사료 첨가제 및 사료{ANIMAL FEED ADDITIVE AND ANIMAL FEED}

본 발명은 당지질을 함유하는 사료 첨가제, 사료 및 이들을 사용한 조류 및 포유류의 사육 방법에 관한 것이다.

가축의 감염증은 가축의 체중을 감소시키거나 각종 병상을 일으키거나 하는 등, 그 상품 가치를 현저하게 저하시킨다. 예를 들어, 스타필로코커스 아우레우스 (Staphylococcus aureus) 는 소, 양, 염소의 유방염, 피하 종양, 농혈증, 말의 발진, 돼지, 닭의 관절염, 피부염, 패혈증의 원인균이다. 또, 스트랩토코커스 수이스 (Streptococcus suis) 는 돼지의 수막염, 패혈증, 심내막염, 관절염의 원인균이며, 스트랩토코커스 보비스 (Streptococcus bovis) 는 소의 고창증의 원인균이다.

항생 물질을 가축 사료에 소량 첨가함으로써 가축의 성장이 촉진된다는 사실이 1940 년대에 발견되고, 그 이후, 가축의 성장을 촉진하거나 질병을 예방하거나 하는 수단으로서 가축의 사료에 항생 물질을 첨가하는 것이 널리 행해져 왔다. 항생 물질은 가축의 병원균 감염의 예방, 대사의 개선, 장내의 유해균의 증식 억제의 작용을 나타내어, 결과적으로 질병을 예방하고, 성장을 촉진하는 것으로 생각되고 있지만, 자세한 것은 여전히 불분명하다. 그 한편으로, 사료에 항생 물질을 혼합하는 것은 결과적으로 항생 물질을 외부 환경에 널리 퍼뜨리는 것이 되어 축산계에 있어서도 항생 물질 내성균의 출현이 문제로 되고 있다. 예를 들어, 대표적인 항생 물질 내성균인 MRSA (메티실린 내성 황색 포도상구균 (Staphylococcus aureus))은 말 등의 가축에서도 발견되고 있는 것이 보고되어 있다. 이와 같은 배경 하에서, 최근에는 항생 물질의 사료에 대한 첨가가 엄격하게 규제되도록 되었다. 예를 들어, 유럽에서는 2006 년까지 항생 물질의 사료가 전면 금지되고, 일본에서도 사용할 수 있는 항생 물질의 수가 단계적으로 감소되고 있다. 또, 이와 같은 움직임과 함께, 생산자로부터는 항생 물질의 대체물에 대한 요망이 커지고 있다.

이와 같은 항생 물질의 대체라고 하는 흐름을 받아, 일부에서는, 락트산균이 생산하는 나이신, 바실루스균이 생산하는 이트린 등의 폴리펩티드류를 항생 물질 대신에 사용하는 움직임도 나타나고 있다. 또, 유화제로서 캔커피 등에 첨가되어 있는 당지질인 자당 에스테르류가 바실루스균 둥에 대한 항균 작용이 기대되어 첨가되고 있다.

또, 소나 양 등의 반추 가축은 루멘 (rumen) 내에서 미생물에 의해 사료를 소화·발효시키고, 그 발효 생산물을 이용하여 살고 있다. 그 때문에, 루멘으로부터의 메탄 발생은 사료 에너지 효율의 손실이 된다. 또한, 메탄은 지구 온난화에 영향을 미치는 온난화 가스이기 때문에, 반추 동물의 루멘에 있어서의 메탄 생성을 줄이는 것은 중요하다.

루멘 내의 메탄 생성균은 수소를 이용하여 이산화탄소를 환원하여 메탄을 생 성하고 있다. 메탄의 온난화에 대한 기여율은 이산화탄소에 이어 높고, 총 메탄 방출량 중에서 반추 가축으로부터 방출되는 메탄은 15 ∼ 20％ 를 차지한다고 여겨진다.

항생 물질인 모넨신 등의 이오노포아류는 반추 동물용의 사료에 널리 사용되고 있다. 모넨신은 루멘 미생물에 대해 선택적인 억제 효과를 나타내고, 결과적으로 메탄 생성을 저감시켜, 프로피온산 생성을 촉진하는 기능이 있다. 프로피온산은 다른 휘발성 지방산에 비해 ATP 생성 효율이 높기 때문에 프로피온산의 생성 촉진에 의해 사료 효율이 개선된다.

이와 같은 배경으로부터 반추 동물용 사료에 첨가하는 모넨신 등의 대체물의 개발이 요망되고 있다. 대체물로는, 식물 추출유 (비특허 문헌 1), 항락트산 생성균 백신 (비특허 문헌 2), 항락트산 생성균 계란 항체 (비특허 문헌 3) 등이 연구되고 있다. 그러나, 이들 기술은 효과가 일정하지 않고, 사료로서의 등록이 인정되지 않는 등의 과제가 남아 있어 실용화에는 이르지 않았다.

