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用于从色谱柱中去除压力和空气的方法和系统

阅读：611发布：2020-05-11

专利汇可以提供用于从色谱柱中去除压力和空气的方法和系统专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且描述了用于去除在预装色谱系统(柱加上附接的管和阀组)的灭菌(例如，伽马辐照)过程中形成的气体和/或压力的方法和系统。所述方法包括通过专门设计的管和阀组冲洗所述气体和/或压力，而不会破坏所述预装灭菌色谱系统的灭菌性。所述系统包括灭菌或无菌预装色谱柱，所述色谱柱包括具有入口和出口的柱；附接到所述入口和所述出口的管和阀组；以及泵，所述泵被配置成沿着所述管和阀组从流体源泵送灭菌或无菌液体，沿着第一流动路径泵送到柱管入口中并从柱管出口泵送出，从而从腔室中去除任何夹带的气体和/或压力。，下面是用于从色谱柱中去除压力和空气的方法和系统专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种从预装色谱柱中去除夹带的气体、压力或气体和压力两者的方法，所述色谱柱包括具有柱管入口和柱管出口的柱管以及布置在所述柱管内以形成填充有装填介质的腔室的第一流动分配器和第二流动分配器，所述方法包括：
(a)获得包括管和至少一个阀的管和阀组，所述至少一个阀被配置成限定通过所述管的至少两个不同流路；
(b)：
(i)将所述管和阀组的管附接到所述柱管入口和所述柱管出口，并且随后对连接的所述预装色谱柱以及所述管和阀组进行灭菌，或者
(ii)独立地对所述预装色谱柱以及所述管和阀组进行灭菌，并且随后以维持所述柱以及所述管和阀组两者的灭菌性的方式将所述管和阀组的灭菌管附接到灭菌柱管入口和灭菌柱管出口；
(c)将灭菌管和阀组附接到灭菌或无菌流体源和流体出口；以及
(d)沿着其中所述至少一个阀处于第一位置的所述管和阀组从所述灭菌或无菌流体源泵送灭菌或无菌液体，沿着第一流路泵送到所述柱管入口中并从所述柱管出口泵送出，从而沿着所述第一流路从所述腔室、所述管和所述至少一个阀中去除任何夹带的气体、压力或气体和压力两者，而不会破坏所述预装色谱柱以及所述管和阀组的所述灭菌性。
2.根据权利要求1所述的方法，其包括将所述管和阀组的管附接到所述柱管入口和所述柱管出口，并且随后对连接的所述预装色谱柱以及所述管和阀组进行灭菌。
3.根据权利要求1所述的方法，其包括独立地对所述预装色谱柱以及所述管和阀组进行灭菌，并且随后将所述管和阀组的灭菌管附接到灭菌柱管入口和灭菌柱管出口。
4.根据权利要求3所述的方法，其中以灭菌的方式将所述管和阀组的灭菌管附接到灭菌柱管入口和灭菌柱管出口包括使用无菌或灭菌连接器或可焊接管。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中灭菌包括用伽马辐射进行辐照。
6.根据权利要求5所述的方法，其中灭菌包括施加至少8kGy的伽马辐射剂量。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中将管附接到所述柱管入口和所述柱管出口包括将所述管的端部连接到固定到所述柱管入口的连接器和固定到所述柱管出口的连接器。
8.根据权利要求7所述的方法，其中所述连接器旋拧到所述柱管入口和所述柱管出口中、夹紧到所述柱管入口和所述柱管出口上或焊接到所述柱管入口和所述柱管出口。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其还包括使所述至少一个阀从所述第一位置移动到第二位置，以沿着第二流路引导所述灭菌或无菌液体。
10.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其还包括使所述至少一个阀从所述第一位置移动到第二位置，并且将灭菌或无菌液体从所述灭菌或无菌液体源泵送到所述柱管出口，通过所述预装柱管，并且从所述柱入口泵送出。
11.根据权利要求10所述的方法，其还包括泵送等于所述腔室的0.1或更多倍容积的一定体积的灭菌或无菌液体。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的方法，其还包括将所述管附接到灭菌或无菌过滤器，并且将灭菌或无菌液体泵送通过所述灭菌或无菌过滤器。
13.根据权利要求12所述的方法，其还包括收集泵送通过所述灭菌或无菌过滤器的所述灭菌或无菌液体，并且测试所述灭菌或无菌液体的一种或多种性质。
14.根据权利要求1至13中任一项所述的方法，其包括利用通气过滤器从所述管和阀组排放压力。
15.根据权利要求1至14中任一项所述的方法，其还包括将来自所述管和阀组的管附接到膨胀袋。
16.根据权利要求1至15中任一项所述的方法，其中所述柱管被预装以用于单次使用并且是一次性的。
17.根据权利要求1至16中任一项所述的方法，其中所述预装色谱柱以及所述管和阀组连接到色谱系统。
18.一种用于生物分子的无菌纯化的系统，所述系统包括：
灭菌预装色谱柱，其包括具有柱管入口和柱管出口的柱管以及布置在所述柱管内以形成填充有装填介质的腔室的第一流动分配器和第二流动分配器；
灭菌管和阀组，其附接到所述柱管入口和所述柱管出口，其中所述管和阀组包括管和至少一个阀，所述至少一个阀被配置成限定流体连接到所述柱管入口和所述柱管出口的至少两个不同流路；以及
泵，其被配置成沿着所述灭菌管和阀组从灭菌或无菌流体源泵送灭菌或无菌液体，其中所述至少一个阀包括第一位置，所述第一位置使得所述灭菌或无菌液体能够沿着第一流路流到所述柱管入口中并从所述柱管出口流出，以沿着所述第一流路从所述腔室、所述管和所述至少一个阀中去除任何夹带的气体、压力或气体和压力两者。
19.根据权利要求18所述的系统，其中灭菌的柱预装有树脂，并且所述柱、树脂和管具有10-3或更好的灭菌保证水平(SAL)。
20.根据权利要求18或权利要求19所述的系统，其还包括控制器，所述控制器被配置和布置成控制所述泵和控制所述至少一个阀的位置。
21.根据权利要求20所述的系统，其中所述控制器包括处理器和存储指令的存储器，所述指令用于由所述处理器执行以打开和关闭所述至少一个阀。
22.根据权利要求18至21中任一项所述的系统，其还包括在柱入口和柱出口处的连接器，所述连接器被配置成形成灭菌或无菌连接，并且允许流体流过形成在所述第一流动分配器与所述第二流动分配器之间的所述腔室。
23.根据权利要求22所述的系统，其中所述连接器被预安装以与所述管和阀组形成灭菌或无菌连接。
24.根据权利要求18至23中任一项所述的系统，其还包括流体附接到所述管和阀组的第二泵。
25.根据权利要求18至24中任一项所述的系统，其还包括通气过滤器，所述通气过滤器布置在所述管和阀组中，以实现从所述预装色谱柱以及所述管和阀组中排放气体、压力或气体和压力。
26.根据权利要求25所述的系统，其中所述通气过滤器包括疏水性通气过滤器和止回阀。
27.根据权利要求18至26中任一项所述的系统，其中色谱柱管由不锈钢、玻璃、聚丙烯(PP)、聚乙烯(PE)、聚酰胺、乙缩醛、或玻璃填充或碳填充塑料或弹性体组分中的一种或多种形成。
28.根据权利要求18至27中任一项所述的系统，其中色谱装填介质是玻璃、塑料、纤维素、琼脂糖、陶瓷或聚合物中的一种，呈粗糙颗粒、纤维、膜或珠粒的形式。
29.根据权利要求18至28中任一项所述的系统，其中色谱柱管被预装以用于单次使用并且是一次性的。

