用于鉴别中华穿山甲和家猪蹄甲炮制甲片的DNA微型条形码引物
阅读：247发布：2020-05-15
专利汇可以提供用于鉴别中华穿山甲和家猪蹄甲炮制甲片的DNA微型条形码引物专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 属于分子 生物 学领域，具体涉及用于 鉴别 中华穿山甲和家猪 蹄 甲炮制甲片的DNA微型 条形码 引物及其应用。本发明主要是将该DNA微型条形码引物用于中华穿山甲和家猪 蹄甲 炮制甲片的鉴别过程，该过程主要包括DNA微型条形码引物的设计，甲片基因组DNA的提取，DNA微型条形码基因 片段 的扩增与测序，对测序结果在NCBI中进行BLAST比对，同时构建基于DNA微型条形码的NJ系统树。本发明提供的鉴别中华穿山甲和家猪蹄甲炮制甲片的DNA微型条形码引物扩增效率高，特异性强， 质量 好，测序成功率高，能够准确鉴别中华穿山甲和家猪蹄甲炮制甲片。，下面是用于鉴别中华穿山甲和家猪蹄甲炮制甲片的DNA微型条形码引物专利的具体信息内容。
1.用于鉴别中华穿山甲和家猪蹄甲炮制甲片的DNA微型条形码引物，其特征在于，包括特异性的COI-L 191引物对和特异性的COI-L 197引物对，其中，特异性COI-L 191引物对包括COI-L191-F上游引物和COI-L191-R下游引物，所述COI-L 197引物对包括COI-L197-F上游引物和COI-L197-R下游引物，上述引物的核苷酸序列分别为：
COI-L191-F上游引物：5'-AAAAAGGTTGTRTTYAGGTTGCG-3'，
COI-L191-R下游引物：5'-AAATTAATAGCCCCTAGRATTGA-3'；
COI-L197-F上游引物：5'-AAATTAATAGCCCCTAGRATTGA-3'，
COI-L197-R下游引物：5'-AGTAGTCAGAAACTTATGTT-3'。
2.一种如权利要求1所述的用于鉴别中华穿山甲和家猪蹄甲炮制甲片的DNA微型条形码引物在鉴别中华穿山甲和家猪蹄甲炮制甲片中的应用，其特征在于，包括以下步骤：
S1、基于中华穿山甲和家猪的COI基因，设计特异性微型引物，得特异性COI-L191引物对，COI-L 197引物对；
S2、提取中华穿山甲和家猪蹄甲炮制甲片样品DNA，测定DNA的浓度与纯度，得高质量的全基因组DNA；
S3、以步骤S2所得高质量的全基因组DNA为模板，利用步骤S1所得特异性COI-L 191引物对或COI-L 197引物对，进行PCR扩增，得COI基因片段；
S4、将步骤S3所得COI基因片段利用琼脂糖凝胶电泳检测，然后进行双向测序，将测序结果利用Blast和NJ系统树比对，即可。
3.如权利要求2所述的DNA微型条形码引物在鉴别中华穿山甲和家猪蹄甲炮制甲片中的应用，其特征在于：所述步骤S2中提取中华穿山甲和家猪蹄甲炮制甲片样品DNA的具体操作为：
(1)取30-100mg炮制甲片样品，用体积分数为75％的乙醇水溶液除去表面杂质，剪碎后加入炮制甲片样品体积6倍的裂解缓冲液，得裂解液样品；
(2)向步骤(1)所得裂解液样品中加入10-30mg/mL蛋白酶K溶液，混匀，于50℃-60℃条件下放置2-4h，得混合液I；
(3)向步骤(2)所得混合液I中加入200μL体积分数为0.5％-1.0％的十二烷基硫酸钠水溶液，混匀，于50℃-75℃条件下放置30-60min，加入200μL无水乙醇，充分振荡混匀10-30s，得带絮状沉淀的混合液；
(4)将步骤(3)所得带絮状沉淀的混合液加入硅胶膜吸附柱中，离心20-40s后弃掉废液，向吸附柱中加入500μL缓冲液，离心20-40s，弃掉废液，向吸附柱中加入600μL体积分数为70％的乙醇水溶液，离心20-40s后弃掉废液，再次离心1-4min后弃掉废液，静置1-5min，得絮状沉淀；
