用胎儿和成年分化细胞重组非人类哺乳动物胚胎的方法
阅读：1016发布：2020-06-03
专利汇可以提供用胎儿和成年分化细胞重组非人类哺乳动物胚胎的方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及利用一种方法在体外重组非人类 哺乳动物 胚胎，该方法包括在供体 体细胞 的胞核被移植到受体胞质中之前对其进行处理，所述处理包括受控的非组蛋白 水 解 和诱导所述胞核的同形态膨胀。，下面是用胎儿和成年分化细胞重组非人类哺乳动物胚胎的方法专利的具体信息内容。
1.在体外重组非人类哺乳动物的方法，其特征在于，其包括在体细 胞的供体细胞的二倍体核被移植到受体胞质中之前，对其进行处理，所 述处理包括：
a)受控的非组蛋白质的蛋白水解，和
b)诱导所述二倍体核的同形态膨胀，
其中，所述的受控蛋白水解在丝氨酸蛋白酶的作用下产生，并且通 过使用聚阴离子进行处理诱导所述二倍体核的膨胀，所述聚阴离子选自 肝素、葡聚糖硫酸酯和分子量大于20000的聚天冬氨酸。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述蛋白酶为胰蛋白酶 或胰凝乳蛋白酶。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于经处理的二倍体核 被包含在供体细胞中，所述处理包括所述细胞的胞质膜的渗透。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于所述胞质膜的渗透利用 至少一种渗透剂进行，所述渗透剂选自溶血卵磷脂、链球菌溶血素、皂 苷和毛地黄皂苷。
5.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于通过显微注射将二 倍体核移植到受体胞质中。
6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于通过供体细胞和受体胞 质的融合将二倍体核移植到受体胞质中。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于所述融合通过电击进行。
8.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于受体胞质处于细胞 间期状态。
9.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于所述哺乳动物是有 蹄类动物。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于所述有蹄类动物选自 牛、绵羊种，山羊家族成员和猪。
技术领域
背景技术
由胚胎通过将体细胞的供体胞核移植到预先摘除胞核的受体细胞胞 质(通常是卵母细胞)中生产动物特别是哺乳动物的技术，由于其潜在的应 用当前被广泛关注。在后面的情况中，应特别提到：
—动物基因转移：在培养液中将感兴趣的基因整合到细胞中，然后 将其胞核移植到受体卵母细胞中，这样能够提高基因转移的效率；
—繁殖具有特定遗传特性的动物的可能性，不论这些特性是天然的 或是由基因转移所产生的；
—遗传评估：几个动物具有同样的遗传性的事实能够评估遗传和环 境因素对各动物特性的影响。
—获得胚胎细胞系、然后在体外被鉴别的可能性。
在利用核移植进行重组胚胎的技术发展中遇到的主要障碍来自于供 体胞核/受体胞质相互影响的配合，这是未来胚胎的发展所依赖的。
因此常规的胞核移植的方法包括，在胞核移植之前，准备供体细胞 和/或受体细胞。
在体外成熟之后，使用的受体细胞通常在中期II阶段由卵母细胞去 核产生。在细胞周期这一阶段，胞质具有相当大的MPF(成熟促进因素) 活性，从胞质被活化的时间开始上述活性逐渐减小。在自然授精的情况 下由于精子的进入而产生的该活化可以在胞核移植的情况下被人工引 发。
当胞核的移植和受体胞质的活化同时发生时(当胞核和胞质的融合 通过足以能够刺激后者的电脉冲实现时)，高MPF活性引发核膜的降解、 染色质的凝聚，在融合之后使胞核物质立即暴露于中期胞质环境。据报 道，〔CAMPBELL等，Biol.Reprod.，49，933-4942，(1993)〕，这些现象冒 着引起染色体异常的风险，特别是当供体胞核处于细胞周期的G2或S期 中。
