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用于收获 哺乳动物细胞培养物的方法

阅读：275发布：2020-05-13

专利汇可以提供用于收获哺乳动物细胞培养物的方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明提供了用于培养哺乳动物细胞以及收获重组蛋白的方法和材料。，下面是用于收获哺乳动物细胞培养物的方法专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种用于延长的周期性收获的方法，其包括
通过用表达重组蛋白的哺乳动物细胞接种生物反应器来建立细胞培养，
通过将新鲜细胞培养基灌流到所述生物反应器中来维持所述细胞培养、使所述细胞培养物穿过过滤器并收集渗透物，
其中初始收集无效渗透物直到达到第一预定参数，此时收集收获渗透物持续预定时间，
然后交替收集无效渗透物直到达到第二预定参数，然后收集收获渗透物持续预定时间，
其中所述无效渗透物和收获渗透物的交替式收集继续直到所述细胞培养终止。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述预定参数选自时间、活细胞密度、细胞压积或效价。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述第一预定参数为所述细胞培养建立后至少12小时至25天。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述第二预定参数为收集所述收获渗透物后至少
12至72小时。
5.根据权利要求1所述的方法，其中所述预定时间为至少12至72小时。
6.根据权利要求1所述的方法，其中当收集所述无效渗透物时，所述过滤器是具有将所述重组蛋白保留在所述生物反应器中的孔径或分子量筛截的中空纤维过滤器。
7.根据权利要求1所述的方法，其中当收集所述收获渗透物时，所述过滤器是具有不将所述重组蛋白保留在所述生物反应器中的孔径或分子量筛截的中空纤维过滤器。
8.根据权利要求1所述的方法，其中所述过滤器是单一单元过滤器系统。
9. 根据权利要求1所述的方法，其中当从具有不将所述重组蛋白保留在所述生物反应器中的孔径或分子量筛截的中空纤维过滤器的过滤器中收集所述渗透物时，配制或补充所述新鲜细胞培养基以得到至少5 g/L的非离子嵌段共聚物。
10.根据权利要求1所述的方法，其还包括在所述细胞培养过程中取样，评价所述样品以定量和/或定性监测所述重组蛋白的特性和/或所述细胞培养过程。
11.根据权利要求1所述的方法，其中所述灌流为连续灌流。
12.根据权利要求1所述的方法，其中所述灌流以每天小于或等于1.0个工作容积的速率执行。
13. 根据权利要求1所述的方法，其中所述灌流通过蠕动泵、双隔膜泵、低剪切泵或交替式切向流来完成。
14.根据权利要求1所述的方法，其中所述方法还包括
使所述细胞培养经历温度变化，其中所述细胞a)在第一温度下培养第一时间段以及b)在第二温度下培养第二时间段。
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述温度变化响应于预定参数，其中使用基于电容的生物质探针来确定实现所述预定参数。
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16. 根据权利要求1所述的方法，其中所述细胞培养通过用至少0.1 x 10个活细胞/mL接种所述生物反应器来建立。
17.根据权利要求1所述的方法，其中所述哺乳动物细胞为中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。
18.根据权利要求1所述的方法，其中所述重组蛋白选自由人抗体、人源化抗体、嵌合抗体、重组融合蛋白或细胞因子组成的组。
19.根据权利要求1所述的方法，其中所述重组蛋白通过絮凝、沉淀、离心、深层过滤、亲和色谱、大小排阻色谱、离子交换色谱、混合模式阴离子交换色谱、疏水相互作用色谱或羟基磷灰石色谱中的一种或多种从所述收获渗透物中进行纯化。
20.根据权利要求19所述的方法，其还包括在所述纯化过程中取样，评价所述样品以定量和/或定性监测所述纯化过程以及所述重组蛋白的特性。
21.根据权利要求20所述的方法，其中所述样品使用过程分析技术进行定量和/或定性监测。
22.根据权利要求19所述的方法，其中所述重组蛋白被配制成药学上可接受的制剂。
23. 一种重组蛋白，其通过权利要求1所述的方法生产。
24.一种用于收获重组蛋白的方法，其包括
通过用表达重组蛋白的哺乳动物细胞接种生物反应器来建立细胞培养，
通过用配制或补充以得到至少5 g/L的非离子嵌段共聚物浓度的新鲜细胞培养基灌流所述细胞培养物来维持所述细胞培养，以及
使所述细胞培养物穿过具有不将所述重组蛋白保留在所述生物反应器中的孔径或分子量筛截的中空纤维过滤器，以及
收集含有所述重组蛋白的渗透物。
25.一种用于收获重组蛋白的方法，其包括
通过用表达重组蛋白的哺乳动物细胞接种生物反应器来建立细胞培养，
通过用配制或补充以得到至少1 g/L的非离子嵌段共聚物浓度的新鲜细胞培养基灌流所述细胞培养物来维持所述细胞培养，以及使所述细胞培养物穿过具有将所述重组蛋白保留在所述生物反应器中的孔径或分子量筛截的中空纤维过滤器，以及收集渗透物；
一旦达到预定参数，用配制或补充以得到至少5 g/L的非离子嵌段共聚物浓度的新鲜细胞培养基灌流所述细胞培养物，以及使所述细胞培养物穿过具有不将所述重组蛋白保留在所述生物反应器中的孔径或分子量筛截的中空纤维过滤器，以及
收集含有所述重组蛋白的渗透物。
26.根据权利要求25所述的方法，其中具有将所述重组蛋白保留在所述生物反应器中的孔径或分子量筛截的所述中空纤维过滤器以及具有不将所述重组蛋白保留在所述生物反应器中的孔径或分子量筛截的所述中空纤维过滤器是单一单元过滤器系统的部件。
27.一种单一单元过滤器系统，其包括具有不同孔径或分子量筛截的两个或更多个中空纤维过滤器部件，其中所述中空纤维过滤器部件彼此串联固定使得所述单独的中空纤维之间维持无菌流动路径，并且不同孔径或分子量筛截的所述中空纤维过滤器部件相对于它们的从中取出所述渗透物的中空壳体侧彼此隔离，使得所述渗透物可以从每个相应的中空纤维过滤器部件中独立地移除。
28.根据权利要求27所述的单一单元过滤器系统，其中至少一个中空纤维过滤器部件具有将所述重组蛋白保留在所述生物反应器中的孔径或分子量筛截，并且至少一个中空纤维过滤器部件具有孔径过滤器，其为具有不将所述重组蛋白保留在所述生物反应器中的孔径或分子量筛截的中空纤维过滤器。
29.根据权利要求27所述的单一单元系统，其中所述单一单元过滤器系统被包含在壳体内。
30. 根据权利要求27所述的单一单元过滤器系统，其还包括所述中空纤维过滤器部件中的至少两个之间的间隔物。
31.一种用于培养表达重组蛋白的细胞的方法，其包括
通过用表达重组蛋白的哺乳动物细胞接种生物反应器来建立细胞培养，
通过将新鲜细胞培养基灌流到所述生物反应器中来维持所述细胞培养、使所述细胞培养物穿过根据权利要求27所述的单一单元过滤器系统并收集渗透物，
其中所述单一单元过滤器系统附接至所述生物反应器并且所述细胞培养物通过单一泵送系统从所述生物反应器中抽出并进入到所述单一单元过滤器系统中，其中所述细胞培养物穿过所述单一单元过滤器系统的中空纤维的管腔侧并返回到所述生物反应器中，并且从所述中空纤维过滤器部件中的一个或多个中取出渗透物。

说明书全文

用于收获 哺乳动物细胞培养物的方法

[0001] 相关申请的交叉引用

[0002] 本申请要求2014年6月4日提交的美国临时申请号62/007,588的权益，所述临时申请以引用的方式整体并入本文。发明领域

[0003] 本发明提供了用于培养哺乳动物细胞以及收获重组蛋白的方法和材料。

[0004] 发明背景

[0005] 由于对更大量的治疗性重组蛋白的需求持续增长，正在对过程进行优化，特别是用于生长、补料和维持对细胞活力和蛋白回收具有积极影响的生产细胞培养物的方法和策略进行大量的努力。开发用于生产重组蛋白的制造过程是一个复杂的尝试，其中许多变量必须平衡。这对于上游过程尤其如此，其中细胞培养过程的每个元素都可以对生产的后期阶段、特别是收获和下游加工具有很大的影响。

[0006] 典型的细胞培养经历生长期，这是指数生长的时期，其中细胞密度增加。指数细胞生长减慢并且蛋白质生产开始增加时，生长期之后是过渡期。这标志着平台期即生产期的开始，其中细胞密度通常趋于平稳并且产物效价增加。在分批收获系统中，其中将细胞培养物维持设定的天数，然后一次收获所有全部培养物，大多数产物可以在收获前最后几天产生，此时细胞培养物通常达到其最大产量。虽然这可以造成单一的高效价收获，但是它是以启动下一次运行的非生产性周转时间和再次达到最高产量的迟延时间为代价。在连续收获系统中，其中在整个生产期在连续基础上从细胞培养物中收集含有渗透物的产物，细胞培养持续时间延长，但是以较低的产物效价和在收获和纯化阶段需要处理的较高体积的废细胞培养液为代价。

[0007] 细胞培养和收获过程开发最终是过程优化的练习，交易变量诸如产品效价和产品质量的加工速度。挑战包括例如维持细胞活力、实现可行的产物效价以及平衡来自上游过程的产量与收获和下游过程可以处理的产量。

[0008] 鉴于大规模细胞培养过程的费用以及对生物产品的更大量和更低成本的不断增长的需求，提供重组蛋白生产和回收的甚至递增改进的新过程方法是很有价值的。细胞培养过程的改进可以导致更大的产物回收，因此需要降低与制造蛋白质治疗剂相关的成本。本发明通过提供此类用于延长细胞培养持续时间同时增加蛋白质回收的方法和材料来满足这些需要。
发明概要

[0009] 本发明提供了用于延长的周期性收获的方法，其包括通过用表达重组蛋白的哺乳动物细胞接种生物反应器来建立细胞培养，通过将新鲜细胞培养基灌流到生物反应器中来维持细胞培养，使细胞培养物穿过过滤器以及收集渗透物，其中初始收集无效渗透物直到达到第一预定参数，此时收集收获渗透物持续预定时间，然后交替收集无效渗透物直到达到第二预定参数，然后收集收获渗透物持续预定时间，其中所述无效渗透物和收获渗透物的交替式收集持续直到细胞培养终止。

[0010] 在一个实施方案中，预定参数选自时间、活细胞密度、细胞压积或效价。

[0011] 在一个实施方案中，第一预定参数为细胞培养建立后至少12小时至25天。在一个实施方案中，第一预定参数为细胞培养建立后至少24至72小时。在一个实施方案中，第一预定参数为细胞培养建立后至少4天。在一个实施方案中，第一预定参数为细胞培养建立后至少5或更多天。在一个实施方案中，第一预定参数为细胞培养建立后至少25天。在一个实施方案中，第一预定参数为细胞培养建立后至少5至25天。在一个实施方案中，第一预定参数为细胞培养建立后至少10至12天。

[0012] 在一个实施方案中，第二预定参数为收集收获渗透物后至少12至72小时。在一个实施方案中，第二预定参数为收集收获渗透物后至少24至72小时。在一个实施方案中，第二预定参数为收集收获渗透物后至少24至48小时。

[0013] 在一个实施方案中，预定时间为至少12至72小时。在一个实施方案中，预定时间为至少24至72小时。在一个实施方案中，预定时间为至少24至48小时。\

[0014] 在一个实施方案中，初始收集无效渗透物至少24小时至25天，此时收集收获渗透物12至72小时，然后交替收集无效渗透物至少24小时至25天，然后收集收获渗透物12至72小时。

[0015] 在一个实施方案中，当收集无效渗透物时，过滤器是具有将重组蛋白保留在生物反应器中的孔径或分子量筛截(MWCO)的中空纤维过滤器。在一个相关实施方案中，分子量筛截为300kDa或更小。在一个相关实施方案中，中空纤维过滤器为超滤器。

[0016] 在一个实施方案中，当收集收获渗透物时，过滤器是具有不将重组蛋白保留在生物反应器中的孔径或分子量筛截(MWCO)的中空纤维过滤器。在一个相关实施方案中，分子量筛截为至少500kDa。在一个相关实施方案中，中空纤维过滤器为微滤器。

[0017] 在一个实施方案中，过滤器为单一单元过滤器系统。在一个相关实施方案中，单一单元过滤器系统包括至少一个具有将重组蛋白保留在生物反应器中的孔径或分子量筛截(MWCO)的中空纤维过滤器部件以及至少一个具有不将重组蛋白保留在生物反应器中的孔径或分子量筛截(MWCO)的中空纤维过滤器部件。在一个相关实施方案中，将重组蛋白保留在生物反应器中的至少一个中空纤维过滤器部件的分子量筛截为300kDa或更小。在一个相关实施方案中，不将重组蛋白保留在生物反应器中的至少一个中空纤维过滤器部件的分子量筛截为至少500kDa。在一个相关实施方案中，将重组蛋白保留在生物反应器中的至少一个中空纤维过滤器部件为超滤器，并且不将重组蛋白保留在生物反应器中的至少一个中空纤维过滤器部件为微滤器。在一个相关实施方案中，单一单元过滤器系统被包含在壳体内。在一个相关实施方案中，单一单元过滤器系统还包括中空纤维过滤器部件中的至少两个之间的间隔物。

[0018] 在一个实施方案中，当收集无效渗透物时，其从具有将重组蛋白保留在生物反应器中的孔径或分子量筛截(MWCO)的至少一个中空纤维过滤器中取出。

[0019] 在一个实施方案中，当收集收获渗透物时，其从具有不将重组蛋白保留在生物反应器中的孔径或分子量筛截(MWCO)的至少一个中空纤维过滤器中取出。

[0020] 在一个实施方案中，当从具有不将重组蛋白保留在生物反应器中的孔径或分子量筛截的中空纤维过滤器的过滤器中收集渗透物时，配制或补充新鲜细胞培养基以得到至少5g/L的非离子嵌段共聚物。在一个相关实施方案中，非离子嵌段共聚物为聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段共聚物。在一个相关实施方案中，非离子嵌段共聚物为泊洛沙姆188。

[0021] 在一个实施方案中，上述方法还包括在细胞培养过程中取样，评价样品以定量和/或定性监测重组蛋白的特性和/或细胞培养过程。在一个相关实施方案中，使用过程分析技术定量和/或定性监测样品。

[0022] 在一个实施方案中，灌流为连续灌流。在一个实施方案中，灌流的速率是恒定的。在一个实施方案中，灌流以每天小于或等于1.0个工作体积的速率进行。在一个实施方案中，灌流通过蠕动泵、双隔膜泵、低剪切泵或交替式切向流来完成。在一个相关实施方案中，灌流通过交替式切向流来完成。

[0023] 在一个实施方案中，上述方法还包括使细胞培养经历温度变化，其中细胞a)在第一温度下培养第一时间段以及b)在第二温度下培养第二时间段。在一个相关实施方案中，温度变化发生在生长期与生产期之间的过渡处。在一个相关实施方案中，温度变化在生产期期间发生。在一个相关实施方案中，温度变化响应于预定参数。在一个相关实施方案中，温度变化响应于预定参数，其中使用基于电容的生物质探针来确定实现预定参数。

[0024] 在一个实施方案中，细胞培养通过用至少0.1x106个活细胞/mL接种生物反应器来建立。在一个相关实施方案中，通过使用交替式切向流过滤的灌流过程来使接种物生长。

[0025] 在一个实施方案中，在进入生物反应器之前，将细胞培养基使用纳米过滤、高温瞬时灭菌(HTST)或UV与过滤相结合进行处理。

[0026] 在一个实施方案中，生物反应器为生产型生物反应器。在一个相关实施方案中，生物反应器具有至少500L的容量。在一个相关实施方案中，生物反应器具有至少500L至2000L的容量。在一个相关实施方案中，生物反应器具有至少1000L至2000L的容量。

[0027] 在一个实施方案中，细胞培养基是无血清细胞培养基。在一个实施方案中，细胞培养基是化学成分确定的无血清细胞培养基。在一个实施方案中，细胞培养基是灌流细胞培养基。