한편, 만노실에리트리톨리피드 (MEL) 나 람노리피드 (RL) 로 대표되는 당지질에는, 계면 활성 작용을 비롯하여 다양한 성질이 있고, 이하에 서술하는 바와 같이 다양한 용도로의 전개가 도모되고 있다. 예를 들어, MEL 을 함유하는 리포솜을 사용하여, 유전자의 도입 효율을 향상시키는 기술 (특허 문헌 1), MEL 을 사용하여 약제 내성 등의 유전자를 함유하는 리포솜의 형성을 저해하고, 약제 내성균등의 발생을 감소시키는 방법 (특허 문헌 2), MEL 을 항염증제 및 항알레르기제의 유효 성분으로서 사용하는 기술 (특허 문헌 3) 등이 알려져 있다. 또, 람노리 피드를 사용하여 천연 섬유의 흡수성을 향상시키는 기술 (특허 문헌 4), 람노리피드를 사용하여 유해 사용성 유기 화합물을 함유하는 비처리물로부터 상기 유기 화합물을 분리하는 기술 (특허 문헌 5), 람노리피드를 사용하여 고밀도 냉열 축열 수송용의 얼음 슬러리를 조제함으로써, 얼음의 응집 및 합일을 방지하는 기술 (특허 문헌 6) 등이 알려져 있다. 또한, MEL 이나 람노리피드의 항균성은 일부 보고되어 있지만 (비특허 문헌 4, 비특허 문헌 5), 가축의 감염증을 일으키는 세균에 대한 항균성에 대해서는 여전히 검토되지 않고, MEL 이나 람노리피드를 축산 분야에서 적용한 예는 없다.

특허 문헌 1 : 일본 공개특허공보 2006-174727호

특허 문헌 2 : 일본 공개특허공보 2006-158387호

특허 문헌 3 : 일본 공개특허공보 2005-68015호

특허 문헌 4 : 일본 공개특허공보 2002-105854호

특허 문헌 5 : 일본 공개특허공보 2001-327803호

특허 문헌 6 : 일본 공개특허공보 2001-131538호

비특허 문헌 1 : Benchaar et al., Can.J.Anim.Sci.86, 91-96 (2006)

비특허 문헌 2 : Shu et al., FEMS Immunology ＆ Medical Microbiology, 26 (2), 153-158 (1999)

비특허 문헌 3 : DiLorenzo et al., J.Anim.Sci., 84, 2178-2185 (2006)

비특허 문헌 4 : Fat.Sci.Technol., 91, 363-366, 1989

비특허 문헌 5 : Biotechnol., 29, 91-96, 1993

발명의 개시

본 발명은 조류 및 포유류, 특히 가축의 질병을 예방 또는 치료하기 위한 안전하고 간편한 수단을 제공하는 것을 과제로 한다. 본 발명은 특히, 그람 양성 세균에 의해 발생되는 가축의 감염증을 예방 또는 치료하기 위한 수단을 제공하는 것을 과제로 한다.

또, 본 발명은 반추 동물의 루멘 발효를 개선하고, 온난화 가스의 발생 억제에 공헌하고, 또한 사료 효율을 향상시키는 것을 과제로 한다.

본 발명자들은 상기 과제를 해결하기 위하여 예의 연구를 실시한 결과, 만노실에리트리톨리피드 (MEL) 및 람노리피드 (RL) 등의 당지질이 가축의 감염증을 일으키는 그람 양성 세균에 대해, 항균 활성을 갖는 것을 알아내어, 발명을 완성하기에 이르렀다. 또한 본 발명자들은 만노실에리트리톨리피드 (MEL) 및 람노리피드 (RL) 등의 당지질이 루멘에 있어서 메탄 생성을 억제하고, 또한, 프로피온산 생성을 촉진하는 것을 알아내어, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

즉, 본 발명은 이하와 같다.

(1) 만노실에리트리톨리피드 및/또는 람노리피드를 함유하는 조류 또는 포유류용의 사료 첨가제.

(2) 가축용인 것을 특징으로 하는 (1) 에 기재된 사료 첨가제.

(3) 가축이 닭, 돼지 또는 소인 것을 특징으로 하는 (2) 에 기재된 사료 첨가제.

(4) 반추 동물용인 것을 특징으로 하는 (1) 에 기재된 사료 첨가제.

(5) 만노실에리트리톨리피드가 슈도지마 (Pseudozyma) 속에 속하는 효모로부터 얻어지는 것을 특징으로 하는 (1) 내지 (4) 중 어느 하나에 기재된 사료 첨가제.

(6) 람노리피드가 슈도모나스 (Pseudomonas) 속에 속하는 세균으로부터 얻어지는 것을 특징으로 하는 (1) 내지 (5) 중 어느 하나에 기재된 사료 첨가제.

(7) 질병의 예방 또는 치료용인 것을 특징으로 하는 (1) 내지 (6) 중 어느 하나에 기재된 사료 첨가제.

(8) 상기 질병이 그람 양성 세균에 의해 발생되는 감염증인 것을 특징으로 하는 (7) 에 기재된 사료 첨가제.

(9) 그람 양성 세균이 스타필로코커스 (Staphylococcus) 속 또는 스트랩토코커스 (Streptococcus) 속에 속하는 세균인 (8) 에 기재된 사료 첨가제.

(10) 그람 양성 세균이 스타필로코커스 아우레우스 (Staphylococcus aureus), 스타필로코커스 에피데르미디스 (Staphylococcus epidermidis), 스트랩토코커스 수이스 (Streptococcus suis) 또는 스트랩토코커스 보비스 (Streptococcus bovis) 인 (9) 에 기재된 사료 첨가제.

(11) (1) 내지 (10) 항 중 어느 하나에 기재된 사료 첨가제를 함유하는 사료.

(12) (11) 에 기재된 사료를 조류 또는 포유류에 섭취시키는 것을 특징으로 하는 조류 또는 포유류의 사육 방법.