(5)向步骤(4)所得絮状沉淀中加入50-200μL 10-200mM Tris-HCl缓冲液，室温放置1-
5min后离心1-4min，即得。
4.如权利要求2所述的DNA微型条形码引物在鉴别中华穿山甲和家猪蹄甲炮制甲片中的应用，其特征在于，所述步骤(1)中的裂解缓冲液由10-200mM Tris-HCl和25-100mM EDTA组成。
5.如权利要求2所述的DNA微型条形码引物在鉴别中华穿山甲和家猪蹄甲炮制甲片中的应用，其特征在于，所述步骤(4)，步骤(5)中的离心条件为10000rpm-14000rpm。
6.如权利要求2所述的DNA微型条形码引物在鉴别中华穿山甲和家猪蹄甲炮制甲片中的应用，其特征在于：所述步骤S2中测定DNA浓度是采用紫外分光光度计或酶标仪检测DNA溶液在260nm处的吸光值；所述测定DNA纯度是采用紫外分光光度计或酶标仪检测DNA溶液在260nm和280nm处的吸光值。
7.如权利要求书2所述的DNA微型条形码引物在鉴别中华穿山甲和家猪蹄甲炮制甲片中的应用，其特征在于：所述步骤S3中进行PCR扩增时，PCR反应具体条件如下：共配制50μL的PCR体系，其中PCR mix预混液为35-45μL，上下游引物各1-3μL，DNA模板2-5μL，加蒸馏水定容至50μL；PCR扩增程序为98℃预变性1-3min；98℃变性5-20s，55℃退火5-20s，72℃延伸
5-10s，25-35个循环；72℃延伸0.5-2min，-20℃冻存。
8.如权利要求2所述的DNA微型条形码引物在鉴别中华穿山甲和家猪蹄甲炮制甲片中的应用，其特征在于：所述步骤S4中所述的NJ系统树是采用MEGA软件，通过ClustalW或Muscle算法对序列进行比对后，采用K2P模型和自展检验法来构建完成。
用于鉴别中华穿山甲和家猪蹄甲炮制甲片的DNA微型条形码
引物
[0001] 方法领域
背景技术
[0003] 穿山甲片为鲮鲤科动物穿山甲(Manis pentadactyla)的鳞甲，是一种名贵的动物药材，可用于经闭癓瘕、乳汁不通、痈肿疮毒、风湿痹痛、中风瘫痪、麻木拘挛。其中中华穿山甲是我国药典规定的中药穿山甲甲片的唯一正品来源。然而，穿山甲这一古老的哺乳动物，因遭到大肆非法捕猎陷入了濒临灭绝的地步，已被列入我国药用濒危野生动物之一。因中华穿山甲资源极其稀少，而且存量甲片价格昂贵，一些不法商贩往往用家猪蹄甲(Sus scrofa domestica)炮制甲片来冒充中华穿山甲炮制甲片。这两种甲片在炮制后的形态、色泽、气味等方面都较为相似，难以通过常规手段区分，从而影响了药材质量及用药安全，给药材市场监管带来了困扰。
[0004] DNA条形码技术是通过对生物基因组内一段标准DNA片段进行分析比较来实现物种识别的一种分子鉴定技术，其在动物分类与鉴定中的发展与应用最为迅速与广泛，研究也较为系统和深入。线粒体细胞色素C氧化酶亚基I基因(cytochrome oxidase subunit I，COI)在绝大多数动物物种中具有序列特异性，该序列以每百万年2％的进化速率不断演化，提供了足够的可识别变异信号位点，其中长度约为650bp的片段可作为动物物种鉴定的标准条形码序列。
[0005] 作为物种鉴定分类的一种新方法，DNA条形码技术有着独特的优势，但也存在一定的局限性。例如，对于经过高温炮制的样本，由于DNA发生降解，采用标准条形码引物很可能无法扩增出标准长度的COI基因片段，也就无法鉴定样本的物种。然而，采用微型条形码技术可以解决这一难题。DNA微型条形码是指长度一般约为200bp的DNA序列，与DNA标准条形码(一般超过500bp)相比，DNA微型条形码更容易从DNA降解样本中扩增获得。