[0028] 在一个实施方案中，哺乳动物细胞是中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。在一个实施方案中，重组蛋白选自由人抗体、人源化抗体、嵌合抗体、重组融合蛋白或细胞因子组成的组。

[0029] 在一个实施方案中，通过絮凝、沉淀、离心、深层过滤、亲和色谱、大小排阻色谱、离子交换色谱、混合模式阴离子交换色谱、疏水相互作用色谱或羟基磷灰石色谱中的一种或多种从收获渗透物中纯化重组蛋白。在一个实施方案中，上述方法还包括在纯化过程中取样，评价样品以定量和/或定性监测纯化过程和重组蛋白的特性。

[0030] 在一个实施方案中，将重组蛋白配制成药学上可接受的制剂。在一个实施方案中，提供了由以上方法生产的重组蛋白。

[0031] 本发明也提供了用于收获重组蛋白的方法，其包括通过用表达重组蛋白的哺乳动物细胞接种生物反应器来建立细胞培养，通过用配制或补充以得到至少5g/L的非离子嵌段共聚物浓度的新鲜细胞培养基灌流细胞培养物来维持细胞培养并且使细胞培养物穿过具有不将重组蛋白保留在生物反应器中的孔径或分子量筛截(MWCO)的中空纤维过滤器，以及收集含有重组蛋白的渗透物。

[0032] 在一个实施方案中，分子量筛截为至少500kDa。在一个实施方案中，中空纤维过滤器为微滤器。

[0033] 本发明也提供了用于收获重组蛋白的方法，包括通过用表达重组蛋白的哺乳动物细胞接种生物反应器来建立细胞培养，通过用配制或补充以得到至少1g/L的非离子嵌段共聚物浓度的新鲜细胞培养基灌流细胞培养物来维持细胞培养以及使细胞培养物穿过具有将重组蛋白保留在生物反应器中的孔径或分子量筛截(MWCO)的中空纤维过滤器，以及收集渗透物；一旦达到预定参数，用配制或补充以得到至少5g/L的非离子嵌段共聚物浓度的新鲜细胞培养基灌流细胞培养物来维持细胞培养，并且使细胞培养物穿过具有不将重组蛋白保留在生物反应器中的孔径或分子量筛截(MWCO)的中空纤维过滤器，并且收集含有重组蛋白的渗透物。

[0034] 在一个实施方案中，具有将重组蛋白保留在生物反应器中的孔径或分子量筛截的中空纤维过滤器的分子量筛截为300kDa或更小。在一个实施方案中，具有将重组蛋白保留在生物反应器中的孔径或分子量筛截的中空纤维过滤器为超滤器。

[0035] 在一个实施方案中，具有不将重组蛋白保留在生物反应器中的孔径或分子量筛截(MWCO)的中空纤维过滤器的分子量筛截为至少500kDa。在一个实施方案中，具有不将重组蛋白保留在生物反应器中的孔径或分子量筛截(MWCO)的中空纤维过滤器为微滤器。

[0036] 在一个实施方案中，具有将重组蛋白保留在生物反应器中的孔径或分子量筛截的中空纤维过滤器以及具有不将重组蛋白保留在生物反应器中的孔径或分子量筛截的中空纤维过滤器是单一单元过滤器系统的部件。

[0037] 在一个实施方案中，非离子嵌段共聚物为聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段共聚物。在一个实施方案中，非离子嵌段共聚物为泊洛沙姆188。

[0038] 在一个实施方案中，上述方法还包括在细胞培养过程中取样，评价样品以定量和/或定性监测重组蛋白的特性和/或细胞培养过程。在一个实施方案中，使用过程分析技术定量和/或定性监测样品。

[0039] 在一个实施方案中，灌流为连续灌流。在一个实施方案中，灌流的速率是恒定的。在一个实施方案中，灌流以每天小于或等于1.0个工作体积的速率进行。在一个实施方案中，灌流通过蠕动泵、双隔膜泵、低剪切泵或交替式切向流来完成。在一个实施方案中，灌流通过交替式切向流来完成。

[0040] 在一个实施方案中，上述方法还包括使细胞培养经历温度变化，其中细胞a)在第一温度下培养第一时间段以及b)在第二温度下培养第二时间段。在一个相关实施方案中，温度变化发生在生长期与生产期之间的过渡处。在一个相关实施方案中，温度变化在生产期期间发生。在一个相关实施方案中，温度变化响应于预定参数。在一个相关实施方案中，温度变化响应于预定参数，其中使用基于电容的生物质探针来确定达到预定参数。

[0041] 在一个实施方案中，细胞培养通过用至少0.1x106个活细胞/mL接种生物反应器来建立。在一个实施方案中，通过使用交替式切向流过滤的灌流过程来使接种物生长。

[0042] 在一个实施方案中，在进入生物反应器之前，将细胞培养基使用纳米过滤、高温瞬时灭菌(HTST)或UV与过滤相结合进行处理。

[0043] 在一个实施方案中，生物反应器为生产型生物反应器。在一个实施方案中，生物反应器具有至少500L的容量。在一个相关实施方案中，生物反应器具有至少500L至2000L的容量。在一个相关实施方案中，生物反应器具有至少1000L至2000L的容量。

[0044] 在一个实施方案中，细胞培养基是无血清细胞培养基。在一个实施方案中，细胞培养基是化学成分确定的无血清细胞培养基。在一个实施方案中，所述细胞培养基是灌流细胞培养基。

[0045] 在一个实施方案中，哺乳动物细胞是中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。

[0046] 在一个实施方案中，重组蛋白选自由人抗体、人源化抗体、嵌合抗体、重组融合蛋白或细胞因子组成的组。

[0047] 在一个实施方案中，通过絮凝、沉淀、离心、深层过滤、亲和色谱、大小排阻色谱、离子交换色谱、混合模式阴离子交换色谱、疏水相互作用色谱或羟基磷灰石色谱中的一种或多种从收获渗透物中纯化重组蛋白。

[0048] 在一个实施方案中，上述方法还包括在纯化过程中取样，评价样品以定量和/或定性监测生产过程和重组蛋白的特性。

[0049] 在一个实施方案中，将重组蛋白配制成药学上可接受的制剂。

[0050] 在一个实施方案中，提供了由以上方法生产的重组蛋白。

[0051] 本发明也提供了包括具有不同孔径或分子量筛截(MWCO)的两个或更多个中空纤维过滤器部件的单一单元过滤器系统，其中所述中空纤维过滤器部件彼此串联固定使得单独的中空纤维之间维持无菌流动路径，并且具有不同孔径或分子量筛截的中空纤维过滤器部件相对于它们的从中取出渗透物的中空壳体侧彼此隔离使得渗透物可以从每个相应的中空纤维过滤器部件中独立地移除。

[0052] 在一个实施方案中，至少一个中空纤维过滤器部件具有将重组蛋白保留在生物反应器中的孔径或分子量筛截，并且至少一个中空纤维过滤器部件具有孔径过滤器，其为具有不将重组蛋白保留在生物反应器中的孔径或分子量筛截的中空纤维过滤器。在一个相关实施方案中，至少一个中空纤维过滤器部件具有300kDa或更小的分子量筛截，并且至少一个中空纤维过滤器部件具有至少500kDa的分子量筛截。在一个相关实施方案中，至少一个中空纤维过滤器部件是超滤器，并且至少一个中空纤维过滤器部件是微滤器。在一个相关实施方案中，单一单元过滤器系统被包含在壳体内。在一个实施方案中，单一过滤器单元还包括中空纤维过滤器部件中的至少两个之间的间隔物。

[0053] 所述方法也提供了培养表达重组蛋白的细胞的方法，其包括通过用表达重组蛋白的哺乳动物细胞接种生物反应器来建立细胞培养，通过将新鲜细胞培养基灌流到生物反应器中来维持细胞培养，使细胞培养物穿过单一单元过滤器系统以及收集渗透物，其中所述单一单元过滤器系统附接至所述生物反应器并且通过单一泵送系统将所述细胞培养物从所述生物反应器抽出并进入所述单一单元过滤器系统，其中所述细胞培养物穿过单一单元过滤器系统的中空纤维的官腔侧并返回到生物反应器内并且从一个或多个中空纤维过滤器部件中取出渗透物。

[0054] 在一个实施方案中，上述方法还包括在细胞培养过程中取样，评价样品以定量和/或定性监测重组蛋白的特性和/或细胞培养过程。在一个相关过程中，提供过程分析技术定量和/或定性监测样品。

[0055] 在一个实施方案中，灌流为连续灌流。在一个实施方案中，灌流的速率是恒定的。在一个实施方案中，灌流以每天小于或等于1.0个工作体积的速率进行。

[0056] 在一个实施方案中，灌流通过蠕动泵、双隔膜泵、低剪切泵或交替式切向流来完成。在一个实施方案中，灌流通过交替式切向流来完成。

[0057] 在一个实施方案中，当从具有不将重组蛋白保留在生物反应器中的孔径或分子量筛截的中空纤维过滤器部件中收集渗透物时，配制或补充新鲜细胞培养基以得到至少5g/L的非离子嵌段共聚物。在一个相关实施方案中，非离子嵌段共聚物为聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段共聚物。在一个相关实施方案中，非离子嵌段共聚物为泊洛沙姆188。

[0058] 在一个实施方案中，上述方法还包括使细胞培养经历温度变化，其中细胞a)在第一温度下培养第一时间段以及b)在第二温度下培养第二时间段。在一个实施方案中，温度变化发生在生长期与生产期之间的过渡处。在一个相关实施方案中，温度变化在生产期期间发生。在一个相关实施方案中，温度变化响应于预定参数，其中使用基于电容的生物质探针来确定达到预定参数。

[0059] 在一个实施方案中，细胞培养通过用至少0.1x106个活细胞/mL接种生物反应器来建立。在一个相关实施方案中，通过使用交替式切向流过滤的灌流过程来使接种物生长。

[0060] 在一个实施方案中，在进入生物反应器之前，将细胞培养基使用纳米过滤、高温瞬时灭菌(HTST)或UV与过滤相结合进行处理。

[0061] 在一个实施方案中，生物反应器为生产型生物反应器。在一个相关实施方案中，生物反应器具有至少500L的容量。在一个相关实施方案中，生物反应器具有至少500L至2000L的容量。在一个相关实施方案中，生物反应器具有至少1000L至2000L的容量。

[0062] 在一个实施方案中，细胞培养基是无血清细胞培养基。在一个实施方案中，细胞培养基是化学成分确定的无血清细胞培养基。在一个实施方案中，所述细胞培养基是灌流细胞培养基。

[0063] 在一个实施方案中，哺乳动物细胞是中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。

[0064] 在一个实施方案中，重组蛋白选自由人抗体、人源化抗体、嵌合抗体、重组融合蛋白或细胞因子组成的组。

[0065] 在一个实施方案中，通过絮凝、沉淀、离心、深层过滤、亲和色谱、大小排阻色谱、离子交换色谱、混合模式阴离子交换色谱、疏水相互作用色谱或羟基磷灰石色谱中的一种或多种从收获渗透物中纯化重组蛋白

[0066] 在一个实施方案中，上述方法还包括在纯化过程中取样，评价样品以定量和/或定性监测生产过程和重组蛋白的特性。

[0067] 在一个实施方案中，将重组蛋白配制成药学上可接受的制剂。在一个实施方案中，提供了由以上方法生产的重组蛋白。

[0068] 附图简述

[0069] 图1单一单元过滤器系统的示意图，所述单一单元过滤器系统具有单个开口，其中细胞培养液通过单个开口进入和离开。过滤器可以在任何方向，示出了微滤器中空纤维后面是超滤器中空纤维。

[0070] 图2与超滤过程相比n＝4(实心圆)延长的周期性收获过程n＝2(空心正方形)的效价。

[0071] 图3与超滤过程相比n＝4(实心圆)延长的周期性收获过程n＝2(空心正方形)的活细胞密度。

[0072] 图4与超滤过程相比n＝4(实心圆)延长的周期性收获过程n＝2(空心正方形)的活力百分比。

[0073] 图5配备有750kDa过滤器(空心圆)的反应器和配备有30kDa过滤器的反应器(实心圆)的活力百分比。在配备有750kDa过滤器的反应器中，活力百分比在第6天下降至80％。在配备有30kDa过滤器的反应器中的活力百分比维持在>80％持续14天。

[0074] 图6在具有30kDa或750kDa的中空纤维过滤器单元的反应器的上清液(实心圆)和渗透物(空心正方形)中测量的 F68浓度。30kDa上清液示出在超过第9-13天F68的积累。

[0075] 图7A与1g/L相比，在每种 F68浓度(2g/L-5g/L)下细胞系A和细胞系B的标准化活细胞密度，得出细胞密度比。与1g/L的传代数据相比，使用所有传代的数据之间的学生t-检验进行比较。统计显著性：*≤0.0001；**≤0.001；***≤0.01；****≤0.05。

[0076] 图7B与1g/L相比，在每种 F68浓度(2g/L-5g/L)下细胞系A和细胞系B的活力百分比。与1g/L的传代数据相比，使用所有传代的数据之间的学生t-检验进行比较。统计显著性：*≤0.0001；**≤0.001；***≤0.01；****≤0.05。

[0077] 图7C与1g/L F68下的细胞直径相比，每种 F68浓度下细胞系A和细胞系B的细胞直径。与1g/L的传代数据相比，使用所有传代的数据之间的学生t-检验进行比较。统计显著性：*≤0.0001；**≤0.001；***≤0.01；****≤0.05。

[0078] 图8 1g/L F68(空心正方形)和5g/L F68(实心圆)下细胞系A和细胞系B的细胞活力百分比。当 F68的浓度增加至5g/L时，存活力维持在>90％持续>
30天。

[0079] 图9 pluronic浓度对具有含有1g/L F68(实心正方形)或5g/LF68(空心圆)的灌流培养基的750kDa ATF过滤器的2L反应器中生长的细胞的活力的影响。

[0080] 图10 F68的浓度的增加(直到5g/L)对生长在具有750kDa ATF过滤器的2L反应器中的1g/L F68下的细胞活力的恢复的影响。培养基A：实心圆。培养基B：空心
圆。箭头指示 F68浓度何时增加。

[0081] 图11：葡萄糖和甘露糖的GCMS定量。(A)用于己糖的GC分离的TIC和(B)在含有12C-己糖和13C-内标己糖的己糖峰中发现的典型的质谱断裂模式。(C)葡萄糖和甘露糖定量的测定线性关系。

[0082] 图12：甘露糖对IgG的高甘露糖糖基化的影响。(A)用递增量的甘露糖培养的CHO细胞；(B)用递增量的甘露糖和不同浓度的葡萄糖培养的CHO细胞。高甘露糖糖基化的线性增加不依赖于葡萄糖浓度。

[0083] 图13：PAC反馈回路的示意图。需要提供预定义的产品质量属性的PAC过程的关键元素是QTPP，其为包括自动采样和属性指定分析、用于修改过程的控制模型以及具有调整属性水平的已知控制杆的过程的一种PAT系统。

[0084] 图14：使用单反应器运行经由最小二乘回归计算模型参数。符号是用于经由最小二乘回归找到模型参数的测量。虚线为所得的模型输出。点线是使用用于MPC的生长参数的模型拟合。图A和B中的红色实线示出了用于产生此训练数据的甘露糖补料。A)高甘露糖％B)反应器甘露糖浓度C)细胞密度(任意缩放的计算体积)D)产物浓度

[0085] 图15：经由模型预测控制证明高甘露糖％的控制。在所有图中，符号是测量值，但是只有空心符号用于模型预测控制。点线是给出测量和采取控制动作的模型输出。图A和B中的红色实线示出了通过MPC的甘露糖补料。A)高甘露糖％B)反应器甘露糖浓度C)随着任意缩放的计算体积(SCV)的细胞密度D)产物浓度