为了避免染色质的过早凝集且为了保持核膜完整，已经提出[BARNES 等，Mol.Reprod.Dev.，36，33-41，(1993)；STICE等，Mol.Reprod.Dev.， 38，61-68，(1994)]预先活化受体胞质，仅当获得分裂间期型的胞质环境 时才进行胞核的移植，其特别导致低水平的MPF活性，或者是使用由成 熟(old)卵母细胞源发的受体胞质[CHESNE等，CRAS，316，487-492， (1993)]，其对于活化更加敏感，并且其中向着细胞间期的过渡更加迅速。
该方法能够提高当胚胎细胞(裂球(blastmer))被用作供体细胞时的 成功率。另一方面，特别是在牛类中，在从分化的体细胞的胞核源发的 胞核的情况下，效率更低，其中胚胎发育的比率保持非常低[VIGNON等， C.R.Acad.Sci.Paris，321，734-745，(1998)；RENARD等The Lancet， 353，1489-1491，(1999)]。
根据另一种方法，来自分化细胞的供体胞核与处于中期中的受体胞 质的因子的接触具有这样的结果，即容许胞核的重新编程，并恢复其全 能性。命名为ROSLININSTITUTE的PCT国际申请WO97/07668(发明人： WILMUT等)提出为了延长源自供体胞核物质和受体胞质之间的接触，在融 合之后仅活化卵母细胞几个小时。为了在这些条件下保持正确的倍性， 需要在G0和G1期中使用供体细胞，并稳定或抑制在活化是微管的形成。
命名为ROSLIN INSTITU的PCT国际申请WO 97/07669(发明人：WILMUT 等)推荐使用在没有血清的情况下预先进行培养一段时间、从处于静止期 (细胞周期的G0期)的细胞获得的胞核；通过使其更易于从受体细胞接受 胞质因子，这种处理也被认为是便于供体胞核的重新编程。这种方法特 别能够改善从分化细胞的胞核获得的胚胎的发育率，特别是在绵羊种中。 WAKAMAYA等(Nature，394，369-374，1998)报告了在小鼠中由胞核获得的 胚胎在G0或G1期的发育，以及被注入到卵母细胞的胞质中的分化的卵丘 细胞在注射之后活化1至3小时的中期II的发育。
—动物基因转移：在培养液中将感兴趣的基因整合到细胞中，然后 将其胞核移植到受体卵母细胞中，这样能够提高基因转移的效率；
—繁殖具有特定遗传特性的动物的可能性，不论这些特性是天然的 或是由基因转移所产生的；
—遗传评估：几个动物具有同样的遗传性的事实能够评估遗传和环 境因素对各动物特性的影响。
—获得胚胎细胞系、然后在体外被鉴别的可能性。
在利用核移植进行重组胚胎的技术发展中遇到的主要障碍来自于供 体胞核/受体胞质相互影响的配合，这是未来胚胎的发展所依赖的。
因此常规的胞核移植的方法包括，在胞核移植之前，准备供体细胞 和/或受体细胞。
在体外成熟之后，使用的受体细胞通常在中期II阶段由卵母细胞去 核产生。在细胞周期这一阶段，胞质具有相当大的MPF(成熟促进因素) 活性，从胞质被活化的时间开始上述活性逐渐减小。在自然授精的情况 下由于精子的进入而产生的该活化可以在胞核移植的情况下被人工引 发。
当胞核的移植和受体胞质的活化同时发生时(当胞核和胞质的融合 通过足以能够刺激后者的电脉冲实现时)，高MPF活性引发核膜的降解、 染色质的凝聚，在融合之后使胞核物质立即暴露于中期胞质环境。据报 道，〔CAMPBELL等，Biol.Reprod.，49，933-4942，(1993)〕，这些现象冒 着引起染色体异常的风险，特别是当供体胞核处于细胞周期的G2或S期 中。
为了避免染色质的过早凝集且为了保持核膜完整，已经提出[BARNES 等，Mol.Reprod.Dev.，36，33-41，(1993)；STICE等，Mol.Reprod.Dev.， 38，61-68，(1994)]预先活化受体胞质，仅当获得分裂间期型的胞质环境 时才进行胞核的移植，其特别导致低水平的MPF活性，或者是使用由成 熟(old)卵母细胞源发的受体胞质[CHESNE等，CRAS，316，487-492， (1993)]，其对于活化更加敏感，并且其中向着细胞间期的过渡更加迅速。
