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一种用于检测伊 马替尼靶向用药相关基因突变的 试剂盒

阅读：995发布：2021-06-10

专利汇可以提供一种用于检测伊马替尼靶向用药相关基因突变的试剂盒专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明公开了一种用于检测伊马替尼靶向用药相关基因突变的试剂盒，所述伊马替尼靶向用药相关基因包括C-kit和PDGFRA基因，该试剂盒包括分别用于检测C-kit基因第9、11、13、17号外显子和PDGFRA基因第12、18号外显子的引物和荧光探针，通过荧光定量PCR扩增目的基因片段再进行测序反应，该试剂盒还包括虾碱酶和核酸外切酶I组成的消化酶系，PCR产物纯化效果更好且样品损失少。本发明试剂盒检测准确度及灵敏度高，重复性好，操作方便快捷，为伊马替尼靶向用药的测试、分析与评估提供了快速、可靠的实验依据。，下面是一种用于检测伊马替尼靶向用药相关基因突变的试剂盒专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种用于检测伊马替尼靶向用药相关基因突变的引物探针组合物，其特征在于：所述伊马替尼靶向用药相关基因为C-kit基因和PDGFRA基因，所述引物探针组合物包括引物
1-12和荧光探针1-6，所述引物1-12的碱基序列分别如序列表中SEQ ID NO.1-12所示，所述荧光探针1-6的碱基序列分别如序列表中SEQ ID NO.13-18所示。
2.一种用于检测伊马替尼靶向用药相关基因突变的试剂盒，其特征在于：包括权利要求1所述的引物探针组合物。
3.如权利要求2所述的用于检测伊马替尼靶向用药相关基因突变的试剂盒，其特征在于：应用于荧光定量PCR反应中，反应体系中所述引物探针组合物中各引物浓度为0.3μmol/L，各荧光探针浓度为0.2μmol/L。
4.如权利要求2所述的用于检测伊马替尼靶向用药相关基因突变的试剂盒，其特征在于：还包括PCR反应液和测序反应液，所述PCR反应液包括含Mg2+的PCR扩增缓冲液、dNTPs和Taq DNA聚合酶，所述测序反应液包括2.5×BigDye和5×BigDye测序缓冲液。
5.如权利要求2所述的用于检测伊马替尼靶向用药相关基因突变的试剂盒，其特征在于：还包括消化酶系，所述消化酶系包括1-4U/μL虾碱酶和4-7U/μL核酸外切酶I。
6.如权利要求2所述的用于检测伊马替尼靶向用药相关基因突变的试剂盒，其特征在于：还包括PCR产物纯化试剂，所述PCR产物纯化试剂包括2-5mol/L NaAc溶液、无水乙醇和甲酰胺。
7.如权利要求2所述的用于检测伊马替尼靶向用药相关基因突变的试剂盒，其特征在于：还包括阴性质控品和阳性质控品，所述阴性质控品为含C-kit和PDGFRA野生型基因片段的重组质粒，所述阳性质控品为含C-kit和PDGFRA突变型基因片段的重组质粒。

说明书全文

一种用于检测伊马替尼靶向用药相关基因突变的 试剂盒

技术领域

[0001] 本发明涉及生物医药领域，尤其涉及一种用于检测伊马替尼靶向用药相关基因突变的试剂盒。

背景技术

[0002] 靶向药物(targeted medicine)是目前最先进的用于治疗癌症的药物，它与传统药物最大的不同就在于其作用机理上。常规化疗药物是通过对细胞的毒害发挥作用，由于不能准确识别肿瘤细胞，因此在杀灭肿瘤细胞的同时也会殃及正常细胞，所以产生较大的毒副作用。而靶向药物是针对肿瘤基因开发的，它能够识别肿瘤细胞上由肿瘤细胞特有的基因所决定的特征性位点，通过与之结合(或类似的其他机制)，阻断肿瘤细胞内控制细胞生长、增殖的信号传导通路，从而杀灭肿瘤细胞、阻止其增殖。由于这样的特点，靶向药物不仅效果好，而且副作用要比常规的化疗方法小得多。使用靶向药物的治疗方法称为“靶向治疗”。