[0086] 图16：PAC数据和非PAC数据的比较。经由HILIC测定获得的高甘露糖％数据。

[0087] 发明详述

[0088] 本发明提供了一种延长的周期性收获方法，其提供了在获得高效价渗透物的同时维持连续细胞培养物处于其峰值产量的优点。本发明提供了用于延长的周期性收获的方法，其包括通过用表达重组蛋白产物的哺乳动物细胞接种生物反应器来建立细胞培养，通过将新鲜细胞培养基灌流到生物反应器中来维持细胞培养，使细胞培养物穿过过滤器以及收集渗透物，其中初始收集无效渗透物直到达到第一预定参数，此时收集收获渗透物持续预定时间，然后交替收集无效渗透物直到达到第二预定参数，然后收集收获渗透物持续预定时间，其中所述无效渗透物和收获渗透物的交替式收集继续直到细胞培养终止。

[0089] 可以通过实现细胞培养的一些所需的特性、属性或性能里程碑(诸如活细胞密度、细胞压积或效价或时间点)来达到预定参数。在一个实施方案中，当活细胞密度大于或等于1x106个活细胞/ml时，可以达到预定参数。在一个实施方案中，当活细胞密度为至少20x106
6
个活细胞/ml至30x10个活细胞/ml时，可以达到预定参数。在一个实施方案中，当细胞压积小于或等于35％时，可以达到预定参数。在一个实施方案中，当细胞压积小于或等于30％时，可以达到预定参数。

[0090] 预定参数可以基于时间点。时间点可以在触发事件或操作之后的几小时、几天、几周或几月中测量。触发事件或操作可以是在培养中的几小时或几天，在事件(诸如达到活细胞密度、细胞压积、效价、接种生物反应器或收集收获渗透物)后的几小时或几天。在一个实施方案中，预定参数可以在触发事件或操作之后的12小时至25天内达到。在一个实施方案中，预定参数可以在触发事件或操作之后的24至72小时内达到。在一个实施方案中，预定参数可以在触发事件或操作的4天内达到。在一个实施方案中，预定参数可以在触发事件或操作后的5天或更多天达到。在一个实施方案中，预定参数可以在触发事件或操作的至少25天达到。在一个实施方案中，第一预定参数可以在接种生物反应器之后的5至25天内达到。在一个实施方案中，第一预定参数可以在接种生物反应器之后的10至12天内达到。在一个实施方案中，第二预定参数可以在收集收获渗透物之后的12至72小时内达到。在一个实施方案中，第二预定参数可以在收集收获渗透物之后的24至72小时内达到。在一个实施方案中，第二预定参数可以在收集收获渗透物之后的24至48小时内达到。

[0091] 一旦已经达到预定参数，可以收集收获渗透物持续预定时间。在一个实施方案中，预定时间为至少12至72小时。在一个实施方案中，预定时间为24至72小时。在一个实施方案中，预定时间为24至48小时。

[0092] 在一个实施方案中，过滤器为单一单元过滤器系统。在一个相关实施方案中，单一单元过滤器系统包括至少一个具有将重组蛋白保留在生物反应器中的孔径或分子量筛截(MWCO)的中空纤维过滤器部件以及至少一个具有不将重组蛋白保留在生物反应器中的孔径或分子量筛截的中空纤维过滤器部件。在另一个实施方案中，将重组蛋白保留在生物反应器中的至少一个中空纤维过滤器部件的分子量筛截为300kDa或更小。在另一个实施方案中，不将重组蛋白保留在生物反应器中的至少一个中空纤维过滤器部件的分子量筛截为至少500kDa。在另一个实施方案中，将重组蛋白保留在生物反应器中的至少一个中空纤维过滤器部件为超滤器，并且不将重组蛋白保留在生物反应器中的至少一个中空纤维过滤器部件为微滤器。在另一个实施方案中，单一单元过滤器系统被包含在壳体内。在另一个实施方案中，单一单元过滤器系统还包括中空纤维过滤器部件中的至少两个之间的间隔物。

[0093] 在一个实施方案中，当使用单一单元过滤器系统收集无效渗透物时，其从具有将重组蛋白保留在生物反应器中的孔径或分子量筛截的至少一个中空纤维过滤器中取出。在一个实施方案中，当使用单一单元过滤器系统收集收获渗透物时，其从具有不将重组蛋白保留在生物反应器中的孔径或分子量筛截的至少一个中空纤维过滤器中取出。在一个实施方案中，从具有不将重组蛋白保留在生物反应器中的孔径或分子量筛截的中空纤维过滤器的过滤器中收集渗透物，配制或补充新鲜细胞培养基以得到至少5g/L的非离子嵌段共聚物。在一个相关实施方案中，非离子嵌段共聚物为聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段共聚物。在另一个相关实施方案中，非离子嵌段共聚物为泊洛沙姆188。

[0094] 本发明也提供了用于收获重组蛋白的方法，其包括：通过用表达重组蛋白的哺乳动物细胞接种生物反应器来建立细胞培养，通过用配制或补充以得到至少5g/L的非离子嵌段共聚物浓度的新鲜细胞培养基灌流细胞培养物来维持细胞培养并且使细胞培养物穿过具有不将重组蛋白保留在生物反应器中的孔径或分子量筛截的中空纤维过滤器，以及收集含有重组蛋白的渗透物。在一个实施方案中，分子量筛截为至少500kDa。在一个实施方案中，中空纤维过滤器为微滤器。

[0095] 本发明也提供了用于收获重组蛋白的方法，包括通过用表达重组蛋白的哺乳动物细胞接种生物反应器来建立细胞培养，通过用配制或补充以得到至少1g/L的非离子嵌段共聚物浓度的新鲜细胞培养基灌流细胞培养物来维持细胞培养以及使细胞培养物穿过具有将重组蛋白保留在生物反应器中的孔径或分子量筛截的中空纤维过滤器，以及收集渗透物；一旦达到预定参数，用配制或补充以得到至少5g/L的非离子嵌段共聚物浓度的新鲜细胞培养基灌流细胞培养物来维持细胞培养，以及使细胞培养物穿过具有不将重组蛋白保留在生物反应器中的孔径或分子量筛截的中空纤维过滤器，以及收集含有重组蛋白的渗透物。在一个实施方案中，具有将重组蛋白保留在生物反应器中的孔径或分子量筛截的中空纤维过滤器的分子量筛截为300kDa或更小。在一个相关实施方案中，具有将重组蛋白保留在生物反应器中的孔径或分子量筛截的中空纤维过滤器为超滤器。在一个实施方案中，具有不将重组蛋白保留在生物反应器中的孔径或分子量筛截的中空纤维过滤器的分子量筛截为至少500kDa。在一个相关实施方案中，具有不将重组蛋白保留在生物反应器中的孔径或分子量筛截的中空纤维过滤器为微滤器。在一个实施方案中，具有将重组蛋白保留在生物反应器中的孔径或分子量筛截的中空纤维过滤器以及具有不将重组蛋白保留在生物反应器中的孔径或分子量筛截的中空纤维过滤器是单一单元过滤器系统的部件。在一个相关实施方案中，非离子嵌段共聚物为聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段共聚物。在另一个相关实施方案中，非离子嵌段共聚物为泊洛沙姆188。

[0096] 本发明也提供了包括具有不同孔径或分子量筛截的两个或更多个中空纤维过滤器部件的单一单元过滤器系统，其中所述中空纤维过滤器部件彼此串联固定使得单独的中空纤维之间维持无菌流动路径，并且具有不同孔径或分子量筛截的中空纤维过滤器部件相对于它们的从中取出渗透物的中空壳体侧彼此隔离使得渗透物可以从每个相应的中空纤维过滤器部件中独立地移除。在一个实施方案中，至少一个中空纤维过滤器部件具有将重组蛋白保留在生物反应器中的孔径或分子量筛截，并且至少一个中空纤维过滤器部件具有孔径过滤器，其为具有不将重组蛋白保留在生物反应器中的孔径或分子量筛截的中空纤维过滤器。在一个实施方案中，至少一个中空纤维过滤器部件具有300kDa或更小的分子量筛截，并且至少一个中空纤维过滤器部件具有至少500kDa的分子量筛截。在一个实施方案中，至少一个中空纤维过滤器部件是超滤器，并且至少一个中空纤维过滤器部件是微滤器。在一个实施方案中，单一单元过滤器系统被包含在壳体内。在一个实施方案中，单一单元过滤器系统还包括中空纤维过滤器部件中的至少两个之间的间隔物。

[0097] 在一个相关实施方案中，本发明提供了用于培养细胞和/或收获重组蛋白的方法，其包括表达重组蛋白，包括通过用表达重组蛋白的哺乳动物细胞接种生物反应器来建立细胞培养，通过将新鲜细胞培养基灌流到生物反应器中来维持细胞培养，使细胞培养物穿过单一单元过滤器系统以及收集渗透物，其中所述单一单元过滤器系统附接至所述生物反应器并且通过单一泵送系统将所述细胞培养物从所述生物反应器抽出并进入所述单一单元过滤器系统，其中所述细胞培养物穿过单一单元过滤器系统的中空纤维的官腔侧并返回到生物反应器内并且从一个或多个中空纤维过滤器部件中取出渗透物。

[0098] 在一个相关实施方案中，本发明的方法还包括在细胞培养过程中取样，评价样品以定量和/或定性监测重组蛋白的特性和/或细胞培养过程。在一个相关实施方案中，使用过程分析技术定量和/或定性监测样品。

[0099] 在本发明的方法的一个相关实施方案中，灌流为连续灌流。在一个实施方案中，灌流的速率是恒定的。在一个实施方案中，灌流以每天小于或等于1.0个工作体积的速率进行。在一个实施方案中，灌流通过蠕动泵、双隔膜泵、低剪切泵或交替式切向流来完成。在一个实施方案中，灌流通过交替式切向流来完成。

[0100] 在一个相关实施方案中，本发明的方法还包括使细胞培养经历温度变化，其中细胞a)在第一温度下培养第一时间段以及b)在第二温度下培养第二时间段。在一个实施方案中，温度变化发生在生长期与生产期之间的过渡处。在一个实施方案中，温度变化在生产期期间发生。在一个实施方案中，温度变化响应于预定参数，其中使用基于电容的生物质探针来确定实现预定参数。在一个实施方案中，温度变化响应于预定参数，其中使用基于电容的生物质探针来确定实现预定参数。

[0101] 在本发明的方法的一个相关实施方案中，细胞培养通过用至少0.1x106个活细胞/mL接种生物反应器来建立。在一个实施方案中，通过使用交替式切向流过滤的灌流过程来使接种物生长。在一个实施方案中，在进入生物反应器之前，将细胞培养基使用纳米过滤、高温瞬时灭菌(HTST)或UV与过滤相结合进行处理。

[0102] 在本发明的方法的一个相关实施方案中，生物反应器为生产型生物反应器。在一个实施方案中，生物反应器具有至少500L的容量。在一个实施方案中，生物反应器具有至少500L至2000L的容量。在一个实施方案中，生物反应器具有至少1000L至2000L的容量。

[0103] 在本发明的方法的一个相关实施方案中，细胞培养基是化学成分确定的无血清细胞培养基。在一个实施方案中，所述细胞培养基是灌流细胞培养基。在一个实施方案中，哺乳动物细胞是中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。在一个实施方案中，重组蛋白选自由人抗体、人源化抗体、嵌合抗体、重组融合蛋白或细胞因子组成的组。

[0104] 在一在本发明的方法的一个相关实施方案中，通过絮凝、沉淀、离心、深层过滤、亲和色谱、大小排阻色谱、离子交换色谱、混合模式阴离子交换色谱、疏水相互作用色谱或羟基磷灰石色谱中的一种或多种从收获渗透物中纯化重组蛋白。在一个实施方案中，本发明的方法还包括在纯化过程中取样，评价样品以定量和/或定性监测纯化过程和重组蛋白的特性。在一个实施方案中，使用过程分析技术定量和/或定性监测样品。在一个实施方案中，将重组蛋白配制成药学上可接受的制剂。

[0105] 本发明也提供了通过本发明的任何方法生产的重组蛋白。

[0106] 细胞培养

[0107] “细胞培养”或“培养”意指多细胞生物或组织外的细胞的生长和增殖。合适的哺乳动物细胞培养条件在本领域是已知的。参见例如Animal cell culture:A Practical Approach,D.Rickwood,编,Oxford University Press,New York(1992)。哺乳动物细胞可在悬浮液中培养或当附着到固体基质上时培养。

[0108] 如本文所用，术语“细胞培养基”(也称为“培养基”、“细胞培养基(cell culture media)”、“组织培养基”)是指用于使细胞(例如动物或哺乳动物细胞)生长的任何营养液，并且其通常提供来自以下的至少一种或多种组分：能量来源(通常呈碳水化合物诸如葡萄糖的形式)；所有必需氨基酸中的一种或多种，并且通常为20种基本氨基酸外加半胱氨酸；通常以低浓度需要的维生素和/或其他有机化合物；脂质或游离脂肪酸；以及微量元素，例如通常以极低浓度(常在微摩尔浓度范围内)需要的无机化合物或天然存在的元素。

[0109] 根据要培养的细胞的需要和/或所需的细胞培养参数，所述营养液可任选地补充另外的组分以优化细胞生长，诸如激素和其他生长因子，诸如胰岛素、转铁蛋白、表皮生长因子、血清等；盐，诸如钙、镁和磷酸盐以及缓冲液，例如HEPES；核苷和碱基，诸如腺苷、胸苷、次黄嘌呤；以及蛋白质和组织水解产物，诸如水解植物或动物蛋白(蛋白胨或蛋白胨混合物，其可以从动物副产品、纯化明胶或植物材料中获得)；抗生素，诸如庆大霉素；多胺，诸如腐胺、亚精胺和精胺(参见WIPO公布号WO 2008/154014)以及丙酮酸盐(参见美国专利号8053238)，抗凋亡化合物，例如MDL 28170、氯氰菊酯、环孢霉素A、BBMP、米酵菌酸、S-15176二富马酸盐、环状pifithrin-a、pifithrin mu、BI-6C9、NSCI、NS3694或Necrostatin-1(参见WIPO公布号WO 2014/022102)。

[0110] 非离子表面活性剂也可以被添加至细胞培养基中。非离子表面活性剂的实例包括但不限于聚乙烯醇、聚乙二醇和非离子嵌段共聚物。也包括烷基聚(环氧乙烷)、聚(环氧乙烷)和聚(环氧丙烷)的共聚物(EO-PO嵌段共聚物)、聚(乙烯基吡咯烷酮)、烷基聚葡糖苷(诸如蔗糖单硬脂酸酯、月桂基二葡萄糖苷或脱水山梨糖醇单月桂酸酯、辛基葡糖苷和癸基麦芽糖苷)、脂肪醇(鲸蜡醇或油醇)或椰油酰胺(椰油酰胺MEA、椰油酰胺DEA和椰油酰胺TEA)。

[0111] 也包括基于环氧乙烷和环氧丙烷的嵌段共聚物，也称为聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段共聚物。这些分子是具有由聚氧乙烯(聚(环氧乙烷))的两个亲水链侧接的聚氧丙烯(聚(环氧丙烷))的中心疏水链的非离子三嵌段共聚物。特别感兴趣的是具有70个聚氧丙烯单元和每个聚氧乙烯链的30个单元的那些嵌段共聚物。在优选实施方案中，嵌段共聚物是以各种品牌名称(诸如 F68、 P-188、 F68和 188)销售的泊洛沙姆188(具有8.4kd的平均分子量的CAS#90003-11-6，BASF Chemical，Washington，NJ)。

[0112] 这些聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段共聚物用于保护细胞免于由于反应器中的鼓泡和泡沫的气泡诱导的死亡。如本文所述，当细胞培养物暴露于微滤时，通常在细胞培养基(1g/L)中使用的泊洛沙姆188的水平可能不足以保护细胞免受在交替切向流(ATF)灌流系统内的高剪切力。如本文所述，添加较高浓度(诸如5g/L)的聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段共聚物诸如泊洛沙姆188对细胞活力具有积极的影响，这使得在ATF灌流条件下的培养持续时间更长。

[0113] 细胞培养基包括通常在任何细胞培养过程中采用的和/或已知用于任何细胞培养过程的那些培养基，诸如但不限于细胞的分批培养、延长分批培养、补料分批培养和/或灌流培养或连续培养。

