技术领域
[0001] 本
发明涉及
生物发酵技术领域，尤其涉及一种裂壶藻粉在提高反刍动物乳汁中DHA含量的应用。
背景技术
[0002] DHA(Docosahexaenoicacid，二十二
碳六烯酸，22:6，n-3)是一种必需
脂肪酸，即人体不能自生合成，又具有重要生理功能的长链脂肪酸。DHA是人的大脑和
视网膜的主要组成成分，在大脑皮层中含量达20％，在视网膜中含量高达50％，因此，对胎婴儿的神经系统和视觉系统的发育起重要作用，是维持正常智
力和视力的重要的保障，还具有防治心
血管疾病、抗癌、抗炎等重要的生理功能。
[0003] 另外，DHA在乳品中的应用已不罕见，婴幼儿配方奶粉中的广泛使用就是一个典型的例子。DHA强化多是以添加鱼油、藻油来实现的，在添加过程中会给产品带来不同程度的腥味，需要特殊的工艺才能使产品的
风味口感满足食用的要求。另一方面为保证产品的
货架期，需要对产品体系内的鱼油及藻油进行乳化稳定及抗
氧化保护，例如均质处理及使用抗
氧化剂等，这无疑增加了
食品加工工艺的复杂性。
[0004] 以及天然DHA概念的提出，天然DHA原料奶这一概念从技术
角度回避了前面提出的产品配料过程中遇到的问题。通过对奶
牛的
饲料进行DHA强化而获得，传统的DHA资源已无法满足市场需求。因此，开发DHA的新生资源已成为新的研究热点。普通牛奶中的DHA含量极低，通过适当增加反刍动物日粮中DHA等多不
饱和脂肪酸摄入量，可提高乳汁、肌肉组织中DHA含量，扩展了DHA天然有机奶的制作来源。
[0005] 此外，
专利CN109082381A公开了一种裂壶藻及其制剂在提高反刍动物乳汁中DHA含量的应用的方法，其所采用的发酵培养基组成复杂程度，生产成本较高；且所制备的裂壶藻粉制剂口感有待提高，在给反刍动物饲喂过程中存在预饲期，造成饲喂周期长，且牛奶中富集的DHA含量
水平还有待提高。
发明内容
[0006] 本发明为解决
现有技术中的上述问题，提出一种裂壶藻粉在提高反刍动物乳汁中DHA含量的应用。
[0007] 为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
[0008] 本发明提供一种裂壶藻或其制剂在提高反刍动物乳汁中DHA含量的应用，所述动物为反刍动物，其中：所述裂壶藻(Schizochytrium sp.)为裂壶藻(Schizochytrium sp.)D1.0，其在中国典型培养物保藏中心的保藏编号为CCTCC NO.M2016617。
[0009] 进一步地，在所述的裂壶藻粉在提高反刍动物乳汁中DHA含量的应用中，所述反刍动物为牛。
[0010] 进一步地，在所述的裂壶藻粉在提高反刍动物乳汁中DHA含量的应用中，所述裂壶藻制剂为裂壶藻粉。
[0011] 进一步优选地，在所述的裂壶藻粉在提高反刍动物乳汁中DHA含量的应用中，所述培养裂壶藻(Schizochytrium sp.)D1.0可利用发酵培养基进行，所述裂壶藻粉的制备方法包括：
[0012] 培养如
权利要求1中所述的裂壶藻(Schizochytrium sp.)，得裂壶藻发酵液：
[0013] 利用所述裂壶藻发酵液制备得到所述裂壶藻粉。
[0014] 进一步较为地，在所述的裂壶藻粉在提高反刍动物乳汁中DHA含量的应用中，所述裂壶藻(Schizochytrium sp.)利用
种子培养基和发酵培养基进行培养，其中：
[0015] a.种子培养基配方为(g/L)：
[0016]
葡萄糖50-70g/L，
酵母浸膏4-6g/L，谷
氨酸钠10-20g/L，
氯化钠2.4-4.0g/L，
硫酸镁1.0-2.0g/L，硫酸铵1.0-2.0g/L，余量为水；
[0017] b、发酵培养基配方为(g/L)
[0018] 甘油50-70g/L，葡萄糖50-70g/L，酵母浸膏4-6g/L，谷氨酸钠10-20g/L，氯化钠2.4-4.0g/L，
硫酸镁1.0-2.0g/L，硫酸铵1.0-2.0g/L，余量为水。
[0019] 进一步优选地，在所述的裂壶藻粉在提高反刍动物乳汁中DHA含量的应用中，所述裂壶藻(Schizochytrium sp.)发酵液的培养
温度为22-27℃，初始pH：5.0-7.0。