说明书全文

用于从色谱柱中去除压力和空气的方法和系统

[0001] 优先权的要求

[0002] 本申请要求2017年9月21日提交的美国临时申请号62/561,575的权益。前述申请的全部内容以引用方式并入本文。

技术领域

[0003] 本发明涉及用于建立色谱柱的无菌连接同时提供去除截留在柱内的任何压力和空气的能力的方法和系统。

背景技术

[0004] 柱色谱法是分离和/或纯化技术，其中装填介质的固定“床”容纳在刚性管内。装填介质可以呈固体颗粒(“固定相”)或涂覆有液体固定相的固体支撑材料的形式。无论哪种方式，装填介质通常填充柱管的内部容积。

[0005] 在分离色谱中，当液体样品(“流动相”)通过柱时，样品中的不同化合物可以与固定相(例如，装填介质)不同程度地缔合，以使得它们相对于流动相变慢并以不同的速度移动通过柱。因此，与固定相更多缔合的那些化合物比较少缔合的那些化合物更慢地移动通过柱，并且这种速度差导致化合物在它们通过色谱柱时彼此分离。促进差异缔合的固定相的特征可以是例如离子电荷(离子交换色谱)、疏水性(疏水相互作用色谱)和孔隙率(尺寸排阻色谱)。

[0006] 在另一种类型的柱色谱法：亲和色谱法中，装填介质包括与液体样品中的一种或多种所需化合物或分子特定结合的结合剂，诸如抗原、抗体或配体。因此，当液体样品流过装填介质时，只有所需的化合物或分子保留在柱中。洗脱液通过装填介质的随后流将所需的化合物或分子与附着到装填介质的结合剂分离，或将结合剂与装填介质分离。无论哪种方式，都将所需的化合物或分子从柱中冲洗出并收集在洗脱液中。亲和色谱法可以用于许多应用，包括核酸纯化、从无细胞提取物中纯化蛋白质以及从血液中纯化。

[0007] 色谱柱的主要部件是通常由金属、玻璃或高刚性塑性材料制成的管和一对流动分配器，所述一对流动分配器通常插入管的两端中以在流动分配器之间的管中形成空间或腔室，装填介质装载到所述空间或腔室中。流动分配器被设计成具有集成的多孔表面，诸如保留色谱介质的筛网、筛孔或熔块(frits)。

[0008] 根据用于发展和商业生物工艺制造的需求，色谱柱可以被预装(pre-packed)并使用。这些柱被生产并以床高固定，以使得流动分配器在色谱管内不可逆地对准。生物工艺的新发展，诸如连续工艺或多产品设施，要求对微生物的控制更加严格。从细胞培养到下游纯化的无菌连接策略和流路对于降低污染风险至关重要。蒸汽和辐射灭菌已应用于一次性生物反应器、流路和最近用于生物制剂纯化的色谱柱。然而，在某些情况下，装填介质溶液的放气可能在伽马辐照过程中发生，从而在柱的装填床内形成气穴和加压。在这种情况下，装填床可能对流体流动动力学产生负面影响。因此，需要设计预装色谱柱，其无菌或灭菌且无气体，并且其不会损害柱的分离性能或增加在柱的正常使用期间增加不必要的生物负担的风险。

发明内容

[0009] 本发明至少部分地基于以下发现：如果将如本文所指定的管和阀系统连接到预装色谱柱以创建封闭系统，则随后可以例如利用伽马辐照对封闭系统进行灭菌，并且然后使用管和阀系统来简单且容易地冲洗(purge)在灭菌过程中在封闭系统内部可能已形成的任何气泡和/或压力，并且维持封闭系统的灭菌性。因此，新的系统和方法可以维持装填柱的性能，并且避免在使用过程中由于在辐照期间和在使用前由柱内的放气所形成的气泡和/或压力而中断色谱流路。

[0010] 柱可以装填有各种类型的色谱介质，并且可以用于制造生物制剂。根据本发明制备的预装柱可以通过大于或等于8kGy的伽马辐射剂量灭菌。伽马辐照后的功能流体分布(例如，通过理论塔板高度(HETP)或HETP和不对称性测试测量)与去除气体后的原始值相似。

[0011] 本公开描述所连接的管线的有效灌注并且随后将回流、也称为向上流动(例如，与柱使用期间典型的向前流动方向相反的流动，而不必具有能够反向流动的色谱系统)提供到柱以去除夹带的空气并恢复装填床的功能。排出(effluent)流可以经由出口离开，其可以经由连接到灭菌或无菌过滤器的流路离开，或者其可以收集在为此目的而附接的膨胀袋中。还可以结合灭菌级疏水性通气过滤器，以减轻压力积聚或排泄截留的气体。与止回阀结合的该通气过滤器会确保在一个方向上通气而不会回流到系统中。