[0114] “基础”(或分批)细胞培养基或补料培养基是指通常用来启动细胞培养，并且足够完全支持细胞培养的细胞培养基。

[0115] “生长”细胞培养基或补料培养基是指通常在指数生长时期(生长期)期间的细胞培养中使用的并且足够完全支持此时期期间的细胞培养的细胞培养基。生长细胞培养基也可以含有赋予对并入宿主细胞系内的选择标记的抗性或存活性的选择剂。此类选择剂包括但不限于遗传霉素(G4118)、新霉素、潮霉素B、嘌呤霉素、博莱霉素、蛋氨酸亚砜亚胺、氨甲蝶呤、无谷氨酰胺细胞培养基、缺乏甘氨酸、次黄嘌呤和胸苷的细胞培养基或单独缺乏胸苷的细胞培养基。

[0116] “生产”细胞培养基或补料培养基是指通常在指数生长终止的过渡期间以及随后的蛋白质生产发生时的过渡和/或生产期期间的细胞培养中使用的细胞培养基。此种细胞培养基足够完全以在这时期期间维持所需的细胞密度、活力和/或产物效价。

[0117] “灌流”细胞培养基或补料培养基是指通常在通过灌流培养或连续培养方法维持的细胞培养中使用的并且足够完全支持此过程期间的细胞培养的细胞培养基。灌流细胞培养基制剂可以更为富集或比基础细胞培养基制剂更为浓缩以适应用来移除废培养基的方法。灌流细胞培养基可在生长期和生产期期间使用。

[0118] 细胞培养基组分可以完全地碾磨成粉末培养基制剂；部分地与液体补充物一起碾磨，按需添加至细胞培养基中；或者以完全液体形式添加至细胞培养物中。

[0119] 可以用含有在细胞培养的生产期过程期间消耗的组分(诸如营养物和氨基酸)的浓缩补料培养基补充细胞培养物。浓缩细胞培养基可以含有一些或所有维持细胞培养所需的营养物；特别是可以含有鉴定为或已知是在细胞培养的生产期过程期间消耗的营养物的浓缩培养基。浓缩培养基可以基于几乎任何细胞培养基制剂。浓缩补料培养基可以含有例如约2X、3X、4X、5X、6X、7X、8X、9X、10X、12X、14X、16X、20X、30X、50X、100x、200X、400X、600X、800X或者甚至约1000X它们的正常量的细胞培养基的一些或所有组分。

[0120] 细胞培养物也可以用可能难以配制或在细胞培养中快速耗乏的特定营养物的独立浓缩补料进行补充。此类营养物可以为氨基酸，诸如酪氨酸、半胱氨酸和/或胱氨酸(参见，例如，WIPO公布号2012/145682)。在一个实施方案中，独立地向在含有酪氨酸的细胞培养基中生长的细胞培养物中补料浓缩的酪氨酸溶液，使得酪氨酸在细胞培养物中的浓度不超过8mM。在另一个实施方案中，独立地向在缺乏酪氨酸、胱氨酸或半胱氨酸的细胞培养基中生长的细胞培养物中补料酪氨酸和胱氨酸的浓缩溶液。所述独立补料可以在生产期之前或生产期开始时开始。所述独立补料可以在与浓缩补料培养基相同或不同的天数通过细胞培养基的分批补料来完成。所述独立补料也可以在与灌流培养基相同或不同的天数进行灌流。此类独立补料可以在一天或多天后添加至细胞培养基中，并且也可以在生产期过程期间重复添加，只要避免细胞培养基中的酪氨酸、半胱氨酸和胱氨酸耗尽即可。

[0121] 可以采用方法来连续补料哺乳动物细胞培养物，诸如不采用反馈控制的那些方法(参见WIPO公开号WO 2013/040444)。

[0122] 在某些实施方案中，细胞培养基是无血清的和/或无动物来源的产物或成分的。在某些实施方案中，细胞培养基是化学成分确定的，其中所有化学组分都是已知的。

[0123] 动物或哺乳动物细胞在适合于培养特定细胞的培养基中培养，并且这可以被本领域技术人员在不需要过多实验的情况下确定。可以利用可商购获得的培养基，并且其包括但不限于Iscove改良的Dulbecco培养基、RPMI 1640、最低必需培养基-α.(MEM-α)、Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM)、DME/F12、α-MEM、含有Earle BSS的Eagle基础培养基、含有谷氨酰胺的高葡萄糖DMEM、不含谷氨酰胺的高葡萄糖DMEM、不含谷氨酰胺的低葡萄糖DMEM、含有谷氨酰胺的DMEM:F12 1:1、GMEM(Glasgow MEM)、含有谷氨酰胺的GMEM、Grace完全昆虫培养基、不含FBS的Grace昆虫培养基、含有谷氨酰胺的Ham’s F-10、含有谷氨酰胺的Ham’s F-12、含有HEPES和谷氨酰胺的IMDM、含有HEPES且不含谷氨酰胺的IMDM、IP41昆虫培养基、不含谷氨酰胺或酚红的15(Leibovitz)(2X)、不含谷氨酰胺的15(Leibovitz)、McCoy 5A改良培养基、培养基199、不含谷氨酰胺或酚红(2X)的MEM Eagle、含有谷氨酰胺的MEM Eagle-Earle BSS、不含谷氨酰胺的MEM Eagle-Earle BSS、不含谷氨酰胺的MEM Eagle-Hanks BSS、含有谷氨酰胺的NCTC-109、含有谷氨酰胺的Richter CM培养基、含有HEPES、谷氨酰胺和/或青霉素-链霉素的RPMI 1640、含有谷氨酰胺的RPMI 1640、不含谷氨酰胺的RPMI 1640、Schneider昆虫培养基或配制用于特定细胞类型的本领域技术人员已知的任何其他培养基。必要时或根据需要，以及如被本领域技术人员利用常规技能知晓并实践的，可以以适当的浓度或量向前述的示例性培养基中添加补充性组分或成分(包括任选组分)。

[0124] 培养基处理

[0125] 可以在添加至生物反应器和/或细胞培养物之前使用方法或装置灭菌或消毒培养基来处理细胞培养基。在一个实施方案中，使用高温瞬时灭菌(HTST)处理细胞培养基(参见例如美国专利号7,420,183)。在一个实施方案中，使用UV与过滤相结合处理细胞培养基(参见例如，WIPO公布WO 2008/157247、WO 2012/115874、WO 2013/063298和WO 2013/138159)。在另一个实施方案中，使细胞培养基经历纳米过滤(参见例如，Liu等,(2000)
Biotechnol.Prog.16:425-434)。在另一个实施方案中，用灭活病毒的化学品诸如溶剂、去污剂、补骨脂素或β-丙内酯处理细胞培养基。

[0126] 细胞

[0127] 本发明所用的细胞系(也称为“细胞”或“宿主细胞”)经基因工程改造以表达具有商业或科学价值的多肽。细胞系通常从起源于原代培养物的谱系中得到，所述原代培养物可以在培养中维持无限时间。所述细胞可以含有例如通过转化、转染、感染或注射并入的表达载体(构建体)，诸如质粒等，所述表达载体带有编码用于在培养过程中表达和生产的蛋白的编码序列或其部分。此类表达载体含有用于转录和翻译插入编码序列的必要元件。可以使用本领域技术人员所熟知并实践的方法来构建含有编码生产的蛋白和多肽的序列以及适当转录和翻译控制元件的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、合成技术和体内基因重组。在J.Sambrook等人,2012,Molecular Cloning,A Laboratory Manual,第4版Cold Spring Harbor Press,Plainview,N.Y.或任何先前版本；F.M.Ausubel等人,2013,Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley&Sons,New York,N.Y,或任何先前版本；Kaufman,R.J.,Large Scale Mammalian Cell Culture,1990中描述了此类技术，所有这些文献为了任何目的并入本文。

[0128] 动物细胞、哺乳动物细胞、培养的细胞、动物或哺乳动物宿主细胞、宿主细胞、重组细胞、重组宿主细胞等是用于可以根据本发明方法而培养的细胞的所有术语。此类细胞通常是获自或来源于哺乳动物的细胞系，并且当在含有适当营养物和/或其他因子(诸如本文描述的那些)的培养基中处于单层培养物或悬浮培养物中时能够生长并存活。通常选择可以表达并分泌蛋白质或者可经分子工程改造以表达并向培养基中分泌大量特定蛋白质，更具体地说是目标糖蛋白的细胞。将会理解由宿主细胞生产的蛋白质可以是内源性的或与所述宿主细胞同源。另选地，所述蛋白质与所述宿主细胞异源，即异质的，例如由中国仓鼠卵巢(CHO)宿主细胞生产并分泌的人蛋白。此外，哺乳动物蛋白，即初始获自或来源于哺乳动物有机体的那些蛋白可以通过本发明的方法取得，并可以由细胞分泌至培养基中。

[0129] 本发明的组合物可以用来培养多种细胞。在一个实施方案中，培养的细胞是真核细胞，诸如植物和/或动物细胞。所述细胞可以为哺乳动物细胞、鱼类细胞、昆虫细胞、两栖动物细胞或禽类细胞。适合于在培养物中生长的多种多样的哺乳动物细胞系可购自美国种质保存中心(Manassas,Va.)和其他贮藏所以及商业供应商。可以用于本发明的过程中的细胞包括但不限于MK2.7细胞，PER-C6细胞，中国仓鼠卵巢细胞(CHO)诸如CHO-K1(ATCC CCL-61)、DG44(Chasin等,1986,Som.Cell Molec.Genet.,12:555-556；Kolkekar等,1997,
Biochemistry,36:10901-10909；和WO 01/92337 A2)、二氢叶酸还原酶阴性CHO细胞(CHO/-DHFR，Urlaub和Chasin,1980,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,77:4216)和dp12.CHO细胞(美国专利号5,721,121)；猴肾细胞(CV1,ATCC CCL-70)；SV40转化的猴肾CV1细胞(COS细胞，COS-7，ATCC CRL-1651)；HEK 293细胞；和Sp2/0细胞，5L8杂交瘤细胞，Daudi细胞，EL4细胞，HeLa细胞，HL-60细胞，K562细胞，Jurkat细胞，THP-1细胞，Sp2/0细胞，原代上皮细胞(角化细胞、宫颈上皮细胞、支气管上皮细胞、气管上皮细胞、肾上皮细胞和视网膜上皮细胞)和建立的细胞系及其细胞株(例如，人胚肾细胞(例如，293细胞或亚克隆用于在悬浮培养中生长的293细胞，Graham等,1977,J.Gen.Virol.,36:59)；幼仓鼠肾细胞(BHK，ATCC CCL-10)；小鼠支持细胞(TM4，Mather,1980,Biol.Reprod.,23:243-251)；人宫颈癌细胞(HELA，ATCC CCL-2)；
犬肾细胞(MDCK，ATCC CCL-34)；人肺细胞(W138，ATCC CCL-75)；人肝癌细胞(HEP-G2，HB
8065)；小鼠乳腺肿瘤细胞(MMT 060562，ATCC CCL-51)；水牛鼠肝细胞(BRL 3A，ATCC CRL-
1442)；TRI细胞(Mather,1982,Annals NY Acad.Sci.,383:44-68)；MCR 5细胞；FS4细胞；
PER-C6视网膜细胞，MDBK(NBL-1)细胞，911细胞，CRFK细胞，MDCK细胞，BeWo细胞，Chang细胞，Detroit 562细胞，HeLa 229细胞，HeLa S3细胞，Hep-2细胞，KB细胞，LS 180细胞，LS
174T细胞，NCI-H-548细胞，RPMI 2650细胞，SW-13细胞，T24细胞，WI-28VA13，2RA细胞，WISH细胞，BS-C-I细胞，LLC-MK2细胞，克隆M-3细胞，1-10细胞，RAG细胞，TCMK-1细胞，Y-1细胞，LLC-PK1细胞，PK(15)细胞，GH1细胞，GH3细胞，L2细胞，LLC-RC 256细胞，MH1C1细胞，XC细胞，MDOK细胞，VSW细胞和TH-I，B1细胞或其衍生物)，来自任何组织或器官的成纤维细胞(包括但不限于心脏，肝脏，肾脏，结肠，肠，食道，胃，神经组织(脑、脊髓)，肺，血管组织(动脉、静脉、毛细血管)，淋巴组织(淋巴腺、腺样体、扁桃体、骨髓和血液)，脾)以及成纤维细胞和成纤维细胞样细胞系(例如TRG-2细胞、IMR-33细胞、Don细胞、GHK-21细胞、瓜氨酸血症细胞、Dempsey细胞、Detroit 551细胞、Detroit 510细胞、Detroit 525细胞、Detroit 529细胞、Detroit 532细胞、Detroit 539细胞、Detroit 548细胞、Detroit 573细胞、HEL 299细胞、IMR-90细胞、MRC-5细胞、WI-38细胞、WI-26细胞、MiCl1细胞、CV-1细胞、COS-1细胞、COS-3细胞、COS-7细胞、非洲绿猴肾细胞(VERO-76，ATCC CRL-1587；VERO，ATCC CCL-81)；DBS-FrhL-
2细胞，BALB/3T3细胞，F9细胞，SV-T2细胞，M-MSV-BALB/3T3细胞，K-BALB细胞，BLO-11细胞，NOR-10细胞，C3H/IOTI/2细胞，HSDM1C3细胞，KLN205细胞，McCoy细胞，小鼠L细胞，细胞株
2071(小鼠L)细胞，L-M细胞株(小鼠L)细胞，L-MTK(小鼠L)细胞，NCTC克隆2472和2555，SCC-PSA1细胞，Swiss/3T3细胞，赤麂细胞(Indian muntac cells)，SIRC细胞，CII细胞和Jensen细胞或其衍生物)或本领域技术人员已知的任何其他细胞类型。

[0130] 细胞可以适合于贴壁培养、单层培养和/或悬浮培养、转染以及表达蛋白质，例如抗体。所述细胞可用于，例如，分批培养、补料分批培养和灌流培养或连续培养方法。

[0131] 细胞培养的类型

[0132] 为了理解而没有限制的目的，熟练从业者将会明白用于蛋白质生产的细胞培养和培养运行可以包括分批培养、补料分批培养、灌流培养或其组合。在分批培养中，细胞初始培养在培养基中，并且不移除、替换或补充此培养基，即，在培养运行期间或结束之前，不用新鲜培养基“饲喂”所述细胞。在培养运行结束时收获整个细胞培养物。

[0133] 对于补料分批培养，在运行期间通过周期性或连续地用新鲜培养基补充培养基来增加培养运行时间，即，在培养期运行期间用新的培养基(“补料培养基”)“饲喂”所述细胞。补料分批培养可包括如以上所述的各种补料方案和次数，例如每日、每隔一天、每两天等、每天不止一次或每天不到一次等等。此外，可用补料培养基连续地补料进行补料分批培养。
然后，在培养运行结束时收获所需产物。

[0134] 灌流培养，有时称为连续培养，是其中细胞培养物接受添加新鲜培养基(“灌流培养基”)并从生物反应器中移除废培养基的一种培养。灌流可以是连续的、逐步的、间歇的或者这些中的任何的任一种或全部的组合。灌流速率可以为每天小于一个工作体积至每天许多个工作体积。术语“灌流流速”是在给定时间内从生物反应器穿过(添加和移除)的培养基的量，通常表现为一部分或多倍的工作体积。“工作体积”是指用于细胞培养的生物反应器体积的量。在一个实施方案中，所述灌流流速为每天一个工作体积或更少。可以配制灌流补料培养基以使灌流营养浓度最大化，使灌流速率最小化。

[0135] 优选地，细胞保留在培养物中并且移除的废培养基基本不含细胞或比所述细胞培养物具有显著较少的细胞。根据所使用的保留系统，可以从细胞培养物中保留或移除由细胞培养物表达的重组蛋白。有时优选宿主细胞和表达的重组蛋白保留在生物反应器中的滞留物中，并且渗透物基本上不含或具有显著更少的宿主细胞和表达的重组蛋白中的任一个(“无效渗透物”)。其他时间可能优选保留细胞，但允许表达的蛋白质进入渗透物(“收获渗透物”)。

[0136] 灌流可以通过多种方式(包括离心、沉降或过滤)来实现，参见，例如，Voisard等,(2003),Biotechnology and Bioengineering 82:751-65。在一个实施方案中，使用过滤方法。过滤器包括膜滤器、陶瓷滤器和金属滤器，并且可呈任何形状，包括螺旋缠绕式或螺旋管状或呈薄片形式。一个或多个过滤器可以一起或者独立地以串联或并联连接至生物反应器，与生物反应器流体连通。