[0006] 中国专利申请CN 108103217 A公开了一种快速鉴别食腺嘌呤节孢酵母菌株的DNA条形码引物、DNA条形码、试剂盒、方法和应用，该方法包括提取全基因组DNA，设计引物，进行PCR扩增，对扩增结果进行纯化，测序，将测序结果进行拼接，比对等，该方法可以快速鉴别普洱茶发酵菌株食腺嘌呤节孢酵母TMCC 70007，但是，该方法共涉及四条DNA条形码引物，这在一定程度上增加了试验操作的难度，而且扩增后还需要将四段序列进行拼接，操作过程复杂，也增加了鉴别过程中出错的概率，而且，该方法只适用于鉴别真菌。
[0007] 因此，现有技术中利用DNA标准条形码鉴别炮制样品时普遍存在DNA降解问题，而且鉴别过程中操作复杂，出错概率提高，因此应用范围窄，成本高。
发明内容
[0008] 本发明的目的是针对现有技术中存在的缺点，提供一种中华穿山甲和家猪蹄甲炮制甲片的DNA微型条形码鉴别方法，该方法主要针对难以获得全长DNA序列的炮制类动物中药材，操作过程简单，不易出错，能够扩大DNA条形码技术的应用范围。
[0009] 为了达到上述目的，本发明采用的技术方案为：
[0010] 用于鉴别中华穿山甲和家猪蹄甲炮制甲片的DNA微型条形码引物，其特征在于，包括特异性的COI-L 191引物对和特异性的COI-L 197引物对，其中，特异性COI-L 191引物对包括COI-L191-F上游引物和COI-L191-R下游引物，所述COI-L 197引物对包括COI-L197-F上游引物和COI-L197-R下游引物，上述引物的核苷酸序列分别为：
[0011] COI-L191-F上游引物：5'-AAAAAGGTTGTRTTYAGGTTGCG-3'，
[0012] COI-L191-R下游引物：5'-AAATTAATAGCCCCTAGRATTGA-3'；
[0013] COI-L197-F上游引物：5'-AAATTAATAGCCCCTAGRATTGA-3'，
[0014] COI-L197-R下游引物：5'-AGTAGTCAGAAACTTATGTT-3'。
[0015] 一种鉴别中华穿山甲和家猪蹄甲炮制甲片的DNA微型条形码引物在鉴别中华穿山甲和家猪蹄甲炮制甲片中的应用，包括以下步骤：
[0016] S1、基于中华穿山甲和家猪的COI基因，设计特异性微型引物，得特异性COI-L 191引物对，COI-L 197引物对；
[0017] S2、提取中华穿山甲和家猪蹄甲炮制甲片样品DNA，测定DNA的浓度与纯度，得高质量的全基因组DNA；
[0018] S3、以步骤S2所得高质量的全基因组DNA为模板，利用步骤S1所得特异性COI-L 191引物对或COI-L 197引物对，进行PCR扩增，得COI基因片段；
[0019] S4、将步骤S3所得COI基因片段利用琼脂糖凝胶电泳检测，然后进行双向测序，将测序结果利用Blast和NJ系统树比对，即可。
[0020] 进一步地，所述步骤S1所得特异性COI-L 191引物对包括COI-L191-F上游引物和COI-L191-R下游引物，所述COI-L 197引物对包括COI-L197-F上游引物和COI-L197-R下游引物，上述引物的核苷酸序列分别为：
[0021] COI-L191-F上游引物：5'-AAAAAGGTTGTRTTYAGGTTGCG-3'，
[0022] COI-L191-R下游引物：5'-AAATTAATAGCCCCTAGRATTGA-3'；
[0023] COI-L197-F上游引物：5'-AAATTAATAGCCCCTAGRATTGA-3'，
[0024] COI-L197-R下游引物：5'-AGTAGTCAGAAACTTATGTT-3'。
[0025] 进一步地，所述步骤S2中提取中华穿山甲和家猪蹄甲炮制甲片样品DNA的具体操作为：