[0003] 胃肠道间质瘤(Gastrointestinal stromal tumors,GIST)是胃肠道最常见的间叶来源肿瘤，依照目前的GIST诊断标准，新近流行病学研究显示发病率0.66～2.20/10万。GIST对传统化学治疗极不敏感，化疗药物有效率不足5％，进展期中位生存率仅约18个月。
研究发现，干细胞因子表面的跨膜酪氨酸激酶受体C-kit和血小板源性生长因子受体(Platelet-derived growth factor receptor，PDGFR)基因的功能活化突变是GIST发生发展的关键，针对以上分子靶点的靶向药物伊马替尼在2001年被FDA批准用于GIST的治疗，改变了这一疾病的治疗策略。伊马替尼(Imatinib mesylate，商品名：格列卫，Glivec)是一种高效特异的酪氨酸激酶抑制剂，可以通过接合C-kit和PDGFRA的酪氨酸激酶活性中心，抑制其活性，进而达到治疗肿瘤的目的。

[0004] 在GIST中C-kit基因突变占75％-80％，PDGFRA基因突变占5％-10％，非C-kit和PDGFRA基因突变占10％-15％。不同的基因突变类型与胃肠道间质瘤靶向治疗的选择、伊马替尼剂量的评估、疗效及预后关系密切。已发现的C-kit基因突变类型有4种，9号外显子(5％-10％)、11号外显子(57％-71％)、13号外显子(约5％)和17号外显子(约5％)；PDGFRA基因突变类型主要有2种，12号外显子(约3％)和18号外显子(约97％)。临床研究表明，GIST中C-kit基因的突变情况与伊马替尼分子靶向治疗的疗效相关：存在11号外显子突变患者的疗效最好，存在9号外显子突变的患者疗效次之，而C-kit基因为野生型时，伊马替尼的疗效最差。另外，对于9号外显子突变的患者，提高伊马替尼用药剂量可显著提高疗效。PDGFRA基因12号外显子及18号外显子发生突变的多数GIST患者对伊马替尼也很敏感，但PDGFRA基因18号外显子的D842V突变会导致GIST患者对伊马替尼原发耐药。

[0005] 因此，针对原发GIST或复发转移的GIST，明确其C-Kit和PDGFRA基因突变状态，对GIST进行精确的分子分型，筛选靶向药物伊马替尼适宜患者，根据基因突变类型推荐合理治疗剂量，是GIST个体化诊疗的重要环节。然而，现有市售的伊马替尼靶向用药相关基因C-kit或PDGFRA突变的试剂盒只能检测其中一种基因的突变，部分检测方法灵敏度低，不能准确检测出C-kit基因或PDGFRA基因是否发生突变，并且检测成本高。

发明内容

[0006] 有鉴于此，本发明提出了一种用于检测伊马替尼靶向用药相关基因突变的试剂盒，可用来检测样本组织中C-kit和PDGFRA基因是否发生突变，检测方便快捷，灵敏度高，并且检测成本较低。

[0007] 本发明的技术方案是这样实现的：

[0008] 第一方面，本发明提供了一种用于检测伊马替尼靶向用药相关基因突变的引物探针组合物，所述伊马替尼靶向用药相关基因为C-kit基因和PDGFRA基因，所述引物探针组合物包括引物1-12和荧光探针1-6，所述引物1-12的碱基序列分别为：

[0009] 引物1 5’-GCCACATCCCAAGTGTTTTATG-3’(SEQ ID NO.1)

[0010] 引物2 5’-GAGCCTAAACATCCCCTTAAATTG-3’(SEQ ID NO.2)

[0011] 引物3 5’-CCAGAGTGCTCTAATGACTG-3’(SEQ ID NO.3)

