技术领域
[0001] 本
发明涉及
植物有效成分精制加工技术领域，具体是一种红花羊
蹄甲花原花青素的制备方法。
背景技术
[0002] 原花青素（proantho Cyanidin，PC）简称PC，是植物中广泛存在的一大类多酚化合物的总称，具有极强的抗
氧化、消除自由基的作用，可有效消除超氧阴离子自由基和羟基自由基，也参与
磷酸、花生四烯酸的代谢和
蛋白质磷
酸化，保护脂质不发生过氧化损伤；是强有
力的金属螯合剂，可螯合
金属离子，在体内形成惰性化合物；保护和稳定维生素C，有助于维生素C的吸收和利用。原花青素分布广泛，存在于许多植物的皮、壳、籽、核、花、叶中，种类丰富。是目前国际上公认的清除人体内自由基最有效的天然抗
氧化剂，一般为红棕色粉末，溶于
水和大多
有机溶剂。
[0003] 红花羊蹄甲（Bauhinia blakeana Dunn），
别名洋紫荆、玲甲花，为豆科、羊蹄甲属乔木或直立灌木植物喜阳光和温暖、潮湿环境，不耐寒。树皮厚，近光滑，灰色至暗褐色。主要分布在中国南部，中南半岛、印度、斯里兰卡也有分布，是很好的园林绿化树种，常作行道树植路边。羊蹄甲以根、树皮，叶及花入药，根、树皮全年可采，叶及花夏季采，晒干，具有健脾燥湿、消炎
止血等功效。
[0004] 甲醇提取的红花羊蹄甲花原花青素含有蛋白质、黄
酮类化合物、多糖等杂质，可利用大孔
树脂进行
吸附纯化，提高红花羊蹄甲花原花青素的含量和纯度。本发明采取
超声波辅助甲醇提取法对红花羊蹄甲花原花青素进行提取，利用大孔树脂AB-8进行吸附纯化，对红花羊蹄甲花原花青素进行了清除DPPH自由基、羟自由基、超氧阴离子自由基的测定。
发明内容
[0005] 本发明的目的在于提供一种红花羊蹄甲花原花青素的制备方法，该原花青素具有良好的DPPH自由基、羟自由基、超氧阴离子自由基清除能力。
[0006] 为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：一种红花羊蹄甲花抗氧化原花青素的制备方法，包括以下步骤：（1）红花羊蹄甲花花粉制备；（2）红花羊蹄甲花原花青素提取；（3）红花羊蹄甲花原花青素的纯化；（4）红花羊蹄甲花原花青素的
冷冻干燥。
[0007] 所述步骤（1）中红花羊蹄甲花花粉的具体制备方法为：将红花羊蹄甲花挑选去除杂物，于65℃下干燥12小时，然后经高速
粉碎机粉碎，过80目筛，装袋备用。
[0008] 所述步骤（2）中红花羊蹄甲花原花青素提取的具体方法为：称取红花羊蹄甲花干燥粉，按照
质量体积比1:10的比例加入甲醇，于超声功率480w超声辅助提取20分钟，再50℃恒温浸提50分钟，4000r/min离心20min，取上清液即为红花羊蹄甲花原花青素提取液。
[0009] 所述步骤（3）红花羊蹄甲花原花青素的分离纯化的具体方法为：将足量预处理过的AB-8大孔树脂和红花羊蹄甲花原花青素提取液混合均匀，振荡吸附24小时，滤掉液体的AB-8大孔树脂分别用浓度为20%v/v、50%v/v、100%v/v的
乙醇依次进行洗脱。获得纯化的原花青素（proantho Cyanidin，PC）简称PC组分PC1、PC2、PC3。
[0010] 本发明的优点在于：本发明采用超声辅助甲醇提取红花羊蹄甲花原花青素，选取AB-8大孔树脂对原花青素进行吸附，采用乙醇等梯度洗脱对原花青素进行纯化，获得的原花青素纯度高，安全性高。
对获得的红花羊蹄甲花原花青素进行了清除DPPH自由基、羟自由基、超氧阴离子自由基的测定。
具体实施方式
[0011] 下面根据优选
实施例详细描述本发明，本发明的目的和效果将变得更加明白。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
[0012] 实施例 11将红花羊蹄甲花挑选去除杂物，于65℃下干燥12小时，然后经高速粉碎机粉碎，过80目筛，装袋备用。
[0013] 1.1红花羊蹄甲花花粉水分含量的测定称量1.1124g干燥红花羊蹄甲花粉，烘至恒重，测得1.0515g。计算红花羊蹄甲花花粉水分含量值为5.47%。
[0014] 2称取红花羊蹄甲花干燥粉，按照质量体积比1:10的比例加入甲醇，于超声功率480w超声辅助提取20分钟，再50℃恒温浸提50分钟，4000r/min离心20min，取上清液即为红花羊蹄甲花原花青素提取液。
[0015] 2.1原花青素标准曲线的制作取原花青素标准品10.000mg，用甲醇溶解，定容至25ml。准备6支10ml比色管，分别加入原花青素标准品溶液0.1、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5ml，再加入4wt%香草