该方法能够提高当胚胎细胞(裂球(blastmer))被用作供体细胞时的 成功率。另一方面，特别是在牛类中，在从分化的体细胞的胞核源发的 胞核的情况下，效率更低，其中胚胎发育的比率保持非常低[VIGNON等， C.R.Acad.Sci.Paris，321，734-745，(1998)；RENARD等The Lancet， 353，1489-1491，(1999)]。
根据另一种方法，来自分化细胞的供体胞核与处于中期中的受体胞 质的因子的接触具有这样的结果，即容许胞核的重新编程，并恢复其全 能性。命名为ROSLININSTITUTE的PCT国际申请WO97/07668(发明人： WILMUT等)提出为了延长源自供体胞核物质和受体胞质之间的接触，在融 合之后仅活化卵母细胞几个小时。为了在这些条件下保持正确的倍性， 需要在G0和G1期中使用供体细胞，并稳定或抑制在活化是微管的形成。
命名为ROSLIN INSTITU的PCT国际申请WO 97/07669(发明人：WILMUT 等)推荐使用在没有血清的情况下预先进行培养一段时间、从处于静止期 (细胞周期的G0期)的细胞获得的胞核；通过使其更易于从受体细胞接受 胞质因子，这种处理也被认为是便于供体胞核的重新编程。这种方法特 别能够改善从分化细胞的胞核获得的胚胎的发育率，特别是在绵羊种中。 WAKAMAYA等(Nature，394，369-374，1998)报告了在小鼠中由胞核获得的 胚胎在G0或G1期的发育，以及被注入到卵母细胞的胞质中的分化的卵丘 细胞在注射之后活化1至3小时的中期II的发育。
发明内容
本发明开发了一种在体外重组哺乳动物胚胎的新方法，其能够改善来 自多种胎儿或成年组织的体细胞的胞核的存活胚胎的产出率和发育率。
该方法包括，在体细胞的二倍体核(下文中也称其为“胞核”)移植 进入受体胞质中之前，对该体细胞的二倍体核进行处理，所述处理包括：
a)受控的非组蛋白蛋白水解，
b)所述二倍体核的同形膨胀的诱导，
其中，所述的受控蛋白水解在丝氨酸蛋白酶的作用下产生，并且通 过使用聚阴离子进行处理诱导所述二倍体核的膨胀，所述聚阴离子选自 肝素、葡聚糖硫酸酯和分子量大于20000的聚天冬氨酸。
该处理的效果是使得胞核DNA更加容易取得，且对于胞质环境的活 性更强，其中即使在核膜没有破裂时也有能够与胞核结构相互作用的因 子[ADENOT等，Development，124，4615-4625，(1997)；THOMPSON等， Dev.Genetics，42，22-31，(1998)]。在第一次胚胎分裂之前，胞核膜的保存 能够使正确的倍性被保持。
特别地，二倍体核可以由源自各种组织(例如，乳腺或皮肤上皮细胞、 肌细胞、肝细胞等)的胎儿细胞或成年细胞的原始培养获得。这些细胞可以 未分化地来源于新鲜原始培养物或经过数代建立的培养物或通过冷冻保存 的细胞恢复的细胞。上述细胞不论其在细胞周期的哪个时期都可以被应用。
按照本发明的方法从这些供体细胞中摘除胞核并进行处理，然后通 过显微注射移植到受体胞质中；然而，在实践中更便利的是处理包含在 供体细胞中的胞核，然后通过受体胞质和供体细胞的融合进行胞核移植。
在后一种情况下，本发明的方法的实施需要一个预先的步骤，即为 了使胞核更容易进行处理操作，对供体细胞的胞质膜进行渗透。
例如，原生质膜的渗透可以通过用一种或多种温和的渗透剂温育细 胞而获得，例如，溶血卵磷脂、链球菌溶血素、皂苷或毛地黄皂苷，假 设使用的条件不会引起细胞溶解，并且使原生质膜保持在一种与受体卵 母细胞融合的后续操作相适合的状态下。可以使用的剂量和培养条件根 据细胞源变化。适宜的条件通过预先使用锥虫蓝的渗透测试来确定；在 显微镜下能够容易地观察到被渗透的细胞变为蓝色。适宜的条件符合给 出50％-100％的可渗透细胞。渗透处理与蛋白质水解同时进行并且应在胞 核的诱导膨胀之前，其需要较长的温育时间。
对于受控的蛋白水解，可以使用丝氨酸蛋白酶，例如胰蛋白酶或胰 凝乳蛋白酶；蛋白酶的作用必须限制于胞核非组蛋白蛋白以及环绕胞核 的细胞骨架的蛋白质的降解，并且必须不导致胞核的溶解。通常，使用 非常低的蛋白酶浓度。例如，在整个细胞进行蛋白质水解的情况下(与渗 透或其连续地同时)，级别为1至10U/ml的胰蛋白酶浓度可以被用于细 胞培养混合物中，培养在37℃下持续1至10min。在处理分离的胞核的 情况下，蛋白酶剂量和培养时间必须进一步减小。
