一种哺乳动物基因组修饰方法
阅读：641发布：2020-05-13
专利汇可以提供一种哺乳动物基因组修饰方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且一种 哺乳动物 基因组修饰方法，属于基因工程技术领域。本 发明 根据研究目的 选定 哺乳动物基因 组上特定区域的靶基因DNA序列，设计识别靶基因DNA序列的一对单链DNA寡核苷酸然后与本发明构建的质粒载体pcDNA-DN按照 质量 比1-2:1-2:5-20的比例共 转染 哺乳动物细胞，48小时后提取基因组DNA，PCR扩增并克隆测序，检测靶标区域序列的突变比例。与 现有技术 相比，本发明通过合成一对短链向导DNA引导核酸酶X在细胞或个体 水 平上对哺乳动物特定基因进行切割以达到敲除或修饰某一基因的目的，从而解析基因的功能、构建基因突变库。有益效果在于，向导DNA的总长度为40nt以上，极大增加了基因组修饰的特异性。，下面是一种哺乳动物基因组修饰方法专利的具体信息内容。
1.一种哺乳动物基因组修饰方法，其特征在于包括如下步骤：
1)根据研究目的选定哺乳动物基因组上特定区域的靶基因DNA序列；
2)设计识别靶基因DNA序列的一对单链DNA寡核苷酸，这一对单链DNA寡核苷酸除3'末端的一个碱基外分别与靶基因DNA不同区段的正义链和反义链互补；
3)步骤2)中所述的一对单链DNA寡核苷酸与质粒载体pcDNA-DN按照质量比1-2:1-2:5-
20共转染哺乳动物细胞，所述pcDNA-DN序列如SEQ ID NO.2所示。
2.如权利要求1所述的哺乳动物基因组修饰方法，其特征在于步骤3)中的质粒载体pcDNA-DN是通过如下步骤构建的：
a合成DNA片段DN,其序列如SEQ ID NO.1所示；
b DNA片段DN通过BamHⅠ与EcoRⅠ双酶切克隆到pcDNA3.1(+)载体的相应多克隆位点，通过测序验证，获得质粒载体pcDNA-DN。
3.如权利要求1所述的哺乳动物基因组修饰方法，其特征在于步骤2)中所述的一对单链DNA寡核苷酸长度是20-30nt。
4.如权利要求2所述的哺乳动物基因组修饰方法，其特征在于设计正向测序引物及反向测序引物对质粒载体pcDNA-DN的序列进行验证，所述正向测序引物pcDNA3.1-F的序列如SEQ IDNO.3所示，反向测序引物pcDNA3.1-R的序列如SEQ ID NO.4所示。
一种哺乳动物基因组修饰方法
技术领域
背景技术
[0002] ZFN、TALEN及CRISPR/Cas9打靶技术是目前研究较为成熟的几种基因组修饰技术。(CRISPR)/CRISPR-associated(Cas)是细菌和古细菌一种不断进化适应的免疫防御机制。
CRISPR/Cas9利用一段小RNA来识别并剪切DNA以降解外来核酸分子。Cong等(Multiplex Genome Engineering Using CRISPR/Cas Systems.Science.2013)及Mali等(RNA-guided human genome engineering via Cas9.Science.2013)证明Cas9系统能在293T、K562、iPS等多种细胞中，进行有效的靶向酶切，非同源重组(NHEJ)、同源重组(HR)效率在3-25％之间，与TALEN酶切效果相当。他们还证明，多个靶点可以同时进行靶向酶切。但是，随后的研究表明，Cas9存在较为明显的脱靶效应(High-frequency off-target mutagenesis induced by CRISPR-Cas nucleases in human cells.Nature Biotechnology.Fu et al,
2013；High-throughput profiling of off-target DNA cleavage reveals RNA-programmed Cas9nuclease specificity.Nature Biotechnology.Pattanayak et al,
2013)。因此，开发出新的基因组修饰工具势在必行。