도 1 은 RL 및 MEL 의 루멘에 있어서의 가스의 생성량 및 조성에 대한 영향을 나타낸다.

도 2 는 RL 및 MEL 의 루멘에 있어서의 휘발성 지방산의 농도 및 비율에 대한 영향을 나타낸다.

발명을 실시하기 위한 최선의 형태

본 발명의 사료 첨가제는 만노실에리트리톨리피드 (MEL) 및/또는 람노리피드 (RL) 를 함유하는 것을 특징으로 한다.

MEL 은 당지질형의 계면 활성제의 1 종으로서, 만노오스, 에리트리톨 및 지방산이 결합된 구조를 갖고 있고, 하기 일반식 (1) 로 나타난다.

일반식 (1) 에 있어서, R ¹ 및 R ² 는 각각 독립적으로 탄소수 3 ∼ 25 의 지방족 아실기이다. 특히, R ¹ 및 R ² 는 각각 독립적으로 탄소수 5 ∼ 14 의 지방 족 아실기인 것이 바람직하다. 또, R ¹ 및 R ² 는 각각 독립적으로 탄소수 5 ∼ 13 의 지방족 아실기이어도 된다. 이들 지방족 아실기는 직사슬형이어도 되고 분기형이어도 되며, 포화이어도 되고 불포화이어도 된다. 또, R ³ 및 R ⁴ 는 일방이 아세틸기이고, 타방이 수소이거나, 양방이 아세틸기이다.

또한, R ³ 및 R ⁴ 가 모두 아세틸기인 것은 MEL-A, R ³ 이 수소이고, R ⁴ 가 아세틸기인 것은 MEL-B, R ³ 이 아세틸기이며, R ⁴ 가 수소인 것은 MEL-C 로 불린다.

또, 본 발명의 사료 첨가제에 있어서의 MEL 은 1 종만이어도 되고, 복수종의 혼합물이어도 된다.

본 발명에 있어서 사용하는 MEL 은 균류, 특히 효모류 등의 미생물을 배양하여 얻을 수 있다. 예를 들어, 슈도지마 (Pseudozyma) 속, 칸디다 (Candida) 속, 쿠르츠마노마이세스 (Kurtzmanomyces) 속에 속하는 효모 등을 사용할 수 있다. 또, Shizonella melanogramma 를 사용할 수도 있다. 이 중에서도, 슈도지마속에 속하는 효모를 사용하는 것이 바람직하다. 슈도지마속에 속하는 효모로는 Pseudozyma aphidis, Pseudozyma antarctica 등을 들 수 있다. 구체적으로는, 예를 들어, Pseudozyma aphidis NBRC 10182 균주, Peudozyma Antarctica NBRC 10260 균주, Peudozyma Antarctica NBRC 10736 균주를 사용할 수 있다.

NBRC 10182 균주, NBRC 10260 균주, NBRC 10736 균주는 독립행정법인 제품평가기술기반기구의 생물유전자원부문 (NBRC) 에 등록되어 있는 균주이다.

또, MEL 은 합성한 것이나 시판품을 사용할 수도 있다.

람노리피드는 당지질형의 바이오 서팩턴트의 1 종으로서, 람노오스와 지방산이 결합된 구조를 갖고 있다. 본 발명에 있어서 사용하는 람노리피드는 특별히 제한되지 않지만, 예를 들어 하기 일반식 (2) 또는 일반식 (3) 으로 나타내는 구조를 갖는 것을 사용할 수 있다.

일반식 (2) 에 있어서, R ⁵ 는 수소 원자, -CH ₂ -[CH(OH)] _m -CH ₂ (OH), -(XO) _n H, 혹은 탄소수 1 ∼ 36 의 알킬기, 알케닐기 또는 지방족 아실기를 나타낸다. 여기서, 알킬기, 알케닐기는 직사슬형이어도 되고 분기형이어도 되며, 지방족 아실기는 직사슬형이어도 되고 분기형이어도 되며, 포화이어도 되고 불포화이어도 된다. 또, m 은 0 ∼ 8 의 정수이며, X 는 에틸렌, 프로필렌 및 부틸렌 중 적어도 1 종을 나타내고, n 은 1 ∼ 1000 의 정수이다. R ⁶ 은 수소 원자 또는 2-데세노일기이 다. R ⁵ 와 R ⁶ 은 독립되어 있다.

일반식 (3) 에 있어서, R ⁷ 은 수소 원자, -CH ₂ -[CH(OH)] _m -CH ₂ (OH), -(XO) _n H, 혹은 탄소수 1 ∼ 36 의 알킬기, 알케닐기 또는 지방족 아실기를 나타낸다. 여기서, 알킬기, 알케닐기는 직사슬형이어도 되고 분기형이어도 되며, 지방족 아실기는 직사슬형이어도 되고 분기형이어도 되며, 포화이어도 되고 불포화이어도 된다. 또, m 은 0 ∼ 8 의 정수이며, X 는 에틸렌, 프로필렌 및 부틸렌 중 적어도 1 종을 나타내고, n 은 1 ∼ 1000 의 정수이다. R ⁸ 은 수소 원자 또는 2-데세노일기이다. R ⁷ 과 R ⁸ 은 독립되어 있다.

또, 본 발명의 사료 첨가제에 있어서의 람노리피드는 1 종만이어도 되고, 복수종의 혼합물이어도 된다.