另外，在处理过程[BROWN等，Exp.Cell Res.，104，207-213，(1977)] 中，胰蛋白酶对于处于G1或G0时期的细胞中的DNA聚合酶具有直接的 激活效果。这将能够使得当它们被混入处于细胞中的受体胞质中时，更 容易重新开始处于G0/G1时期的胞核的细胞周期。
如在KAREMER和COFFEY[Biochim.Biophys.Acta， 224，568-578，(1970)]中所描述的，胞核的膨胀可以使用至少一种聚阴 离子化合物通过处理而诱发，例如肝素、葡聚糖硫酸酯或高分子量(＞ 20000)的聚天冬氨酸。
在蛋白质水解之后或与其同时，在有聚阴离子的情况下，通过培养 胞核或包含胞核的细胞来实施处理，直到观察到胞核膨胀为止。例如， 在渗透整个细胞的情况下，可以使用50到200μg/ml培养基的聚阴离子， 在室温(15℃到25℃)下培养30至60分钟。
在该处理结束时，胞核被移植到受体胞质中。
根据本发明处理的胞核的移植不论在供体细胞的细胞周期的哪个时 期或受体胞质的哪个时期都可以进行。在胞核和受体卵母细胞在中期II (在成熟开始后20到25h)融合的情况下，需要活化重组胚胎，例如通过 使用如LIU等描述的化学激活方法[Mol.Reprod.Dev.，49，298-307， (1998)]，或通过其它方法。
然而，特别有利的是使用预先准备从而使其处于细胞间期的受体胞 质。
“细胞间期中的受体胞质”被定义为这样一种胞质，其中MPF的水 平小于其诱发核膜降解和染色质凝集时的水平。
特别地，该胞质可以由在体内或在体外成熟的卵母细胞获得。染色 体物质通过显微操纵被提取，而卵母细胞被阻断在中期II阶段。然后处 理获得的胞质，以便减小MPF活性。例如，它可以通过融合之前的体外 老化和冷却方法[CHESNE等，C.R.Acad.Sci.，316，487-491，(1993)] 来制备。使用抑制蛋白质合成(环己酰亚胺)或者是抑制磷酸化作用 (6-DMAP)的药物或这两种药物的混合物也能够获得相同的结果。在这种 情况下，细胞间期状态通常通过培养1至4小时获得。
在分离的胞核的情况下，通过显微注射可以重组胚胎。然而，特别 有利的是直接使用被处理的细胞，以便将它们与受体胞质融合。在这种 情况下，融合最好通过电击或其它方法进行。不需要在为了诱发受体胞 质的活化的条件下进行操作。
将重组的胚胎直接在体外培养，而不需要在融合之后进行任何其它 活化；直到它们生长到胚泡阶段。
供体胞核不经历其核膜的任何破坏，在发生于融合之后的第一次分 裂之前不发生任何染色质凝集(PCC)。
根据常规公知技术，当胚胎达到了胚泡阶段时，它们被移植到受体 雌性体内。
根据本发明的方法，其首先能够依靠融合之前的温和的酶促作用容 许胞质的因子接近染色质，以提高移植的胞核的重组，其次，通过使染 色质凝集最小化及防止在被引入受体胞质中的胞核的重新模造 (remodeling)期间它的分散来促进胚胎细胞的正确倍性的维持。这种 胞核和胞质之间关系的最初步骤中的修饰能够促进由分化的体细胞的胞 核重组的胚胎的最终发育，不论是在这些细胞的细胞周期中的哪个阶段。
该方法适用于多种哺乳动物物种；然而，更特别适合于重组有蹄哺 乳动物，特别是反刍动物，以及特别适膈于绵羊种、牛、和山羊家族的 成员或猪。
该方法包括，在体细胞的二倍体核(下文中也称其为“胞核”)移植 进入受体胞质中之前，对该体细胞的二倍体核进行处理，所述处理包括：
a)受控的非组蛋白蛋白水解，
b)所述二倍体核的同形膨胀的诱导，
其中，所述的受控蛋白水解在丝氨酸蛋白酶的作用下产生，并且通 过使用聚阴离子进行处理诱导所述二倍体核的膨胀，所述聚阴离子选自 肝素、葡聚糖硫酸酯和分子量大于20000的聚天冬氨酸。
该处理的效果是使得胞核DNA更加容易取得，且对于胞质环境的活 性更强，其中即使在核膜没有破裂时也有能够与胞核结构相互作用的因 子[ADENOT等，Development，124，4615-4625，(1997)；THOMPSON等， Dev.Genetics，42，22-31，(1998)]。在第一次胚胎分裂之前，胞核膜的保存 能够使正确的倍性被保持。