[0020] 进一步优选地，在所述的裂壶藻粉在提高反刍动物乳汁中DHA含量的应用中，所述所述裂壶藻(Schizochytrium sp.)发酵液的培养方法包括如下步骤：
[0021] (1)培养基的制备
[0022] 种子培养基为葡萄糖20-50g/L，酵母浸膏2-4g/L，谷氨酸钠10-20g/L，氯化钠1.5-2.0g/L，硫酸镁1.0-2.0g/L，余量为水，pH5.0-7.0；配制培养基通入
蒸汽消毒121℃，30min后降至接种温度待用；
[0023] 发酵培养基为甘油50-70g/L，葡萄糖50-70g/L，酵母浸膏4-6g/L，谷氨酸钠10-20g/L，氯化钠2.4-4.0g/L，硫酸镁1.0-2.0g/L，硫酸铵1.0-2.0g/L，余量为水,pH5.0-7.0；
配制培养基通入蒸汽消毒121℃，30min后降至接种温度待用；
[0024] (2)裂壶藻(Schizochytrium sp.)种子扩培
[0025] 向种子培养基中接入裂壶藻，按体积比计，接种量1-10％，摇床转速180rmp、25℃的条件下进行摇瓶培养；
[0026] 按照所述的裂壶藻培养基，以700L种子罐体积计，向种子培养基中通入蒸汽消毒121℃，30min后降至接种温度，将摇瓶培养的种子液转入到700L种子罐，培养20～28小时，培养温度22-27℃，在通气比为0.6VVM的条件下进行扩大培养；
[0027] 按照所述的种子培养基，以6500L种子罐体积80％计，向种子培养基中通入蒸汽消毒121℃，30min后降至接种温度，将700L扩大培养的种子培养液转入到6500L种子培养基中，培养20～28小时；
[0028] (3)裂壶藻发酵液的制备
[0029] 按照所述裂壶藻培养基，以60000L
发酵罐体积80％计，向发酵培养基中通入蒸汽消毒121℃，30min后降至接种温度，将6500L的种子培养液转入到60000L培养基中，通气比0.8-1.0VVM，通过控制搅拌转速调节溶氧水平，培养62～70小时，得裂壶藻发酵液；
[0030] 进一步较为优选地，在所述的裂壶藻粉在提高反刍动物乳汁中DHA含量的应用中，所述裂壶藻粉由所述裂壶藻发酵液经离心、洗涤、添加抗氧化剂后进行干燥而得。
[0031] 更进一步地，在所述的裂壶藻粉在提高反刍动物乳汁中DHA含量的应用中，所述抗氧化剂由不同的抗氧剂组成，所述抗氧化剂选自维生素E、单，双甘油脂肪酸酯、卵磷脂、特丁基对苯二酚(TBHQ)、竹叶抗氧化物组成的混合抗氧化剂或单一抗氧化剂。
[0032] 更进一步优选地，在所述的裂壶藻粉在提高反刍动物乳汁中DHA含量的应用中，所述抗氧化剂为：
[0033] K1：组分配比为(0.3-0.8):(0.7-1.2):(0.05-0.10)的单，双甘油脂肪酸酯、卵磷脂、竹叶抗氧化物的组合物；或
[0034] K2：组分配比为(0.03-0.08):(0.03-0.08):(0.07-0.12)的单，双甘油脂肪酸酯、特丁基对苯二酚(TBHQ)、维生素E抗氧化物的组合物；或
[0035] K3：单一特丁基对苯二酚或维生素E。
[0036] 更进一步优选地，在所述的裂壶藻粉在提高反刍动物乳汁中DHA含量的应用中，所述抗氧化剂为：K1：组分配比为(0.3-0.8):(0.7-1.2):(0.05-0.10)的单，双甘油脂肪酸酯、卵磷脂、竹叶抗氧化物的组合物；或K2：组分配比为(0.03-0.08):(0.03-0.08):(0.07-0.12)的单，双甘油脂肪酸酯、特丁基对苯二酚(TBHQ)、维生素E抗氧化物的组合物。
[0037] 进一步优选地，在所述的裂壶藻粉在提高反刍动物乳汁中DHA含量的应用中，所述干燥为
喷雾干燥。
[0038] 本发明采用上述技术方案，与现有技术相比，具有如下技术效果：
[0039] 本发明提供的裂壶藻或其制剂可有效改善反刍动物脂肪品质，提高反刍动物乳汁中DHA含量的应用，所采用的裂壶藻保藏于中国典型培养物保藏中心，菌株保藏号为CCTCC M2016617；利用本发明的裂壶藻制备的裂壶藻粉可以提高反刍动物乳汁中DHA的含量；制作的裂壶藻粉保留了裂壶藻原生固有成分，这种天然来源的高DHA含量乳汁，有机、安全、稳定、易吸收，可以作为人们摄取天然DHA的更安全有效途径，更能迎合和满足消费者需求，同时畜牧养殖业可利用其发明提高生产性能和产品品质新的突破口，提高生产效益，有重要意义。
附图说明