본 발명에 있어서 사용하는 람노리피드는 세균을 배양하여 얻을 수 있다. 예를 들어, 슈도모나스 (Pseudomonas) 속, 버크홀데리아 (Burkholderia) 속에 속하는 세균 등을 사용할 수 있다. 이 중에서도, 슈도모나스속에 속하는 세균을 사 용하는 것이 바람직하다. 슈도모나스속에 속하는 세균으로는 Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas chlororaphis 등을 들 수 있지만, Pseudomonas sp. 를 사용할 수도 있다. 버크홀데리아속에 속하는 세균으로는 Burkholderia pseudomalle 등을 들 수 있다. 이 중에서도, 특히 Pseudomonas aeruginosa 를 사용하는 것이 바람직하다. 구체적으로는, 예를 들어 Pseudomonas aeruginosa NBRC 3924 균주, Pseudomonas sp. DSM 2874 균주 등을 사용할 수 있다.

NBRC3924 균주는 독립행정법인 제품평가기술기반기구의 생물유전자원부문 (NBRC) 에 등록되어 있는 균주이다.

DSM 2874 균주는 Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ) 에 등록되어 있는 균주이다.

또, 람노리피드는 합성한 것이나 시판품을 사용할 수도 있다.

상기 서술한 미생물을 사용하여 MEL 및 람노리피드를 생산시키기 위해서는 이하와 같은 방법을 사용할 수 있다.

MEL 을 생산시키기 위해서는, 천연 유지류, 지방산, 알코올, 케톤류, 탄화수소류, n-알칸 등의 원료 중에서, 사용하는 미생물에 적절한 원료를 선택하고, 그 미생물의 배양에 통상적으로 사용되는 배양 온도를 사용하여 배양하면 된다. 원료로서 바람직한 것은 천연 유지류로서, 예를 들어, 대두유, 해바라기유, 코코넛유, 면실유, 콘유, 팜유 등을 사용할 수 있고, 이 중에서도 특히 대두유가 바람직하게 사용된다.

또, 람노리피드를 생산시키기 위해서는, 천연 유지류, 지방산, 알코올, 케톤 류, 탄화수소류, n-알칸, 당류 등의 원료 중에서, 사용하는 미생물에 적절한 원료를 선택하고, 그 미생물의 배양에 통상적으로 사용되는 배양 온도를 사용하여 배양하면 된다. 이와 같은 방법으로서 예를 들어, 일본 공개특허공보 평10-75796호에 기재된 방법을 사용할 수 있다.

어느 쪽의 경우도, 배양 방법은 특별히 제한되지 않고, 정치 (靜置) 배양, 왕복동식 진탕 배양, 회전 이동식 진탕 배양, 자퍼멘터 배양 등에 의한 액체 배양법이나 고체 배양법을 사용할 수 있다.

Pseudozyma 속에 속하는 효모를 사용하여 MEL 을 생산하는 경우에는, 통상적으로 Pseudozyma 속에 속하는 효모의 배양에 사용되는 배지에 대두유 등의 천연 유지류를 첨가하고, 20℃ ∼ 35℃ 에서 배양하면 된다.

또, Pseudomonas 속에 속하는 세균을 사용하여, 람노리피드를 생산하는 경우에는, 통상적으로 Pseudomonas 속에 속하는 세균의 배양에 사용되는 배지에, 대두유 등의 천연 유지류, 글루코오스 등의 당류, 에탄올 등의 알코올류를 첨가하고, 20 ∼ 40℃ 에서 배양하면 된다.

또, 미생물을 사용하여 MEL 및/또는 람노리피드를 생산하는 경우에는, 배양물을 정제하여 MEL 및/또는 람노리피드의 정제품을 사용해도 되고, 배양물을 원심 분리하여 MEL 및/또는 람노리피드를 함유하는 획분을 사용해도 된다. 또, 배양물을 그대로 사용해도 되고, 예를 들어, 배양액이나 고체 배양물을 건조·분쇄한 것 등을 사용할 수 있다.

본 발명의 사료 첨가제는 MEL 및 람노리피드 중 어느 것을 함유하고 있어도 되고, 이들 양방을 함유하고 있어도 된다. 또, MEL 및/또는 람노리피드의 함유량은 특별히 제한되지 않지만, 효과를 충분히 얻는 관점에서는, 바람직하게는 10 질량ppm 이상, 더욱 바람직하게는 1 질량％ 이상이다.

또, 본 발명의 사료 첨가제는 MEL 및/또는 람노리피드 외에, 조류 또는 포유류의 질병을 예방 또는 치료에 유효한 성분, 반추 동물의 성장 촉진에 유효한 성분, 영양 보조 성분, 보존 안정성을 높이는 성분 등의 임의 성분을 더욱 함유하는 것이어도 된다. 이와 같은 임의 성분으로는, 예를 들어, 엔테로코커스류, 바실루스류, 비피더스균류 등의 생균제 ； 아밀라아제, 리파아제 등의 효소 ； L-아스코르브산, 염화콜린, 이노시톨, 엽산 등의 비타민 ； 염화칼륨, 시트르산철, 산화마그네슘, 인산염류 등의 미네랄, DL-알라닌, DL-메티오닌, 염산L-리신 등의 아미노산 ； 푸마르산, 부티르산, 락트산, 아세트산 및 그들의 염류 등의 유기산 ； 에톡시킨, 디부틸히드록시톨루엔 등의 항산화제 ； 프로피온산칼슘 등의 곰팡이 방지제 ； CMC, 카세인나트륨, 폴리아크릴산나트륨 등의 점결제 ； 글리세린 지방산 에스테르, 소르비탄 지방산 에스테르 등의 유화제 ； 아스타크잔틴, 칸타크잔틴 등의 색소 ； 각종 에스테르, 에테르, 케톤류 등의 착향료를 들 수 있다.