特别地，二倍体核可以由源自各种组织(例如，乳腺或皮肤上皮细胞、 肌细胞、肝细胞等)的胎儿细胞或成年细胞的原始培养获得。这些细胞可以 未分化地来源于新鲜原始培养物或经过数代建立的培养物或通过冷冻保存 的细胞恢复的细胞。上述细胞不论其在细胞周期的哪个时期都可以被应用。
按照本发明的方法从这些供体细胞中摘除胞核并进行处理，然后通 过显微注射移植到受体胞质中；然而，在实践中更便利的是处理包含在 供体细胞中的胞核，然后通过受体胞质和供体细胞的融合进行胞核移植。
在后一种情况下，本发明的方法的实施需要一个预先的步骤，即为 了使胞核更容易进行处理操作，对供体细胞的胞质膜进行渗透。
例如，原生质膜的渗透可以通过用一种或多种温和的渗透剂温育细 胞而获得，例如，溶血卵磷脂、链球菌溶血素、皂苷或毛地黄皂苷，假 设使用的条件不会引起细胞溶解，并且使原生质膜保持在一种与受体卵 母细胞融合的后续操作相适合的状态下。可以使用的剂量和培养条件根 据细胞源变化。适宜的条件通过预先使用锥虫蓝的渗透测试来确定；在 显微镜下能够容易地观察到被渗透的细胞变为蓝色。适宜的条件符合给 出50％-100％的可渗透细胞。渗透处理与蛋白质水解同时进行并且应在胞 核的诱导膨胀之前，其需要较长的温育时间。
对于受控的蛋白水解，可以使用丝氨酸蛋白酶，例如胰蛋白酶或胰 凝乳蛋白酶；蛋白酶的作用必须限制于胞核非组蛋白蛋白以及环绕胞核 的细胞骨架的蛋白质的降解，并且必须不导致胞核的溶解。通常，使用 非常低的蛋白酶浓度。例如，在整个细胞进行蛋白质水解的情况下(与渗 透或其连续地同时)，级别为1至10U/ml的胰蛋白酶浓度可以被用于细 胞培养混合物中，培养在37℃下持续1至10min。在处理分离的胞核的 情况下，蛋白酶剂量和培养时间必须进一步减小。
另外，在处理过程[BROWN等，Exp.Cell Res.，104，207-213，(1977)] 中，胰蛋白酶对于处于G1或G0时期的细胞中的DNA聚合酶具有直接的 激活效果。这将能够使得当它们被混入处于细胞中的受体胞质中时，更 容易重新开始处于G0/G1时期的胞核的细胞周期。
如在KAREMER和COFFEY[Biochim.Biophys.Acta， 224，568-578，(1970)]中所描述的，胞核的膨胀可以使用至少一种聚阴 离子化合物通过处理而诱发，例如肝素、葡聚糖硫酸酯或高分子量(＞ 20000)的聚天冬氨酸。
在蛋白质水解之后或与其同时，在有聚阴离子的情况下，通过培养 胞核或包含胞核的细胞来实施处理，直到观察到胞核膨胀为止。例如， 在渗透整个细胞的情况下，可以使用50到200μg/ml培养基的聚阴离子， 在室温(15℃到25℃)下培养30至60分钟。
在该处理结束时，胞核被移植到受体胞质中。
根据本发明处理的胞核的移植不论在供体细胞的细胞周期的哪个时 期或受体胞质的哪个时期都可以进行。在胞核和受体卵母细胞在中期II (在成熟开始后20到25h)融合的情况下，需要活化重组胚胎，例如通过 使用如LIU等描述的化学激活方法[Mol.Reprod.Dev.，49，298-307， (1998)]，或通过其它方法。
然而，特别有利的是使用预先准备从而使其处于细胞间期的受体胞 质。
“细胞间期中的受体胞质”被定义为这样一种胞质，其中MPF的水 平小于其诱发核膜降解和染色质凝集时的水平。
特别地，该胞质可以由在体内或在体外成熟的卵母细胞获得。染色 体物质通过显微操纵被提取，而卵母细胞被阻断在中期II阶段。然后处 理获得的胞质，以便减小MPF活性。例如，它可以通过融合之前的体外 老化和冷却方法[CHESNE等，C.R.Acad.Sci.，316，487-491，(1993)] 来制备。使用抑制蛋白质合成(环己酰亚胺)或者是抑制磷酸化作用 (6-DMAP)的药物或这两种药物的混合物也能够获得相同的结果。在这种 情况下，细胞间期状态通常通过培养1至4小时获得。
在分离的胞核的情况下，通过显微注射可以重组胚胎。然而，特别 有利的是直接使用被处理的细胞，以便将它们与受体胞质融合。在这种 情况下，融合最好通过电击或其它方法进行。不需要在为了诱发受体胞 质的活化的条件下进行操作。
将重组的胚胎直接在体外培养，而不需要在融合之后进行任何其它 活化；直到它们生长到胚泡阶段。
供体胞核不经历其核膜的任何破坏，在发生于融合之后的第一次分 裂之前不发生任何染色质凝集(PCC)。
根据常规公知技术，当胚胎达到了胚泡阶段时，它们被移植到受体 雌性体内。
