使用电穿孔的哺乳动物基因修饰方法
阅读：80发布：2020-05-13
专利汇可以提供使用电穿孔的哺乳动物基因修饰方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且一个目的是开发一种技术，其能够仅仅通过非常简单的操作来利用可广泛应用于 哺乳动物 的技术，该技术不需要利用ES细胞，并且其包括通过靶向基因组上的特定序列来修饰特定基因(基于ZFN等的基因组编辑技术)。提供了有效地修饰哺乳动物的任意靶基因的技术，其包括：将具有完整透明带的原核阶段哺乳动物合子浸入含有一对具有特定序列的mRNA分子的溶液中，和通过在三个步骤中施加多个方波脉冲来执行电穿孔处理，其中在预定范围内调节第一个电脉冲的总 电能 。，下面是使用电穿孔的哺乳动物基因修饰方法专利的具体信息内容。
1.一种哺乳动物基因修饰方法，其包括：
将如在以下项目(A)中定义的合子浸入含有如在以下项目(B)中定义的核酸分子的溶液中；
将如在以下项目(C)中定义的方波电脉冲施加于所述溶液1次或2次或更多次，使得所述方波电脉冲具有从0.2 J/100 μL至7.5 J/100 μL的总电能；
然后施加如在以下项目(D)中定义的方波电脉冲2次或更多次；和
然后施加如在以下项目(E)中定义的方波电脉冲2次或更多次：
(A)具有完整透明带的、除了人以外的哺乳动物的原核阶段合子；
(B) RNA，其起作用从而以序列特异性的方式表现出对基因组DNA的任意区域的内切核酸酶活性；
(C)具有375 V/cm或更高的电压/脉冲的方波电脉冲；
(D)具有250 V/cm或更低的电压/脉冲和从0.01 J/100 μL至3.6 J/100 μL的电能/脉冲的方波电脉冲；和
(E)其极性与如在项目(D)中定义的电脉冲相反且具有250 V/cm或更低的电压/脉冲和从0.01 J/100 μL至3.6 J/100 μL的电能/脉冲的方波电脉冲。
2.根据权利要求1所述的方法，其中如在以下项目(B)中定义的核酸分子包含如在以下项目(b1)中定义的核酸分子和如在以下项目(b2)中定义的核酸分子：
(B) RNA，其起作用从而以序列特异性的方式表现出对基因组DNA的任意区域的内切核酸酶活性；
(b1)编码蛋白的mRNA，所述蛋白具有序列特异性的DNA-结合结构域和当与如在以下项目(b2)中定义的限制性酶活性结构域形成二聚体时表现出限制性酶活性的结构域；和(b2)编码蛋白的mRNA，所述蛋白具有序列特异性的DNA-结合结构域和当与如在项目(b1)中定义的限制性酶活性结构域形成二聚体时表现出限制性酶活性的结构域，所述DNA-结合结构域是如在项目(b1)中定义的蛋白所结合的基因组DNA区域末端附近的区域且结合其互补链。
3.根据权利要求1所述的方法，其中如在以下项目(B)中定义的核酸分子包含如在以下项目(b3)中定义的核酸分子和如在以下项目(b4)中定义的核酸分子：
(B) RNA，其起作用从而以序列特异性的方式表现出对基因组DNA的任意区域的内切核酸酶活性；
(b3)指导RNA，其具有基因组DNA的任意碱基序列的互补序列和特异性地结合如在以下项目(b4)中定义的蛋白的序列；和
(b4)编码蛋白的mRNA，所述蛋白当特异性地结合如在项目(b3)中定义的指导RNA时表现出内切核酸酶活性。
4.根据权利要求1-3中的任一项所述的方法，所述方法还包括，在执行电穿孔以后，将得到的合子在培养基中培养成2-16细胞阶段胚胎，然后将所述胚胎移植进哺乳动物的相同物种或近似物种的雌性的输卵管或子宫中以提供后代。
5.根据权利要求1-4中的任一项所述的方法，其中所述溶液还含有编码外切核酸酶1 (Exo1)的mRNA。
6.根据权利要求1-5中的任一项所述的方法，其中所述哺乳动物包括属于啮齿目的物种。
7.根据权利要求1-6中的任一项所述的方法，其中将如在项目(D)中定义的方波电脉冲的施加执行5次或更多次，和将如在项目(E)中定义的方波电脉冲的施加执行5次或更多次：
(D)具有250 V/cm或更低的电压/脉冲和从0.01 J/100 μL至3.6 J/100 μL的电能/脉冲的方波电脉冲；和