[0027] (2)向步骤(1)所得裂解液样品中加入10-30mg/mL蛋白酶K溶液，混匀，于50℃-60℃条件下放置2-4h，得混合液I；
[0028] (3)向步骤(2)所得混合液I中加入200μL体积分数为0.5％-1.0％的十二烷基硫酸钠水溶液，混匀，于50℃-75℃条件下放置30-60min，加入200μL无水乙醇，充分振荡混匀10-30s，得带絮状沉淀的混合液；
[0029] (4)将步骤(3)所得带絮状沉淀的混合液加入硅胶膜吸附柱中，离心20-40s后弃掉废液，向吸附柱中加入500μL缓冲液，离心20-40s，弃掉废液，向吸附柱中加入600μL体积分数为70％的乙醇水溶液，离心20-40s后弃掉废液，再次离心1-4min后弃掉废液，静置1-5min，得絮状沉淀；
[0030] (5)向步骤(4)所得絮状沉淀中加入50-200μL 10-200mM Tris-HCl缓冲液，室温放置1-5min后离心1-4min，即得。
[0031] 进一步地，所述步骤(1)中的裂解缓冲液由10-200mM Tris-HCl和25-100mM EDTA组成。
[0032] 进一步地，所述步骤(4)，步骤(5)中的离心条件为10000rpm-14000rpm。
[0033] 进一步地，所述步骤S2中测定DNA浓度是采用紫外分光光度计或酶标仪检测DNA溶液在260nm处的吸光值；所述测定DNA纯度是采用紫外分光光度计或酶标仪检测DNA溶液在260nm和280nm处的吸光值。
[0034] 进一步地，所述步骤S3中进行PCR扩增时，PCR反应具体条件如下：共配制50μL的PCR体系，其中PCR mix预混液为35-45μL，上下游引物各1-3μL，DNA模板2-5μL，加蒸馏水定容至50μL；PCR扩增程序为98℃预变性1-3min；98℃变性5-20s，55℃退火5-20s，72℃延伸5-10s，25-35个循环；72℃延伸0.5-2min，-20℃冻存。
[0036] 与现有技术相比，本发明提供的用于鉴别中华穿山甲和家猪蹄甲炮制甲片的DNA微型条形码引物具有如下优点：
[0037] (1)本发明提供的鉴别中华穿山甲和家猪蹄甲炮制甲片的DNA微型条形码引物，是基于一种微型DNA条形码序列差异，可以实现对中华穿山甲和家猪蹄甲炮制甲片的准确鉴别，弥补了炮制类动物中药材难以获得全长DNA序列的缺陷，扩大了DNA条形码技术的应用范围；
[0038] (2)本发明提供的鉴别中华穿山甲和家猪蹄甲炮制甲片的DNA微型条形码引物，可以实现对炮制甲片DNA中目标片段的有效扩增，且制备方法简单，准确性高；
[0040] 图1为标准DNA条形码和微型DNA条形码引物对已知中华穿山甲和家猪蹄甲炮制甲片样品DNA的COI基因序列扩增的电泳图；
[0041] 图2为中华穿山甲和家猪蹄甲炮制甲片基于COI基因的NJ系统树。
具体实施方式
[0042] 以下通过具体实施方式的描述对本发明作进一步说明，但这并非是对本发明的限制，本领域技术人员根据本发明的基本思想，可以做出各种修改或改进，但是只要不脱离本发明的基本思想，均在本发明的保护范围之内。
[0043] 实施例1、一种用于鉴别中华穿山甲和家猪蹄甲炮制甲片的DNA微型条形码引物[0044] 所述用于鉴别中华穿山甲和家猪蹄甲炮制甲片的DNA微型条形码引物，设计过程包括如下步骤：
[0045] ①从GenBank中下载中华穿山甲和家猪的COI基因序列，序列信息见表1；
[0046] 表1 GenBank中中华穿山甲和家猪COI基因片段登录号
[0047]
[0048] ②应用MEGA软件比对序列，查找中华穿山甲和家猪COI基因的保守序列；
[0049] ③应用Primer Premier 5.0软件针对COI基因中的197bp保守片段设计DNA微型条形码引物对COI-L191，引物对COI-L197，该引物对核苷酸序列为：