根据本发明的方法，其首先能够依靠融合之前的温和的酶促作用容 许胞质的因子接近染色质，以提高移植的胞核的重组，其次，通过使染 色质凝集最小化及防止在被引入受体胞质中的胞核的重新模造 (remodeling)期间它的分散来促进胚胎细胞的正确倍性的维持。这种 胞核和胞质之间关系的最初步骤中的修饰能够促进由分化的体细胞的胞 核重组的胚胎的最终发育，不论是在这些细胞的细胞周期中的哪个阶段。
该方法适用于多种哺乳动物物种；然而，更特别适合于重组有蹄哺 乳动物，特别是反刍动物，以及特别适膈于绵羊种、牛、和山羊家族的 成员或猪。
具体实施方式
通过下文的进一步描述，将更加易于理解本发明，下文的描述涉及 实施用于重组牛类胚胎的本发明方法的非限定性实例。
实施例1
细胞的制备和胚胎的重组
由胎儿皮肤或肌肉细胞培养物获得供体细胞，或由成年动物的耳活 组织(皮肤细胞)培养物获得供体细胞，按照VIVNON等描述的方法制备 (C.R.Acad.Sci.Paris，321，735-745，1998)。在这些条件下，可获得成纤维细 胞型的分化细胞。
从细胞培养皿中去除培养基，用PBS缓冲剂冲洗，并填充“渗透” 介质，其组成为：不含钙和镁的HANKS平衡盐水，在胎儿皮肤细胞的 情况下包含0.5μg/ml胰蛋白酶和20至30μg/ml的溶血卵磷脂，在成年 动物皮肤细胞的情况下，含有15至20μg/ml溶血卵磷脂。在37℃下培 养5分钟之后，从培养皿中去除培养基，为了停止渗透和蛋白水解，立 即使用缓冲剂溶液(不含钙和镁的HANKS平衡盐水)冲洗培养皿，该缓冲 剂包含0.5％的胎牛血清或牛血清白蛋白。
然后将培养皿填充“聚阴离子”介质，该介质的组成为：不含钙和 镁的HANKS溶液，包含10U/ml的肝素。培养在室温下进行30到60分 钟。然后通过刮培养支持物收集细胞，以1200g离心5分钟，在受体卵 母细胞融合之前，重新留存在无血清培养基中。
摘除受体卵母细胞胞核，并按照VIGNON等(C.R.Acad.Sci.Paris， 321，735-745(1998))所描述的方案使之进入细胞间期。
在受体胞质的透明带下，通过引入分离的供体细胞进行胞核移植， 并在以下条件下进行融合：2个2.2kv/cm电脉冲，持续20μs，在补充5 μg/ml的细胞松弛素B的TCM199培养基(LIFE TECHNOLOGIES， Cergy Pontoise，France)中。
利用双目显微镜下观察证实融合，重组的胚胎在体外培养，并被 植入体内，如VIGNON等(C.R.Acad.Sci.Paris，321，735-745，(1998)) 所述。
对照：
通过上述方案得到对照，但是对供体细胞既不进行渗透也不进行胰 蛋白酶和肝素处理。
结果：
在来自胎儿皮肤或肌肉细胞的情况下，在用经历本发明处理的供体 细胞重组633个胚胎(7.1％)之后，获得47个胚泡。通过与对照细胞比较， 从386个重组胚胎获得13个胚泡(3.37％)。
在从经历本发明处理的供体细胞获得的胚胎移植之后，27头受体母 牛有5头怀孕超过90天，并生出4只存活的动物。对于对照细胞，6头 受体母牛接受移植，仅有一个怀孕超过90天，但没有达到整个期限(怀 孕8个月晚期流产)。
在由成年动物耳活组织得到的细胞的情况下，在用经历本发明处理 的供体细胞进行580个胚胎重组之后，产生23个胚泡(4％)，而从采用 对照细胞的250个重组胚胎中获得6个胚泡(2.4％)。移植所有的胚胎， 由处理的细胞产生的一系列胚胎中，有一个出生。
实施例2：
在另一系列试验中，根据在上述实施例1中描述的方案，由增殖培 养物或由置于静止状态的培养物(在它们使用之前，将它们保持在无血 清介质中36到48小时)衍生的胎儿或成年牛体细胞重组胚胎。如上述 实施例1所描述，同样重组对照胚胎。
结果通过表I和II显示。表I表示由增殖培养物获得的供体细胞所 得到的结果。
表I 供体细胞 胚胎数目 桑椹胚的数目 (％) 胚泡的数目 (％) 重组的(％) 分裂的(％) 处理的 502(56.5) 256(51.0) 43(8.6) 28(5.6) 对照 221(55.6) 115(52.0) 10(4.5) 6(2.7)
表II表示由静止的供体细胞获得的结果