(E)其极性与如在项目(D)中定义的电脉冲相反且具有250 V/cm或更低的电压/脉冲和从0.01 J/100 μL至3.6 J/100 μL的电能/脉冲的方波电脉冲。
8.根据权利要求1-7中的任一项所述的方法，其中所述基因修饰通过基因的破坏而造成功能的缺失或抑制。
9.一种建立遗传修饰的哺乳动物个体的方法，其包括使用根据权利要求1-8中的任一项所述的方法。
使用电穿孔的哺乳动物基因修饰方法
技术领域
[0001] 本发明涉及有效地修饰哺乳动物的任意靶基因的技术，该技术包括：将具有完整透明带的原核阶段哺乳动物合子浸入含有某种RNA分子的溶液中，和通过在三个步骤中施加多个方波脉冲来执行电穿孔处理，其中在预定范围内调节第一个电脉冲的总电能。
背景技术
[0002] 迄今，为了执行哺乳动物的基因修饰已经必须使用ES细胞，且因此除了一些可以利用其ES细胞系的动物（诸如小鼠）以外已经非常难以建立遗传修饰的个体。但是，近年来，已经出现了涉及利用例如锌指核酸酶(ZFN)、TALEN或CRISPR的新基因修饰技术，以使哺乳动物中的基因组编辑通过仅胚胎操作容易地执行，而不使用任何ES细胞(参见，例如，非专利文献1-4)。
[0003] 涉及利用ZFN等的技术是一种突破性技术，其使用基因组上的特定序列作为靶标且通过核酸酶的作用来实现特定基因的破坏或同源重组。另外，该技术使靶序列的基因修饰(基因组编辑)能够容易地执行，即使对于不存在确立的ES细胞系统的任何动物。
[0004] 但是，基于ZFN等的基因组编辑技术的利用需要将核酸转移进合子中的操作。所述核酸转移操作通常通过需要特殊装置(显微操作器)的显微注射方法(显微注射)来执行。也就是说，相关技术方法已经指出了基于ZFN等执行等的基因组编辑技术中的成本问题。
[0005] 另外，需要熟练技术人员来执行显微注射方法，并且已经指出了依赖于实验者的低再现性问题。
[0006] 如上所述，基于ZFN等的基因组编辑技术用于哺乳动物的用途涉及成本和技术问题。因此，需要可以被任何人容易地采用且可以在哺乳动物中高效率地实现基因组编辑的技术。
[0007] 引文列表非专利文献
[NPL 1] Tomoji Mashimo: New Gene Modification Technology“Zinc Finger
Nuclease (ZFN)”: KAGAKU TO SEIBUTSU, Japan Society for Bioscience,
Biotechnology, and Agrochemistry编, 第220-222页(2011)
[NPL 2] Tomoji Mashimo和Tadao Serikawa: Zinc Finger Nuclease (ZFN): Cell Technology第31 (3)卷第296-301页(2012)
[NPL 3] Genome Editing Revolution (监督人: Takashi Yamamoto和Sumihare
Noji): Cell Technology第32 (5)卷(2013)
[NPL 4] Ryan M. Walsh和Konrad Hochedlinger, PNAS, 第110卷, 第39期, 15514-
15515 (2013)。
[NPL 1] Tomoji Mashimo: New Gene Modification Technology“Zinc Finger
Nuclease (ZFN)”: KAGAKU TO SEIBUTSU, Japan Society for Bioscience,
Biotechnology, and Agrochemistry编, 第220-222页(2011)
[NPL 2] Tomoji Mashimo和Tadao Serikawa: Zinc Finger Nuclease (ZFN): Cell Technology第31 (3)卷第296-301页(2012)
[NPL 3] Genome Editing Revolution (监督人: Takashi Yamamoto和Sumihare