[0012] 引物4 5’-ACCTATCAAAAGGGGCGCAA-3’(SEQ ID NO.4)

[0013] 引物5 5’-GTTGTCTTCCTTCCTACAGGGAA-3’(SEQ ID NO.5)

[0014] 引物6 5’-CAAGAGAGAACAACAGTCTGGGTAA-3’(SEQ ID NO.6)

[0015] 引物7 5’-GTGAACATCATTCAAGGCGTACT-3’(SEQ ID NO.7)

[0016] 引物8 5’-AAAATGTGTGATATCCCTAGACAGG-3’(SEQ ID NO.8)

[0017] 引物9 5’-AAGCTCTGGTGCACTGGGACTT-3’(SEQ ID NO.9)

[0018] 引物10 5’-ATTGTAAAGTTGTGTGCAAGGGA-3’(SEQ ID NO.10)

[0019] 引物11 5’-ATGGCTTGATCCTGAGTCATTTC-3’(SEQ ID NO.11)

[0020] 引物12 5’-CACTCAAACCTGGGCAATCT-3’(SEQ ID NO.12)

[0021] 所述荧光探针1-6的碱基序列分别为：

[0022] 荧光探针1 5’-AGGCAGAAGTCTTGCCCACATCGTTG-3’(SEQ ID NO.13)

[0023] 荧光探针2 5’-TACCCAAAAAGGTGACATGGAAAGCCC-3’(SEQ ID NO.14)

[0024] 荧光探针3 5’-CCCTGGGTGCTGGAGCTTTCGG-3’(SEQ ID NO.15)

[0025] 荧光探针4 5’-TCCTTTGCAGGACTGTCAAGCAGAGAATG-3’(SEQ ID NO.16)[0026] 荧光探针5 5’-AACCGAGGTATGAAATTCGCTGGAGG-3’(SEQ ID NO.17)

[0027] 荧光探针6 5’-TCCACCGTGATCTGGCTGCTCG-3’(SEQ ID NO.18)

[0028] 所述荧光探针1-6的5’端均连接有荧光基团，所述荧光探针的3’端均连接有能够淬灭相应5’端荧光基团发射的荧光信号的淬灭基团。

[0029] 引物1、2和荧光探针1用于检测C-kit基因的第9号外显子突变，引物3、4和荧光探针2用于检测C-kit基因的第11号外显子突变，引物5、6和荧光探针3用于检测C-kit基因的第13号外显子突变，引物7、8和荧光探针4用于检测C-kit基因的第17号外显子突变，引物9、10和荧光探针5用于检测PDGFRA基因的第12号外显子突变，引物11、12和荧光探针6用于检测PDGFRA基因的第18号外显子突变。

[0030] 本发明在对伊马替尼靶向用药相关基因C-kit和PDGFRA野生型序列和现有已知的所有突变型序列进行比对的基础上，针对突变频率比较高的C-kit基因第9号外显子、第11号外显子、第13号外显子和第17号外显子以及PDGFRA基因的第12号外显子和第18号外显子各设计多对引物和探针，经PCR反应优化，筛选出扩增效果最好的一种引物探针组合物，可准确检测上述几种突变类型，具有很好的特异性。

[0031] 第二方面，本发明提供了一种用于检测伊马替尼靶向用药相关基因突变的试剂盒，包括本发明第一方面所述的引物探针组合物。

[0032] 在以上技术方案的基础上，优选的，所述试剂盒应用于荧光定量PCR反应中，反应体系中所述引物探针组合物中各引物浓度为0.3μmol/L，各荧光探针浓度为0.2μmol/L。

[0033] 在以上技术方案的基础上，优选的，所述试剂盒还包括还包括PCR反应液和测序反2+
应液，所述PCR反应液包括含Mg 的PCR扩增缓冲液、dNTPs和Taq DNA聚合酶，所述测序反应液包括2.5×BigDye和5×BigDye测序缓冲液。