본 발명의 사료 첨가제의 제형은 특별히 제한되지 않고, 예를 들어 분말, 액체, 정제 등 임의의 형태로 할 수 있다. 본 발명의 사료 첨가제는 MEL 및/또는 람노리피드, 그리고 필요에 따라 임의 성분을 혼합하고, 제제화함으로써 제조할 수 있다.

또, MEL 및 람노리피드는 조류 또는 포유류의 질병을 일으키는 세균에 대해 항균 활성을 나타내기 때문에, 본 발명의 사료 첨가제는 이들 세균에 의해 발생되는 조류 또는 포유류의 질병을 예방 또는 치료하기 위해서 사용할 수 있다.

본 발명의 사료 첨가제는 특히 그람 양성 세균에 의해 발생되는 감염증의 예방 또는 치료에 바람직하게 사용할 수 있다.

이와 같은 그람 양성 세균으로는, 예를 들어 Micrococcus, Staphylococcus, Streptococcus, Planococcus, Stomatococcus, Enterococcus, Peptococcus, Peptostreptococcus, Ruminococcus, Leuconostoc, Pediococcus, Aerococcus, Gemella, Coprococcus, Sarcina, Bacillus, Clostridium, Lactobacillus, Listeria, Erysipelothrix, Corynebacterium, Rhodococcus, Propionibacterium, Eubacterium, Actinomyces, Bifidobacterium, Mycobacterium, Nocardia, Dermatophilus 등의 속에 속하는 세균을 들 수 있다.

본 발명의 사료 첨가제는 특히, 스타필로코커스속 또는 스트랩토코커스속에 속하는 세균, 구체적으로는 Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Streptococcus suis, Streptococcus bovis 등에 의해 발생되는 질병의 예방 또는 치료에 바람직하게 사용할 수 있다.

본 발명의 사료 첨가제는 조류 또는 포유류의 사료, 애완 동물 사료, 애완 동물용 서플리먼트 (이하, 사료라고 한다) 에 사용되는 다른 사료 성분과 혼합하여, 조류 또는 포유류용의 사료로 할 수 있다. 사료의 종류나 성분은 특별히 제한되지 않는다. 또, 본 발명의 사료에는, 사료 첨가제에 첨가할 수 있는, 상기 임의 성분을 첨가하여 조제해도 된다. 또, 본 발명의 사료는 조류 또는 포 유류의 질병을 예방 또는 치료하기 위한 사료로 할 수도 있다.

본 발명의 사료에 있어서의 MEL 및/또는 람노리피드의 함유량은 부여하는 동물의 종류, 건강 상태, 사료의 종류, 사료 성분, 연령, 성별, 체중 등에 따라 적절히 조절되고, 특별히 제한되지 않지만, 건물 질량당 바람직하게는 1 ∼ 10000 질량ppm, 더욱 바람직하게는 10 ∼ 10000 질량ppm, 더욱 바람직하게는 10 ∼ 1000 질량ppm 이다.

본 발명의 사료는 사료 첨가제를 그대로 사료 성분에 첨가하고, 혼합하여 제조할 수 있다. 이 때, 분말상, 고형상의 사료 첨가제를 사용하는 경우에는, 혼합을 용이하게 하기 위해서 사료 첨가제를 액상 또는 겔상의 형태로 해도 된다. 이 경우에는, 물, 대두유, 채종유, 콘유 등의 식물유, 액체 동물유, 폴리비닐알코올이나 폴리비닐피롤리돈, 폴리아크릴산 등의 수용성 고분자 화합물을 액체 담체로서 사용할 수 있다. 또, 사료 중에 있어서의 MEL 및/또는 람노리피드의 균일성을 유지하기 위해서 알긴산, 알긴산나트륨, 잔탄검, 카세인나트륨, 아라비아고무, 구아검, 타마린드 종자 다당류 등의 수용성 다당류를 배합하는 것도 바람직하다.

본 발명의 사료를 섭취시키는 동물의 종류는 조류 또는 포유류이다. 예를 들어, 가축이나 개, 고양이 등의 애완 동물에게 사용할 수 있다. 본 발명의 사료는 이 중에서도 가축, 특히 닭, 돼지, 소의 사육에 바람직하다. 또, 반추 동물의 사육에도 바람직하다. 예를 들어, 본 발명의 사료는 소, 염소, 양 등의 사육에 바람직하다. 섭취시키는 사료의 양은 동물의 종류, 체중, 연령, 성별, 건강 상태, 사료의 성분 등에 의해 적절히 조절할 수 있다.

사료를 섭취시키는 방법 및 사육하는 방법은 동물의 종류에 따라, 통상적으로 사용되는 방법을 취할 수 있다.

［I］항균성의 평가

＜1＞ MEL 의 생산

(1) 슈도지마속 효모의 배양

(전 배양)

포테이토덱스트로오스 배지 10㎖ 를 시험관에 넣고, 실리콘 마개를 하였다. 오토클레이브 멸균 후, Pseudozyma aphidis NBRC 10182 를 식균하고, 30℃ 에서 24 시간 진탕 배양하였다.