Noji): Cell Technology第32 (5)卷(2013)
[NPL 4] Ryan M. Walsh和Konrad Hochedlinger, PNAS, 第110卷, 第39期, 15514-
15515 (2013)。
发明内容
[0008] 技术问题本发明的一个目的是开发一种技术，其能够仅仅通过非常简单的操作来利用可广泛应用于哺乳动物的技术，该技术不需要利用ES细胞，并且其包括通过靶向基因组上的特定序列来修饰特定基因(基于ZFN等的基因组编辑技术)。
[0009] 本发明的另一个目的是以高效率和良好再现性建立遗传修饰的哺乳动物个体，不限于特定哺乳动物物种。
[0010] 问题的解决方案本发明的发明人为了完成上述目的已经进行了广泛研究，并由此已经发现，可以如下有效地修饰充当靶标的期望的哺乳动物基因：将具有完整透明带的原核阶段哺乳动物合子浸入含有某种RNA分子的溶液中；然后执行电穿孔处理，其包括，在使它的总电能落在预定范围内的条件下施加具有高电压的方波电脉冲(第一电脉冲)短时间段，然后施加具有低电压的方波电脉冲(第二电脉冲)长时间段2次或更多次，然后施加具有低电压的、具有与所述第二电脉冲相反的极性的方波电脉冲(第三电脉冲)长时间段2次或更多次(在三个步骤中的多个方波脉冲：参见图1和图2)。
[0011] 具体地，本发明的发明人已经发现，以下技术特征在那些条件下是特别重要的：“使用处于原核阶段的哺乳动物合子作为合子”；“使用处于具有透明带状态的合子作为合子”；“使用具有特定序列的RNA分子作为核酸分子物质”；和“在预定条件内的电脉冲条件下在三个步骤中施加多个方波脉冲作为电穿孔的电条件”。
[0012] 本发明的发明人还已经发现，该技术是可广泛应用于一般哺乳动物的技术，不限于特定哺乳动物物种。
[0013] 应当指出，在相关领域中，没有报道这样的例子：其中通过对'合子'进行'电穿孔'来建立遗传修饰的哺乳动物个体(已经通过基因转移经历基因组编辑的个体)。例如，在Joanna B. Grabarek等人, Genesis 32第269-276页(2002)和Hui Peng等人, PLOS ONE vol. 7 (8) e43748第1-13页(2012)中，报道了其中将DNA或dsRNA转移进合子中的一个例子。但是，那些文献仅仅报道了转移的核酸的'短暂'基因表达。
[0014] 前述内容的一个可能的原因是以下问题：相关技术电穿孔经常使用这样的方法：其涉及从采用“衰减波系统(指数系统)”的输出装置施加电脉冲一次(参见，例如，Shimogawara, K. 等人, Genetics 148第1821-1828页(1998))，因此基因转移效率非常低。
[0015] 另外，在上述的Joanna B. Grabarek等人和Hui Peng等人中，用酸性台氏液（Tyrode's solution）处理以除去合子的透明带（其造成基因转移中的屏障），其目的是提高通过电脉冲处理来转移DNA等的效率。但是，当将除去了它的透明带或使它的透明带变薄的合子移植进假妊娠雌性的输卵管中时，存在这样的问题：合子正常生长成后代的效率显著地下降。也就是说，存在这样的问题：通过执行用于提高基因转移效率的处理，相反地抑制正常生长。
[0016] 另外，作为哺乳动物细胞(培养的细胞等)的电穿孔技术，已经公开了这样的方法：其包括施加两类电脉冲以执行向哺乳动物细胞中的有效基因转移(参见Sukharev S.I. 等人, Biophys. J. 63第1320-1327页(1992))。但是，也在该方法中，没有减轻需要除去或薄化透明带以便实现合子的足够转移效率的问题。
[0017] 已经基于上述发现做出了本发明。
[0018] 也就是说，根据第一方面的发明涉及一种哺乳动物基因修饰方法，其包括：将如在以下项目(A)中定义的合子浸入含有如在以下项目(B)中定义的核酸分子的溶液中；
将如在以下项目(C)中定义的方波电脉冲施加于所述溶液1次或2次或更多次，使得所述方波电脉冲具有从0.2 J/100 μL至7.5 J/100 μL的总电能；
然后施加如在以下项目(D)中定义的方波电脉冲2次或更多次；和