醛甲醇溶液3ml和浓
盐酸1.5ml，用甲醇定容摇匀，显色20min后，以无水乙醇做参比，在
波长为518nm处测定相应吸光值。以原花青素标准品的量为横坐标，以对应的吸光值为纵坐标，制作标准曲线。
[0016] 曲线方程：y = 0.7310x – 0.0014，R2 = 0.99862.2红花羊蹄甲花原花青素含量的测定
取样液1ml加入10ml比色管，再加入4wt%香草醛甲醇溶液3ml和浓盐酸1.5ml，摇匀，用甲醇定容，以无水乙醇做参比，在波长为518nm处测定相应吸光值，代入标准曲线算出红花羊蹄甲花原花青素的含量为6.452mg/g。
[0017] 采用静态吸附法，将用常规方法（乙醇浸泡24h→用乙醇洗至流出液与水1：5不浑浊→用水洗至无醇味→5%HCl浸泡2-4h→水洗至中性→2%NaOH浸泡2-4h→水洗至中性）预处理过的AB-8大孔树脂与红花羊蹄甲花原花青素提取液混合均匀，使提取液刚好浸没树脂，振荡吸附24小时，滤掉液体的AB-8大孔树脂分别用浓度为20%、50%、100%的乙醇依次进行洗脱。获得纯化的原花青素（proantho Cyanidin，PC）简称PC组分PC1、PC2、PC3。分别对PC1、PC2、PC3三个组分冷冻干燥。
[0018] 实施例21红花羊蹄甲花原花青素及纯化组分PC1、PC2、PC3进行清除DPPH自由基
样品组：在试管中加入2mL 0.2mmol/L DPPH溶液，3mL的不同浓度的红花羊蹄甲花提取液，充分混匀，暗处放置30min后，以95%的乙醇作参比在517nm波长处测定吸光值Ai。
[0019] 对照组：在试管中加入2mL 95%的乙醇，3mL的不同浓度红花羊蹄甲花提取液，以相同条件处理后测定其吸光值 Ax。
[0020] 空白组：在试管中加入2mL 0.2mmol/L DPPH溶液，3mL 95%的乙醇，以相同条件处理后测定其吸光值 Ao。
[0021] 2红花羊蹄甲花原花青素及纯化组分PC1、PC2、PC3进行清除羟自由基在试管中加入1ml蒸馏水，1mL 0.75mmol/L FeSO4溶液，1ml 0.75mmol/L 邻二氮菲，2mL 0.2mol/L pH7.4的PBS溶液，混匀，再加入1ml双氧水，37℃水浴60min，冷却至室温，以蒸馏水作为参比，在536nm波长下测其吸光度值Ap。
[0022] 在试管中加入1ml蒸馏水，1mL 0.75mmol/L FeSO4溶液，1ml 0.75mmol/L 邻二氮菲，2mL 0.2mol/L pH7.4的PBS溶液，混匀，再加入1ml蒸馏水，37℃水浴60min，冷却至室温，以蒸馏水作为参比，在536nm波长下测其吸光度值Ab。
[0023] 在试管中加入1ml不同浓度的红花羊蹄甲花提取液，1mL 0.75mmol/L FeSO4溶液，1ml 0.75mmol/L 邻二氮菲，2mL 0.2mol/L pH7.4的PBS溶液，混匀，再加入1ml双氧水，37℃水浴60min，冷却至室温，以蒸馏水作为参比，在536nm波长下测其吸光度值As。
[0024] 3红花羊蹄甲花原花青素及纯化组分PC1、PC2、PC3进行清除超氧阴离子自由基调零组：在试管中加入2.4ml的PBS溶液，1ml不同浓度的红花羊蹄甲花提取液，0.6ml去离子水，在40W日光灯箱中照射20min。
[0025] 空白组：在试管中加入1.5ml，0.05mol/L pH7.8的PBS溶液，0.3ml，6.4mol/L的Met溶液，0.3ml 0.03mmol/L的核黄素溶液，1.6ml去离子水，在40W日光灯箱中照射20min，以调零组做参比在560nm波长处测定吸光值Ao。
[0026] 样品组：在试管中加入1.5ml，0.05mol/L pH7.8的PBS溶液，0.3ml，6.4mol/L的Met溶液，0.3ml，0.03mmol/L的核黄素溶液，1ml不同浓度的红花羊蹄甲花提取液，0.6ml去离子水，在40W日光灯箱中照射20min，以调零组做参比在560nm波长处测定吸光值Ai。
[0027] 清除率（%）=（Ao—Ai）/ Ao×100%对获得的红花羊蹄甲花原花青素及纯化组分PC1、PC2、PC3进行清除DPPH自由基、羟自由基、超氧阴离子自由基的测定结果以IC50值（μg/mL）表示见表1。
[0028] 表1清除DPPH自由基、羟自由基、超氧阴离子自由基*在所配制样品浓度下清除率不到50%。
[0029] 以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明
申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。