[0137] 中空纤维过滤器在哺乳动物细胞灌流培养中用于细胞和/或重组蛋白产物保留。当将细胞培养物，包括细胞培养基、细胞(完整的和裂解的)、可溶性表达的重组蛋白、宿主细胞蛋白、废产物等引入过滤器时，中空纤维材料可以根据孔径或分子量筛截(MWCO)在官腔侧(内侧)保留某些细胞培养物组分，并且基于中空纤维材料的孔径或分子量筛截允许某些组分穿过过滤器(渗透物)。保留的材料(滞留物)返回到生物反应器。将新鲜灌流细胞培养基加入到生物反应器中，并且以预定间隔或连续地从过滤器中取出渗透物以维持所需的或恒定的生物反应器体积。渗透物可以被丢弃，储存在储备罐、袋或箱中或者直接转移到另一单元操作，诸如过滤、离心和/或其他下游纯化方法等。用于微滤的中空纤维通常具有0.1μm至5-10μm范围的孔径或500kDa或更大的分子量筛截，并且可以用于允许蛋白质穿过进入渗透物中。超滤中空纤维通常具有0.01μm至0.1μm范围的孔径或300kDa或更小的分子量筛截，并且可以用于在滞留物中保留所需的蛋白质并将其返回至生物反应器。这可以用于例如浓缩重组蛋白产物用于收获。此类过滤器是可商购获得的，诸如Xampler UFP-750-E-
4MA、Xampler UFP-30-E-4MA(GE Healthcare,Pittsburg,PA)以及Midikros TC Modules T02-E030-10、T02-050-10,T02-E750-05、T02-M10U-06(Spectrum Laboratories,Inc,Dominguez,CA)。

[0138] 本发明提供了，当收集无效渗透物时，过滤器是具有不允许重组蛋白产物进入渗透物而是将其保留在生物反应器中的孔径或分子量筛截的中空纤维过滤器。本发明也提供了，当收集收获渗透物时，过滤器是具有允许重组蛋白穿过中空过滤器的孔径或分子量筛截的中空纤维过滤器。

[0139] 细胞培养物通过泵送系统从生物反应器中抽出并进入过滤器中，泵送系统使细胞培养物穿过中空纤维的官腔侧。细胞泵送系统的实例包括蠕动泵、双隔膜泵、低剪切泵(泵,Zurich,Switzerland)和交替切向流系统(ATFTM,Refine Technology,Pine Brook,NJ，参见例如，美国专利号6,544,424；Furey(2002)Gen.Eng.News.22(7),62-
63.)。可以通过使用蠕动泵从过滤器中抽出渗透物。

[0140] 单一单元过滤器系统

[0141] 本发明提供了单一单元过滤器系统，其包括在单一单元过滤器系统中串联组合的两个或更多个具有不同孔径或分子量筛截的中空纤维过滤器部件，所述单一单元过滤器系统任选地包含在壳体内，可以由单一细胞泵送装置进行操作。这允许经由一个过滤系统(图1)以产物保留模式(移除无效渗透物)或产物收集模式(移除收获物渗透物)的收集。单一单元过滤器系统提供在收获循环期间从细胞培养物中移除宿主细胞蛋白和其他废物的优点，延长细胞培养的持续时间。单一单元过滤器系统潜在地具有更少的过滤器结垢以获得更高的收获效率。单一单元过滤器系统可以提供多个更小批量的渗透物，用于更容易并有效地加载下游纯化柱。单一单元过滤器系统可以用作连续制造过程的一部分。

[0142] 单一单元过滤器系统的构造包括被构造成串联的具有不同孔径或分子量筛截的两个或更多个中空纤维过滤器部件，使得所有过滤器彼此与生物反应器流体连通，并且可以通过单一泵送装置进行操作。此类中空纤维过滤器部件可以从例如GE Healthcare和Spectrum Laboratories，Inc商购获得。当细胞培养物流经所有过滤器时，可以一次从一个或多个过滤器中选择性地移除渗透物。通过从适当的中空纤维部件中基于其孔径或分子量筛截取出渗透物来移除渗透物(无效或收获)。通过使用单独的蠕动泵分别和独立地移除无效渗透物和收获渗透物。渗透物收集的定时和比例可以通过其分开的蠕动泵来控制。

[0143] 单独的中空纤维过滤器部件可以以适合于本应用的任何构造排列。在一个实施方案中，具有使得细胞培养物的重组蛋白产物保留在细胞培养生物反应器中的滞留物中的孔径或分子量筛截值的中空纤维过滤器部件被放置，使得其第一个接收来自生物反应器的细胞培养物流。

[0144] 单一单元过滤器系统的构造允许收获渗透物和无效渗透物以分离的方式以及以使得可以根据需要控制移除的相对体积比和定时的方式从生物反应器中移除。以与灌流速率相同的速率从单一单元过滤器系统收集渗透物。

[0145] 除了使用可商购获得的的中空纤维过滤器部件之外，中空纤维材料可以构造成在单一过滤器内具有两个单独的区域，它们通过灌封区域彼此隔离。此外，具有不同孔径或分子量筛截的单独的中空纤维可以通过中间灌封区域中的连接器区域接合以隔离两个渗透侧。在中空纤维长度上的每个孔径结构域将具有与其他孔径壳侧结构域隔离的相应的壳侧，使得渗透物可以从独立于其他孔径壳侧结构域的每个孔径壳侧结构域中被取出。

[0146] 过滤器可以通过允许中空纤维过滤器部件之间的流体连通的任何方法彼此固定。过滤器部件可以胶合或焊接在一起。过滤器可以通过夹钳(诸如三夹钳(tri claim))或将过滤器单元固定在一起并允许过滤器之间的流体连通的其他机械装置接合在一起。过滤器壳体可以设置有内部和外部螺纹区域，以用于直接地或通过螺纹联接器来接合过滤器单元。过滤器也可以通过任何类型的锁定机构进行连接。

[0147] 将两个过滤器直接端对端地定位可能会在中空纤维之间建立紧密连接或轻微的错位，这可能阻碍细胞流动并由于剪切造成细胞损坏。结果，由于过滤器的对准，可能存在可行性的下降。在过滤器单元之间可以使用间隔物或联接器，其在相邻过滤器单元之间提供一些距离，使细胞的流动更容易地在一个过滤器的官腔之间转移到下一个中空纤维的官腔中。间隔物将各个过滤单元彼此分开，允许各个中空纤维之间的无菌流动路径，同时也维持从其中取出渗透物的相应的空心壳侧的隔离。

[0148] 此类间隔物可以由将在过滤器之间形成安全和无菌连接并允许过滤器之间的流体连通的任何材料制成。此类间隔物可以对过滤器自密封。间隔物可以胶合或焊接到被接合的过滤器。间隔物可以通过将间隔物固定到过滤器的机械装置(诸如夹钳)固定到过滤器。间隔物可以设置有内部或外部螺纹区域，以用于直接地或通过螺纹联接器将间隔物固定过滤器。间隔物也可以通过任何类型的锁定机构进行连接。

[0149] 单一单元过滤器系统可以任选地由外部壳体封闭以便于使用，尤其是当多于两个过滤器被串联配置时。外部壳体可以由塑料或将维持对过滤器单元内部材料的无菌屏障的其他合适的材料制成。壳体可以是制成以装配在可商购获得的中空纤维过滤器上的次级外壳，或者壳体可以被制造为连接的中空纤维过滤器的初级壳体。壳体应该具有允许补料和滞留物的引入和收集的足够的开口，以及具有不同孔径或分子量筛截的每个中空纤维过滤器的至少一个渗透物端口。

[0150] 如上所述，单一单元过滤器系统可以与单细胞泵送系统结合使用，其使细胞培养物以恒定的流速通过中空纤维的官腔侧。

[0151] 细胞培养过程

[0152] 可以在适应小规模至大规模生产重组蛋白的条件下，使用常规用于动物或哺乳动物细胞培养的培养容器和/或培养仪器来实施细胞培养。对于更大规模的培养，可以使用设备诸如滚瓶系统、填充床式培养装置、发酵罐式生物反应器、气升式生物反应器、流化床生物反应器、固定化细胞生物反应器、中空纤维生物反应器、搅拌釜式生物反应器、多级生物反应器、离心生物反应器或本领域技术人员已知的任何其他合适的装置。也可以使用一次性生物加工设备，诸如一次性生物反应器。微载体也可以和生物反应器系统一起使用。可以以分批模式、补料分批模式或灌流模式/连续模式操作所述系统。此外，培养容器可配备有另外的仪器，诸如利用过滤器、重力、离心力等的细胞分离器。

[0153] 细胞培养的术语“生长期”是指细胞通常快速分裂的指数细胞生长时期(即，对数期)。细胞在生长期维持约一天、或约两天、或约三天、或约四天或超过四天的时期。例如，细胞在生长期维持的持续时间将基于细胞类型、细胞生长速率和/或培养条件而变化。

[0154] 术语“过渡期”是指在生长期与生产期之间的时期。通常，过渡期是可以控制培养条件以支持从生长期至生产期的变化的时间。可以监测或操纵各种细胞培养参数以控制变化，包括但不限于温度，重量摩尔渗透压浓度，维生素、氨基酸、糖、铵、乳酸和盐等的浓度中的一种或多种。

[0155] 术语“生产期”是指细胞生长正在/已经稳定的时间段。对数细胞生长通常在此阶段之前或在此时期期间减少，并且蛋白质生产发生。补料分批和灌流细胞培养过程在此时期补充细胞培养基或提供新鲜培养基以达到和/或维持所需的细胞密度、活力和/或重组蛋白产物效价。可以大规模进行生产期。可以以至少约100、500、1000、2000、3000、5000、7000、8000、10,000、15,000、20,000升或更大的体积维持大规模细胞培养。在一个优选的实施方案中，生产期在500L、1000L和/或2000L生物反应器中进行。

[0156] 重组蛋白的生产可以在多个时期完成。在多个时期过程中，以两个或更多个不同时期培养细胞。通常细胞可以首先在一个或多个生长期中在使细胞增殖和活力最大化的环境条件下培养，然后在使蛋白质生产最大化的条件下过渡至生产期。在用于通过哺乳动物细胞生产重组蛋白的商业过程中，在最终生产培养之前，常有存在于不同培养容器中的多个(例如，至少约2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个)生长期(N-x至N-1)。一个或多个过渡期可以先于或隔开生长期和生产期。可以大规模进行生产期。根据本发明的方法可以用来延长细胞培养的生产期。

[0157] 当准备商业生产重组蛋白时，在最终生产培养之前细胞培养通常经历两个过程，种子培养和接种培养。种子培养期(N-X)以细胞在数量上快速扩张的小规模发生。在接种物培养期(N-1)，细胞进一步扩张以生产用于生产型生物反应器的接种物。种子培养和N-1培养可以通过任何培养方法(通常为分批细胞培养)来生产。>15x106个细胞/mL的N-1细胞密度对于种子生产型生物反应器是典型的。更高的N-1细胞密度和/或调整细胞培养基可以减少乃至消除达到生产型生物反应器中所需的细胞密度需要的时间。在一个实施方案中，经由使用交替切向流过滤的灌流培养达到了更高的N-1细胞密度。通过使用交替式切向流过滤的灌流过程来生长的N-1细胞培养物可以提供任何所需密度的细胞，高细胞密度(诸如>6
90x10个细胞/mL或更多的密度)可以很容易达到。N-1细胞培养物可以用来生产快速灌流接种培养物或可以用作维持以接种多个生产型生物反应器的滚种储备培养物(rolling seed stock culture)。接种密度可以具有对产生的重组蛋白水平的积极影响。重组蛋白产物水平倾向于随着增加接种密度增加而增加。效价的改进不但与更高的接种密度相关，而且很可能被放置于生产中的细胞的代谢状态和细胞周期状态影响。在N-1过程期间，可以在接种到生产型生物反应器内之前允许细胞培养物进入生产期。此接种允许在生产型生物反应器中立即开始生产。

[0158] 术语“细胞密度”是指给定体积的培养基中的细胞数目。“活细胞密度”是指如通过标准活力测定(诸如台盼蓝染料排斥方法)所确定的给定体积的培养基中的活细胞数量。术语“细胞压积”(PCV)，也称为“细胞压积百分比”(PCV％)，是细胞所占体积与细胞培养物的总体积的比率，表示为百分比(参见，Stettler等,(2006)Biotechnol Bioeng.Dec 20:95(6):1228-33)。细胞压积是细胞密度和细胞直径的函数；细胞压积的增加可以由细胞密度或细胞直径或两者的增加引起。细胞压积是细胞培养物中固体含量的量度。因为宿主细胞大小不同并且细胞培养物也含有死的和垂死的细胞以及其他细胞碎片，所以细胞压积可以6
用细胞培养物内的更高的精确度的固体含量来描述。例如，根据细胞大小，具有50x10个细胞/ml的细胞密度的2000L培养物将具有迥然不同的细胞压积。此外，一些细胞将在大小上增加，诸如当处于生长停滞状态时，因此由于细胞大小增加而导致生物量增加，使得在生长停滞之前和生长停滞之后的细胞压积可能将会不同。生产期期间较低的细胞压积有助于缓解可以妨碍更高细胞密度灌流培养的溶解氧鼓泡问题。较低的细胞压积也允许较小的培养基体积，所述较小的培养基体积允许使用较小的培养基储存容器并且可以与较小流速组合。与较高的细胞生物量培养物相比，较小的细胞压积也对收获和下游加工具有较小影响。
所有这些都降低了与制造重组蛋白治疗剂相关的成本。

[0159] 在一个实施方案中，所述方法还包括在生产期期间细胞压积小于或等于35％。在一个相关实施方案中，所述细胞压积小于或等于30％。

[0160] 在一个实施方案中，在小于或等于35％的细胞压积下的哺乳动物细胞培养物的活细胞密度为10x106个活细胞/ml至80x106个活细胞/ml。在一个相关实施方案中，所述哺乳动物细胞培养物的活细胞密度为20x106个活细胞/ml至30x106个活细胞/ml。

[0161] 细胞培养控制

[0162] 适用于本发明的方法的细胞培养条件是通常用于或已知用于细胞的分批培养、补料分批培养或灌流(连续)培养或这些方法的任何组合的那些条件，其中注意pH、溶解氧(O2)和二氧化碳(CO2)、搅拌和湿度以及温度。在重组蛋白生产期间，需要具有使细胞生长持续所需时间或生长至所需密度的可控系统，然后使细胞的生理状态切换至生长受限或生长停滞的高生产率状态，其中细胞使用能量和底物以生产有利于增加细胞密度的重组蛋白。对于商业规模的细胞培养和生物治疗剂的制造，非常需要在生产期期间限制或停滞细胞生长并且能够将细胞维持在生长受限或停滞状态的能力。此类方法包括例如温度变化、使用蛋白质生产的化学诱导物、营养限制或饥饿以及细胞周期抑制剂的单独或组合。

[0163] 用于限制或停滞生长的此机制曾经是在细胞培养期间变化温度。例如，生长期可以在更高的温度下发生，变化到更低的温度可以启动和/或维持生产期。例如，生长期可在约35℃至约38℃的第一温度设定点下发生，并且生产期可在约29℃至约37℃、任选地约30℃至约36℃或约30℃至约34℃的第二温度设定点下发生。

[0164] 切换温度设定点可以手动完成，或者可以通过利用生物反应器控制系统自动完成。可以在预定时间或响应于一种或多种细胞培养参数(诸如细胞密度、效价或一种或多种培养基成分的浓度)处切换温度设定点。一种此类方法使用集成到生物反应器控制系统中的在线生物质监测工具以在达到所需的细胞密度时触发温度设定点改变。例如，基于电容的生物质探针可以用于在线细胞密度估算，并且在线测量的数据可以用于触发生物反应器温度的变化。此类基于电容的生物质探针包括Fogale电容传感器(DN12-200)(Nimes，France)。