然后施加如在以下项目(E)中定义的方波电脉冲2次或更多次：
(A)具有完整透明带的、除了人以外的哺乳动物的原核阶段合子；
(B)RNA，其起作用从而以序列特异性的方式表现出对基因组DNA的任意区域的内切核酸酶活性；
(C)具有375 V/cm或更高的电压/脉冲的方波电脉冲；
(D)具有250 V/cm或更低的电压/脉冲和从0.01 J/100 μL至3.6 J/100 μL的电能/脉冲的方波电脉冲；和
(E)其极性与如在项目(D)中定义的电脉冲相反且具有250 V/cm或更低的电压/脉冲和从0.01 J/100 μL至3.6 J/100 μL的电能/脉冲的方波电脉冲。
将如在以下项目(C)中定义的方波电脉冲施加于所述溶液1次或2次或更多次，使得所述方波电脉冲具有从0.2 J/100 μL至7.5 J/100 μL的总电能；
然后施加如在以下项目(D)中定义的方波电脉冲2次或更多次；和
然后施加如在以下项目(E)中定义的方波电脉冲2次或更多次：
(A)具有完整透明带的、除了人以外的哺乳动物的原核阶段合子；
(B)RNA，其起作用从而以序列特异性的方式表现出对基因组DNA的任意区域的内切核酸酶活性；
(C)具有375 V/cm或更高的电压/脉冲的方波电脉冲；
(D)具有250 V/cm或更低的电压/脉冲和从0.01 J/100 μL至3.6 J/100 μL的电能/脉冲的方波电脉冲；和
(E)其极性与如在项目(D)中定义的电脉冲相反且具有250 V/cm或更低的电压/脉冲和从0.01 J/100 μL至3.6 J/100 μL的电能/脉冲的方波电脉冲。
[0019] 另外，根据第二方面的发明涉及根据第一方面的方法，其中如在项目(B)中定义的核酸分子包括如在以下项目(b1)中定义的核酸分子和如在以下项目(b2)中定义的核酸分子：(b1)编码蛋白的mRNA，所述蛋白具有序列特异性的DNA-结合结构域和当与如在以下项目(b2)中定义的限制性酶活性结构域形成二聚体时表现出限制性酶活性的结构域；和(b2)编码蛋白的mRNA，所述蛋白具有序列特异性的DNA-结合结构域和当与如在项目(b1)中定义的限制性酶活性结构域形成二聚体时表现出限制性酶活性的结构域，所述DNA-结合结构域是如在项目(b1)中定义的蛋白所结合的基因组DNA区域末端附近的区域且结合其互补链。
[0020] 另外，根据第三方面的发明涉及根据第一方面的方法，其中如在项目(B)中定义的核酸分子包括如在以下项目(b3)中定义的核酸分子和如在以下项目(b4)中定义的核酸分子：(b3)指导RNA，其具有基因组DNA的任意碱基序列的互补序列和特异性地结合如在以下项目(b4)中定义的蛋白的序列；和
(b4)编码蛋白的mRNA，所述蛋白当特异性地结合如在项目(b3)中定义的指导RNA时表现出内切核酸酶活性。
(b4)编码蛋白的mRNA，所述蛋白当特异性地结合如在项目(b3)中定义的指导RNA时表现出内切核酸酶活性。
[0021] 另外，根据第四方面的发明涉及根据第一至第三方面中的任一个的方法，所述方法还包括，在执行电穿孔以后，将得到的合子在培养基中培养成2-16细胞阶段胚胎，然后将所述胚胎移植进哺乳动物的相同物种或近似物种的雌性的输卵管或子宫中以提供后代。
[0022] 另外，根据第五方面的发明涉及根据第一至第四方面中的任一个的方法，其中所述溶液还含有编码外切核酸酶1 (Exo1)的mRNA。
[0023] 另外，根据第六方面的发明涉及根据第一至第五方面中的任一个的方法，其中所述哺乳动物包括属于啮齿目的物种。
[0024] 另外，根据第七方面的发明涉及根据第一至第六方面中的任一个的方法，其中将如在项目(D)中定义的方波电脉冲的施加执行5次或更多次，和将如在项目(E)中定义的方波电脉冲的施加执行5次或更多次。
[0025] 另外，根据第八方面的发明涉及根据第一至第七方面中的任一个的方法，其中所述基因修饰通过基因的破坏而造成功能的缺失或抑制。
[0026] 另外，根据第九方面的发明涉及一种建立遗传修饰的哺乳动物个体的方法，其包括使用第一至第八方面中的任一个的方法。