[0012] 在一个方面，本公开提供从预装色谱柱中去除夹带的气体、压力或气体和压力两者的方法，所述色谱柱包括具有柱管入口和柱管出口的柱管以及布置在所述柱管内以形成填充有装填介质的腔室的第一流动分配器和第二流动分配器。所述方法包括：(a)获得包括管和至少一个阀的管和阀组，所述至少一个阀被配置成限定通过所述管的至少两个不同流路；(b)：(i)将所述管和阀组的管附接到所述柱管入口和所述柱管出口，并且随后对连接的所述预装色谱柱以及所述管和阀组进行灭菌，或者(ii)独立地对所述预装色谱柱以及所述管和阀组进行灭菌，并且随后以维持所述柱以及所述管和阀组两者的灭菌性的方式将所述管和阀组的灭菌管附接到灭菌柱管入口和灭菌柱管出口；(c)将灭菌管和阀组附接到灭菌或无菌流体源和流体出口；以及(d)沿着其中所述至少一个阀处于第一位置的所述管和阀组从所述灭菌或无菌流体源泵送灭菌或无菌液体，沿着第一流路泵送到所述柱管入口中并从所述柱管出口泵送出，从而沿着所述第一流路从所述腔室、所述管和所述至少一个阀中去除任何夹带的气体、压力或气体和压力两者，而不会破坏所述预装色谱柱以及所述管和阀组的所述灭菌性。

[0013] 在这些方法中，以灭菌的方式将所述管和阀组的灭菌管附接到灭菌柱管入口和灭菌柱管出口可以包括使用无菌或灭菌连接器或可焊接管。在这些方法中，灭菌可以通过辐照(例如，通过伽马辐射)来实现。例如，通过施加至少8kGy的伽马辐射剂量。

[0014] 在一些实施例中，将管附接到所述柱管入口和所述柱管出口包括将所述管的端部连接到固定到所述柱管入口的连接器和固定到所述柱管出口的连接器。例如，可以将所述连接器旋拧到所述柱管入口和所述柱管出口中、夹紧到所述柱管入口和所述柱管出口上或焊接到所述柱管入口和所述柱管出口。

[0015] 在某些实施方式中，所述方法还可以包括使所述至少一个阀从所述第一位置移动到第二位置，以沿着第二流路引导所述灭菌或无菌液体。在其他实施方式中，所述方法还包括使所述至少一个阀从所述第一位置移动到第二位置，并且将灭菌或无菌液体从所述灭菌或无菌液体源泵送到所述柱管出口，通过所述预装柱管，并且从所述柱入口泵送出。例如，这些方法可以包括泵送等于腔室的0.1、0.2、0.3、0.4、0.5或更多倍容积的一定体积的灭菌或无菌液体。

[0016] 在一些实施例中，所述方法还包括将所述管附接到灭菌或无菌过滤器，并且将灭菌或无菌液体泵送通过所述灭菌或无菌过滤器。在一些实施方式中，所述方法还可以包括收集泵送通过所述灭菌或无菌过滤器的所述灭菌或无菌液体，并且测试所述灭菌或无菌液体的一种或多种性质。

[0017] 在一些实施方式中，所述方法可以包括利用通气过滤器从所述管和阀组排放压力。在一些实施方式中，所述方法还包括将来自所述管和阀组的管附接到膨胀袋。

[0018] 在一些实施例中，所述方法与被预装以用于单次使用并且是一次性的柱管一起使用。通常，所述方法可以在所述预装色谱柱以及所述管和阀组连接到色谱系统时使用。

[0019] 在另一方面，本公开的特征在于用于生物分子的无菌纯化的系统。所述系统包括灭菌预装色谱柱，其包括具有柱管入口和柱管出口的柱管以及布置在所述柱管内以形成填充有装填介质的腔室的第一流动分配器和第二流动分配器；灭菌管和阀组，其附接到所述柱管入口和所述柱管出口，其中所述管和阀组包括管和至少一个阀，所述至少一个阀被配置成限定流体连接到所述柱管入口和所述柱管出口的至少两个不同流路；以及泵，其被配置成沿着所述灭菌管和阀组从灭菌或无菌流体源泵送灭菌或无菌液体，其中所述至少一个阀包括第一位置，所述第一位置使得所述灭菌或无菌液体能够沿着第一流路流到所述柱管入口中并从所述柱管出口流出，以沿着所述第一流路从所述腔室、所述管和所述至少一个阀中去除任何夹带的气体、压力或气体和压力两者。

[0020] 在这些系统中，灭菌柱可以预装有树脂，并且所述柱、树脂和管具有10-3或更好的灭菌保证水平(SAL)。

[0021] 在一些实施方式中，所述系统还包括控制器，所述控制器被配置和布置成控制所述泵和控制所述至少一个阀的位置。例如，在一些实施例中，所述控制器包括处理器和存储指令的存储器，所述指令用于由所述处理器执行以打开和关闭所述至少一个阀。

[0022] 在一些实施例中，所述系统还包括在柱入口和柱出口处的连接器，所述连接器被配置成形成灭菌或无菌连接，并且允许流体流过形成在所述第一流动分配器与所述第二流动分配器之间的所述腔室。例如，在一些实施例中，所述连接器被预安装以与所述管和阀组形成灭菌或无菌连接。

[0023] 在某些实施方式中，所述系统还包括流体附接到所述管和阀组的第二泵。在一些实施方式中，所述系统还包括通气过滤器，所述通气过滤器布置在所述管和阀组中，以实现从所述预装色谱柱以及所述管和阀组中排放气体、压力或气体和压力。例如，此类通气过滤器可以是或包括疏水性通气过滤器和止回阀。

[0024] 在某些实施例或这些系统中，色谱柱管由不锈钢、玻璃、聚丙烯(PP)、聚乙烯(PE)、聚酰胺、乙缩醛、或玻璃填充或碳填充塑料或弹性体组分中的一种或多种形成。在不同的实施例中，色谱装填介质是玻璃、塑料、纤维素、琼脂糖、陶瓷或聚合物中的一种，呈粗糙颗粒、纤维、膜或珠粒的形式。在某些实施方式中，色谱柱管被预装以用于单次使用并且是一次性的。