[0165] 此外，可以在温度变化的同时、之前或之后添加蛋白质生产的化学诱导物，诸如咖啡因、丁酸盐和/或六亚甲基二乙酰胺(HMBA)。如果在温度变化之后添加诱导物，它们可一在温度变化后一小时至五天、任选在温度变化后一至两天添加。当细胞生产所需蛋白质时，细胞培养可以维持数天乃至数周。

[0166] 使细胞维持在所需生理状态的另一种方法是通过将细胞培养物暴露于低L-天冬酰胺和/或天冬酰胺缺乏条件下来诱导细胞生长停滞(参见，例如，WIPO公布号WO 2013/006479)。细胞生长停滞可以通过含有限制浓度的L-天冬酰胺的培养基并且在细胞培养中维持低浓度的L-天冬酰胺来达到并维持。维持5mM或更少的L-天冬酰胺的浓度可以用来将细胞诱导并维持在生长停滞状态，由此生产率增加。

[0167] 细胞周期抑制剂，已知或怀疑调控细胞周期进程和相关的转录过程、DNA修复、分化、衰老和与此有关的凋亡的化合物也对诱导细胞生长停滞有用。与周期运转(cycle machinery)相互作用的细胞周期抑制剂(诸如细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK))如同与来自其他途径的蛋白相互作用的那些分子(诸如AKT、mTOR)以及直接或间接影响细胞周期的其他途径一样有用。

[0168] 收获和纯化

[0169] 表达的重组蛋白可分泌至培养基中，可以从所述培养基中回收和/或收集它们。然后可以对重组蛋白进行一个或多个加工步骤，包括收获、纯化、内毒素和/或病毒灭活/过滤、超滤/渗滤成合适的药物制剂和/或储存

[0170] 表达的重组蛋白可以被捕获在收获渗透物中。可以使用本领域已知的和/或可从商业供应商获得的方法和可商购获得的产品从收获渗透物中纯化或部分纯化所述蛋白质。此类方法包括絮凝；离心；沉淀；过滤法诸如深层过滤；色谱法包括亲和色谱、大小排阻色谱、离子交换色谱、混合模式阴离子交换色谱、疏水相互作用色谱和羟基磷灰石色谱以及其他可用的方法。

[0171] 然后可以将纯化的蛋白质“配制”(意指缓冲液交换)、灭菌、成批包装和/或包装以用于最终用户。用于药物组合物的合适的制剂包括在Remington's Pharmaceutical Sciences,第18版.1995,Mack Publishing Company,Easton,PA中描述的那些制剂。

[0172] 过程分析技术

[0173] 过程分析技术和方法可用于监测和评估在细胞培养和纯化过程中取得的样品，以定量和/或定性监测生产过程和重组蛋白的特性。这种实时或在线信息可以用于监测和/或控制产物和生产参数，诸如效价，细胞密度；产品质量属性诸如翻译后修饰；产品或过程变异性诸如杂质等，以便必要时作出及时决定和修改过程。例如，可以监测和/或控制产品质量属性，诸如聚糖种类的分布、氧化水平或脱酰胺。

[0174] 可以监测上游细胞培养过程或下游纯化过程的每个步骤以提供关于特定产品质量属性(PQA)的量的信息，并且用预设的目标和范围控制此PQA。

[0175] 取样可以以所需的频率间歇地或连续地进行。样品可以实时地或接近实时地分析或储存用于以后的分析。此信息可以用于在上游和下游过程中进行更改。

[0176] 产品质量属性的检测可以使用质谱、具有UV和/或质谱检测的液相色谱和毛细管电泳等来完成。

[0177] 这些过程可适应于具有手动或自动过程调整(诸如由指定的产品质量属性的水平确定的补料、温度、过程持续时间)的连续监测。

[0178] 检测翻译后修饰(诸如氨基酸加工和糖基化)的存在的完整质量分析可以使用在大小排阻模式下操作并与ESI-MS联接的聚羟乙基天冬酰胺柱来完成(Brady等,(2008)J Am Soc Mass Spectro,19:502-509)。

[0179] 通过使用激光散射检测器监测每个级分的标准化LS/UV比和UV吸光度实时监测离子交换色谱的洗脱液，参见美国专利公布号US 2013-0303732。

[0180] 多属性方法利用单一液相色谱/质谱(LC/MS)使用各种数据库和搜索平台诸如Sequest(The Scripps Research Institute,La Jolla,CA)、X！Tandem(The Global
Proteome Machine Organization)或Mascot(Matrix Science,Boston,MA)来搜索和表征串联MS数据。样品可以在高pH下变性或在低pH下维持二硫化物同种型并保护琥珀酰亚胺变体。然后将样品还原并烷基化，接着用胰蛋白酶消化。然后将样品注射到MS(诸如Q
ExactiveTM混合四极-轨道阱质谱仪，Thermo Fischer Scientific,Waltham,MA)中，并且使用Pinpoint 软件(Thermo Fischer Scientific)进行分析。可以鉴定、定量并监测的属性包括异构化、脱氨基作用、二硫化物还原、宿主细胞蛋白污染、突变、错参、羟赖氨酸、硫醚、非糖基化重链、C-末端酰胺化、残留蛋白A、表征聚糖并提供分子同一性。所监测的每个属性的质量精度可以设定为小于预测质量的5ppm。肽/性质的鉴定通过MS2断裂和正交表征方法(例如用于糖基化的HILIC-MS)来证实。当与理论同位素分布相比时，实验同位素分布必须具有高于0.95的点积分数。为每个属性设置保留时间窗口，并且考虑量化每个属性的所有可检测的电荷状态。定义将在属性中检测的变化的标准。例如，可以通过确定脱氨基值(脱氨基肽除以脱氨基肽和未修饰的母体肽的总和乘以100)来监测脱氨基作用。糖基化可以通过比较每种特定的聚糖与所有可检测的聚糖的总和进行监测。

[0181] 在一些实施方案中，过程分析技术也可以包括“产品属性控制”(PAC)。PAC将多个PAT元件与生物过程的模型组合以表现一个或多个CQA的实时反馈控制。这种新的PAC过程是生物制药QbD生产的实施的一个实例。PAC过程利用可以影响CQA的控制杆的使用。控制杆被并入到基于模型的控制回路中，以将CQA维持在QTPP中指定的所需目标处。具体来说，控制杆是对可以数学建模的方式影响CQA的过程参数的调整。例如，可以动态调整抑制剂或活化剂的水平以调节糖基化酶活性来调节产物的糖基化特性，条件是它们的影响可以数学建模。同样，在运行期间可以调整温度或pH，条件是它们对CQA的影响也可以可靠地建模。

[0182] 蛋白质

[0183] 如本文所用的“肽”、“多肽”和“蛋白质”通篇可互换地使用，并且是指包含两个或更多个通过肽键互相连接的氨基酸残基的分子。肽、多肽和蛋白质也包括了包括但不限于糖基化、脂质连接、硫酸化、谷氨酸残基的γ-羧化、羟化和ADP-核糖基化的修饰。

[0184] 蛋白质可以具有科学或商业价值，包括基于蛋白质的药物。除了其他情况，蛋白质还包括抗体、融合蛋白和细胞因子。肽、多肽和蛋白质可以使用细胞培养方法通过原核细胞和真核细胞来生产，并且可以被称为“重组肽”、“重组多肽”、“重组蛋白”、“重组蛋白产物”和“产物”。表达的蛋白可以在细胞内产生或分泌至培养基中，可以从所述培养基中回收和/或收集所述蛋白。

[0185] 可以通过本发明方法来有利地生产的哺乳动物蛋白的非限制性实例包括包含与以下蛋白质之一的全部或部分相同或基本相似的氨基酸序列的蛋白质：肿瘤坏死因子(TNF)、flt3配体(WO 94/28391)、促红细胞生成素、促血小板生成素、降钙素、IL-2、血管生成素-2(Maisonpierre等(1997),Science 277(5322):55-60)、NF-κB的受体激活物的配体(RANKL，WO 01/36637)、肿瘤坏死因子(TNF)相关的凋亡诱导配体(TRAIL，WO 97/01633)、胸腺基质淋巴细胞生成素、粒细胞集落刺激因子、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF，澳大利亚专利号588819)、肥大细胞生长因子、干细胞生长因子(美国专利号6,204,363)、表皮生长因子、角质化细胞生长因子、巨核细胞(megakaryote)生长和发育因子、RANTES、人纤维蛋白原样2蛋白(FGL2；NCBI登记号NM_00682；Rüegg和Pytela(1995),Gene160:257-62)、生长激素、胰岛素、促胰岛素、胰岛素样生长因子、甲状旁腺素、包括α-干扰素、γ-干扰素和共有序列干扰素(consensus interferon)的干扰素(美国专利号4,695,623和4,897471)、神经生长因子、脑源性神经营养因子、突触结合蛋白样蛋白(SLP 1-5)、神经营养因子-3、胰高血糖素、白细胞介素、集落刺激因子、淋巴毒素-β、白血病抑制因子和制瘤素-M。可以根据本发明方法生产的蛋白质的描述可见于，例如，Human Cytokines:Handbook for Basic and Clinical Research,1-3卷(Aggarwal和Gutterman编.Blackwell Sciences,Cambridge,MA,1998)；Growth Factors:A Practical Approach(McKay和Brown编,Oxford University Press Inc.,New York,1998)所有版本；以及The Cytokine Handbook,卷1和2(Thompson和Lotze编,Academic Press,San Diego,CA,2003)。

[0186] 此外，本发明的方法将用来生产包含上述蛋白质的任一个的受体的全部或部分氨基酸序列的蛋白质、此类受体或任何上述蛋白质的拮抗剂和/或基本类似于此类受体或拮抗剂的蛋白质。这些受体和拮抗剂包括：两种形式的肿瘤坏死因子受体(TNFR，也称为p55和p75，美国专利号5,395,760和美国专利号5,610,279)、白细胞介素-1(IL-1)受体(I型和II型；欧洲专利号0460846、美国专利号4,968,607和美国专利号5,767,064,)、IL-1受体拮抗剂(美国专利号6,337,072)、IL-1拮抗剂或抑制剂(美国专利号5,981,713、6,096,728和5,075,222)、IL-2受体、IL-4受体(欧洲专利号0 367 566和美国专利号5,856,296)、IL-15受体、IL-17受体、IL-18受体、Fc受体、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子受体、粒细胞集落刺激因子受体、制瘤素-M的受体和白血病抑制因子的受体、NF-κB的受体激活物(RANK，WO 01/
36637和美国专利号6,271,349)、骨保护素(美国专利号6,015,938)、TRAIL的受体(包括TRAIL受体1、2、3和4)以及包含死亡结构域的受体，诸如Fas或凋亡诱导受体(AIR)。

[0187] 可以使用本发明来生产的其他蛋白质包括包含分化抗原(也称为CD蛋白)或它们的配体或基本类似于这两者之一的蛋白质的全部或部分氨基酸序列的蛋白质。在Leukocyte Typing VI(Proceedings of the VIth International Workshop and
Conference,Kishimoto,Kikutani等,编,Kobe,Japan,1996)中公开了此类抗原。在随后的研讨会中公开了类似的CD蛋白。此类抗原的实例包括CD22、CD27、CD30、CD39、CD40和其配体(CD27配体、CD30配体等)。若干CD抗原是TNF受体家族的成员，所述TNF家族还包括41BB和OX40。配体常是TNF家族的成员，41BB配体和OX40配体也是。

[0188] 也可以使用本发明生产酶促活性蛋白或它们的配体。实例包括包含以下蛋白质或它们的配体或基本类似于这两者之一的蛋白质中的一个的全部或部分的蛋白质：包括TNF-α转化酶的解联蛋白和金属蛋白酶结构域家族成员、各种激酶、葡糖脑苷脂酶、超氧化物歧化酶、组织纤溶酶原激活物、因子VIII、因子IX、载脂蛋白E、载脂蛋白A-I、珠蛋白、IL-2拮抗剂、α-1抗胰蛋白酶、任何上述酶类的配体和许多其他酶类和它们的配体。

[0189] 术语“抗体”包括对任何同种型或亚类的糖基化的和非糖基化的免疫球蛋白或与完整抗体竞争以特异性结合的其抗原结合区的提及，除非另外指明，否则包括人抗体、人源化抗体、嵌合抗体、多特异性抗体、单克隆抗体、多克隆抗体和其寡聚体或抗原结合片段。还包括了具有抗原结合片段或抗原结合区(诸如Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv、双抗体、Fd、dAb、大抗体、单链抗体分子、互补决定区(CDR)片段、scFv、双抗体、三体抗体、四体抗体和含有足以使特异性抗原结合至靶多肽的至少一部分免疫球蛋白的多肽)的蛋白质。术语“抗体”包括但不限于通过重组方式制备、表达、产生或分离的那些抗体，诸如从受转染而表达抗体的宿主细胞中分离的抗体。

[0190] 抗体的实例包括但不限于识别包括但不限于上述蛋白质和/或以下抗原的蛋白质的任何一种或其组合的那些抗体：CD2，CD3，CD4，CD8，CD11a，CD14，CD18，CD20，CD22，CD23，CD25，CD33，CD40，CD44，CD52，CD80(B7.1)，CD86(B7.2)，CD147，IL-1α，IL-1β，IL-2，IL-3，IL-7，IL-4，IL-5，IL-8，IL-10，IL-2受体，IL-4受体，IL-6受体，IL-13受体，IL-18受体亚基，FGL2，PDGF-β和其类似物(参见美国专利号5,272,064和5,149,792)，VEGF，TGF，TGF-β2，TGF-β1，EGF受体(参见美国专利号6,235,883)，VEGF受体，肝细胞生产因子，骨保护素配体，干扰素γ，B淋巴细胞刺激因子(BlyS，也称为BAFF、THANK、TALL-1和zTNF4；参见Do和Chen-Kiang(2002)，Cytokine Growth Factor Rev.13(1):19-25)，C5补体，IgE，肿瘤抗原CA125，肿瘤抗原MUC1，PEM抗原，LCG(其是与肺癌相关的表达的基因产物),HER-2，HER-3，肿瘤相关糖蛋白TAG-72，SK-1抗原，在结肠癌和/或胰腺癌患者的血清中以升高的水平存在的肿瘤相关表位，癌症相关表位或在乳腺、结肠、鳞状细胞、前列腺、胰腺、肺和肾癌细胞上和/或黑色素瘤上表达的蛋白质，神经胶质瘤或成神经细胞瘤细胞，肿瘤的坏死核心，整合素α4β7，整联蛋白VLA-4，B2整联蛋白，TRAIL受体1、2、3和4，RANK，RANK配体，TNF-α，黏附分子VAP-1，上皮细胞黏附分子(EpCAM)，细胞间黏附分子-3(ICAM-3)，白细胞整合素黏附素，血小板糖蛋白gp IIb/IIIa，肌球蛋白重链，甲状旁腺素，rNAPc2(其为因子VIIa-组织因子的抑制剂)，MHC I，癌胚抗原(CEA)，甲胎蛋白(AFP)，肿瘤坏死因子(TNF)，CTLA-4(其为细胞毒性的T淋巴细胞相关抗原)，Fc-γ-1受体，HLA-DR10β，HLA-DR抗原，骨硬化素，L-选择素，呼吸道合胞病毒，人类免疫缺陷病毒(HIV)，乙型肝炎病毒(HBV)，变异链球菌(Streptococcus mutans)和金黄色葡萄球菌(Staphlycoccus aureus)。可以使用本发明方法来生产的已知抗体的具体实例包括但不限于阿达木单抗、贝伐单抗、英夫利昔单抗、阿昔单抗、阿仑单抗、巴匹珠单抗、巴利昔单抗、贝利木单抗、布雷奴单抗、康纳单抗、培舍珠单抗、西妥昔单抗、可那木单抗(conatumumab)、地诺单抗(denosumab)、依库珠单抗、吉妥珠单抗奥唑米星、戈利木单抗(golimumab)、替伊莫单抗、拉贝珠单抗、马帕木单抗、马妥珠单抗、美泊利单抗、莫他珠单抗、莫罗单抗-CD3、那他珠单抗、帕利珠单抗、奥法木单抗、奥马珠单抗、奥戈伏单抗(oregovomab)、帕利珠单抗、帕尼单抗、pemtumomab、培妥珠单抗、兰尼单抗、利妥昔单抗、罗维珠单抗、塔西单抗、托西莫单抗、曲妥珠单抗、优特克单抗、维多珠单抗(vedolizomab)、扎芦木单抗和扎木单抗。