(본 배양)

이온 교환수, 대두유 8％, NaNO ₃ 0.2％, KH ₂ PO ₄ 0.02％, MgSO ₄ ·7H ₂ O 0.02％, yeast extract 0.1％ 로 이루어지는 배지 50㎖ 를 500㎖ Erle㎚eyer 플라스크에 넣고, 실리콘 마개를 하여 오토클레이브에서 멸균하였다. 그곳에, 앞서 서술한 NBRC 10182 의 전 배양액을 첨가하고, 30℃／220rpm 으로 7 일간 진탕 배양하였다.

(2) MEL 의 추출·정제

(추출)

본 배양에서 얻은 배양액 50㎖ 를 분액 깔때기에 넣고, 등량의 아세트산에틸로 2 회 추출하고, 아세트산에틸층을 합하여 용매를 증류 제거하였다. 그 후, 메탄올 25㎖ 에 용해하고, 50㎖ 의 헥산으로 2 회 세정한 후, 메탄올을 증류 제거하고, MEL 의 조정제물을 얻었다 (후술하는 안트론 반응으로부터, 순도 69％).

(정제)

상기 조정제물 1g 을 소량의 클로로포름에 용해하고, 실리카 겔 칼럼으로 분획하였다. 클로로포름 500㎖, 클로로포름/아세트산에틸 = 4/1 500㎖, 아세톤 500㎖, 메탄올 500㎖ 를 순차적으로 흘려 분획하였다.

각 획분을 박층 크로마토그래피로 전개하고 (전개 용매 CHCl ₃ /MeOH/물 = 65/15/2), 하기 문헌 1) 에 기술된 각종 MEL 의 Rf 치 (Rf = 0.52, 0.58, 0.63, 0.77) 를 나타내는 획분을 선별하고, 이들 획분을 정리하여 표준 샘플로 하였다.

1) Agric.Biol.Chem., 54 (1) 31-36, 1990

(순도 측정 ： 안트론 반응)

아세트산에틸에 의해 적당한 농도로 희석한 조정제물을 시험관에 넣고, 용매를 증류 제거하였다. 그곳에 안트론 시약 (0.2％ 안트론 75％ 황산액) 5㎖ 를 첨가하고, 끓는 물 중에서 10 분간 반응시켜, 620㎚ 의 흡수를 측정하였다. 표준 샘플과의 비교에 의해, 조정제물의 순도를 산출하였다.

＜2＞ 람노리피드의 생산

(1) 슈도모나스속 균의 배양

(전 배양)

펩톤 배지 10㎖ 를 시험관에 넣고, 실리콘 마개를 하였다. 오토클레이브 멸균 후, Pseudomonas aeruginosa NBRC 3924 를 식균하고, 30℃ 에서 24 시간 진탕 배양하였다.

(본 배양)

이온 교환수, CaCO ₃ 0.2％, K ₂ HPO ₄ 0.05％, MgSO ₄ ·7H ₂ O 0.05％, yeast extract 0.5％, Soy flour 0.5％ 로 이루어지는 배지 50㎖ 를 500㎖ Erle㎚eyer 플라스크에 넣고, 실리콘 마개를 하여 오토클레이브에서 멸균하였다. 그곳에, 필터 멸균한 에탄올 1㎖ 및 상기 서술한 NBRC 3924 의 전 배양액을 첨가하고, 이틀마다 필터 멸균한 에탄올 0.75㎖ 를 첨가하고, 28℃／220rpm 으로 8 일간 진탕 배양하였다.

(2) 람노리피드의 추출·정제

(추출)

본 배양에서 얻은 배양액 50㎖ 를 분액 깔때기에 넣고, 메탄올/클로로포름 = 1/1 로 2 회 추출하고, 유기층을 합하여 용매를 증류 제거하고, 람노리피드의 조(粗)정제물을 얻었다 (후술하는 안트론 반응으로부터, 순도 55％).

(정제)

상기 본 배양에서 얻은 배양액 450㎖ 를 pH 3 으로 조제하고, 원심 분리에 의해 균체를 제거하였다. 상청을 0.5M Tris-HCl 버퍼 (pH 9.0) 로 전 처리한 TSKgel DEAE-토요펄 650M 을 채운 칼럼에 통과시키고, 그 후 0.5M Tris-HCl 버퍼 (pH 9.0) 로 칼럼 세정하였다. NaCl 농도 0 ∼ 0.4M (0.5M Tris-HCl 버퍼 (pH 9.0)) 의 범위에서 경사를 주어 2.3㎖/min 으로 칼럼에 통과시키고, 겔에 포착되어 있는 람노리피드를 용출시켜 분획하였다.

각 획분을 박층 크로마토그래피로 전개하고 (전개 용매 CHCl ₃ /MeOH/물 = 65/25/4), 하기 문헌 2) 에 기술된 각종 람노리피드의 Rf 치 (Rf = 0.32, 0.52) 를 나타내는 획분을 선별하고, 메탄올/클로로포름 = 1/1 에서 추출하고, 이들 획분을 정리하고 용매를 증류 제거하여 표준 샘플로 하였다.

2) Biotechnology Letters, 54 (12) 1213-1215, 1997

(순도 측정 ： 안트론 반응)

메탄올에 의해 적당한 농도로 희석한 조정제물을 시험관에 넣고, 용매를 증류 제거하였다. 거기에 안트론 시약 (0.2％ 안트론 75％ 황산액) 5㎖ 를 첨가하고, 끓는 물 중에서 10 분간 반응시키고, 620㎚ 의 흡수를 측정하였다. 표준 샘플과의 비교에 의해, 조정제물의 순도 산출을 행하였다.

