-630)；增稠剂(例如，粘土增稠剂如Van Gel B，用于增加微粒悬浮体的粘度并减少微粒悬浮液的沉淀)；乳浊液稳定剂；表面活性剂；防冻剂化合物(例如尿素)；染料；着色剂，等等。适用于本发明的另外的惰性成分可以在[McCutcheon′s，vol.1，″Emulsifiers and Detergents，″MC Publishing Company，Glen Rock，N.J.，U.S.A.，1996]中查到。适用于本发明的另外的惰性成分可以在[McCutcheon′s，vol.2，″Functional Materials，″MC Publishing Company，Glen Rock，N.J.，U.S.A.，1996]中查到。
[0049] 在一种实施方式中，粘附剂用于促使孢子附着于种子上。粘附剂使孢子或包含巴氏杆菌的组合物附着于种子的表面，因此阻止或至少减少了不必要的芽孢脱落。优选地，粘附剂是无毒的、生物可降解的，以及具有粘性的。合适的粘附剂包括，但不限于胶、聚醋酸乙烯酯、聚醋酸乙烯酯共聚物、聚乙烯醇、聚乙烯醇共聚物、纤维素(比如甲基纤维素、羟甲基纤维素及羟甲基丙基纤维素)、糊精、藻酸盐、碳水化合物、糖浆(molasses)、聚乙烯吡咯烷酮、多糖、蛋白质、脂肪、油类、阿拉伯胶、明胶、糖浆(syrups)、和淀粉。另外的合适的粘附剂在，例如，美国专利US 7213367中有描述。在一种具体的实施方式中，粘附剂是聚醋酸乙烯酯。
[0050] 在另一种实施方式中，所述的组合物进一步包含一种或多种聚合物，该聚合物能够使活性成分混合或附着到固体载体上。合适的聚合物可以是天然的或合成的，并且优选地对有待包被的种子没有或几乎没有植物性毒素作用。聚合物可以选自，例如，聚醋酸乙烯酯、聚醋酸乙烯酯共聚物、乙烯-醋酸乙烯酯共聚物(EVA)、聚乙烯醇、聚乙烯醇共聚物、纤维素(包括乙基纤维素、甲基纤维素、羟甲基纤维素、羟丙基纤维素以及羧甲基纤维素)、聚乙烯吡咯烷酮、多糖(包括淀粉、改性淀粉、糊精、麦芽糊精、藻酸盐及壳聚糖)、脂肪、油类、蛋白质(包括明胶和玉米蛋白)、阿拉伯胶、虫胶、偏二氯乙烯和偏二氯乙烯共聚物、木素磺酸钙、丙烯酸共聚物、聚乙烯丙烯酸酯、聚环氧乙烷、丙烯酰胺聚合物和共聚物、聚羟乙基丙烯酸酯、甲基丙烯酰胺单体、以及聚氯丁烯。
[0051] 在另一种实施方式中，所述的组合物可以进一步包含填充剂，用以在应力条件下保护种子。此外，所述的组合物可以进一步包含塑化剂，以改善液体或半液体组合物的流动性，混合的或聚合的组合物的弹性，和/或组合物与种子间的粘附性。此外，向制剂中添加干燥剂(比如碳酸钙、高岭土或膨润土、珍珠岩、硅藻土或在例如美国专利US5876739中描述的任何其他吸附材料)是可取的。本领域普通技术人员，可以容易地从现有技术中选择所需要的用于制剂的组分。
[0052] 在一个进一步的实施方式中，所述的巴氏杆菌组合物包含次要的(second)农业上有益的成分。次要的农业上有益的成分可以是，例如选自杀虫剂和杀菌剂，如克菌丹、福美双、甲霜灵、咯菌腈、恶霜灵以及这些材料的同分异构体，等等；除草剂，包括下列化合物：如氨基甲酸酯类、硫代氨基甲酸酯类、乙酰胺类、三嗪类、二硝基苯胺、甘油醚类、哒嗪酮、尿嘧啶、苯氧羧酸类(phenoxys)、尿素和苯甲酸；除草安全剂，如苯并恶嗪、二苯甲基衍生物、N，N-二烯丙基二氯乙酰胺、各种二卤代酰基、恶唑烷基以及噻唑烷基化合物、乙酮、萘酐化合物和肟衍生物。