[0025] 在某些情况下，可以通过灭菌或无菌连接或通过焊接将如本文所述的具有附接的管和阀组的色谱柱附接到色谱系统(例如，AKTATMReady，GE Healthcare)。可以通过打开阀组或使用本文所述的灌注顺序，将由灭菌过程(例如，由伽马辐照)引起的在色谱柱以及管和阀组中的任何超压和/或气体或气泡通过色谱系统排放。

[0026] 在某些情况下，管是可焊接的，以形成封闭的过程流路。管和阀组可以在伽马辐照之前或之后形成灭菌或无菌连接。

[0027] 如本文所用，术语“树脂”、“分离介质”、“色谱介质”和“介质”均指悬浮在液体中的用于填充色谱柱的颗粒。这些树脂的示例包括由玻璃、塑料、聚合物、纤维素、琼脂糖和其他物质制成的材料。树脂可以是粗糙颗粒或珠粒。珠粒可以是单分散的或具有多种尺寸，并且可以例如在15μm至200μm的尺寸之间变化。可以将树脂改性以包含影响与颗粒的结合以实现进料流中蛋白质和其他物质的分离的各种取代基。取代基可以是带正电或带负电的，或疏水的，或特定的亲和力部分(诸如蛋白质A)或这些性质的组合。在某些情况下，色谱柱填充有保留在流体分配系统中的纤维、膜或整料(monoliths)。

[0028] 如本文所用，术语“连接器”是指实现灭菌或无菌连接(例如，机械配合或适合于与灭菌或无菌管焊接部接合的一个或多个位置)的接合装置。

[0029] 如本文所用，术语“无菌”是指被设计为减少来自病原体(例如，病原菌、病毒、真菌和/或寄生虫或有害孢子)的污染的可能性的条件或工艺。

[0030] 术语“灭菌”通常是指被设计为实现这样的环境的条件或工艺，所述环境不含或基本上不含所有活的微生物(有害的或其他的)及其孢子。如本文所用，“灭菌”是指10-3或更好的灭菌保证水平(SAL)。

[0031] 除非另外定义，否则本文所用的所有技术术语和科学术语具有本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。尽管在本发明的实践或测试中可以使用与本文所述的方法和材料类似或等同的方法和材料，但是下面描述示例性方法和材料。本文提及的所有出版物、专利申请、专利和其他参考文献的全部内容以引用的方式并入本文中。如果发生冲突，将控制包括定义的本说明书。此外，材料、方法和示例仅仅是说明性的，并且不旨在限制。

[0032] 在附图和以下具体实施方式中阐述本发明的一个或多个实施例的细节。根据具体实施方式和附图以及权利要求书，本发明的其他特征、目的和优点将显而易见。

附图说明

[0033] 图1A-1E是如本文所述的灭菌或无菌色谱柱和连接到柱的形成封闭系统的流体流路的阀和管的相关联系统的实施例的示意图。

[0034] 图2A和2B是如本文所述的灭菌或无菌色谱柱和连接到柱的形成封闭系统的流体流路的阀和管的相关联系统的另一个实施例的示意图。

[0035] 图3A-3E是如本文所述的灭菌或无菌色谱柱和连接到柱的形成封闭系统的流体流路的阀和管的相关联系统的另一个实施例的示意图。

[0036] 图4是形成封闭系统的灭菌或无菌色谱柱以及阀和管系统的实施例的示意图。

[0037] 图5是形成封闭系统的灭菌或无菌色谱柱以及阀和管系统的实施例的示意图。

[0038] 图6是形成封闭系统的灭菌或无菌色谱柱以及阀和管系统的实施例的示意图。

[0039] 图7是用于封闭系统的灭菌或无菌色谱柱以及阀和管系统的实施例的示意图。

[0040] 图8是用于封闭系统的灭菌或无菌色谱柱以及阀和管系统的实施例的示意图。

[0041] 图9A-9D是用于测试图1A的柱的实验单元的示例的图示。

[0042] 图10A-10J是示出表1的实验数据的色谱图。

[0043] 各个图中的类似的参考符号指示类似的元件。

具体实施方式

[0044] 本公开描述用于布置在包括一系列阀和管的封闭系统中的预装色谱柱的伽马辐照的新方法和系统，其中通过装填柱床的性能保持适合于其预期用途，并且其中阀和管的系统可以用于从封闭系统中冲洗可能在例如通过伽马辐照进行灭菌过程中产生的气体。

[0045] 预装或一次性色谱柱可以通过伽马辐射灭菌，并且显示出维持装填床的完整性，例如，如通过非相互作用的小分子的脉冲注入所测量的。然而，在某些情况下，装填介质溶液的放气可能在伽马辐照过程中发生，从而在柱的装填床和连接的灭菌或无菌管内产生不希望的气穴气体或气泡和/或压力，其可能对流体流动动力学产生负面影响。在某些情况下，发生柱的加压。本公开通过使用安装到预装柱的入口和出口的管和阀系统以及通气过滤器来解决截留的压力、气体或空气的问题。这些管、阀系统和通气口允许与色谱系统的封闭无菌连接，从而允许在维持封闭系统和无菌性的同时，从柱中去除夹带的气体。这些管阀系统和通气方法导致这样的预装柱，所述预装柱具有与原始预辐照值相当的装填床性能。管可以是任何类型的管，诸如硅树脂、编织/硅树脂、等。

[0046] 因此可以避免由于来自柱内放气的气泡和/或压力而导致的色谱流路的中断。柱可以例如用具有硅、琼脂糖、陶瓷或聚合物主链的色谱介质装填，所述色谱介质可以用亲和配体(例如，蛋白质A–重组天然结构或工程化的功能位点(domain))、离子相互作用配体、混合模式配体或疏水配体进行功能化。柱被装填并储存在可能包含有机组分(例如，2％苯甲醇、20％乙醇)的含水缓冲液中。这些柱可以用于制造生物制剂，诸如蛋白质、病毒、病毒样颗粒、外来体等。如本文所述制备的预装柱通过通常大于或等于8kGy的伽马辐射剂量灭菌。通过理论塔板高度(HETP)和不对称性测试测量的伽马辐照后的功能流体分布显示与去除气体后的原始值相似的值。