[0040] 图1为本发明裂壶藻粉在提高反刍动物乳汁中DHA含量的应用中的裂壶藻粉的制备工艺流程示意图。
具体实施方式
[0041] 下面通过具体
实施例对本发明进行详细和具体的介绍，以使更好的理解本发明，但是下述实施例并不限制本发明范围。
[0042] 实施例1裂壶藻粉的制备
[0043] 利用中国典型培养物保藏中心的保藏编号为CCTCC NO.M2016617的裂壶藻(Schizochytrium sp.)D1.0制备裂壶藻粉的步骤如下，如图1所示，在发酵罐成套设备上能够重复如下步骤：
[0044] (1)培养基的制备
[0045] 种子培养基为葡萄糖20-50g/L，酵母浸膏2-4g/L，谷氨酸钠10-20g/L，氯化钠1.5-2.0g/L，硫酸镁1.0-2.0g/L，余量为水，pH5.0-7.0。配制培养基通入蒸汽消毒121℃，30min后降至接种温度待用；
[0046] 发酵培养基为甘油50-70g/L，葡萄糖50-70g/L，酵母浸膏4-6g/L，谷氨酸钠10-20g/L，氯化钠2.4-4.0g/L，硫酸镁1.0-2.0g/L，硫酸铵1.0-2.0g/L，余量为水，pH5.0-7.0。
配制培养基通入蒸汽消毒121℃，30min后降至接种温度待用；
[0047] (2)裂壶藻全细胞获取
[0048] 向种子培养基中接入裂壶藻，按体积比计，接种量1-10％，摇床转速180rmp、25℃的条件下进行摇瓶培养；
[0049] 然后于700L种子罐培养24小时，培养温度22～27℃，VVM为0.6的条件下进行扩大培养；
[0050] 将700L种子培养液转入到扩大种子培养基中，培养24小时转入到6500L种子罐培养液中。培养温度22～27℃，VVM为0.6的条件下进行扩大培养；
[0051] (3)裂壶藻发酵液的制备
[0052] 将6500L种子培养液转入到60000L培养基中，通气比0.8-1.0VVM，通过控制搅拌转速调节溶氧水平，培养62～70小时，获得裂壶藻发酵液；
[0053] (4)裂壶藻粉的制备
[0054] 将发酵结束后制得的裂壶藻发酵液通过离心除去残糖废液，向发酵液添加抗氧化剂K1)单，双甘油脂肪酸酯、卵磷脂、竹叶抗氧化物组合比为：(0.3-0.8):(0.7-1.2):(0.05-0.10)，将
混合液混合均匀获得稳定的裂壶藻发酵液经
过喷雾干燥制备获得裂壶藻粉1；
[0055] 发酵结束后通过离心除去残糖废液，向发酵液添加抗氧化剂K2)单，双甘油脂肪酸酯、特丁基对苯二酚(TBHQ)、维生素E抗氧化物组合比为：(0.03-0.08):(0.03-0.08):(0.07-0.12)，将混合液混合均匀获得稳定的裂壶藻发酵液经过喷雾干燥制备获得裂壶藻粉2；
[0056] 发酵结束后通过离心除去残糖废液，向发酵液添加抗氧化剂K3)单一添加特丁基对苯二酚或维生素E，将混合液混合均匀获得稳定的裂壶藻发酵液过喷雾干燥制备获得裂壶藻粉3。
[0057] 指标检测
[0058] (一)按照湖北欣和裂壶藻粉企业标准将得到的裂壶藻粉1-3的样品进行
粗蛋白、粗灰分、粗脂肪和DHA含量指标分析，其分析方法如下：
[0059] 粗
蛋白质的检测：按照GB/T 6432饲料中粗蛋白测定方法进行。
[0060] 粗灰分的检测：按照GB/T 6438饲料中粗灰分的测定方法进行。
[0061] 粗脂肪的检测：按照GB/T 21514饲料中脂肪酸含量的测定方法进行。
[0062] DHA含量的检测：按照GB26400-2011
食品安全国家标准
食品添加剂卫视二碳六烯酸油脂(发酵法)的测定进行。
[0063] (二)检测结果如表1和表2所示，结果显示，上述步骤中得到的裂壶藻粉中的蛋白质含量为10～60％，水分的
质量含量为2～5％，粗脂肪的质量含量为25～50％，DHA含量在18～22％。
[0064] 表1 裂壶藻粉的指标检测结果
[0065]
[0066]
[0067] 表2 裂壶藻粉营养成分分析表
[0068]
[0070] (一)试验动物的选择和分组
[0071] 试验奶牛按年龄、胎次、泌乳时间及生理状态大致相同或相近的原则，选择处于泌乳中期的健康荷斯坦
泌乳母牛64头，随机分为4组，每组16头。
[0072] (二)试验日粮
[0073]
基础日粮——精饲料和粗饲料，保持牛场原来的饲喂状况：精饲料10kg，粗饲料是