[0053] 次要的农业上有益的成分，可以进一步包含肥料和/或能促进种子发芽、和/或促进植物生长、和/或改善植物健康状况的成分。此外，所述的次要的农业上有益的成分可以包含各种生物防治试剂，如其他自然产生或重组的细菌和真菌，选自根瘤菌属、芽孢杆菌属、假单胞菌属、沙雷氏菌属、木霉菌属、球囊菌属、粘帚霉菌属和菌根真菌属。这些化学或生物试剂对于防治线虫和/或其它害虫是有益的。
[0054] 根据以上教导，本领域普通技术人员将会在所述的组合物和/或处理方法中引入各种成分，如惰性或无活性成分，杀虫剂，或肥料。此外，本领域普通技术人员将会典型地不包括那些会显著地危害巴氏杆菌孢子的存活、生长、和/或繁殖，降低巴氏杆菌孢子附着到线虫、侵染线虫、在线虫中生长、和/或杀死线虫的能力，和/或抑制种子发芽、植物生长、果实发育和/或植物繁殖的组分。植物种类
[0056] 线虫种类
[0057] 本发明所述的物质和方法对于杀死、防治、和/或侵染线虫，延迟线虫的生长和繁殖，减少线虫数量，和/或减少或阻止由植物病原线虫、植物寄生线虫和其他土栖线虫(包括但不限于花生根结线虫(Meloidogyne arenaria)、短体线虫(Pratylenchus brachyurus)、肾 形 线 虫 (Rotylenchulus reniformis)、刺 线 虫 (Belonolaimus longicaudatus)，大豆胞囊线虫(Heterodera glycines)和纽带线虫(Hoplolaimus galeatus))对植物造成的损害是有用的。
[0058] 附着和传递的方法
[0059] 本发明同样提供了将巴氏杆菌组合物附着到植物种子上以及将种子传递到线虫侵染位置的方法。
[0060] 优选的，附着方法不会显著危害到巴氏杆菌孢子的存活、生长、和/或繁殖，不会显著降低巴氏杆菌孢子附着到线虫、侵染线虫、在线虫体内生长、和/或杀死线虫的能力。优选地，附着和传递方法几乎不会产生植物毒性，如影响种子发芽、植物组织形成、植物高度、植物繁殖和/或果实生长。
[0061] 在某些实施方式中，巴氏杆菌组合物通过包衣、喷雾到种子上、与种子接触，或与种子混合的方式附着于种子上。在一种实施方式中，巴氏杆菌组合物通过包衣至少部分种子表面面积的方式附着于种子上。
[0062] 所述的巴氏杆菌组合物可以使用多种技术附着于种子上，比如流化床技术、滚筒碾碎机方法，以及喷动床技术。进一步，所述的组合物可以使用一种机器，例如可以使用机器装置将所述的巴氏杆菌制剂附着于种子上，所述的机器装置优选为rotostatic种子处理机(rotostatic seed treater)或鼓式包衣机。种子可以在包覆前先测量大小。包覆后，种子典型地干燥然后转移到尺寸测量机上测量尺寸，这些为本领域普通技术人员所熟知。
[0063] 在一种实施方式中，所述的巴氏杆菌组合物先和各种农业上有益的成分(例如杀虫剂、除草剂、杀菌剂、肥料和/或各种生物防治试剂)混合；然后将混合物传递给种子。在另一种实施方式中，所述的巴氏杆菌组合物与各种农业上有益的成分相继传递给种子。在另一种实施方式中，所述的巴氏杆菌组合物与各种农业上有益的成分同时传递给种子，但是传递至种子表面的不同区域。
[0064] 此处使用的种子包衣方法包括任何将材料添加到种子上的方法，所述的方法包含但不限于：薄膜包衣，将单层或多层材料沉积在种子表面面积的全部或部分区域，将连续多层材料施用到种子表面面积的全部或部分区域，将材料同时或相继地施用到种子上以覆盖种子表面面积的整体或部分区域。