CRISPR/Cas9利用一段小RNA来识别并剪切DNA以降解外来核酸分子。Cong等(Multiplex Genome Engineering Using CRISPR/Cas Systems.Science.2013)及Mali等(RNA-guided human genome engineering via Cas9.Science.2013)证明Cas9系统能在293T、K562、iPS等多种细胞中，进行有效的靶向酶切，非同源重组(NHEJ)、同源重组(HR)效率在3-25％之间，与TALEN酶切效果相当。他们还证明，多个靶点可以同时进行靶向酶切。但是，随后的研究表明，Cas9存在较为明显的脱靶效应(High-frequency off-target mutagenesis induced by CRISPR-Cas nucleases in human cells.Nature Biotechnology.Fu et al,
2013；High-throughput profiling of off-target DNA cleavage reveals RNA-programmed Cas9nuclease specificity.Nature Biotechnology.Pattanayak et al,
2013)。因此，开发出新的基因组修饰工具势在必行。
发明内容
[0003] 本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种新的哺乳动物基因组修饰方法。本发明针对某一特定靶点，设计识别这一靶点的一对单链DNA寡核苷酸，与质粒载体pcDNA-DN共转染哺乳动物细胞，对哺乳动物基因组上特定位点的序列进行修饰，从而达到失活或修改某一基因的目的。
[0004] 具体地本发明是通过如下技术方案实现的：
[0005] 一种哺乳动物基因组修饰方法，包括如下步骤：1)根据研究目的选定哺乳动物基因组上特定区域的靶基因DNA序列；
2)设计识别靶基因DNA序列的一对单链DNA寡核苷酸,这一对单链DNA寡核苷酸除3'末端的一个碱基外分别与靶基因DNA不同区段的正义链和反义链互补；
3)步骤2)中所述的一对单链DNA寡核苷酸与质粒载体pcDNA-DN按照质量比1-2:1-2:5-
20共转染哺乳动物细胞，所述pcDNA-DN序列如SEQ ID NO.2所示。
2)设计识别靶基因DNA序列的一对单链DNA寡核苷酸,这一对单链DNA寡核苷酸除3'末端的一个碱基外分别与靶基因DNA不同区段的正义链和反义链互补；
3)步骤2)中所述的一对单链DNA寡核苷酸与质粒载体pcDNA-DN按照质量比1-2:1-2:5-
20共转染哺乳动物细胞，所述pcDNA-DN序列如SEQ ID NO.2所示。
[0006] 具体地，步骤3)中的质粒载体pcDNA-DN是通过如下步骤构建的：a合成DNA片段DN,其序列如SEQ ID NO.1所示；
b片段DN通过BamHⅠ与EcoRⅠ双酶切克隆到pcDNA3.1(+)载体的相应多克隆位点，通过测序验证，获得质粒载体pcDNA-DN，正向测序引物pcDNA3.1-F其序列如SEQ ID NO.3所示，反向测序引物pcDNA3.1-R其序列如SEQ ID NO.4所示。
b片段DN通过BamHⅠ与EcoRⅠ双酶切克隆到pcDNA3.1(+)载体的相应多克隆位点，通过测序验证，获得质粒载体pcDNA-DN，正向测序引物pcDNA3.1-F其序列如SEQ ID NO.3所示，反向测序引物pcDNA3.1-R其序列如SEQ ID NO.4所示。
[0007] 进一步地步骤2)中的一对单链DNA寡核苷酸长度是20-30nt。
[0008] 本发明针对哺乳动物基因组上特定区域的(根据各自目的确定靶基因)DNA序列，合成一对单链DNA寡核苷酸(20-30nt)，与质粒载体pcDNA-DN(其作用是表达核酸酶X，X的氨基酸序列如SEQ ID NO.20所示)按照质量比1-2:1-2:5-20的比例共转染哺乳动物细胞，48小时后提取基因组DNA，PCR扩增并克隆测序，检测靶标区域序列的突变比例。
[0009] 与现有技术相比，本发明提供了一种哺乳动物基因组修饰方法，通过合成一对短链向导DNA引导核酸酶X在细胞或个体水平上对哺乳动物特定基因进行切割以达到敲除或修饰某一基因的目的，从而解析基因的功能、构建基因突变库。本发明的有益效果在于，向导DNA的总长度为40nt以上，极大增加了基因组修饰的特异性。附图说明