[0191] 本发明还可用来生产包含例如任何上述蛋白质的重组融合蛋白。例如，可以使用本发明的方法来生产包含上述蛋白质之一加上多聚化结构域诸如亮氨酸拉链、卷曲螺旋、免疫球蛋白或基本类似的蛋白质的Fc部分的重组融合蛋白。参见例如WO94/10308；Lovejoy等(1993),Science 259:1288-1293；Harbury等(1993),Science 262:1401-05；Harbury等(1994),Nature 371:80-83；等(1999),Structure 7:255-64。明确地包括在此类重组融合蛋白中的是受体的部分融合到抗体的Fc部分(诸如依那西普(p75TNFR:Fc)和贝拉西普(CTLA4:Fc))的蛋白质。任何前述蛋白质和多肽的嵌合蛋白和嵌合多肽以及片段或部分或突变体、变体或类似物也包括在可以通过本发明方法来生产的适合的蛋白质、多肽和肽中。

[0192] 虽然在本申请中使用的术语在本领域中是标准的，但是本文也提供了某些术语的定义以确保权利要求意思的清楚和明确。单位、前缀和符号可以他们的SI接受的形式来表示。本文列举的数值范围包括界定了范围的数字，并且包括并支持所界定的范围内的每个整数。除非另外指示，否则本文描述的方法和技术一般根据本领域中所熟知且如在本说明书中通篇所引用并论述的各种一般参考文献和更特定参考文献中所述的常规方法来进行。参见例如，Sambrook等Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第4版,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.(2012)；Ausubel等,Current
Protocols in Molecular Biology,Greene Publishing Associates(1995)，以及
Greenfield,Antibodies:A Laboratory Manual第2版,,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.(2013)，或任何早期版本。本申请中引用的所有文件或文件的部分，包括但不限于专利、专利申请、文章、书籍和论文，均特此明确地以引用的方式并入。本发明的一个实施方案中描述的可以与本发明的其他实施方案组合。

[0193] 本发明的范围不受本文所述的具体实施方案限制，所述具体实施方案意欲作为本发明的个别方面的说明，并且功能上等同的方法和组分构成本发明的方面。确实，除了本文示出和描述的那些之外，根据以上描述和所附附图，本发明的各种修改将对于本领域技术人员而言变得显而易见。此类修改意图落在附加权利要求的范围之内。实施例

[0194] 实施例1

[0195] 延长的周期性细胞培养过程

[0196] 本实验描述了与超滤培养过程(UF)相比具有延长的周期性收获(X-PH)的细胞培养过程。对于延长的周期性过程，使用包括具有使得细胞培养物的重组蛋白产物保留在细胞培养生物反应器的滞留物中的孔径或MWCO的超滤器的单一过滤器单元系统进行灌流，所述细胞培养生物反应器与具有使得目标重组蛋白被携带在渗透物中并作为产物收获收集的孔径或分子量筛截的微滤器连接。通过从超滤器部件中取出无重组蛋白的渗透物或无效渗透物来执行灌流，直到达到预定的参数，在这种情况下是培养的天数，此时通过从微滤器部件中取出含有重组蛋白的渗透物或收获渗透物持续预定时间。在预定时间过去之后，重复所述过程。重复保留和收获蛋白产物的循环，直到培养终止。

[0197] 对于超滤培养过程，使用具有使得重组蛋白产物保留在细胞培养生物反应器中的滞留物中的孔径或分子量筛截的超滤器在灌流系统中培养细胞，并收集无重组蛋白的渗透物。当培养终止时，保留的重组蛋白产物作为收获从生物反应器中回收。

[0198] 延长的周期性收获培养过程(X-PH)

[0199] 在第0天，将表达重组抗体的CHO细胞以1x106个活细胞/mL以1500ml的无血清化学成分确定的分批培养基的工作体积接种到两个2L生物反应器(Applikon,Foster City,CA)中。将培养维持在36℃、DO 48.0mmHg、以350RPM搅拌。

[0200] 以分批模式启动细胞培养，在第2天使用ATF-2TM交替切向流过滤系统(Refine Technologies,Hanover,NJ)开始灌流，所述交替切向流过滤系统使用与30cm 750kDa的中空纤维过滤器(Xampler UFP-750-E-4MA,GE Healthcare)串联连接的30cm 30kDa的中空纤维过滤器(Xampler UFP-30-E-4MA,GE Healthcare,Pittsburg,PA)。使用清洁的夹钳将过滤器与大约1英寸长的清洁的连接器管段接合在一起。培养基是含有1.5g/L pluronic(Kolliphor P188 SAFC Biosciences,ST.Louis,MO)的无血清化学成分确定的灌流培养基。

[0201] 在细胞培养运行中，灌流速率从0.5逐渐增加至1.0生物反应器工作体积/天，并且均匀地通过过滤器单元。经由独立灌流泵以与灌流速率相同的速率收集无效渗透物和收获渗透物。每天从生物反应器中取出样品以评估培养物。使用Vi-Cell(Beckman Coulter,Brea,CA)确定活细胞密度(VCD)和活力。效价通过HPLC分析进行测量。

[0202] 对于聚糖分析，收集含蛋白质的样品并通过蛋白质A(Protein A)纯化。纯化的样品用PNGase-F处理，并在37℃下孵育2小时以释放N-连接的聚糖。酶促释放的聚糖用2-氨基苯甲酸(2-AA)在80℃标记75分钟。然后用Glycoclean S柱体移除过量的2-AA标记。将样品蒸发过夜，并将所得干燥沉淀用水重构用于随后的HILIC(亲水相互作用液相色谱)分析。在高有机条件下将聚糖注射并结合到柱上，并用渐增梯度的含水甲酸铵缓冲液洗脱。使用荧光检测来监测聚糖洗脱，并计算主要和次要聚糖物质的相对百分比。

[0203] 在第11天之前，通过使用蠕动泵(Watson Marlow 120U/DV Falmouth,Cornwal l,UK)从750kDa超滤器中取出渗透物来连续收集无效渗透物或不含产物的渗透物，并丢弃。因为过滤器的尺寸，细胞培养物的蛋白产物被保留在细胞培养生物反应器中的滞留物中。

[0204] 根据表1中提供的时间表，在细胞培养运行期间在五个单独的预定时间收集收获渗透物或含有产物的渗透物。在通过使用蠕动泵(Watson Marlow 120U/DV Falmouth,Cornwall,UK)从30kDa微滤器中取出渗透物来收集收获渗透物。细胞培养物的蛋白产物被携带在渗透物中并作为收获渗透物的一部分进行收集。如上所述评价收获渗透物的滴度和产物质量。将收获渗透物储存在渗透物袋(RCBB-300,RIM Bio Inc.,Seattle,WA)中。

[0205] 表1收获渗透物收集时间表

[0206]收获天数收集时间(小时)
1 11至12 22
2 14至15 23
3 17至18 25
4 20至21 26
5 23至24 25

[0207] 在收获渗透物的每一个的收集完成后，立即再次从750kDa超滤过滤器中连续收集无效渗透物并丢弃。在收集收获渗透物后第24天终止培养。

[0208] 超滤培养过程(UF)

[0209] 在第0天，将表达相同重组抗体的CHO细胞如上所述以1x106个活细胞/mL以1500ml的无血清限定的分批培养基的工作体积接种到四个2L生物反应器(Applikon,Foster City,CA)中。将培养维持在36℃、DO 48.0mmHg、以350RPM搅拌。

[0210] 以分批模式启动细胞培养，在第2天使用配备60kDa的中空纤维过滤器(Xampler TMUFP-30-E-4MA,GE Healthcare,Pittsburg,PA)的ATF-2 交替切向流过滤系统(Refine
Technologies,Hanover,NJ)开始灌流。培养基是含有1g/L pluronic(Kolliphor P188 SAFC Biosciences,ST.Louis,MO)的无血清限定的灌流培养基。

[0211] 在细胞培养运行中，灌流速率从0.5逐渐增加至1.0工作体积/天。每天取样品以评估培养物。使用Vi-Cell(Beckman Coulter,Brea,CA)确定活细胞密度(VCD)和活力。效价通过HPLC分析进行测量。

[0212] 以与灌流速率相同的速率收集渗透物。因为过滤器的尺寸，细胞培养物的蛋白产物被保留在细胞培养生物反应器中的滞留物中直到培养在第15天被终止时被收获。

[0213] X-PH过程的效价曲线与UF培养过程直到第11天的效价一致(图2)。当在X-PH过程中引入第一个750kDa收获循环时，效价曲线分离。在活细胞密度(图3)和活力％(图4)中观察到了类似的对应。

[0214] 使用五十一天生物反应器生产期以允许X-PH过程与UF过程的比较，其中在生产型生物反应器的运行之间分配三天的周转时间。有了这个标准，两个24天的X-PH过程运行和三个UF过程运行将在类似的五十一天期间完成。

[0215] 在51天的生产期中，X-PH过程与UF过程相比将提供多出98％的回收产物(表2)。这主要包括积分活细胞密度(IVCD)增加26％以及单位生产率增加46％。相对于UF过程的三次运行，X-PH过程在两次运行中使用多出27％的培养基，但是相当于与UF过程相比由X-PH产生的每克产物的培养基需求(培养基成本)降低-36％。

[0216] 表2.在具有1.5L工作体积的2L生物反应器中，在51天的制造期内回收的产物

[0217]

[0218]

[0219] 通过HILIC聚糖作图评价X-PH过程产物质量，并与使用15天UF过程产生的标准进行比较(表3)。X-PH过程聚糖图属性与使用UF过程的标准一致。

[0220] 表3.HILIC聚糖分析

[0221]

[0222] 实施例2

[0223] 本实验比较了低浓度和高浓度的聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段共聚物、 F68以及30kDa相对于750kDa的过滤器在灌流培养系统中的影响。

[0224] 在第0天，将表达重组抗体的CHO细胞系以2x106个活细胞/mL以1500ml的含1g/LF68(BASF,Mt Olive,NJ)的无血清化学成分确定的灌流培养基的工作体积接种到四个2L生物反应器(Applikon Biotechnology,Foster City,CA)中。将培养维持在36℃、溶氧浓度在48％、pH 6.9、以350RPM搅拌。

[0225] 以分批模式启动细胞培养运行；当细胞密度达到4-5x106个细胞/ml时，在第2天开始灌流。使用ATF-2TM交替切向流灌流和过滤系统(Refine Technologies,Hanover,NJ)完成灌流。细胞培养物通过外部垂直取向的过滤器的官腔侧连续循环，在上端进入。经由蠕动泵连续取出渗透物。两个反应器配备有30kDa中空纤维过滤器(Xampler UFP-30-E-4MA,GE Healthcare,Pittsburg,PA)。两个反应器配备有750kDa中空纤维过滤器(Xampler UFP-750-E-4MA,GE Healthcare,Pittsburg,PA)

[0226] 在细胞培养运行中，灌流速率从0.5逐渐增加至3mL/分钟。以与灌流速率相同的速率收集渗透物样品。每天从生物反应器和渗透物系中取样一次。在用磷酸盐缓冲盐水稀释后，通过CEDEX(Roche,Nut ley,NJ)测量细胞密度、活力和细胞直径，以获得<107个细胞/ml的细胞密度。使用血液气体分析仪测量CO2(pCO2)和O2(pO2)的pH和分压；通过NovaFLEX仪器+ +(Nova Biomedical,Waltham,MA)维持葡萄糖、乳酸盐、谷氨酰胺、氨的浓度以及K 和Na的离子浓度。

[0227] 在配备有750kDa过滤器的反应器中，细胞活力在第6天降至80％。在配备有30kDa过滤器的反应器中，减少不明显，其中活力维持在80％以上持续14天。(图5)

[0228] 观察到在配备有30kDa中空纤维过滤器的反应器中上清液中 F68的积累高达7g/L。在这些条件下， F68低于渗透物样品中的可检测水平。在配备有750kDa
过滤器的反应器中，生物反应器上清液和渗透物中的 F68的水平保持相对恒定并
且与灌流培养基中的水平相似，在1-1.5g/L范围内，表明没有积累(图6)。 F68的平
均摩尔质量为8,400Da，并且理论上应该流过30kDa过滤器。 F68胶束的形成可以在
远低于1g/L(根据制造商在20-25℃下为0.04mM)的浓度下发生。可能由于反应器和过滤器内胶束的形成，提高了 F68的浓度。

[0229] F68毒性研究

[0230] 为了测试高 F68浓度的毒性对细胞的影响，表达不同单克隆抗体的两个CHO细胞系(细胞系A和细胞系B)在含有1、2、3、4或5g/L F68的细胞培养基的250ml
摇瓶中以8x105个细胞/ml的初始接种密度进行10次传代(3天/代)。

[0231] 3天后观察到细胞密度的总体增加(3.4-6.5x106个细胞/ml)。将活细胞密度标准化至1g/L条件以能够比较不同的 F68浓度。

[0232] 在含有3、4或5g/L F68的培养基中生长的细胞在传代期间始终较高，其中与1g/L条件相比测量到细胞密度增加10％(p<0.01)(图7A)。较高的 F68培养物的
活力也更高(平均值>95％)(图7B)。也发现与1g/L条件(15.42μM)相比，在所有条件下细胞直径都略有增加(p<0.05)(图7C)。在较高的 F68条件下活细胞密度、活力％和直径
的变化是由于连续传代的特征的改变。

[0233] 使用表达单克隆抗体的两个CHO细胞系，在2L补料分批培养中也进行高F68浓度的毒性对细胞的影响。同样，高 F68对活细胞密度、活力、细胞直径或效价
没有影响(图8)。

[0234] 用5g/L F68补充ATF灌流培养

[0235] 进执行比较1g/L和5g/L F68的实验。在第0天，将表达重组抗体的CHO细胞系以2x106个活细胞/mL以1500ml的工作体积接种到六个2L生物反应器(Applikon
Biotechnology,Foster City,CA)中。两个反应器接受含有1g/L F68的无血清限
定的灌流培养基，并且两个反应器接受含有5g/L F68的无血清限定的灌流培养基。
将培养维持在36℃、溶氧浓度在48％、pH 6.9、以350RPM搅拌。

[0236] 以分批模式启动细胞培养运行；在第2天开始灌流。使用配备750kDa的中空纤维过滤器(Xampler UFP-750-E-4MA,GE Healthcare,Pittsburg,PA)的ATF-2TM交替切向流过滤系统(Refine Technologies,Hanover,NJ)完成灌流。灌流速率为3工作体积/天。

[0237] 每天从生物反应器和渗透物系中取样一次并如上所述进行测试。

[0238] 将 F68浓度提高至5g/L导致了持续14天的>95％的延长的活力和高达25天的>90％的延长的活力(图9)。

[0239] 用高 F68回收低 F68浓度培养物

[0240] 在第0天，将表达重组抗体的CHO细胞系以2x106个活细胞/mL以1500ml的工作体积接种到四个2L生产型生物反应器(Applikon Biotechnology,Foster City,CA)中。以分批模式启动细胞培养运行；在第2天开始灌流。使用配备750kDa的中空纤维过滤器(Xampler UFP-750-E-4MA,GE Healthcare,Pittsburg,PA)的ATF-2TM交替切向流过滤系统(Refine Technologies,Hanover,NJ)完成灌流。将反应器分成两组，每组两个接受不同的灌流细胞培养基制剂(培养基A和培养基B)。两种培养基制剂都含有1g/L F68。将培养维持在36℃、溶氧浓度在48％、pH 6.9、以350RPM搅拌。将培养物维持在这些条件下，直到细胞活力降至80％。此时，用另外的4g/L F68(总数为5g/L)补充两组的培养基。将培养物维
持在这些高pluronic条件下直到第30天。通过添加更高浓度的 F68的细胞活力的
恢复如图10所示。补充后，活力百分比增加了高达15％。不论细胞培养基制剂，在具有下降的细胞活力的培养物中较高浓度的pluronic的保护作用显而易见。