[0027] 发明的有利效果本发明能够仅仅通过非常简单的操作来利用可广泛应用于哺乳动物的技术，该技术不需要利用ES细胞，并且其包括通过靶向基因组上的特定序列来修饰特定基因(基于ZFN等的基因组编辑技术)。
[0028] 本发明还能够以高效率和良好再现性建立遗传修饰的哺乳动物个体，不限于特定哺乳动物物种。
[0030] 图2的概念图用于解释通过电穿孔处理将mRNA转移进合子中的机制，其包括在三个步骤中施加多个方波脉冲。在图2中，“Pp”代表穿孔脉冲，且“Tp”代表转移脉冲。左图的概念图用于解释，穿孔脉冲在透明带和细胞膜中形成微孔。中图的概念图用于解释，转移脉冲1造成mRNA迁移进合子的细胞质中。右图的概念图用于解释，转移脉冲2 (极性发生变化的脉冲)造成mRNA进一步迁移进合子的细胞质中。
[0031] 图3是在实施例中使用的电脉冲产生装置的拍摄照片图像。图3(A)是玻璃室的照片图像，所述玻璃室具有固定在其上面的培养皿铂板电极。图3(B)是电脉冲产生装置NEPA21 (商标)的主体的照片图像。
[0032] 图4是合子的拍摄照片图像，其已经在测试实施例1中在所述合子中转移进四甲基罗丹明标记的糊精。上行中的照片图像是用显微镜在明视场中拍摄的照片图像。下行中的照片图像是用荧光显微镜拍摄的照片图像。
[0033] 图5是在测试实施例5中通过转移靶向Il2rg基因的ZFN mRNA而建立的敲除大鼠的拍摄照片图像。在左侧显示了Il2rg基因敲除的大鼠。在右侧显示了野生型大鼠(F344/Stm品系)。
[0034] 图6是测试实施例5中的ZFN的概念图，所述ZFN被设计成靶向Il2rg基因的第二个外显子附近的特定区域。
[0035] 图7是测试实施例6中的TALEN的概念图，所述TALEN被设计成靶向Il2rg基因的第二个外显子附近的特定区域。
[0036] 图8是测试实施例7中的CRISPR-Cas9系统的概念图，所述CRISPR-Cas9系统被设计成靶向Thy基因的特定区域。
具体实施方式
[0037] 在下面详细描述本发明的实施方案。
[0038] 本发明涉及有效地修饰哺乳动物的任意靶基因的技术，该技术包括：将具有完整透明带的原核阶段哺乳动物合子浸入含有某种RNA分子的溶液中，和通过在三个步骤中施加多个方波脉冲来执行电穿孔处理，其中在预定范围内调节第一个电脉冲的总电能。
[0039] [要进行基因转移的合子]本发明的基因修饰技术是基本上使用“具有完整透明带的原核阶段哺乳动物合子”的技术。
[0040] 原核阶段要进行基因转移的合子需要处于“原核阶段(原核阶段胚胎的状态)”。本文中使用的术语'原核阶段' 表示这样的合子状态：其中精子的核已经整合进卵的细胞质中，但是卵的核和精子的核的融合尚未发生。通过显微术可以确定合子是否处于原核阶段。
[0041] 收集原核阶段合子的方法例如如下所述。当允许经受超数排卵处理的雌性个体与相同物种的雄性个体彼此交配时，可以在交配后的天收集原核阶段合子。可选地，也可以通过将没有执行交配就收集的未受精卵进行精子卵浆内注射来人工得到原核阶段合子。
[0042] 在本发明中，通过执行向原核阶段的合子中的基因转移，可以得到这样的动物：其中个体的所有细胞已经以均匀方式进行了遗传修饰。
[0043] 相反，在对已经经过原核阶段的合子进行基因转移的情况下，产生嵌合个体（其中存在进行了基因转移的细胞和没有进行基因转移的细胞）的可能性显著增加，因此这样的情况不是优选的。另外，在对未受精卵进行基因转移的情况下，正常发育变得难以发生，这不是优选的。
[0044] 透明带要进行基因转移的合子需要处于“具有透明带的状态”。本文中使用的术语'透明带' 表示糖蛋白的基质结构（matrix structure），其充当用于覆盖和保护哺乳动物的卵母细胞或合子的外层。
[0045] 在胎盘哺乳动物的早期发育中，受精后的早期胚胎需要在被这样的结构物理上保护的同时生长成胚泡。在这点上，将透明带视作在哺乳动物的早期胚胎的正常生长中起重要作用的结构。
[0046] 应当指出，生长成胚泡以后的胚胎会经历透明带破裂的孵化过程和植入子宫壁中以形成胎盘。