[0065] 在一种具体的实施方式中，所述的制剂可以通过多种方法包衣到种子上，所述的方法包括但不限于：薄膜包衣，在一个容器中(如一个瓶子或袋子)将种子和制剂混合，机械涂覆，搅拌，喷雾和沉浸。各种活性的或惰性的材料可以用于包衣，比如常规的薄膜包衣材料包括但不限于水溶性薄膜包衣材料，如SEPIRET(Seppic，Inc.，Fairfield，N.J.)和Opacoat(Berwind Pharm.Services，Westpoint，Pa.)。
[0066] 各种用于生成包衣种子的方法进一步包括那些在，例如US 5918413、US 5891246、US 5554445、US 5389399、US 5107787、US 5080925、US 4759945、US 4465017、US 5939356、US 5882713、US 5876739、US 5849320、US 5834447、US 5791084、US 5661103、US 5622003、US 5580544、US 5328942、US 5300127、US 4735015、US 4634587、US 4383391、US 4372080、US 4339456、US 4272417和US 4245432中描述的方法。
[0067] 在另一种具体的实施方式中，巴氏杆菌组合物通过固体基质引发技术传递至种子。简单地讲，均匀分布在一固体基质中的巴氏杆菌孢子与种子接触足够长的时间，直到种子的整体表面被巴氏杆菌孢子包覆。处理过的种子可以与固体基质分离以用于进一步的储存或使用；或者处理过的种子可以与固体基质一起储存或种植。
[0068] 适于作为固体基质使用的材料包括聚丙烯酰胺、淀粉、粘土、硅土、矾土、土壤、沙子、聚脲、聚丙烯酸酯、或任何一种能够可控地吸附和释放所述组合物到种子上的材料。优选地，所述的固体基质能够可控地释放所述组合物。期望的释放速度可以变化，取决于植物种类、巴氏杆菌种类、线虫种类和其他因素。优选地，所述的巴氏杆菌组合物可以缓慢地从处理过的种子中释放，比如通过扩散或迁移穿过固体基质释放到周围的介质或土壤中。
[0069] 用巴氏杆菌组合物包衣的种子可以进一步在包衣之上包覆另外一层薄膜来保护巴氏杆菌包衣。例如，用于在包衣之上再包覆一层薄膜的技术包括但不限于流化床技术和鼓式薄膜包衣技术。
[0070] 在一种进一步的实施方式中，传递方法包括一个另外的热处理步骤。所述的热处理步骤将会增强巴氏杆菌组合物的杀线虫效果。在一种实施方式中，巴氏杆菌孢子悬浮液先加热，再与固体载体(比如颗粒)混合。在另一种实施方式中，巴氏杆菌-颗粒混合物被加热。
[0071] 此外，所述的方法可以包含一个将粘附剂施用到种子上的步骤，该步骤在巴氏杆菌处理前或与巴氏杆菌处理同时进行。在一种实施方式中，种子先包覆一层粘附剂，然后用巴氏杆菌混合物处理。合适的粘附剂包括但不限于聚醋酸乙烯酯、聚醋酸乙烯酯共聚物、聚乙烯醇、聚乙烯醇共聚物、甲基纤维素、羟甲基纤维素、羟甲基丙基纤维素糊精、藻酸盐、糖浆(molasse)、聚乙烯吡咯烷酮、多糖(polysaccharides)、蛋白质、脂肪、油类、多糖(polysaccharide)、阿拉伯胶、明胶、糖浆(syrups)，以及上述物质的任意组合。
[0072] 在一种具体的实施方式中，所述的方法包括a)将巴氏杆菌孢子悬浮液和微粒载体混合，再将混合物充分干燥，直到形成孢子/颗粒微粒(spore/granule particles)；b)种子用粘附剂包衣；以及c)使种子与孢子/颗粒微粒接触，直至种子被杀线虫有效量的巴氏杆菌孢子包衣。