[0034] 在以上技术方案的基础上，优选的，所述试剂盒还包括消化酶系，所述消化酶系包括1-4U/μL虾碱酶和4-7U/μL核酸外切酶I。

[0035] 在以上技术方案的基础上，优选的，所述试剂盒还包括PCR产物纯化试剂，所述PCR产物纯化试剂包括2-5mol/L NaAc溶液、无水乙醇和甲酰胺。

[0036] 在以上技术方案的基础上，优选的，所述试剂盒还包括阴性质控品和阳性质控品，所述阴性质控品为含C-kit和PDGFRA野生型基因片段的重组质粒，所述阳性质控品为含C-kit和PDGFRA突变型基因片段的重组质粒。

[0037] 本发明的用于检测伊马替尼靶向用药相关基因突变的试剂盒相对于现有技术具有以下有益效果：

[0038] (1)本发明试剂盒中提供的特异性引物探针组合物能够高灵敏地检测伊马替尼靶向用药相关基因C-kit和PDGFRA是否发生突变，涵盖C-kit基因第9、11、13、17号外显子和PDGFRA基因第12、18号外显子多个热点突变类型的检测，同时，对待测样本的基因片段采用荧光PCR进行扩增，可以通过直观观察扩增曲线和Ct值判断扩增情况是否合格，再进行后续测序过程；

[0039] (2)本发明试剂盒采用虾碱酶和核酸外切酶I对PCR扩增产物进行酶解纯化，省去了凝胶电泳的步骤，操作方便快捷，能够有效去除PCR扩增产物中残留的dNTP、引物和单链DNA等，纯化效率高，同时不损失样本，得到的测序峰图干净清晰、无杂峰，检测更准确、灵敏度更高，且大大降低了检测成本。附图说明

[0040] 为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

[0041] 图1为本发明实施例2中用乙醇/醋酸钠纯化PCR产物后检测样本C-kit基因第9号外显子突变情况的测序峰图。

[0042] 图2为本发明实施例2中用SAP/EXOI纯化PCR产物后检测样本C-kit基因第9号外显子突变情况的测序峰图。

[0043] 图3为本发明实施例2中用乙醇/醋酸钠纯化PCR产物后检测样本C-kit基因第11号外显子突变情况的测序峰图。

[0044] 图4为本发明实施例2中用SAP/EXOI纯化PCR产物后检测样本C-kit基因第11号外显子突变情况的测序峰图。

[0045] 图5为本发明实施例2中用乙醇/醋酸钠纯化PCR产物后检测样本C-kit基因第13号外显子突变情况的测序峰图。

[0046] 图6为本发明实施例2中用SAP/EXOI纯化PCR产物后检测样本C-kit基因第13号外显子突变情况的测序峰图。

[0047] 图7为本发明实施例2中用乙醇/醋酸钠纯化PCR产物后检测样本C-kit基因第17号外显子突变情况的测序峰图。

[0048] 图8为本发明实施例2中用SAP/EXOI纯化PCR产物后检测样本C-kit基因第17号外显子突变情况的测序峰图。

[0049] 图9为本发明实施例2中用乙醇/醋酸钠纯化PCR产物后检测样本PDGFRA基因第12号外显子突变情况的测序峰图。

[0050] 图10为本发明实施例2中用SAP/EXOI纯化PCR产物后检测样本PDGFRA基因第12号外显子突变情况的测序峰图。

[0051] 图11为本发明实施例2中用乙醇/醋酸钠纯化PCR产物后检测样本PDGFRA基因第18号外显子突变情况的测序峰图。

[0052] 图12为本发明实施例2中用SAP/EXOI纯化PCR产物后检测样本PDGFRA基因第18号外显子突变情况的测序峰图。

具体实施方式

[0053] 下面将结合本发明实施方式，对本发明实施方式中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施方式仅仅是本发明一部分实施方式，而不是全部的实施方式。基于本发明中的实施方式，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施方式，都属于本发明保护的范围。

[0054] 下面实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，可以参考《分子克隆实验指南》(第四版)。实施例中所用的引物和探针委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