[0050] COI-L191-F：5'-AAAAAGGTTGTRTTYAGGTTGCG-3'，
[0051] COI-L191-R：5'-AAATTAATAGCCCCTAGRATTGA-3'；
[0052] COI-L197-F：5'-AAATTAATAGCCCCTAGRATTGA-3'，
[0053] COI-L197-R：5'-AGTAGTCAGAAACTTATGTT-3'。
[0054] 实施例2、一种用于鉴别中华穿山甲和家猪蹄甲炮制甲片的DNA微型条形码引物在鉴别中华穿山甲和家猪蹄甲炮制甲片中的应用
[0055] 所述用于鉴别中华穿山甲和家猪蹄甲炮制甲片的DNA微型条形码方法，包括如下步骤：
[0056] S1、如实施例1所示的方法设计特异性的DNA微型条形码引物对COI-L191，引物对COI-L197；
[0057] S2、提取中华穿山甲和家猪蹄甲炮制甲片样品DNA，测定DNA的浓度与纯度，得高质量的全基因组DNA；
[0058] 提取中华穿山甲和家猪蹄甲炮制甲片样品DNA的具体操作为：
[0059] (1)取30mg炮制甲片样品，用体积分数为75％的乙醇水溶液除去表面杂质，剪碎后加入炮制甲片样品体积6倍的裂解缓冲液，得裂解液样品；所述裂解缓冲液10mM Tris-HCl缓冲液和25mM EDTA组成；
[0060] (2)向步骤(1)所得裂解液样品中加入10mg/mL蛋白酶K溶液，混匀，于50℃条件下放置2h，得混合液I；
[0061] (3)向步骤(2)所得混合液I中加入200μL体积分数为0.5％的十二烷基硫酸钠水溶液，混匀，于50℃条件下放置30min，加入200μL无水乙醇，充分振荡混匀10s，得带絮状沉淀的混合液；
[0062] (4)将步骤(3)所得带絮状沉淀的混合液加入硅胶膜吸附柱中，于10000rpm的条件下离心20s后弃掉废液，向吸附柱中加入500μL缓冲液，离心20s，弃掉废液，向吸附柱中加入600μL体积分数为70％的乙醇水溶液，离心20s后弃掉废液，再次于10000rpm的条件下离心
1min后弃掉废液，静置1min，得絮状沉淀；
1min后弃掉废液，静置1min，得絮状沉淀；
[0063] (5)向步骤(4)所得絮状沉淀中加入50μL 10mM Tris-HCl缓冲液，室温放置1min后于10000rpm的条件下离心1min，即得。
[0064] 用紫外分光光度计检测DNA溶液在260nm处的吸光值和280nm处的吸光值，计算得中华穿山甲炮制甲片ZHGX样品DNA浓度为74.4μg/mL，DNA纯度为1.65。中华穿山甲炮制甲片ZHSD样品DNA浓度为58.0μg/mL，DNA纯度为1.68。家猪蹄甲炮制甲片ZTZJ样品DNA浓度为49.3μg/mL，DNA纯度为1.72。家猪蹄甲炮制甲片ZTGZ样品DNA浓度为105.1μg/mL，DNA纯度为
1.73。均属合格样品。
1.73。均属合格样品。
[0065] S3、以步骤S2所得高质量的全基因组DNA为模板，利用步骤S1所得特异性COI-L 197引物对，进行PCR扩增，得COI基因片段；
[0066] 进行PCR扩增时PCR体系为50μL，其中PCR mix预混液为45μL，上下游引物各1μL，DNA模板2μL，加蒸馏水1μL；PCR扩增程序为98℃预变性1min；98℃变性5s，55℃退火5s，72℃延伸5s，25个循环；72℃延伸0.5min，-20℃冻存。
[0067] S4、将步骤S3所得COI基因片段利用琼脂糖凝胶电泳检测，然后进行双向测序，将测序结果利用Blast和NJ系统树比对，NJ系统树是采用MEGA软件，通过Muscle算法对序列进行比对后，采用K2P模型和自展检验法来构建完成。