表II 供体细胞 胚胎数目 桑椹胚的数目 (％) 胚泡的数目 (％) 重组的(％) 分裂的(％) 处理的 771(58.9) 337(47.0) 83(11.6) 48(6.7) 对照 280(69.3) 168(60.0) 13(4.6) 7(2.5)
这些结果显示出，关于使用细胞间期的受体胞质，供体细胞(静止 或增殖)的初态对于胚胎发育率没有显著影响；另一方面，根据本发明 对供体细胞的处理显著增加了其发育率。
将在上述2个试验结束时获得的胚泡移植到受体母牛体内。结果在 下文的表III中显示。
表III 细胞 被移植的胚 泡数目 怀孕的数目/受体数目 出生 D35 D60 D＞90 处理的 76 7/50(14.0) 6/50(12.0) 6/50(12.0) 5(10.0) 未处理的 13 3/8(37.5) 11/8(12.5) 1/8(12.5) 0(0.0)
这些结果证实根据本发明对供体细胞的处理显著增加了可以产生存 活动物的胚胎的出生率。
实施例3
供体细胞为来源于培养的胎儿或成年牛皮肤细胞的增殖成纤维细 胞。它们按照实施例1制备。在15-20μg/ml的溶血卵磷脂的存在下， 通过温育完成渗透。
在体外成熟22至24小时之后，受体卵母细胞被摘除胞核，并在于 实施例1相同的条件下与供体细胞融合24-25小时。融合之后，根据如 LIU等[Mol.Reprod.Dev.，49，298-307，(1998)]所述方法的进行化学活 化：在融合之后立即将重组的胚胎在含有10μg/ml的放线(菌)酮和5 μg/ml细胞松弛素B的TCM199培养基中(LIFE TECHNOLOGIES，Cergy Pontoise，France)温育5小时。然后在体外培养胚胎。以相同方式重组 对照胚胎，但在融合之前不进行供体细胞的处理。
结果在下文的表IV和V中给出：
表IV 供体细胞 重组的胚胎(％) 分裂的胚胎(％) 桑椹胚(％) 胚泡 处理的 365(53.7) 227(62.2) 101(27.7) 88(24.1) 对照 438(59.2) 271(61.9) 101(21.1) 70(16.0)
表V 供体细胞 被移植的胚 泡 怀孕/重组 D35 怀孕/重组 D60 怀孕/重组 D90 出生 处理的 60 18/40(45.0) 17/40(42.5) 9/40(22.5) 4/40(10.0) 对照 55 10/38(26.3) 8/38(21.0) 4/38(10.5) 2/38(5.3)+
+：这两只动物在出生几个小时之后死亡。
实施例1
细胞的制备和胚胎的重组
由胎儿皮肤或肌肉细胞培养物获得供体细胞，或由成年动物的耳活 组织(皮肤细胞)培养物获得供体细胞，按照VIVNON等描述的方法制备 (C.R.Acad.Sci.Paris，321，735-745，1998)。在这些条件下，可获得成纤维细 胞型的分化细胞。
从细胞培养皿中去除培养基，用PBS缓冲剂冲洗，并填充“渗透” 介质，其组成为：不含钙和镁的HANKS平衡盐水，在胎儿皮肤细胞的 情况下包含0.5μg/ml胰蛋白酶和20至30μg/ml的溶血卵磷脂，在成年 动物皮肤细胞的情况下，含有15至20μg/ml溶血卵磷脂。在37℃下培 养5分钟之后，从培养皿中去除培养基，为了停止渗透和蛋白水解，立 即使用缓冲剂溶液(不含钙和镁的HANKS平衡盐水)冲洗培养皿，该缓冲 剂包含0.5％的胎牛血清或牛血清白蛋白。
然后将培养皿填充“聚阴离子”介质，该介质的组成为：不含钙和 镁的HANKS溶液，包含10U/ml的肝素。培养在室温下进行30到60分 钟。然后通过刮培养支持物收集细胞，以1200g离心5分钟，在受体卵 母细胞融合之前，重新留存在无血清培养基中。
摘除受体卵母细胞胞核，并按照VIGNON等(C.R.Acad.Sci.Paris， 321，735-745(1998))所描述的方案使之进入细胞间期。
在受体胞质的透明带下，通过引入分离的供体细胞进行胞核移植， 并在以下条件下进行融合：2个2.2kv/cm电脉冲，持续20μs，在补充5 μg/ml的细胞松弛素B的TCM199培养基(LIFE TECHNOLOGIES， Cergy Pontoise，France)中。
利用双目显微镜下观察证实融合，重组的胚胎在体外培养，并被 植入体内，如VIGNON等(C.R.Acad.Sci.Paris，321，735-745，(1998)) 所述。