[0047] 色谱柱

[0048] 柱管是中空的柱形构件，并且通常是圆形柱体，其允许流体(例如，液体)从第一端(例如，上端)流到第二端(例如，下端)。管的内径的大小和构造被设计成接收用于将流体递送到管和从管中去除流体的流动分配器。基于各种色谱柱的性能规格，管可以被制成各种不同的大小和构造，并且包括系列色谱柱和在生物制药应用(Repligen Corp.，Waltham，MA)中使用的其他柱。

[0049] 本文所述的色谱部件可以由各种结构和化学上合适的材料中的任何材料制成。例如，部件可以由各种塑料制成，诸如热塑性塑料(例如，丙烯腈丁二烯苯乙烯(ABS)、丙烯酸(PMMA)、聚丙烯(PP)、聚氯乙烯(PVC)、聚四氟乙烯(PTFE)、其他热塑性塑料或复合材料)和热固性塑料(例如，环氧树脂和纤维增强塑料)。柱还可以完全由金属(例如，不锈钢)或由其他玻璃或刚性塑料(诸如聚酰胺(诸如各种尼龙)、乙缩醛或玻璃填充或碳填充塑料(例如，玻璃纤维和碳纤维塑料))或弹性体组分制成。材料选择考虑因素可以包括材料的特定机械性能以及材料是否将承受系统的感应内部工作压力。柱的设计使其可以装填有各种类型的色谱装填介质，例如树脂、其他多孔或无孔材料，以达到在0cm和50cm之间或更长范围内无限变化的“床高”。内径可以是例如但不限于5、8、10、12.6、15、20、25、30、40、50或60cm或更长，长达约80、90或100cm或更长。

[0050] 在这些柱中使用的流动分配器呈具有一个或多个入口开口/出口开口的柱形盘的形式，所述开口使得液体能够流入和流过盘。另外，流动分配器可以包括附接到流动分配器盘的装填介质侧的床支架、筛网和/或过滤器。柱在流动分配器与柱管的内壁之间也可能或可能不结合O形环。流动分配器的流路可以根据标准实践和已知设计来设计，并且流动分配器本身可以例如由与管相同或相似的塑性材料制成，但是也可以由金属、陶瓷和对要流过柱的液体和试剂呈惰性的其他刚性材料制成。

[0051] 本文所述的色谱柱的管可以装填有如由最终用户指定的用于柱色谱法中的任何固相介质材料。潜在的装填介质材料的该多样性扩展到基础颗粒的组成以及它们的功能性化学性质(例如，亲和力、离子交换和疏水相互作用)。装填介质材料可以包括添加到流动相液体或溶剂的固定相颗粒浆料。固定相颗粒可以包括各种粒径的硅胶(SiO2)、陶瓷、氧化铝(Al2O3)、纤维素、琼脂糖、聚合物以及其他合适的材料。流动相可以包括各种溶剂(诸如去离子水、缓冲盐溶液、乙醇或用于色谱分离的其他常用溶液)中的一种或多种。

[0052] 用于去除气体的阀和管的系统

[0053] 本文所述的用于去除气体和灌注色谱柱的管和阀组可以附接到可以经受伽马辐照以进行灭菌的呈预装形式的柱或任何色谱柱。通常，8kGy或更大的辐射剂量是有效的。在一些实施方式中，可以使用25kGy-45kGy的剂量范围。如上所述，柱由能够承受这种辐照的材料构建。另外，连接到柱的管和阀组也由伽马稳定的材料构建。

[0054] 图1A示出灭菌或无菌色谱柱系统10，其可以用于灭菌或无菌纯化生物分子(例如，蛋白质，诸如抗体、病毒、病毒样颗粒、外来体等)。色谱柱20(诸如色谱柱)附接到管和阀系统或组30。管组30的上游管部分32在一端附接到流体源或流体入口40，并且在另一端附接到柱入口22。管组30的附加部分(即下游管部分34)在第一端附接到流体汇(sink)或流体出口50，并且在第二端附接到柱出口24。管和阀组30包括附加管分支36。这些管分支36可以将上游管32连接到下游管34，以产生供液体流过管和阀组30的多个流路。

[0055] 柱入口22和柱出口24是附接到柱20以及管和阀系统30的连接器。在某些情况下，柱入口22和柱出口24的连接器与柱20成一体。在其他情况下，柱入口22和柱出口24的连接器与管和阀系统30成一体。柱入口22和柱出口24的连接器可以灭菌或无菌的方式将管和阀组30附接到柱20。例如，柱入口22和柱出口24的连接器可以焊接到柱20，并且随后可以在焊接后经受伽马辐照。可替代地，柱入口22和柱出口24的连接器可以焊接到管和阀组30。在所有情况下，管和阀组30、柱入口22和柱出口24的连接器、以及柱20在它们彼此附接后可以经受伽马辐照。在所有情况下，可以在柱的灭菌之前或之后将管附接到柱。在某些情况下，柱20在入口22和出口24上包括可焊接的灭菌或无菌连接，并且管和阀组30可以在上游管部分
32上和/或在下游管部分34上包括可焊接管或连接器。在不同的情况下，可焊接的灭菌或无菌连接器在伽马辐照过程之前、期间或之后附接到柱20和管组30，并且它们使得灭菌或无菌连接得以建立和维持。

[0056] 管和阀组30包括多个阀，例如在图1A中，存在阀1-8。阀定位在沿着管和阀组30的上游32和下游34部分以及沿着管分支36的各个位置处。打开和关闭阀1-8可以允许或防止从流体入口40进入管和阀组的流体沿着管和阀组30的不同部分流动，例如，打开和关闭阀1-8将流体沿着不同的流路引导，所述流路可以包括上游管并且可能或可能不包括柱20、下游管34、或管分支36中的一个或多个。控制器55(示意性地示出)可以连接到阀1-8和将液体从流体入口40推动通过管和阀组30的泵45或(多个泵)。控制器55可以使阀1-8(或更多阀，取决于整个系统)的打开和关闭与泵的速度同步，以执行如下所述的灌注和使用灭菌或无菌色谱柱系统10的步骤。