[0068] 实施例2、用于鉴别中华穿山甲和家猪蹄甲炮制甲片的DNA微型条形码引物在鉴别中华穿山甲和家猪蹄甲炮制甲片中的应用
[0069] 所述用于鉴别中华穿山甲和家猪蹄甲炮制甲片的DNA微型条形码引物在鉴别中华穿山甲和家猪蹄甲炮制甲片中的应用与实施例2类似，与实施例2的区别在于：
[0070] S2、提取中华穿山甲和家猪蹄甲炮制甲片样品DNA，测定DNA的浓度与纯度，得高质量的全基因组DNA；
[0071] 提取中华穿山甲和家猪蹄甲炮制甲片样品DNA的具体操作为：
[0072] (1)取100mg炮制甲片样品，用体积分数为75％的乙醇水溶液除去表面杂质，剪碎后加入炮制甲片样品体积6倍的裂解缓冲液，得裂解液样品；所述裂解缓冲液200mM Tris-HCl和100mM EDTA组成；
[0073] (2)向步骤(1)所得裂解液样品中加入30mg/mL蛋白酶K溶液，混匀，于60℃条件下放置4h，得混合液I；
[0074] (3)向步骤(2)所得混合液I中加入200μL体积分数为1.0％的十二烷基硫酸钠水溶液，混匀，于75℃条件下放置60min，加入200μL无水乙醇，充分振荡混匀30s，得带絮状沉淀的混合液；
[0075] (4)将步骤(3)所得带絮状沉淀的混合液加入硅胶膜吸附柱中，于14000rpm的条件下离心40s后弃掉废液，向吸附柱中加入500μL缓冲液，离心40s，弃掉废液，向吸附柱中加入600μL体积分数为70％的乙醇水溶液，离心40s后弃掉废液，再次于14000rpm的条件下离心
4min后弃掉废液，静置5min，得絮状沉淀；
4min后弃掉废液，静置5min，得絮状沉淀；
[0076] (5)向步骤(4)所得絮状沉淀中加入200μL200mM Tris-HCl缓冲液，室温放置5min后于14000rpm的条件下离心4min，即得。
[0077] 用紫外分光光度计检测DNA溶液在260nm处的吸光值和280nm处的吸光值，计算得中华穿山甲炮制甲片ZHGX样品DNA浓度为85.6μg/mL，DNA纯度为1.75。中华穿山甲炮制甲片ZHSD样品DNA浓度为62.3μg/mL，DNA纯度为1.76。家猪蹄甲炮制甲片ZTZJ样品DNA浓度为51.6μg/mL，DNA纯度为1.78。家猪蹄甲炮制甲片ZTGZ样品DNA浓度为112.3μg/mL，DNA纯度为
1.67。均属合格样品。
1.67。均属合格样品。
[0078] S3、以步骤S2所得高质量的全基因组DNA为模板，利用步骤S1所得特异性COI-L 191引物对，进行PCR扩增，得COI基因片段；
[0079] 进行PCR扩增时，共配制50μL的反应体系，其中PCRmix预混液为35μL，上下游引物各3μL，DNA模板5μL，加蒸馏水4μL；PCR扩增程序为98℃预变性3min；98℃变性20s，55℃退火20s，72℃延伸10s，35个循环；72℃延伸2min，-20℃冻存。
[0080] 实施例3、用于鉴别中华穿山甲和家猪蹄甲炮制甲片的DNA微型条形码引物在鉴别中华穿山甲和家猪蹄甲炮制甲片中的应用
[0081] 所述用于鉴别中华穿山甲和家猪蹄甲炮制甲片的DNA微型条形码引物在鉴别中华穿山甲和家猪蹄甲炮制甲片中的应用与实施例2类似，与实施例2的区别在于：
[0082] S2、提取中华穿山甲和家猪蹄甲炮制甲片样品DNA，测定DNA的浓度与纯度，得高质量的全基因组DNA；
[0083] 提取中华穿山甲和家猪蹄甲炮制甲片样品DNA的具体操作为：
[0084] (1)取60mg炮制甲片样品，用体积分数为75％的乙醇水溶液除去表面杂质，剪碎后加入炮制甲片样品体积6倍的裂解缓冲液，得裂解液样品；所述裂解缓冲液100mM Tris-HCl缓冲液和60mM EDTA组成；