[0055] 实施例1

[0056] 本发明实施例提供用于检测伊马替尼靶向用药相关基因C-kit和PDGFRA突变的引物探针组合物，该用于检测C-kit和PDGFRA基因突变的引物探针组合物包括用于检测C-kit基因的第9号外显子突变的正反向引物和荧光探针，用于检测C-kit基因的第11号外显子的正反向引物和荧光探针，用于检测C-kit基因的第13号外显子的正反向引物和荧光探针，用于检测C-kit基因的第17号外显子的正反向引物和荧光探针，用于检测PDGFRA基因的第12号外显子的正反向引物和荧光探针，以及用于检测PDGFRA基因的第18号外显子的正反向引物和荧光探针，其中：

[0057] C-kit基因第9号外显子的正向引物如序列表中SEQ ID NO.1所示；

[0058] C-kit基因第9号外显子的反向引物如序列表中SEQ ID NO.2所示；

[0059] C-kit基因第9号外显子的荧光探针如序列表中SEQ ID NO.13所示；

[0060] C-kit基因第11号外显子的正向引物如序列表中SEQ ID NO.3所示；

[0061] C-kit基因第11号外显子的反向引物如序列表中SEQ ID NO.4所示；

[0062] C-kit基因第11号外显子的荧光探针如序列表中SEQ ID NO.14所示；

[0063] C-kit基因第13号外显子的正向引物如序列表中SEQ ID NO.5所示；

[0064] C-kit基因第13号外显子的反向引物如序列表中SEQ ID NO.6所示；

[0065] C-kit基因第13号外显子的荧光探针如序列表中SEQ ID NO.15所示；

[0066] C-kit基因第17号外显子的正向引物如序列表中SEQ ID NO.7所示；

[0067] C-kit基因第17号外显子的反向引物如序列表中SEQ ID NO.8所示；

[0068] C-kit基因第17号外显子的荧光探针如序列表中SEQ ID NO.16所示；

[0069] PDGFRA基因第12号外显子的正向引物如序列表中SEQ ID NO.9所示；

[0070] PDGFRA基因第12号外显子的反向引物如序列表中SEQ ID NO.10所示；

[0071] PDGFRA基因第12号外显子的荧光探针如序列表中SEQ ID NO.17所示；

[0072] PDGFRA基因第18号外显子的正向引物如序列表中SEQ ID NO.11所示；

[0073] PDGFRA基因第18号外显子的反向引物如序列表中SEQ ID NO.12所示；

[0074] PDGFRA基因第18号外显子的荧光探针如序列表中SEQ ID NO.18所示；

[0075] 所有荧光探针的5’端均连接有FAM荧光基团，3’端均连接有BHQ淬灭基团。

[0076] 实施例2

[0077] 本发明实施例提供一种用于检测伊马替尼靶向用药相关基因C-kit和PDGFRA突变的试剂盒，该试剂盒包括本发明实施例1提供的引物探针组合物，各引物和荧光探针浓度均为10μmol/L，可检测C-kit基因的第9号、第11号、第13号和第17号外显子的突变以及PDGFRA基因的第12号和第18号外显子的突变。

[0078] 该试剂盒还包括PCR反应液、测序反应液、消化酶系、PCR产物纯化试剂、阴性质控品和阳性质控品。所述PCR反应液包括含Mg2+的5×PCR扩增缓冲液、2.5mmol/L dNTPs和5U/μL Taq DNA聚合酶，所述测序反应液包括2.5×BigDye和5×BigDye测序缓冲液。