[0057] 在一些实施方式中，新系统包括具有手动打开和关闭能力无需控制器55的阀，例如阀1-8。在一些实施方式中，系统包括控制器55，所述控制器包括一个或多个处理器以及包含由所述一个或多个处理器执行的软件指令的易失性或非易失性存储器，所述软件指令包括用于操作阀和泵的软件指令。软件指令存储在任何类型的非暂时性计算机可读介质上，并且可由所述一个或多个处理器执行以执行指令，包括用于使阀1-8(或更多阀，取决于整个系统)的打开和关闭与泵的速度同步以执行灌注和使用灭菌或无菌色谱柱系统10的步骤(如本文所述并如图(例如，图1A至图1E、图2A至图2B和图3A至图3E)所示)的指令，所述图示出根据用于不同的阀组和不同的灌注、向上流动和向下流动顺序的不同方案(protocol)打开和关闭不同阀的特定顺序。

[0058] 图1A至图1E的灭菌或无菌色谱柱系统10可以用于灌注色谱柱20，同时去除可能存在于柱20、管30和任何连接器(诸如柱入口22和柱出口24)中的任何气泡和/或压力。例如，第一灌注顺序在图1B中示出。该第一灌注顺序提供柱的灌注初始化和向上流动(例如，回流)调理(conditioning)，如下面针对前向流泵所述。

[0059] 在图1B中，阀1、2、3、5、6和7打开，而阀4和8如由“X”所指示关闭。该构造允许流动通过(例如，向下通过)上游管32，例如，流体从流体入口40向下流动以灌注上游管32。该构造还允许柱20的向上流动(例如，回流)调理，例如，从柱出口24流动通过柱20，并且通过入口22流出，并且其中缓冲液或存储溶液用于灌注柱20，随后从流体出口50离开。通常，一个或多个柱容积(CV)的流体被泵送通过柱(例如，1CV、3CV、5CV或10CV)。小于1CV也可能有效。柱容积被定义为形成在第一流动分配器与第二流动分配器之间的柱管内的腔室的容积，并且在该应用中，在进行灌注操作的同时填充有装填介质。如图1B中的箭头所示，流体从流体入口40沿着上游管32通过顶部管分支36行进到下游管32，并且随后从柱出口24通过柱20，从柱入口22流出，沿着底部管分支36并在流体出口50处离开系统。

[0060] 第二灌注顺序在图1C中示出。该顺序灌注管和阀组30的顶部部分，例如管和阀组30的最靠近流体入口40和流体出口50的部分。在这种情况下，阀1、2、3和8打开，而阀4、5、6和7关闭。流体向下流从入口行进，并且随后经由上分支36从流体出口50离开。流体流被控制持续至少直到管的最靠近阀8的部分填充有流体。

[0061] 第三灌注顺序在图1D中示出。该顺序灌注管和阀组30的其余部分，例如管和阀组30的最靠近阀4的部分。在这种情况下，阀1、3、4和5打开，而阀2、6、7和8关闭。流体向下流从入口40并沿着包括阀4的上游管32行进到具有阀5的管分支36，随后到下游管34的通向流体出口的后面部分。流体流被控制持续至少直到管的最靠近阀5的部分填充有流体。

[0062] 在某些情况下，并且因为在伽马辐照之后，在管组的上部中可能存在气泡和/或压力，所以在通过柱的任何流动之前，首先和其次在经伽马辐照后的柱中执行图1C和图1D的灌注步骤。这样做确保没有更多的空气将进入柱。在各种情况下，图1D的灌注步骤可以在图1C的灌注步骤之前进行，反之亦然。通常，图1C和图1D的灌注步骤可以在图1B之前按任何顺序进行，只要没有空气在向下流动中进入柱即可。

[0063] 第四灌注顺序在图1E中示出。该顺序灌注管34的下游部分。该构造还用于使用管和阀组30的向下流动操作。在此，阀1、3、4、6、7和8打开，而阀2和5关闭。通过该阀设置，向下流动操作通过从入口40的向下流动来实现，并且溶液将从流体出口50离开，如箭头所示。

[0064] 在完成图1B-1E所示的灌注顺序(图1B示出向上流动顺序，并且图1E示出向下流动顺序)之后，管和阀组30以及柱20完全填充有液体并且准备好进行色谱操作，其中将可能已经存在的任何气泡和/或压力去除。残留在出口部分34中的任何空气将通过向下流动去除。

[0065] 系统10还可以在使用管组的同时用于向上流动操作。对于向上流动操作，阀1、2、3、6和7打开，而阀4和8关闭。该构造允许与图1B所示的相同的流体流路用于柱的向上流动调理。在图1A和图2B的两个系统中，发生向上流动而没有附加的更改，诸如将柱上下颠倒翻转、或者对系统进行其他更改，诸如反转将流体从流体入口40推动到流体出口50的泵45的方向。此外，这种向上流动顺序不需要使柱在物理上重新铅垂(plumbed)，从而维持柱以及管和阀组的无菌/灭菌特性，例如，如果柱经受了伽马辐照的话。

[0066] 参考图2A，示出灭菌或无菌色谱柱系统100的第二实施例。灭菌或无菌色谱柱系统100的部件与图1的部件相似并且相同的附图标记指代相同的系统元件。图2A中的实施例具有与图1A所示的相似的流路，但仅包括阀2、4、5和8。当以向下流动操作使用时，阀2和5关闭(如由图中每个阀上的X所指示)，并且流路如箭头所示。参考图2B，当以向上流动操作使用时，阀4和8关闭(如由图中每个阀上的X所指示)，并且流路如箭头所示。

[0067] 在一些实施例中，离开柱20的流体不流出流体出口50。图3A示出类似于先前实施例的灭菌或无菌色谱柱系统200，并且相同的元件用相同的附图标记编号。然而，管和阀组仅包括阀1-7，并且包括阀5的管分支36并不将上游管32连接到下游管34。替代地，该管分支36在一端流体连接到上游管32，并且在第二端流体连接到串联(inline)灭菌或无菌过滤器
60。串联灭菌或无菌过滤器60可以用作用于灌注管和阀组30的出口，而不是流体出口50。在一些实施例中，串联灭菌或无菌过滤器60可以连接到流体收集容器65。收集在流体收集容器65中的流体可以用于测试目的，例如以确定柱20内的流体和/或树脂的状态或性质。