[0073] 在进一步的实施方式中，用所述的巴氏杆菌组合物处理过的种子可以经受进一步的处理步骤，例如干燥。有利地，巴氏杆菌孢子在干燥过程中不会受到损害。因此，用所述的组合物处理过的种子可以在室温下长时间存储。所述处理过的种子的保存期限长，在种植时间安排上允许有变化。有利地，在运输、播种期间或一旦与种子置于土壤中，巴氏杆菌孢子的存活率要比细菌营养体高得多。
[0074] 尽管种子处理方法可以应用于任何生理状态的种子，但是优选种子足够地坚硬，以便处理过程不会或几乎不会对种子产生损害。典型地，从地里收割植物；从植物上摘取种子；并且将种子与植物空杆分离。种子优选地在一定程度上是生物稳定的，以致处理方法不会导致对种子的损害。在一种实施方式中，例如，处理方法可以应用于已经被收割、清理并干燥至水分含量在约15wt％以下的玉米种子。
[0075] 在一种可供替代的实施方式中，所述的种子可以是，在用巴氏杆菌组合物进行处理前或处理期间已经被干燥，再被用水和/或其他材料预处理，然后被再次干燥的种子。所述的处理方法可以在从种子收获到播种的任何时段应用到种子上。本发明所述的术语“未播种的种子”包括从收获至播种之间的任何时期的任何种子。
[0076] 下面是实施例，用以说明实施本发明的步骤。这些实施例不应被理解为是限制性的。所有的百分比是基于重量并且所有的溶剂混合比例是基于体积，除非另有说明。
[0077] 实施例1——巴氏杆菌种子包衣的制备
[0078] 这个实施例说明用巴氏杆菌孢子包衣种子的方法。将巴氏杆菌孢子悬浮在7
10mmol/L磷酸盐缓冲液中并调整至约2x10 个孢子/ml悬浮液。在一个皮氏培养皿中将
5ml孢子悬浮液与2g AXIS 硅藻土颗粒混合，得到巴氏杆菌-颗粒混合物；或也可以在一个皮氏培养皿中将3ml孢子悬浮液与2g绿色度PROFILE 粘土颗粒混合，得到巴氏杆菌-颗粒混合物。
10mmol/L磷酸盐缓冲液中并调整至约2x10 个孢子/ml悬浮液。在一个皮氏培养皿中将
5ml孢子悬浮液与2g AXIS 硅藻土颗粒混合，得到巴氏杆菌-颗粒混合物；或也可以在一个皮氏培养皿中将3ml孢子悬浮液与2g绿色度PROFILE 粘土颗粒混合，得到巴氏杆菌-颗粒混合物。
[0079] 将巴氏杆菌-颗粒混合物在灯光照射下干燥。然后，四季豆种子用聚醋酸乙烯酯处理，然后在平盘中干燥5分钟。将上述处理过的种子用巴氏杆菌-颗粒混合物完全包衣。
[0080] 上述巴氏杆菌包衣种子适合立即使用或长期储存。
[0081] 实施例2-巴氏杆菌包覆的种子控制线虫的效应
[0082] 为评估巴氏杆菌包衣种子防治线虫的效果，进行温室盆栽试验。
[0083] 分别将2.2g Axis草皮添加物(Axis turf supplement)和2.2g Profile草皮添7
加物(Profile turf supplement)放置在2个皮氏培养皿中。用吸液管吸取浓度为1.8x10个孢子/ml的穿刺巴氏杆菌孢子悬浮液加入每个皮氏培养皿中，直到使材料湿透。Axis草皮添加物湿透需要5ml悬浮液，Profile草皮添加物湿透需要4ml悬浮液。将培养皿置于卤素灯下干燥。将四季豆种子(Ferry-Morse Blue Lake 274)称重，测定其平均重量为
413.3mg。在烧杯中加入艾尔默透明培养胶(Elmer’s Clear School Glue)，用镊子手动地将单个的种子浸入胶中，从而在种子上包衣聚醋酸乙烯酯粘着剂。种子在皮氏培养皿中干燥5分钟，然后分别置于孢子处理过的Axis颗粒和Profile颗粒中翻转，直到种子被完全地包衣。控制组种子用未经处理的Axis颗粒和Profile颗粒按照上述方法进行包覆。