[0047] 本发明的基因修饰技术是基本上包括对具有完整透明带(在基因转移中造成屏障的结构)的合子直接执行电穿孔的技术。另外，在该技术中，由于透明带的保护功能，可以将基因转移以后的合子移植进雌性的输卵管中并正常地生长成后代。
[0048] 本文中使用的术语“具有完整透明带的合子”表示处于被透明带覆盖的状态(有时称作具有透明带的状态)的合子。关于透明带的状态，期望的是，将收集的合子(或未受精卵)原样保存在液体培养基等中。
[0049] 另外，即使当对收集的合子进行卵丘细胞除去处理(诸如透明质酸酶处理)时，透明带的除去或薄化不会发生，并且它对早期胚胎的保护功能不受影响。因此，在本发明中，还可以适当地使用进行了卵丘细胞除去处理的合子。
[0050] 相反，在通过执行酸性台氏液处理等而'已经除去或薄化它的透明带的合子'的情况下，即使当将合子移植进雌性的输卵管中时，合子显著地难以正常地生长成后代。因此，从本发明的范围中排除包括使用'已经除去或薄化它的透明带的合子'的模式。
[0051] 应当指出，相关技术电穿孔方法基本上要求用于除去或薄化透明带的处理(用于除去基因转移中的屏障的处理)，且因此固有地涉及一个问题：即显著地难以得到正常生长的后代。本发明被视作提供了解决该问题的有效手段的发明。
[0052] 哺乳动物在哺乳动物的早期发育（具体地，早期发育成桑椹胚）中，发育基于所有哺乳动物物种共有的结构和控制机制而进行。因此，根据本发明的基因修饰技术被视作原则上可以用于所有哺乳动物物种的技术。但是，从伦理观点看，本发明的技术不应当应用于人（智人）合子。
[0053] 本文中使用的术语'哺乳动物' （哺乳纲）表示已经与爬行动物群分叉且表现出通过用从乳房中的乳腺分泌的体液（乳汁）进行母乳养育来培育后代的行为模式的单源动物群。许多物种具有被从角质层衍生出的体毛覆盖的身体表面。现存的物种包括单孔类动物、有袋动物和胎盘动物，并且绝大部分的现存物种属于胎盘动物。
[0054] 本文中使用的术语'单孔类动物（' 原兽亚纲动物）表示表现出卵生生殖模式的哺乳动物群。该群被认为是在三叠纪晚期出现的单源分类群。在该分类群中，单孔目（包括鸭嘴兽）是唯一的现存目。
[0055] 另外，术语'有袋动物' （后兽亚纲动物）表示具有不完全胎盘且表现出在袋中培养后代的行为模式的群。该群被视作在白垩纪晚期出现的单源分类群。该分类群的例子可以包括负鼠目（Didelphimorphia）、微兽目（Microbiotheria）、袋鼬目（Dasyuromorphia）、袋狸目（Peramelemorphia）、袋鼹目（Notoryctemorphia）和双门齿目（Diprotodontia）（包括袋鼠、沙袋鼠和考拉）。
[0056] 另外，术语'胎盘动物' （真兽亚纲动物）表示表现出通过在母体的子宫中形成胎盘通过分娩来产生后代的繁殖模式的群。该群被视作在白垩纪晚期出现的单源动物群。该分类群的例子可以包括象鼩目（Macroscelidea）（包括象鼩）、马岛猬亚目（Tenrecomorpha）（包括无尾猬和金色鼹鼠）、管齿目（Tubulidentata）（包括土豚）、蹄兔目（Hyracoidea）（包括蹄兔）、长鼻目（Proboscidea）（包括象）、海牛目（Sirenia）（包括儒艮）、有带下目（Cingulata）（包括犰狳）、披毛目（Pilosa）（包括树獭和食蚁兽）、攀缘目（Scandentia）（包括树鼩）、皮翼目（Dermoptera）（包括飞狐猴）、灵长目（Primates）（包括狐猴、猴、灌丛婴猴、大猩猩和黑猩猩）、兔形目（Lagomorpha）（包括兔和鼠兔）、啮齿目（Rodentia）（包括小鼠、大鼠、松鼠、豪猪和河狸鼠）、猬形目（Erinaceomorpha）（包括刺猬）、鼩形目（Soricomorpha）（包括鼹鼠）、鲸目（Cetacea）（包括鲸和海豚）、偶蹄目（Artiodactyla）（包括骆驼、野猪、长颈鹿、鹿、牛、山羊和河马）、鳞甲目（Pholidota）（包括穿山甲）、食肉目（Carnivora）（包括猫、老虎、狮子、狗、狼、鼬鼠、貉、狐、熊和海豹）、奇蹄目（Perissodactyla）（包括马、犀牛和貘）和翼手目（Chiroptera）（包括蝙蝠）。