[0241] 实施例3

[0242] 本实验证明了通过在PAC过程中设计(QbD)元件以提供预定的质量目标产品概况(QTPP)的成功的多个质量的中试规模应用。本实验中的受控CQA是单克隆抗体的Fc结构域上的高甘露糖N-连接的糖基化(“高甘露糖”)。

[0243] 通过向细胞培养基中添加或移除甘露糖(控制杆)来控制产物中高甘露糖的水平。然而，也可以使用代谢物前体、代谢抑制剂、小分子、酶辅助因子和诱导型启动子。最近的研究已经表明不同的糖可以影响抗体产物上高甘露糖的水平。具体来说，已经显示，甘露糖的补料增加了高甘露糖的水平，而不影响培养生产率。通过实验研究，开发了对细胞培养基中的甘露糖浓度对IgG高甘露糖水平的影响的了解，并研究了与细胞培养过程的关系。结合小规模研究所获得的知识和中试规模的训练生产运行，来开发基于模型预测控制(MPC)原理的PAC 算法。MPC是一种控制方案，其中使用所述过程的数学模型来预测其未来轨迹。典型的CHO生物反应器过程的瞬时性质、多个CQA与其控制杆之间的相互作用的可能性以及与复杂分析相关的延迟都为MPC提供了强烈的动机。与标准生物反应器监测结合的包括近实时质谱分析的PAT技术被用于提供及时的数据以通知MPC的模型。将来自多个测定的数据并入到MPC系统中，其确定添加到生物反应器中以将高甘露糖CQA维持在目标范围内的甘露糖的量。

[0244] 细胞培养板测定葡萄糖与甘露糖的比：

[0245] 细胞系为表达单克隆抗体的重组CHO细胞系。将细胞以7.5e5个细胞/mL以2mL工作体积接种在深孔板中含有12g/L葡萄糖的化学成分确定(CD)的培养基中。将细胞在定轨摇床中在36.0℃和5％CO2下以220rpm进行孵育(轨道直径为50mm)。在第3-4天，经由Polychem葡萄糖试剂板测定(Glucose Reagent Plate Assay)(MedTest DX,Canton MI)测量葡萄糖浓度，并将培养物离心以用新鲜的CD培养基替换26％的废培养基。类似地，在第5天，用不含葡萄糖的新鲜CD培养基替换100％的废培养基。随后通过加入浓缩己糖储备溶液，使用不同比例的葡萄糖与甘露糖将总己糖浓度调节至10g/L。允许细胞生长24小时。移除上清液，纯化IgG，并且通过亲水相互作用液相色谱(HILIC)测定法测量高甘露糖％。

[0246] GC-MS己糖测定

[0247] 通过GC-MS在细胞培养基中定量葡萄糖和甘露糖浓度。将1mL细胞培养物样品离心以沉淀细胞，并过滤(0.2μM)上清液。将过滤的上清液以1/10稀释在DI水中，并且将10μL此稀释液添加到1.5μL离心管中。添加含有10mM D-[UL-13C6]甘露糖99.9％(Omicron Biochemicals)和10mM D-[U-13C6]葡萄糖99.9％(Cambridge Isotope Labs)的己糖内标溶液的5μL的等分试样。将样品干燥(SpeedVac)30分钟。通过添加20μL无水吡啶和30μL具有在40℃孵育30分钟的1％三甲基氯硅烷(TMCS)的N-甲基-N-(三甲基甲硅烷基)三氟乙酰胺(MSTFA)来衍生己糖。衍生后，立即在Agilent GC 6890N MSD 5973系统上分析样品。使用1/
50的拆分将1μL样品注射到Agilent DB-35 GC柱(30m x 0.32mm x 0.25um)上。氦保持在
1mL/min的恒定流速。烘箱温度在190℃保持2分钟，并以4℃/min的速率升温至202℃。

[0248] 以60℃/min的速率将温度进一步升至280℃。总运行时间为6.3分钟。每个己糖产生代表开放异构形式和封闭异构形式的两个峰。甘露糖在2.7分钟和3.34分钟洗脱；葡萄糖在3.5分钟和4.18分钟洗脱(图11(A))。3.34分钟峰面积用于甘露糖定量，而4.18分钟峰用于葡萄糖定量。使用特征TMS碳水化合物片段m/z＝20416和标准同位素稀释来定量己糖，其中将12C糖的m/z＝204峰面积与13C糖的m/z＝206峰面积进行比较(图11(B))。

[0249] IdeS 有限蛋白酶解MS-PAT测定

[0250] 过滤的细胞培养基样品在没有进一步纯化的情况下进行分析。用60单位的IdeS酶(fabRICATOR,Genovis,Lund,Sweden)在37℃下将大约60μg的每个样品消化30分钟。然后将消化的样品在4M盐酸胍中用50mM二硫苏糖醇(DTT)在55℃还原10分钟。然后，通过RP-HPLC/MS分析消化和还原的样品。

[0251] 使用与Agilent MST飞行时间(TOF)质谱仪(Santa Clara,CA)联接的Waters Acquity超高效液相色谱(UPLC)(Milford,MA)执行RP-HPLC/MS分析。在维持在80℃的反相Waters BEH苯基柱(1.7μm,2.1x150mm；Milford,MA)上分离制备的样品。通过220nm的UV和TOF-MS监测峰。质量数据从峰的总离子流(TIC)进行提取，接着使用Agilent MassHunter软件进行解卷积并定量。

[0252] 亲水相互作用色谱(HILIC)聚糖图谱测定

[0253] 将100μg纯化的抗体用PNGase F(New England Biolabs)消化，接着添加50μL含有12mg/mL 2-氨基苯甲酸(2AA)和0.04M氰基硼氢化钠的荧光标记溶液。将此混合物在80℃下孵育75分钟。标记的聚糖通过配备有荧光检测器(Milford,MA)的Acquity UPLC进行分析。
将大约3μL标记的聚糖注射到Acquity UPLC BEH聚糖柱(#186004741,Milford,MA)，接着使用在360nm处的放射和在425nm处的检测的荧光检测器。通过MS/MS技术鉴定2AA标记的聚糖物质。

[0254] 在生物反应器中执行用于拟合模型参数的数据的产生以及用于控制高甘露糖％的MPC的后续证明。在培养的第一天，将甘露糖(Sigma,M6020)添加至使用25％储备溶液的浓度为1g/L的培养物中。在培养的第二天启动灌流。灌流培养基以0.5至1.0生物反应器体积每天的递增的体积进行递送。使用Delta V自动装置(Emerson)控制生物反应器。使用MAST SP200自动样品阀(Bend Research)每四小时进行生物反应器取样，用于效价、己糖和产物聚糖测量。在自动收集样品后，手动离心样品，并0.2um过滤以移除细胞和碎片。手动或使用MAST SP200收集用于测量生长、活力、重量摩尔渗透压浓度和乳酸盐的每日样品。使用Nova CDV(Nova Biomedical)测量活细胞密度(VCD)和培养物活力％。使用Nova Bioprofile Basic分析仪(Nova Biomedical)测定乳酸盐浓度。

[0255] 模型预测控制

[0256] 用于模型预测控制(MPC)以及用于拟合模型参数的编程在MATLAB(版本R2014a，Mathworks)中完成，并且代码可在补充材料中获得。通过对来自单个训练反应器运行的数据的模型方程的最小二乘回归来确定模型参数。对于通过甘露糖补料(经由MPC)的高甘露糖控制，经由以下步骤计算每日的速率变化：

[0257] 1.当前模型偏移量的计算。反应器操作历史与日常测量值(如果可获得)组合用作输入以产生模型微分方程的数值解。然后可以计算模型和最近测量之间的差异。此差异用作未来偏移量的估计。

[0258] Hk在时间点k的模型值＝f(tk)

[0259] H'k＝在时间点k的测量值

[0260] Hk+1＝在时间点k+1的已调整的预测值＝F(tk+1)+(Hk H’k)

[0261] 2.经由MPC确定最佳未来速率。一旦启动控制，每天使用标准MPC后退时域法(receding horizon method)17。通过最小化由模型预测的产品质量概况与目标设定点之间的平方误差的总和来确定五个速率变化的最佳集合。虽然计算了五个速率变化，但只使用第一个。到下一次速率改变将要实施时，然后新的数据可用于重新计算未来速率的最佳集合。

[0262] 甘露糖的补料速率被发现在目标函数(在这种情况下其为分子上所需的高甘露糖水平与通过控制微分方程的积分发现的高甘露糖水平之间的差异的平方和)的最小化中被作为自变量来处理。上述方程充分良好地表现，使得通过MATLAB解算机获得的解足以用于对抗体上+/-1％高甘露糖物质的控制。用于控制高甘露糖的方法是一方面的，因为向反应器中添加甘露糖增加了抗体上的高甘露糖％。通过降低甘露糖浓度(通过在降低甘露糖补料速率后经由灌流稀释)来实现高甘露糖产量％的降低。

[0263] GC-MS己糖定量

[0264] 甘露糖的实时定量是MPC的必需输入。GCMS用于区分细胞培养基中的己糖(甘露糖和葡萄糖)。通过如上所述的同位素稀释定量己糖。图11(A)示出了在典型运行期间来自细胞培养基的甘露糖和通过GC的基线分离。图11(B)示出了己糖断裂模式(甘露糖和葡萄糖之间完全相同)，其中使用来自13C标记的内标的m/z 206峰来定量m/z 204峰。葡萄糖和甘露糖的检测限为0.02g/L，并且证实了直到6g/L的己糖的定量的线性(图11(C))。

[0265] 细胞培养板测定葡萄糖与甘露糖的比

[0266] 用恒定的10/L总己糖培养细胞，但是增加甘露糖的浓度以得到10:0、9:1、8:2、7:3、6:4、5:5、4:6、3:7、2:8和0:10的葡萄糖:甘露糖。细胞以不同的己糖比培养24小时。移除上清液，纯化IgG，并且通过HILIC测定法测量高甘露糖％。图12(A)示出了细胞培养基中甘露糖浓度与总高甘露糖水平之间的线性关系，其中高甘露糖在仅含有葡萄糖的培养基中最低为10％，而在仅含有甘露糖的培养基中最高为37％。

[0267] 为了确定高甘露糖的增加是否是由于甘露糖浓度的增加或葡萄糖浓度的降低，如第一板实验一样培养细胞，除了第5天，其中培养基更换为含有1、3、5、7或10g/L甘露糖的新鲜培养基。将五种不同浓度的葡萄糖(1、3、5、7或9g/L)添加到含培养物的甘露糖的每一种中。这对总共25种不同的培养物进行，其中总己糖的最低量为2g/L(1gm/L葡萄糖和1gm/L甘露糖，图12(B))并且最高量为19g/L(9gm/L葡萄糖和10gm/L甘露糖；图12(B))。允许细胞生长24小时。然后移除上清液，纯化IgG，并且通过HILIC测定法测量高甘露糖％。图12(B)指示高甘露糖的线性增加与葡萄糖浓度无关，并且仅取决于培养基中的甘露糖浓度。这种关系用于开发MPC控制回路。

[0268] 控制回路开发：模型预测控制

[0269] 对于控制回路开发，将生物反应器连接到MAST SP200自动取样装置和甘露糖溶液补料泵，还有常规生物反应器控制和离线分析(图13)。执行15天灌流生物反应器运行以产生训练数据来开发用于使用甘露糖补料的高甘露糖的单侧控制的MPC反馈回路。以4小时的时间间隔收集高甘露糖％(图14(A))、反应器中甘露糖浓度(图14(B))、细胞生长(图14(C))和效价积累(图14(D))的数据，除了在第9-11天没有收集的聚糖数据。从此数据集合来开发MPC模型，除了生长参数由于错误从相似的运行进行计算。使用两个生长参数集合的模型预测在图14中示出，并且它们实际上是完全相同的。

[0270] 控制回路开发：模型方程

[0271] 构建了常微分方程来描述细胞数、产物、甘露糖浓度和高甘露糖物质的变化速率。

[0272]

[0273] 这里N是细胞密度，μ是最大生长速率，并且Nm是最大细胞密度。细胞密度可以表示为细胞/体积或细胞体积/体积。在这项工作中，从在Nova CDV上测量的细胞计数和直径来计算计算的和任意缩放的体积。对于效价，假定单位生产率是恒定的，并且考虑产品的可变保留(其取决于使用的灌流过滤器)：

[0274]

[0275] 产物浓度为P，并且qp为单位生产率。S是筛分系数，其为通过灌流过滤器的产物的部分，并且D为反应器体积/天的灌流速率。甘露糖的变化速率

[0276]

[0277] 反应器中的甘露糖浓度为M，Mf为灌流培养基中甘露糖的有效浓度，并且qM为单位甘露糖消耗速率。假定甘露糖消耗速率遵循米-门氏(Michaelis-Menton)动力学：

[0278]

[0279] 最大反应速率为VM，并且KM为米氏常数(Michaelis-Menton constant)。细胞培养板的数据表明高甘露糖物质的相对生产速率与甘露糖浓度成比例(图12(B))：

[0280]

[0281] 这里H是高甘露糖物质的浓度，并且FH是高甘露糖比例因子。以前的数据(未示出)的检查表明FH随细胞密度变化，因此对于FH使用以下纯经验方程：

[0282] F11＝K1*(Kz+N)

[0283] K1和K2为经验常数。最终，经由连锁法则(chain rule)发现高甘露糖的变化速率：

[0284]

[0285] 经由图14所示的训练数据的最小二乘回归确定所有模型参数。通过拟合图14(C)中所示的细胞生长曲线得到参数。通过拟合图14(D)中所示的效价曲线得到qp的值。第12天后效价的下降是由于从超滤膜(其筛分系数S为零)切换到微滤膜(其给出的筛分系数在0.76至0.78的范围内)。通过同时将那些方程式拟合到图14(A)和图14(B)中的数据得到其余参数。

[0286] 模型中使用的参数值及其95％置信界限在表4中示出。模型参数和置信界限的数值从训练数据获得并用于MPC。图14(虚线A-D)示出了拟合训练数据的所得模型的图，而拟合用于MPC的生长参数的是点线。适合于甘露糖米氏常数KM的参数远大于使用的浓度，因此甘露糖消耗动力学是有效的一级。训练数据和随后的MPC的证明在完全相同的条件下执行，除了作为高甘露糖的控制杆的甘露糖浓度之外。

[0287] 表4.从训练数据获得并用于MPC的模型参数和置信界限的数值。

[0288]

[0289] MPC控制高甘露糖水平的证明

[0290] 在参数值推导之后，在生物反应器运行中使用反馈回路以主动控制抗体A的高甘露糖％水平至6％+/-1％。在生产培养的第2天启动灌流和甘露糖补料。将初始甘露糖补料设定为使其浓度在反应器中保持大致恒定的速率。此初始甘露糖补料速率基于过程的先前经验估计，并且不是控制回路的一部分。在生产的第5天开始控制回路。每天取样并分析以确定进入MPC模型的输入。反应器样品和速率变化之间的延迟在5至14小时之间，平均为8.5小时。一旦获得所有必需的数据，就将它们手动输入到MATLAB模型中以计算下一个甘露糖补料速率。所得的高甘露糖％、其他建模的量以及基于补料浓度的MPC(由进料速率计算)的轨迹在图15中示出。一旦启动控制，测量的和建模的高甘露糖％快速增加并维持在6％目标的1％内(图15(A))。测量的和建模的甘露糖浓度曲线响应于甘露糖补料如预期地上升和下降(图15(B))。细胞生长大部分遵循假定的对数曲线，除了在第6天和第12天的相当显著的偏差(图15(C))。测量的效价与模型匹配，尽管在培养的最后几天中的不连续性证明所述模型正在估计蛋白质产量(图15(D))。尽管有观测偏差，调整MPC模型状态以匹配测量还是能够良好地控制高甘露糖。在图16中，示出了PAC过程和历史中试装置运行之间的比较。历史运行使用在设计和性能上与PAC过程类似但不具有主动控制回路的常规过程来执行。相反，常规过程依赖于静态过程参数，以在每批次的误差界限内运行来递送所需的产品，这将需要通过对沉积的质量控制。使用PAC过程，PQ是近实时测量的，并且由于生产运行期间的主动控制，在处置之前不需要随后的分析表征。

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