[0085] (2)向步骤(1)所得裂解液样品中加入20mg/mL蛋白酶K溶液，混匀，于55℃条件下放置3h，得混合液I；
[0086] (3)向步骤(2)所得混合液I中加入200μL0.8％SDS溶液，混匀，于62℃条件下放置45min，加入200μL无水乙醇，充分振荡混匀20s，得带絮状沉淀的混合液；
[0087] (4)将步骤(3)所得带絮状沉淀的混合液加入硅胶膜吸附柱中，于12000rpm的条件下离心40s后弃掉废液，向吸附柱中加入500μL缓冲液，离心30s，弃掉废液，向吸附柱中加入600μL体积分数为70％的乙醇水溶液，离心30s后弃掉废液，再次于12000rpm的条件下离心
3min后弃掉废液，静置3min，得絮状沉淀；
3min后弃掉废液，静置3min，得絮状沉淀；
[0088] (5)向步骤(4)所得絮状沉淀中加入200μL200mM Tris-HCl缓冲液，室温放置3min后于12000rpm的条件下离心3min，即得。
[0089] 用紫外分光光度计检测DNA溶液在260nm处的吸光值和280nm处的吸光值，计算得中华穿山甲炮制甲片ZHGX样品DNA浓度为88.5μg/mL，DNA纯度为1.71。中华穿山甲炮制甲片ZHSD样品DNA浓度为71.4μg/mL，DNA纯度为1.72。家猪蹄甲炮制甲片ZTZJ样品DNA浓度为56.2μg/mL，DNA纯度为1.68。家猪蹄甲炮制甲片ZTGZ样品DNA浓度为117.8μg/mL，DNA纯度为
1.70。均属合格样品。
1.70。均属合格样品。
[0090] S3、以步骤S2所得高质量的全基因组DNA为模板，采用步骤S1所得特异性COI-L 197引物对，进行PCR扩增，得COI基因片段；
[0091] 进行PCR扩增时，共配制50μL的反应体系，其中PCRmix预混液为40μL，上下游引物各2μL，DNA模板4μL，加蒸馏水2μL；PCR扩增程序为98℃预变性2min；98℃变性10s，55℃退火13s，72℃延伸8s，30个循环；72℃延伸1.2min，-20℃冻存。
[0092] S4、将步骤S3所得COI基因片段利用琼脂糖凝胶电泳检测，然后进行双向测序，将测序结果利用Blast和NJ系统树比对，NJ系统树是采用MEGA软件，通过ClustalW算法对序列进行比对后，采用K2P模型和自展检验法来构建完成。
[0093] 对比例1、一种鉴别中华穿山甲和家猪蹄甲炮制甲片的DNA标准条形码方法[0094] 所述用于鉴别中华穿山甲和家猪蹄甲炮制甲片的DNA标准条形码方法与实施例3类似。
[0095] 与实施例3的区别在于，不包括步骤S1所述的特异性微型引物设计过程，所述步骤S3中PCR反应体系中所用引物对为针对COI基因的标准条形码引物，序列如下：
[0096] LCO1490上游引物：5'-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3'，
[0097] HCO2198下游引物：5'-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3'。
[0098] 将对比例1及实施例3所得PCR产物用琼脂糖凝胶电泳检测条带，标准DNA条形码和微型DNA条形码引物对已知中华穿山甲和家猪蹄甲炮制甲片样品DNA的COI基因序列扩增的电泳图如图1所示，由图1可知，与实施例3相比，利用标准条形码引物扩增的中华穿山甲与家猪蹄甲炮制甲片DNA的PCR产物进行电泳时，在650bp左右均没有扩增出特异性条带，见图1前4条泳道，说明炮制甲片的DNA发生了降解，无法扩增出标准长度的COI基因序列，因此利用标准条形码无法鉴别中华穿山甲与家猪蹄甲炮制甲片，而利用本发明的微型引物对甲片COI基因的扩增电泳图中，微型条形码引物扩增出了200bp左右的单一条带，见图1后4条泳道，与引物设计时预期产物长度相符，并将扩增成功的PCR产物进行双向测序，测序结果如下：