[0057] 本发明的技术是可应用于上述哺乳动物中的任何物种的技术，只要可以得到所述物种的原核阶段合子并且可以通过移植进雌性的子宫中来培育所述物种。
[0058] 例如，本发明的技术是可应用于任何物种的技术，只要已经为该物种建立了能够通过移植将早期胚胎植入雌性的输卵管或子宫中通过妊娠来提供后代的技术。另外，即使当通过胚胎操作不可得到物种的后代时，如果近似物种的雌性可以通过向其中移植来受精，本发明的技术就可应用于该物种。
[0059] 预期该技术是一种有用的技术，特别对于：实验动物，诸如小鼠、大鼠和猴；家养动物，诸如猪、牛、马、狗和猫；和濒临灭绝的野生动物，诸如象、老虎和鲸。具体地，以阐明人疾病的方式，预期该技术是可用于啮齿目和灵长目的动物的技术。
[0060] [要转移的核酸分子]本发明的技术是基本上包括将预定核酸分子转移进合子中的技术。本文中使用的术语'预定核酸分子' 表示“RNA分子，其起作用从而以序列特异性的方式表现出对任意基因组DNA区域的内切核酸酶活性”。另外，术语'任意基因组DNA区域' 表示跨整个基因组的区域，所述基因组包括充当转录因子的靶标的调节区(在广义上被包括在基因中的区域)、间隔区等以及基因中的外显子和内含子。
[0061] 编码ZFN等的mRNA对RNA分子的一个具体例子可以是如在以下项目(1)和(2)中定义的形成一对的两类
mRNA。
mRNA。
[0062] 在该情况下，两类mRNA之一特别地表示(1)“编码蛋白的mRNA，所述蛋白具有序列特异性的DNA-结合结构域和当与如在以下项目(2)中定义的限制性酶活性结构域形成二聚体时表现出限制性酶活性的结构域”。
[0063] 另外，所述对的其它mRNA特别地表示(2)“编码蛋白的mRNA，所述蛋白具有序列特异性的DNA-结合结构域和当与如在项目(1)中定义的限制性酶活性结构域形成二聚体时表现出限制性酶活性的结构域，所述DNA-结合结构域是如在项目(1)中定义的蛋白所结合的基因组DNA区域末端附近的区域且结合其互补链”。
[0064] 由mRNA编码的蛋白是切割充当靶标的任意DNA区域的人工蛋白。所述人工蛋白各自是具有“序列特异性的DNA-结合结构域”和“限制性酶活性结构域”的蛋白，所述两个结构域'直接地'或'通过充当衔接子的区域的介导'彼此结合。
[0065] 本文中使用的术语'序列特异性的DNA-结合结构域' 表示特异性地结合充当靶标的任意DNA序列的蛋白区域。
[0066] 序列特异性的DNA-结合结构域的具体例子可以包括锌指蛋白(ZFP)和转录活化物-样效应物(TALE)。
[0067] ZFP各自是这样的结构域：其具有通过聚合多个识别特定三碱基序列的锌指单元得到的结构，且其识别和结合3的倍数个DNA序列。含有任何ZFP的人工蛋白被称作锌指核酸酶(ZFN) (参见图6)。
[0068] 另外，TALE各自是通过聚合四类单元得到的结构域，其中的每一类识别和结合四类碱基(A、T、G和C)中的任一个。含有任何TALE的人工蛋白被称作转录活化物-样效应物核酸酶(TALEN) (参见图7)。
[0069] 那些DNA-结合结构域使得能够设计这样的DNA-结合结构域：其能够基于肽单元的组合以序列特异性的方式结合任意碱基序列。具体地，可以适当地使用TALE，因为容易设计用于mRNA制备的表达质粒。
[0070] 所述DNA-结合结构域识别和结合的碱基序列的长度可以是，例如，约8 bp至约50 bp，优选地10 bp至45 bp，更优选地13 bp至40 bp，更优选地14 bp至30 bp，特别优选地15 bp至25 bp，甚至更优选地15 bp至21 bp。其中识别序列的长度非常短的情况是不期望的，因为降低序列特异性以增加错配结合。其中识别序列的长度非常长的情况不是优选的，因为增加编码肽的mRNA的分子量以降低转移效率。
[0071] 应当指出，在该技术中，需要设计项目(1)和(2)的DNA-结合结构域从而结合至在二者之间插入限制性酶活性单位的识别序列的位点和结合至这样的位点：项目(1)和(2)的限制性酶活性结构域可以形成二聚体。