＜3＞ 항균성의 평가

하기의 요령으로, MEL, 람노리피드에 대해, 표 1 에 나타내는 각종 세균의 최소 발육 저지 농도 (MIC) 를 측정하였다.

각종 세균의 전 배양은 감수성 측정용 부용 배지 (닛스이) 를 사용하여 행하였다. 배양액의 균농도를 생리 식염수에서 약 1.0×10 ⁵ ∼ 10 ⁶ CFU/㎖ 가 되도록 조제한 후, 측정 배지에 각종 세균을 접종하였다. 측정 배지로는, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Bacillus subtilis 에 대해 서는 감수성 측정용 배지 (닛스이) 를 사용하고, Streptococcus suis, Streptococcus bovis 에 대해서는 혈액 한천 배지 (하트 인퓨전 배지 ： 닛스이, 면양 (綿羊) 무균 탈섬유 혈액 ： 코진 바이오) 를 사용하였다. 배양은 Staphylococcus aureus 및 Staphylococcus epidermidis, Bacillus subtilis 에 대해서는 호기 배양, Streptococcus suis, Streptococcus bovis 에 대해서는 5％ 탄산 가스 배양으로, 모두 37℃, 약 20 시간 행하였다. 배양 종료 후, MIC 를 측정하였다.

MEL 은 ＜1＞ 에서 얻은 MEL 의 조정제물 (순도 69％) 을, 람노리피드는 ＜2＞ 에서 얻은 람노리피드의 조정제물 (순도 55％) 을 사용하였다. 또, 비교를 위해서, 자당 에스테르 (Sucrose monodecanoate : 시그마 알드 리치 재팬 제품), 만노오스 (와코 순약 공업 제품), 람노오스 (시그마 알드 리치 재팬 제품) 에 대해서도 MIC 를 측정하였다.

결과를 표 1 에 나타낸다.

MEL 및 람노리피드는 동일한 당지질의 Sucrose monodecanoate 와 비교하여, Staphylococcus, Streptococcus, Bacillus 속의 세균에 대해 수 ∼ 수십 배 높은 항균 활성을 나타냈다. 한편, 당지질의 구성체인 만노오스 및 람노오스는 항균 활성을 나타내지 않았다.

이것으로부터, MEL 및 람노리피드를 조류나 포유류에 섭취시켜 사육함으로써, 상기 각종 세균에 의해 발생되는 질병을 예방 또는 치료하는 효과가 기대된다.

［Ⅱ］가스 및 휘발성 지방산의 생성량의 평가

＜1＞ 만노실에리트리톨리피드 (MEL) 의 생산

(1) 슈도지마속 효모의 배양

(전 배양)

포테이토덱스트로오스 배지 10㎖ 를 시험관에 넣고, 실리콘 마개를 하였다. 오토클레이브 멸균 후, Psuedozyma aphidis NBRC 10182 를 식균하고, 30℃ 로 24 시간 진탕 배양하였다.

(본 배양)

이온 교환수, 대두유 8％, NaNO ₃ 0.2％, KH ₂ PO ₄ 0.02％, MgSO ₄ ·7H ₂ O 0.02％, yeast extract 0.1％ 로 이루어지는 배지 50㎖ 를 500㎖ Erle㎚eyer 플라스크에 넣고, 실리콘 마개를 하여 오토클레이브로 멸균하였다. 그곳에 상기 서술한 Psuedozyma aphidis NBRC 10182 의 전 배양액을 첨가하고, 30℃／220rpm 로 10 일간 진탕 배양하였다.

(2) MEL 의 정제

(정제)

상기 배양액 50㎖ 에 1N HCl 을 첨가하여 pH 3 으로 조정한 후, 원심 분리에 의해 상청을 없앴다. 침전부에 순수 50㎖ 를 첨가하여 교반한 후, 한번 더 원심 분리 조작을 행하여, 침전부를 회수하였다. 침전부를 10㎖ 의 MeOH 에 용해시킨 후, 추가로 10㎖ 의 헥산을 첨가하여 세정을 실시하였다 (3 회). 세정 후의 MeOH 용액에 물 10㎖ 를 첨가하고, 그곳에서 클로로포름 10㎖ 로 MEL 의 추출 조작을 행하였다 (3 회). 클로로포름층을 합하여 용매를 증류 제거하고, 조정제물을 얻었다. 안트론 반응으로부터 순도 90％.

(표준 샘플)

상기 조정제물 1g 을 소량의 클로로포름에 용해하고, 실리카 겔 칼럼으로 분획하였다. 클로로포름 500㎖, 클로로포름/아세트산에틸 = 4/1 500㎖, 아세톤 500㎖, 메탄올 500㎖ 를 순차적으로 흘려 분획하였다.

각 획분을 박층 크로마토그래피로 전개하고 (전개 용매 CHCl ₃ /MeOH/물 : 65/15/2), Agric.Biol.Chem., 54 (1), 31-36, 1990 에 기술된 Rf.치의 분획 (각종 MEL 이 나타내는 Rf 치, Rf = 0.52, 0.58, 0.63, 0.77) 을 선별하고, 그것들을 정리하여 표준 샘플로 하였다.