[0099] 中华穿山甲炮制甲片样品ZHGX序列为：
[0100] AACATAAGTTTCTGACTACTCCCCCCTTCCTTCCTACTCCTCCTAGCCTCTTCCATAATTGAAGCTGGAGCCGGGACATGATGAACTGTATATCCTCCCCTAGCAGGAAACTTAGCACATGCAGGAGCATCAGTAGACCTAACCATTTTTTCCCTCCACTTAGCAGGTATTTCCTCAATCCTAGGGGCTATTAATTT；
[0101] 中华穿山甲炮制甲片样品ZHSD序列为：
[0102] AACATAAGGCTCTAGCTACTCCCCCCTTCCTTAATACTCCTCCTAGCCTCTTCCATAATTGAAGCTGGGGCCGGGACAGGATGAACTGTATATCCTCCCCTAGCAGGAAACTATGCACATGCAGGTTCATCAGTAGACCATACCATTTTTTTCATCCACTTATTAGGTATTTCCTCAATAATAGGCCCTATTAATTT；
[0103] 家猪蹄甲炮制甲片样品ZTZJ样品序列：
[0104] AACATAAGTTTCTGACTACTTCCACCATCCTTCCTATTACTTCTGGCATCCTCAATAGTAGAAGCCGGAGCGGGTACTGGATGAACTGTATACCCACCTTTACCTGGAAACTTAGCCCATGCAGGGGCTTCAGTTGATTTAACAATTTTCTCCCTACACCTTGCAGGTGTATCATCAATCCTAGGGGCTATTAATTT；
[0105] 家猪蹄甲炮制甲片样品ZTGZ样品序列：
[0106] AACATAAGTTTCTGACTACTTCCACCATCCTTCCTATTACTTCTGGCATCCTCAATAGTAGAAGCCGGAGCGGGTACTGCATGAACTATATACCCACCTTTAGCTGGAAACTTAGCCCATGCAGGGGCTTCAGTTGATTTAACAATTTTCTCCCTACACCTTGCAGGTGTATCATCAATCCTAGGGGCTATTAATTT。
[0107] 将所测得的序列在NCBI的GenBank数据库中进行BLAST搜索，根据相似度、覆盖度以及综合得分确定物种信息。同时构建基于COI基因序列的NJ系统进化树。将DNA微条形码鉴定结果与已知物种信息比较，进一步确定炮制甲片的动物源。
[0108] 比对结果如表2所示，所测甲片样品与已知物种基因相似度达100％，可初步判定为属于同一物种。为进一步明确炮制甲片来源，将所测得的样品序列与Genbank数据库中的中华穿山甲和家猪蹄甲参考序列进行聚类分析，并绘制NJ系统进化树，中华穿山甲和家猪蹄甲炮制甲片基于COI基因的NJ系统树的绘制结果见图2，从图2中可以发现中华穿山甲与家猪蹄甲两个物种的样本序列和参考序列均各自聚为一支，能够明显区分开。因此，针对COI基因设计的微型条形码引物能够准确鉴别中华穿山甲炮制甲片和家猪蹄甲炮制甲片。
[0109] 表2炮制甲片Blast比对鉴定结果
[0110]
[0111] 最后应当说明的是，上文中已经对本技术及具体实施方案作了详尽的描述，但是本发明并不局限于以上描述的具体实施例。因此本领域的任何技术人员在不偏离本发明精神的基础对之作一些改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围，均属于本发明要求保护的范围。
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