[0068] 图3A的灭菌或无菌色谱柱系统200可以用于灌注色谱柱20，同时例如去除可能存在于柱20、管30和任何连接器(诸如柱入口22和柱出口24)中的任何气泡和/或压力。系统200的第一灌注顺序在图3B中示出。如图所示，阀1、2、5、6和7打开，而阀3和4关闭。该构造允许上游管32的液体向下流动和柱20的向上流动调理。通常，三个或更多柱容积(CV)的流体被泵送通过柱。如图3B中的箭头所示，流体从流体入口40沿着上游管32通过连接管分支36行进到下游管32，并且随后从柱出口24通过柱20并且从柱入口22流出。由于阀4关闭，流体随后沿着管分支36转移到串联灭菌或无菌过滤器60并可选地转移到收集容器65。

[0069] 第二灌注顺序在图3C中示出。该顺序灌注管和阀组30的顶部部分，例如管和阀组30的最靠近流体入口40和流体出口50的部分。在这种情况下，阀1、2和3打开，而阀4、5、6和7关闭(或者可替代地，仅阀4和7关闭)。流体向下流从流体入口40跨具有阀2的管分支36行进，并且随后从流体出口50离开。流体被控制持续流动至少直到管的包括阀2的部分填充有流体。

[0070] 第三灌注顺序在图3D中示出。该顺序灌注管组30的其余部分，例如管组30的最靠近阀4的部分。在这种情况下，阀1、4和5打开，而阀2、3、6和7关闭。流体向下流从入口40并沿着包括阀4的上游管32行进到具有阀5的管分支36，并且流出到串联灭菌或无菌过滤器60。流体流动至少直到管的最靠近阀4的部分填充有流体。在某些情况下，在通过柱的任何流动之前，首先和其次在经伽马辐照后的柱中执行图3C和图3D的灌注步骤。这样做确保没有更多的空气将进入柱。这些步骤也可以颠倒。

[0071] 在图3B-3D所示的灌注顺序之后，管和阀组30以及柱20完全填充有液体并准备好进行色谱操作。用于使用管组30的向下流动操作的构造在图3E中示出。在此，阀1、3、4、6和7打开，而阀2和5关闭。通过该阀设置，向下流动操作通过从入口40的向下流动来实现，并且溶液将在穿过柱20的同时如箭头所示从流体出口50离开。

[0072] 图4示出附加的灭菌或无菌色谱柱系统300。除了与上面在实施例中讨论的相同的元件之外，系统300还包括第二流体入口42和第二流体出口52以及相关联的附加阀。因此，除了连接到串联灭菌或无菌过滤器60的可选流体容器之外，各种流体源和汇也是可能的。第二泵47示出为连接到第二流体入口42，然而在系统300中，如在本文所述的所有灭菌或无菌系统中那样，多于一个或两个流泵是可能的。在某些情况下，使用一个或多个泵，以使得操作员可以使用一组入口和出口连接器并对管组和柱进行预灌注，以去除所有空气并且随后夹断这些管。之后，可以在以后使用柱，而无需对柱进行再次灌注。此外，因为仍然存在一组未使用的灭菌或无菌连接器，所以柱可以再次在灭菌或无菌条件下连接。可替代地，操作员可以使用两组灭菌或无菌连接来两次使用柱。

[0073] 图5示出附加的灭菌或无菌色谱柱系统400。除了与上面在实施例中讨论的相同的元件之外，系统400还包括膨胀袋70。膨胀袋70可以部分地填充有缓冲液。膨胀袋70可以可选地包括在系统400外部的通气口，所述通气口包括灭菌或无菌过滤器。灭菌或无菌色谱柱系统400还可以包括次级泵80。除了就位的泵送系统45之外，次级泵80也流体连接到管和阀系统30，并且可以将液体推动或拉动通过管30。次级泵可以是手动的，例如注射器或波纹管(bellows)泵。如果需要，次级泵80可以引导流体向上流动，而不是通过使用阀来重新引导流体。

[0074] 图6示出附加的灭菌或无菌色谱柱系统500。除了与上面关于图1A讨论的相同的元件之外，系统500还包括图4和图5的实施例的特征件。这些特征件包括第二流体入口42和第二流体出口52、膨胀袋70以及灭菌或无菌过滤器60。附加的阀连接各种管元件，并且控制器55可以将流体引导到所有这些元件。

[0075] 图7示出附加的灭菌或无菌色谱柱系统600。除了与上面关于图1A讨论的相同的元件之外，系统600还包括被结合以减轻压力积聚或排泄截留的气体的灭菌级疏水性通气过滤器601。与止回阀602结合的疏水性通气过滤器601确保在一个方向上通气而不会回流到系统600中。

[0076] 图8示出附加的灭菌或无菌色谱柱系统700。除了与上面关于图1A讨论的相同的元件之外，系统700还包括管组701和柱20，所述管组和柱包括允许在伽马辐照后独立地并以灭菌或无菌的方式连接管组和柱的可焊接管或灭菌或无菌连接部A、B、C、D。只要在伽马辐照之后将两部分灭菌或无菌连接的方法是可用的，就可以分别对柱20和管组701进行伽马辐照。图7示出存在于柱20和管组701上的可焊接管702。可以在可焊接管702之间焊接灭菌或无菌连接(A至C和B至D)，或者可以通过灭菌或无菌连接器(未示出)进行灭菌或无菌连接。管组701到色谱柱20上的伽马后灭菌或无菌附接可以应用于任何管组701，只要在伽马辐照之后将两部分灭菌或无菌连接的方法是可用的。

[0077] 示例

[0078] 以下示例说明但不限制本文所述的系统和方法。

[0079] 示例1：评估管组和灌注顺序

[0080] 在伽马辐照过程中，封闭的柱内出现气体和加压，这可能对柱的可用性产生负面影响。通过管和阀组，可以如本文所述从柱中去除这些气体和压力。该实验的目的是证明管和阀组30的除气效率。使用了两个预装柱(Repligen Corporation)。每个预装柱的尺寸为内径10cm、床高20cm，装填有GE Healthcare CaptoTMS，琼脂糖基阳离子交换树脂。在该实验中，管组未被灌注并且(充满空气)以展示伽马处理的模型效果的最坏情况。