[0010] 图1为MSH2TF、MSH2TR与pcDNA-DN共转染293T细胞系，48小时后提取基因组DNA进行PCR扩增，将PCR产物克隆后的部分测序结果(突变序列)；
[0011] 图2为Tada1TF、Tada1TR与pcDNA-DN共转染NIH/3T3细胞系，48小时后提取基因组DNA进行PCR扩增，将PCR产物克隆后的部分测序结果(突变序列)；
[0012] 图3为RELATF、RELATR与pcDNA-DN共转染PIEC细胞系，48小时后提取基因组DNA进行PCR扩增，将PCR产物克隆后的部分测序结果(突变序列)。
具体实施方式
[0013] 以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中，如无特殊说明，均采用低糖DMEM培养基培养细胞。内切酶均购自NEB公司。
[0014] DNA片段及引物均由北京六合华大基因科技股份有限公司合成。
[0015] 实施例1质粒载体pcDNA-DN的构建
[0016] 合成DNA片段DN(其序列如SEQ ID NO.1所示)，通过BamHⅠ与EcoRⅠ双酶切克隆到pcDNA3.1(+)载体(购自Invitrogen,货号V79020)的多克隆位点，获得质粒载体pcDNA-DN。通过测序验证，证实其序列信息如SEQ ID NO.2所示，所用正向测序引物pcDNA3.1-F的序列如SEQ ID NO.3所示；反向测序引物pcDNA3.1-R的序列如SEQ ID NO.4所示。
[0017] pcDNA3.1-F：CTAGAGAACCCACTGCTTAC，pcDNA3.1-R：TAGAAGGCACAGTCGAGG；
[0018] 实施例2本基因组修饰方法在人细胞系293T中的基因修饰效率验证[0019] 人细胞系293T，购自中国科学院上海细胞库，目录号：SCSP-502。
[0020] 人MSH2基因的第一外显子序列(其序列如SEQ ID NO.5所示)：
[0021] 选取上述序列120-180bp区段作为靶标，针对这一靶标设计并合成2条DNA寡核苷酸MSH2TF与MSH2TR(其序列如SEQ ID NO.6-7所示),这两条寡核苷酸分别与上述序列131-153bp区域的反义链、161-180bp区域的正义链互补配对(3'末端最后一个碱基除外)，如下：
[0022] MSH2TF：GGTGGAGCCGAAGGAGACGCTGCC，MSH2TR：AGCCGACCTCGGCCGCGCTCG；
[0023] 将MSH2TF、MSH2TR与pcDNA-DN载体按照1:1:5的比例转染人细胞系293T，48小时后，提取细胞基因组DNA，使用引物对MSH2F、MSH2R(其序列如SEQ ID NO.8-9所示)进行PCR扩增，对获得的258bp的PCR产物进行克隆测序。共挑取20个单克隆菌落测序，其中有6个单克隆的序列发生改变(如附图1所示)。该结果表明，MSH2TF、MSH2TR与pcDNA-DN载体混合转染对人细胞系293T的敲除效率达到30％。
[0024] MSH2F：TTGGGTGTGGTCGCCGT,MSH2R：CCGTGCGCCGTATAGAAGTC；
[0025] 实施例3本基因组修饰方法在小鼠细胞系NIH/3T3中的基因修饰效率验证[0026] 小鼠细胞系NIH/3T3,购自中国科学院上海细胞库，目录号：SCSP-515。
[0027] 小鼠Tada1基因的第一外显子序列(其序列如SEQ ID NO.10所示)如下：1 agagccgagc cgagccgagc cgagcggagc cgagccgagc cgagcggagc cgagccgagc
61 cgagccgagc cgaaccgagc cgagccgagc cgaaccgagc cgagccgagc cgagtggaat
121 cgagtcgagt cgagcctcca gcgtccggcg cgcaggcctt ccgccgcgtt gatctttcgg
181 ttgctggtgg ccgtgggccg cgcggtctac ggtcgggctg aaagacgcgc gctgcaatgg
241 cgacctttgt gagcgagctg gaggcagcca agaagaactt gagcgaggcg ctgggggaca