加物(Profile turf supplement)放置在2个皮氏培养皿中。用吸液管吸取浓度为1.8x10个孢子/ml的穿刺巴氏杆菌孢子悬浮液加入每个皮氏培养皿中，直到使材料湿透。Axis草皮添加物湿透需要5ml悬浮液，Profile草皮添加物湿透需要4ml悬浮液。将培养皿置于卤素灯下干燥。将四季豆种子(Ferry-Morse Blue Lake 274)称重，测定其平均重量为
413.3mg。在烧杯中加入艾尔默透明培养胶(Elmer’s Clear School Glue)，用镊子手动地将单个的种子浸入胶中，从而在种子上包衣聚醋酸乙烯酯粘着剂。种子在皮氏培养皿中干燥5分钟，然后分别置于孢子处理过的Axis颗粒和Profile颗粒中翻转，直到种子被完全地包衣。控制组种子用未经处理的Axis颗粒和Profile颗粒按照上述方法进行包覆。
[0084] 然后，将上述包衣种子暴露在，列举如下，野外采集的根结线虫中21天。在控制组，未处理的四季豆种子在相同的条件下暴露在线虫中。
[0085] 在聚苯乙烯塑料杯中加入1kg土壤。通过吸取线虫悬浮液加入到土壤中并且所达深度为土壤表面以下2英寸，在每个塑料杯中接种1500-2000条根结线虫幼虫(花生根结线虫Meloidogyne arenaria)。随之生成的孔被填满，然后每个杯子种植1粒四季豆种子，种子种植在土壤表面0.5英寸以下的深度。分别种植5粒试验组种子(含孢子)和5粒控制组种子。将塑料杯每天用50ml自来水分别浇灌，并保持在温室中直到温度读数指示线虫已经达到500条/天(degree-days)。
[0086] 然后采集土壤样本用以线虫计数，并将植物和根系从土壤中移出。以1-10等级来评估植物健康和活力状况，1为最不健康，10为最健康。附着百分比通过记录土壤样本中的附着有一个或多个巴氏杆菌孢子的线虫幼虫的数量并计算百分比而进行评估。线虫卵通过收集根系的卵块并用显微镜计数。
[0087] 结果如图1至图3所示，与控制组相比，表明种子的巴氏杆菌包衣提升了种子出苗、植物高度、以及植物生长。
[0089] 本发明使用的术语“一”和“所述”以及类似的指代应被理解为同时涵盖单数形式和复数形式，除非本发明另有说明或与上下文明显矛盾。
[0090] 此处数值范围的叙述，只是作为表示落在该范围内的每个单独数值的一种简洁方法，本发明另有说明的除外，并且每个单独的数值被纳入说明书中，如同每个单独的数值被单独列举在说明书中一样。
[0091] 此处提供的任何一个和所有的实施例，或示例性的语句(如，“例如”)的使用，只是为了更好阐述本发明而非用以对本发明的保护范围做任何限制，除非另有说明。说明书中的任何语句都不应被理解为是指示任何一种元素对于本发明的实施是必不可少，除非有明确说明。
[0092] 此处本发明使用了术语例如“包含”、“具有”、“包括”或“含有”一种或多种元素的任何方面或任何一种实施方式的描述，是用以对本发明与之类似的“由那种特别的元素或那些元素组成”、“主要由那种特别的元素或那些元素组成”或“本质上包含那种特别的元素或那些元素”的方面或实施方式提供支持，除非另有说明或上下文有明显矛盾(例如，一种组合物此处被描述成包含一种特别的元素需要理解成也描述一种由那种元素组成的组合物，除非另有说明或上下文有明确矛盾)。
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