对照：
通过上述方案得到对照，但是对供体细胞既不进行渗透也不进行胰 蛋白酶和肝素处理。
结果：
在来自胎儿皮肤或肌肉细胞的情况下，在用经历本发明处理的供体 细胞重组633个胚胎(7.1％)之后，获得47个胚泡。通过与对照细胞比较， 从386个重组胚胎获得13个胚泡(3.37％)。
在从经历本发明处理的供体细胞获得的胚胎移植之后，27头受体母 牛有5头怀孕超过90天，并生出4只存活的动物。对于对照细胞，6头 受体母牛接受移植，仅有一个怀孕超过90天，但没有达到整个期限(怀 孕8个月晚期流产)。
在由成年动物耳活组织得到的细胞的情况下，在用经历本发明处理 的供体细胞进行580个胚胎重组之后，产生23个胚泡(4％)，而从采用 对照细胞的250个重组胚胎中获得6个胚泡(2.4％)。移植所有的胚胎， 由处理的细胞产生的一系列胚胎中，有一个出生。
实施例2：
在另一系列试验中，根据在上述实施例1中描述的方案，由增殖培 养物或由置于静止状态的培养物(在它们使用之前，将它们保持在无血 清介质中36到48小时)衍生的胎儿或成年牛体细胞重组胚胎。如上述 实施例1所描述，同样重组对照胚胎。
结果通过表I和II显示。表I表示由增殖培养物获得的供体细胞所 得到的结果。
表I 供体细胞 胚胎数目 桑椹胚的数目 (％) 胚泡的数目 (％) 重组的(％) 分裂的(％) 处理的 502(56.5) 256(51.0) 43(8.6) 28(5.6) 对照 221(55.6) 115(52.0) 10(4.5) 6(2.7)
表II表示由静止的供体细胞获得的结果
表II 供体细胞 胚胎数目 桑椹胚的数目 (％) 胚泡的数目 (％) 重组的(％) 分裂的(％) 处理的 771(58.9) 337(47.0) 83(11.6) 48(6.7) 对照 280(69.3) 168(60.0) 13(4.6) 7(2.5)
这些结果显示出，关于使用细胞间期的受体胞质，供体细胞(静止 或增殖)的初态对于胚胎发育率没有显著影响；另一方面，根据本发明 对供体细胞的处理显著增加了其发育率。
将在上述2个试验结束时获得的胚泡移植到受体母牛体内。结果在 下文的表III中显示。
表III 细胞 被移植的胚 泡数目 怀孕的数目/受体数目 出生 D35 D60 D＞90 处理的 76 7/50(14.0) 6/50(12.0) 6/50(12.0) 5(10.0) 未处理的 13 3/8(37.5) 11/8(12.5) 1/8(12.5) 0(0.0)
这些结果证实根据本发明对供体细胞的处理显著增加了可以产生存 活动物的胚胎的出生率。
实施例3
供体细胞为来源于培养的胎儿或成年牛皮肤细胞的增殖成纤维细 胞。它们按照实施例1制备。在15-20μg/ml的溶血卵磷脂的存在下， 通过温育完成渗透。
在体外成熟22至24小时之后，受体卵母细胞被摘除胞核，并在于 实施例1相同的条件下与供体细胞融合24-25小时。融合之后，根据如 LIU等[Mol.Reprod.Dev.，49，298-307，(1998)]所述方法的进行化学活 化：在融合之后立即将重组的胚胎在含有10μg/ml的放线(菌)酮和5 μg/ml细胞松弛素B的TCM199培养基中(LIFE TECHNOLOGIES，Cergy Pontoise，France)温育5小时。然后在体外培养胚胎。以相同方式重组 对照胚胎，但在融合之前不进行供体细胞的处理。
结果在下文的表IV和V中给出：
表IV 供体细胞 重组的胚胎(％) 分裂的胚胎(％) 桑椹胚(％) 胚泡 处理的 365(53.7) 227(62.2) 101(27.7) 88(24.1) 对照 438(59.2) 271(61.9) 101(21.1) 70(16.0)
表V 供体细胞 被移植的胚 泡 怀孕/重组 D35 怀孕/重组 D60 怀孕/重组 D90 出生 处理的 60 18/40(45.0) 17/40(42.5) 9/40(22.5) 4/40(10.0) 对照 55 10/38(26.3) 8/38(21.0) 4/38(10.5) 2/38(5.3)+
+：这两只动物在出生几个小时之后死亡。
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