[0081] 具有管组的柱连接到了 (图9D)。管组按以下顺序进行了灌注：

[0082] 步骤1：阀1、2、8和3打开，并且阀4、5、6和7关闭。

[0083] 步骤2：阀1、4、5和3打开，并且阀2、6、7和8关闭。

[0084] 步骤3：向上流动操作顺序(例如，泵的向前方向)-阀1、2、7、6、5和3打开，并且阀4和8关闭。

[0085] 步骤4：向下流动操作顺序-阀1、4、6、7、8和3打开，并且阀2和5关闭。

[0086] 在此过程中进行了一些观察。前两个顺序灌注了管组的大部分。由于出口管线定位在与位于柱的顶部处的入口管线相同的高度处，因此向上流动顺序会在不将空气引入柱的底部中的同时灌注入口管线。向下流动顺序灌注了出口和管组的最后一段。

[0087] 总之，在完成了灌注顺序后，如通过目视检查确定的，管组不包含任何夹带的空气。阀组合装置已证明具有经由上述方法从柱和管系统中去除空气的功能性。

[0088] 示例2：伽马辐照之后去除空气和柱性能测试

[0089] 进行了以下实验以评估图1A所示的灭菌或无菌色谱柱系统，以确认该实施例可以在伽马辐照之后完全灌注并去除管组30中的截留空气。附加地，进行了测试以确认用于灌注向上流动和向下流动操作的阀组合设置，并且确定添加管和阀组30不影响柱性能。

[0090] 示例1中使用的两个预装柱也用于该实验。在伽马灭菌之前，在具有或不具有管组的情况下，在色谱系统(GE Healthcare)上对这两个柱的HETP(N/m)和不对称性进行测试。在100mM NaCl中通过1％CV 1M NaCl尖峰注入以100cm/hr对柱进行了测试。添加管组不影响这些柱的柱性能(表#1)。

[0091] 图9A-9C示出了附接到 10cm内径柱的管和阀组30。图9D示出附接到的管和阀组30。

[0092] 在准备进行伽马辐照时，每个管组和预装柱组件用包含2％苯甲醇的磷酸盐缓冲盐水(PBS)灌注并储存。储存后和伽马辐照之前，在管组件中未观察到空气。

[0093] 将柱进行伽马辐照至25-40Gy的目标范围。

[0094] 伽马灭菌后，在每个管组组件内在以下位置中均观察到了夹带的空气：

[0095] ·在以下位置处观察到了气泡：

[0096] ο在阀1和4之间

[0097] ο在阀7和8之间

[0098] ο在阀6下方

[0099] 两个柱均在伽马辐照后进行了柱性能测试。

[0100] 用100mM NaCl以100厘米/小时的流速灌注管组。

[0101] 灌注顺序：

[0102] 步骤1：阀1、2、8和3打开，并且阀4、5、6和7关闭。

[0103] 步骤2：阀1、4、5和3打开，并且阀2、6、7和8关闭。

[0104] 步骤3：向下流动顺序-阀1、4、6、7、8和3打开，并且阀2和5关闭。

[0105] 在向下流动顺序过程中，观察到了空气从柱出口24中去除。测试了两个柱，并且与伽马辐照前相比，观察到了两个柱的HETP(N/m)降低。伽马辐照后，柱#1的不对称性落后更加严重(表1)。

[0106] 随后对具有管组的两个柱执行向上流动顺序(阀1、2、7、6、5和3打开，并且阀4和8关闭)，并且观察到了空气从柱的入口离开。对柱进行了测试，与初始的伽玛辐照后的测试相比，两个柱的HETP(N/m)得到改善并且柱#1的不对称性得到改善。

[0107] 表1

[0108]

[0109] 总之，在伽马辐照后，管和阀组成功地去除了在管组中发现的气泡。此外，管和阀组还通过向上流动操作帮助恢复了损失的HETP(N/m)。下图示出以下结果：

[0110] 图10A示出装填之后CaptoTMS柱#1(10x20cm)初始测试的结果。

[0111] 图10B示出伽马辐射之前CaptoTMS柱#1再测试的结果。

[0112] 图10C示出在管组的情况下进行伽马辐射之前CaptoTMS柱#1-10x20cm-测试。

[0113] 图10D示出装填之后CaptoTMS柱#2-10x20cm-初始测试。

[0114] 图10E示出伽马辐射之前CaptoTMS柱#2-10x20cm-再测试。

[0115] 图10F示出在管组的情况下进行伽马辐射之前CaptoTMS柱#2-10x20 cm-测试。

[0116] 图10G示出CaptoTMS柱#2-伽马后测试-仅灌注管组(没有通过柱的向上流动)。

[0117] 图10H示出CaptoTMS柱#2-伽马后测试-1CV的柱的向上流动之后。

[0118] 图10I示出CaptoTMS柱#1-伽马后测试-仅灌注管组(没有通过柱的向上流动)。

[0119] 图10J示出伽马后测试中的CaptoTMS柱#1-在管组的情况下1CV的向上流动之后。

[0120] 示例3：伽马辐照后加压

[0121] 在伽马辐照过程中，封闭的柱和管组组件内出现气体和加压，这可能对柱的可用性产生负面影响。如示例2中所述，使用本文所述的管和阀组可以从柱中去除这些气体和过大的压力。

[0122] 本实验的目的是证明伽马辐照会导致柱、管和阀组和/或柱以及管和阀组组件的加压。使用了两个预装柱(Repligen Corporation)。每个预装柱的尺寸为内径10cm、床高20cm，装填有GE Healthcare CaptoTMS，琼脂糖基阳离子交换树脂。对于该实验，两个柱以一定长度的管附接到柱的入口和出口，其中压力传感器附接到入口管。

[0123] 伽马辐照后，读取了两个柱压力传感器，并且观察到了具有管组的柱的加压(表2)。

[0124] 总之，伽马辐照导致柱管组组件的加压。通过到目前为止所描述的管组30的附接，成功地去除气泡还将有助于柱、管组或两者的减压。

[0125] 表2

[0126]

[0127] 其他实施例

[0128] 已经描述本发明的多个实施例。然而，应理解，在不脱离本发明的精神和范围的情况下可以进行多种修改。相应地，其他实施例处于以下权利要求的范围内。

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