[0079] 所述消化酶系包括1-4U/μL虾碱酶和4-7U/μL核酸外切酶I。

[0080] 在以上技术方案的基础上，优选的，所述试剂盒还包括PCR产物纯化试剂，所述PCR产物纯化试剂包括2-5mol/L NaAc溶液、无水乙醇和甲酰胺。

[0081] 所述阴性质控品为含C-kit和PDGFRA野生型基因片段的重组质粒，所述阳性质控品为含C-kit和PDGFRA突变型基因片段的重组质粒。

[0082] 本发明提供的用于检测检测伊马替尼靶向用药相关基因C-kit和PDGFRA突变的试剂盒包括本发明实施例1提供的特异性引物以及荧光探针，通过荧光定量PCR扩增直观观察扩增目的基因是否合格后，再进行后续测序检测，使得能够准确检测C-kit和PDGFRA基因是否发生突变，采用虾碱酶和核酸外切酶对荧光PCR产物进行纯化，保证后续测序扩增反应的准确性，以提高突变检测的灵敏度。

[0083] 实施例3、伊马替尼靶向用药相关基因的检测

[0084] 选取有伊马替尼用药史的胃肠道间质瘤患者作为受试者，进行回顾性研究。

[0085] S1、提取样本基因组DNA

[0086] 适用样本类型：10％中性福尔马林固定石蜡包埋胃肠道间质瘤组织切片。

[0087] 待检测样本要求：

[0088] (1)石蜡包埋病理切片样品应确定含有肿瘤病变细胞，为了保证切片组织中含有足够比例的肿瘤细胞，需要加同一组织HE染色片一张；

[0089] (2)每例标本切5张8～10μm厚白片，肿瘤细胞区域大于5mm×5mm，连续切片，封存于1.5mL离心管中；

[0090] (3)石蜡包埋病理切片在常温条件下保存不要超过12个月，为确保DNA提取成功率，必须选择1年以内的石蜡包埋病理切片；

[0091] (4)石蜡包埋病理切片常温运输。

[0092] 选用TIANGEN公司的石蜡包埋组织DNA提取试剂盒对样本石蜡包埋组织切片提取基因组DNA，操作步骤详见该试剂盒说明书。提取的样本基因组DNA采用紫外分光光度计测定浓度及质量，A260/A280比值大于1.8，A260/A230比值大于2.0，样本基因组DNA浓度在20ng/μL以上。如提取后的核酸储备液浓度范围不符合要求，应重新取材或扩大样本量再进行核酸提取。提取完的DNA应立即进行检测，否则请于-20℃或-80℃的温度条件下保存，-20℃可以保存1年，且反复冻融不超过5次。

[0093] S2、荧光PCR扩增

[0094] 准备6个PCR反应管，分别对应C-kit基因的第9号外显子、第11号外显子、第13号外显子、第17号外显子和PDGFRA基因的第12号外显子、第18号外显子，用微量加样器在每一个PCR反应管内分别加入对应的引物和荧光探针，每管PCR反应体系为25μL，正向引物0.75μL、反向引物0.75μL、荧光探针0.5μL、含Mg2+的5×PCR扩增缓冲液5μL、2.5mmol/L dNTPs 1.5μL、5U/μL Taq DNA聚合酶0.2μL，补去离子水至23μL，最后向各PCR反应管中加入提取的样本基因组DNA2μL。再准备4个PCR反应管，分别对应C-kit基因检测阴性质控、阳性质控和PDGFRA基因检测阴性质控、阳性质控，按上述方法配制PCR反应体系，引物和荧光探针为与其检测基因种类相对应的任一对引物和荧光探针，模板DNA分别替换成等量的含C-kit野生型基因片段的重组质粒、含C-kit突变型基因片段的重组质粒、含PDGFRA野生型基因片段的重组质粒和含PDGFRA突变型基因片段的重组质粒。盖紧所有PCR反应管，进行PCR扩增反应。在荧光PCR仪上设置以下程序：

[0095]

[0096] 经过上述程序扩增后，得到PCR扩增产物，观察结果扩增曲线均呈S型，且Ct值在20-30之间，可见扩增效果良好。

[0097] S3、纯化PCR扩增产物

[0098] 将2μL虾碱酶和1μL核酸外切酶I混合后，加5μL步骤S2得到的PCR产物，金属浴37℃加热60min，95℃变性2min，反应结束后加72μL超纯水稀释。