(순도 측정 ： 안트론 반응)

아세트산에틸에 의해 적당한 농도로 희석한 비정제 생성물을 시험관에 넣고, 용매를 증류 제거하였다. 그곳에 안트론 시약 (0.2％ 안트론 75％ 황산액) 5㎖ 를 첨가하고, 끓는 물 중에서 10 분간 반응시키고, 620㎚ 의 흡수를 측정하였다. 표준 샘플과의 비교에 의해, 조정제물의 순도 산출을 행하였다.

＜2＞ 람노리피드 (RL)

Bio Future Ltd. 사 제조 BFL Biosurfactant (람노리피드) 를 건조시켜 사용하였다.

＜3＞ 람노리피드 (RL) 및 만노실에리트리톨리피드 (MEL) 의 루멘에 있어서의 가스 생성 및 휘발성 지방산 생성에 대한 영향

(1) 시료

상기한 람노리피드 (RL) 및 만노실에리트리톨리피드 (MEL) 를 시험에 사용하였다. 배양 이노칼럼에는 홋카이도대학 북방생물권 필드과학센터 생물생산연구농장 소유의 홀스타인종 암소 (루멘 캐뉼러 장착) 로부터 채취한 루멘액 (4 겹 거즈 여과액) 을 사용하였다. 이노칼럼은 McDougal 의 인공 타액 (pH 6.8) 으로 2 배로 희석하여 사용하였다.

(2) 배양

시험 배양액 농도를 RL 에서 500㎍/㎖, MEL 에서 500㎍/㎖ 로 하여 실시하였다. RL, MEL 각 0.05g 을 각각 1㎖ 의 에탄올에 용해하고, 각 100㎕ 를 헝게이트 튜브에 첨가하였다. 수 시간 방치함으로써 에탄올을 휘산시켰다. 이곳에 배양기질로서 옥수수 전분 0.15g, 배합 사료 분말 0.025g 및 오챠드 그래스 건초 분말 0.025g 을 첨가하였다. 상기의 희석 루멘액을 10㎖ 첨가하고, 헤드 스페이스에 질소 가스를 불어 넣으면서 부틸 고무 캡과 플라스틱 스크루 캡을 씌워 워터 배스에서 혐기 배양하였다 (37℃, 18 시간).

처리는 무첨가 (에탄올만 ： 대조구), RL 첨가 (RL 구) 및 MEL 첨가 (MEL 구) 로 하고, 각각 5 개씩의 배양으로 하였다.

(3) 분석

메탄, 수소, 이산화탄소는 TCD 가스 크로마토그래피로 분석하였다. 총휘발성 지방산 (VFA) 농도와 조성은 FID 가스 크로마토그래피로 측정하였다.

(4) 결과

(i) 가스 생성

배양 18 시간 후의 총 가스량은 RL 구 및 MEL 구도 감소하였다 (각각 51％ 및 48％ 의 감소). 이 중에서 메탄의 감소는 특히 현저하고, RL 구 및 MEL 구로 각각 96％ 및 99％ 의 감소가 확인되고, 메탄 생성은 거의 없어졌다. 이산화탄소는 RL 구 및 MEL 구로 각각 37％ 및 35％ 감소하였다. 총 가스에서 차지하는 비율로 보면, 메탄에서는 대조구의 23.7％ 에 비교하여 RL 구에서 2.1％ 로, MEL 구에서 0.3％ 로 저하되었다.

결과를 표 2 및 도 1 에 나타낸다.

(ⅱ) 휘발성 지방산 (VFA) 의 생성

총 VFA 농도는 처리에 의한 영향은 없었지만, 각 VFA 산생 패턴은 크게 변화하였다. 즉, 아세트산, 부티르산, 이소부티르산, 발레르산 및 이소발레르산 농도는 RL 첨가 및 MEL 첨가에 의해 유의하게 저하되었다. 한편, 프로피온산 농도는 현저하게 증가되었다 (RL 구에서 85％, MEL 구에서 53％ 증가). 각 산의 몰비율은 프로피온산이 증가 (25.8％ 가 46.7％ 및 41.1％ 로), 아세트산과 부티르산이 저하 (각각 60.9％ 가 49.7％ 및 53.4％ 로, 10.6％ 가 2.0％ 및 5.0％ 로) 되었지만, 모두 유의하였다. 특히 프로피온산 비율은 통상적인 루멘에서는 보이지 않을 정도의 상승을 보았다.

결과를 표 3 및 도 2 에 나타낸다.

본 발명의 사료 첨가제를 사료에 혼합하여 조류 또는 포유류에 섭취시킴으로써, 질병을 예방 또는 치료할 수 있다. 구체적으로는, 그람 양성 세균에 의한 감염증을 예방 또는 치료할 수 있다. 본 발명의 사료 첨가제를 함유하는 사료는 닭, 돼지, 소 등의 가축 사육에 바람직하게 사용할 수 있다. 또, 본 발명의 사료 첨가제는 생분해성이 높고, 생체 및 환경에 대한 안전성이 높다.

또, 본 발명의 사료 첨가제를 사료에 혼합하고, 반추 동물에게 섭취시킴으로써, 메탄 생성을 억제하고, 또한 프로피온산 생성을 촉진할 수 있고, 그 결과, 반추 동물의 성장을 촉진시키고, 사료 효율을 개선할 수 있다. 본 발명의 사료 첨가제를 함유하는 사료는, 소, 염소, 양 등의 반추 동물의 사육에 바람직하게 사용할 수 있다. 또, 본 발명의 사료 첨가제는 생분해성이 높고, 생체 및 환경에 대한 안전성이 높다.