301 acgtgaaaca
61 cgagccgagc cgaaccgagc cgagccgagc cgaaccgagc cgagccgagc cgagtggaat
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181 ttgctggtgg ccgtgggccg cgcggtctac ggtcgggctg aaagacgcgc gctgcaatgg
241 cgacctttgt gagcgagctg gaggcagcca agaagaactt gagcgaggcg ctgggggaca
301 acgtgaaaca
[0028] 选取上述序列的200-280bp区段作为基因修饰的靶标，针对这一靶标设计并合成两条DNA寡核苷酸Tada1TF与Tada1TR(其序列如SEQ ID NO.11-12所示)，这两条寡核苷酸分别与上述序列211-233bp区域的反义链、245-279bp区域的正义链互补配对(3'末端最后一个碱基除外)，如下：
[0029] Tada1TF：GGTCGGGCTG AAAGACGCCC GCTA，Tada1TR：GGCTGCCTCCAGCTCGCTCACAAAGT；
[0030] 将Tada1TF、Tada1TR与pcDNA-DN载体按照1:2:20的比例转染小鼠细胞系NIH/3T3，48小时后，提取细胞基因组DNA，使用引物对Tada1F、Tada1R(其序列如SEQ ID NO.13-14所示)进行PCR扩增，对获得的157bp的PCR产物进行克隆测序。共挑取20个单克隆菌落测序，其中有5个单克隆的序列发生改变(如附图2所示)。该结果表明，Tada1TF、Tada1TR与pcDNA-DN载体混合转染对小鼠细胞系NIH/3T3的敲除效率达到25％。
[0031] Tada1F：CGCGTTGATCTTTCGGTTGC,Tada1R：GCGGCTCTTACTGTTTCACG；
[0032] 实施例4本基因组修饰方法在猪细胞系PIEC中的基因修饰效率验证[0033] 猪血管内皮细胞系，购自中国科学院上海细胞库，目录号：GNO15。
[0034] 猪RELA基因的第二外显子序列(其序列如SEQ ID NO.15所示)如下：gccggccccg gcctcgggcc cctatgtgga gatcatcgag cagcccaagc
181 agcggggcat gcgcttccgc tacaagtgcg agggccgctc agccggcagt atcccgggcg
241 agaggagcac ggataccacc aagacccacc ccaccatcaa g
181 agcggggcat gcgcttccgc tacaagtgcg agggccgctc agccggcagt atcccgggcg
241 agaggagcac ggataccacc aagacccacc ccaccatcaa g
[0035] 选取上述序列180-240bp区段作为基因修饰的靶标，针对这一靶标设计合成2条DNA寡核苷酸RELATF和RELATR(其序列如SEQ ID NO.16-17所示)，这两条寡核苷酸分别与上述序列185-207bp区域的反义链、213-233bp区域的正义链互补配对(3'末端最后一个碱基除外)，如下：
[0036] RELATF：GGGCATGCGCTTCCGCTACAAGC，RELATR：GATACTGCCGGCTGAGCGGCCT；
[0037] 将RELATF、RELATR与pcDNA-DN载体按照1:1:10的比例转染猪细胞系PIEC，48小时后，提取细胞基因组DNA，使用引物对RELAF、RELAR(其序列如SEQ ID NO.18-19所示)进行PCR扩增，对获得的316bp的PCR产物进行克隆测序。共挑取20个单克隆菌落测序，其中有6个单克隆的序列发生改变(如附图3所示)。该结果表明，RELAF、RELAR与pcDNA-DN载体混合转染对猪细胞系PIEC的敲除效率达到30％。
[0038] RELAF：TTCCCCTCGGGTAAGTTGGA，RELAR：TGGGGTTTCACCCCTACTGA。
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