啤酒糟6.5kg，青贮22kg，甜菜粕2.2kg，羊草2.2kg每天分早、晚各饲喂一次。
[0074] 裂壶藻粉：裂壶藻粉按照上述实施例1方法配制而成。
[0075] 裂壶藻粉添加方法：按照分组添加量每组试验量加到精料中混合均匀。
[0076] (三)试验牛的饲养管理
[0077] 试验牛集中在一个牛舍采用单槽饲喂，日饲喂两次，饮水自由采食，
挤奶两次，每次投料按先精料后粗料顺序。
[0078] 试验期内其它管理措施均保持一致，并固定专人做好牛舍温湿度、牛增重、产乳、耗料、采食及健康状况等观察及相关记录。
[0079] (四)试验设计
[0080] 按照对照组仅仅基础日粮、实验一组添加基础日粮+50g裂壶藻粉、试验二组添加基础日粮+100g裂壶藻粉、第三组添加基础日粮+200g裂壶藻粉。
[0081] 试验分为三期，饲喂前7天观察期、饲喂期饲喂各组添加量开始第3天
采样，每隔3天采集饲喂奶牛的牛奶，第30天饲喂停止。后观察期为10天观察同样每隔3天采样进行分析。
[0082] (五)试验结果
[0083] (1)奶牛饲喂日粮：精饲料10kg，粗饲料是啤
酒糟6.5kg，青贮22kg，甜菜粕2.2kg，羊草2.2kg，每天都吃完。
[0084] 实验组于对照组的采食情况一致，表明添加裂壶藻粉不影响奶牛的日采食量。
[0085] (2)产奶量：(对照组选3组数据，其余试验组为9组数据)
[0086] 表3 裂壶藻粉饲喂奶牛的试验结果
[0087]
[0088]
[0089] (3)对产奶量进行偏差分析
[0090] 表4 产奶量的偏差分析结果
[0091] 组别 前第-2天 第3天 第12天 第21天 第30天 第36天对照组 18.70±6.93 19.53±7.19 19.77±8.55 19.47±8.30 201.10±4.28 20.47±6.10添加50g 20.52±7.99 20.07±6.75 22.61±7.53 22.79±7.34 23.36±2.90 23.61±3.18添加100g 21.49±8.19 21.08±6.52 21.18±7.2 20.99±7.20 19.96±2.72 21.60±3.82添加200g 22.38±8.10 21.34±7.96 22.14±7.64 21.61±7.22 22.07±6.70 20.82±6.35[0092] 注：同列肩注不同小写字母表示差异显著(P<0.05)，不同大写字母者表示差异极显著(P<0.01)，不标注或相同字母者表示差异不显著(P>0.05)；
[0093] 由上表4可知，试验组与对照组间的牛奶产量无论在试验开始前还是试验结束均不存在显著差异(P>0.05)，表明日粮中添加裂壶藻粉对牛奶的产奶量不影响。
[0094] (4)牛奶常规检测结果：
[0095] 表5 牛奶常规检测结果
[0096]
[0097]
[0098]
[0100]
[0101] 注：同列肩注不同小写字母表示差异显著(P<0.05)，不同大写字母者表示差异极显著(P<0.01)，不标注或相同字母者表示差异不显著(P>0.05)
[0102] 由上表6可知，三个实验组牛奶中的DHA含量与空白组均存在极显著的差异(P<0.01)，且这两个试验组之间也极显著(P<0.01)，各试验组间的脂肪、蛋白、干物质都差异不显著(P>0.05)。
[0103] 上述结果显示：饲喂奶牛的日粮中添加裂壶藻粉对牛奶的脂肪、蛋白、干物质影响不大，面对牛奶中DHA含量影响不大，能显著提高DHA含量，试验三组比试验二组的等DHA含量比试验组一高。
[0104] 综上，本发明提供的裂壶藻粉，在应用于饲喂反刍动物的过程中可有效提高反刍动物乳汁中DHA含量，且在饲喂过程中没有预饲期，比现有裂壶藻粉在给反刍动物饲喂效果更优；该裂壶藻粉可有效保持微藻全细胞的口感更适合奶牛采食，从饲喂到稳定只需要18天，采用该裂壶藻粉30天的饲喂周期已经超过现有CN109082381A裂壶藻粉制剂报道的牛奶中富集的DHA含量水平。
[0105] 上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同
修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。