[0099] 同样地，用常规乙醇/醋酸钠法对荧光PCR扩增产物进行纯化，作为对照实验。

[0100] S4、测序PCR扩增

[0101] 取纯化的PCR扩增产物3μL作为模板，再分别加入对应的正向引物1μL，加入2.5×BigDye 0.30μL、5×BigDye测序缓冲液0.45μL、去离子水1.25μL，进行测序PCR扩增，扩增条件如下：

[0102]

[0103] 经上述扩增条件，得到测序PCR扩增产物。

[0104] S5、纯化测序PCR扩增产物

[0105] 此步骤是去除测序反应体系中除目标核酸片段之外的杂质，以减少毛细管电泳时杂质对峰图质量的影响。

[0106] 将3mol/L NaAc溶液与无水乙醇按照1:15的体积比例混合分装到10个离心管中，每个离心管内加入16μL PCR反应混合液，充分振荡，在4℃12000rpm离心10min，小心弃上清；加150μL预冷的70％(v/v)乙醇，混匀后12000rpm离心10min，小心弃上清，重复1次，室温晾干。加入10μL的甲酰胺于离心管中，充分溶解DNA沉淀，静置3min稍离心，在金属浴上进行热变性(95℃4min)，冰中骤冷。

[0107] 纯化后当日上机测序；若不能当日测序，需将测序PCR扩增产物于-20℃保存，上机当日再纯化。

[0108] S6、测序分析

[0109] 将纯化后的测序PCR扩增产物在ABI 3500系列基因分析仪上进行测序分析，并与C-kit和PDGFRA基因对应外显子野生型进行比对，判定样本中C-kit和PDGFRA基因是否发生突变，检测结果如下表：

[0110] 基因检测项目检测结果C-kit exon9(502-503ins) 阴性
C-kit exon11(557-558del) 阴性
C-kit exon13(K642E) 阴性
C-kit exon13(V654A) 阴性
C-kit exon17(D816V) 阴性
C-kit exon17(D820G) 阴性
C-kit exon17(S821C) 阴性
C-kit exon17(N822K) 阴性
C-kit exon17(Y823D) 阴性
PDGFRA exon12(V561D) 阴性
PDGFRA exon18(D842V) 阴性

[0111] 本发明针对不同PCR产物纯化方法参照以上操作过程对测序结果进行了对比：图1、3、5、7、9和12分别显示用常规乙醇/醋酸钠法对荧光PCR扩增产物进行纯化后C-kit基因第9、11、13、17号外显子和PDGFRA基因第12、18号外显子的测序结果，图2、4、6、8、10分别显示用本发明试剂盒SAP/EXOI酶解法对荧光PCR扩增产物进行纯化后C-kit基因第9、11、13、
17号外显子和PDGFRA基因第12、18号外显子的测序结果，由图所示，用SAP/EXOI酶解法处理后的测序结果干净清晰、基本无杂峰，主峰峰高更高，说明相比常规乙醇/醋酸钠的PCR产物纯化方法，本发明试剂盒纯化效果更好，并能够保证样本100％回收，没有任何损失。

[0112] 本发明提供用于检测伊马替尼靶向用药相关基因突变的试剂盒及检测方法，能够准确检测C-kit和PDGFRA基因是否发生突变，同时，对待测样本的基因片段采用荧光PCR进行扩增，扩增情况可以通过扩增曲线和Ct值判断；荧光PCR扩增产物采用虾碱酶和核酸外切酶I进行消化，能有效去除PCR扩增产物中残留的dNTP、引物和单链DNA等，省去了凝胶电泳的步骤，不但节省了时间还避免了污染，同时不损失样本，得到的测序峰图干净清晰、无杂峰，检测更准确、灵敏度更高。

[0113] 以上所述仅为本发明的较佳实施方式而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

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一种用于检测伊马替尼靶向用药相关基因突变的试剂盒

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