[0072] 另外，在该技术中，“如在项目(2)中定义的序列特异性的DNA-结合结构域”需要是如在项目(1)中定义的蛋白所结合的DNA区域末端附近的区域且结合其互补链。
[0073] 本文中使用的术语'附近'是指这样的位点，当项目(1)和(2)的蛋白结合DNA时，它们的具有限制性酶活性的结构域隔开特定距离从而能够形成二聚体。这样的位点理想地是例如此类位点：项目(1)和(2)的蛋白所结合的DNA区域的末端彼此被隔开约4 bp至约50 bp的特定距离。
[0074] “限制性酶活性结构域”在该技术中表示这样的区域：仅当如在项目(1)和(2)中定义的限制性酶活性结构域彼此形成二聚体时，所述区域表现出限制性酶活性。也就是说，限制性酶活性结构域各自单独不会表现出活性，但是仅当形成二聚体时表现出序列特异性的内切核酸酶活性。
[0075] 所述结构域优选地表现出II型限制性酶活性。具体地，适当地使用FokI、FokI突变体等。应当指出，FokI突变体表示具有以下氨基酸序列的蛋白：所述氨基酸序列具有在FokI的氨基酸序列中的置换、缺失、插入和/或添加(添加至末端)。具体地，FokI突变体表示具有特定氨基酸序列的蛋白：所述氨基酸序列与FokI的氨基酸序列具有90%或更多、优选地95%或更多、更优选地98%或更多、更优选地99%或更多的同源性，所述蛋白具有与FokI的功能等同或更高的功能。
[0076] 在普通情况下，mRNA的长度是0.3 kb或更多，优选地0.5 kb或更多，更优选地0.8 kb或更多，更优选地1 kb或更多。另外，mRNA是非常长且具有高分子量的情况不是合适的，因为向合子中转移的效率下降。期望的是，所述长度是，例如，5 kb或更小，优选地4 kb或更小，更优选地3 kb或更小。
[0077] 转移进合子中的每个mRNA被细胞的蛋白合成系统翻译以合成人工蛋白。在合子中产生的如在项目(1)中定义的人工蛋白和如在项目(2)中定义的人工蛋白会在特定位点处结合基因组DNA以切割所述DNA，所述特定位点在二者之间插入位于靶区域中的切割位点。
[0078] 应当指出，在本发明的技术中，当使用DNA (具体地，质粒DNA)作为核酸分子时，不可得到期望的遗传修饰的个体。例如，如在后面将要描述的测试实施例中质粒DNA的转移的一个实施例所证实的，不可建立正常地生长的遗传修饰的个体。其一个可能的原因是，合子的转录系统难以充分起作用，并且难以充分地生产是翻译产物的人工蛋白。
[0079] 用于CRISPR-Cas9系统的RNA要在本发明的技术中转移的RNA的另一个例子可以是如在以下项目(3)中定义的指导RNA和如在以下项目(4)中定义的mRNA，它们构成CRISPR-Cas9系统。
[0080] 应当指出，本文中使用的术语'CRISPR' 是规律成簇间隔短回文重复序列（clustered regularly interspaced short palindromic repeats）的首字母简略词，且表示在原核生物中作为针对噬菌体或质粒的获得性免疫机制而起作用的DNA区域。
[0081] 构成CRISPR-Cas9系统的指导RNA特别地表示(3)“指导RNA，其具有基因组DNA的任意碱基序列的互补序列和特异性地结合如在以下项目(4)中定义的蛋白的序列”。
[0082] 指导RNA是这样的RNA分子：其具有在任意基因组DNA区域中设计的任意碱基序列的'互补序列'。指导RNA适当地具有由互补序列构成的它的5’侧(优选地5’末端)。通过互补序列与靶基因组序列的杂交，指导RNA可以以序列特异性的方式结合基因组DNA。
[0083] 在这方面，互补序列与其杂交的'任意碱基序列'适当地是在PAM序列(Cas9的识别序列)的上游紧邻处的碱基序列。特别合适的是，'任意碱基序列'的3’末端和PAM序列的5’末端彼此邻近。另外，为了避免错配结合，重要的是，考虑到类似序列在基因组DNA中的缺失来设计序列。
[0084] 另外，期望的是，任意碱基序列的长度是15 bp至40 bp，优选地15 bp至30 bp，更优选地15 bp至25 bp，还更优选地18 bp至22 bp，特别优选约20 bp。其中所述序列非常短的情况不是合适的，因为错配结合易于发生。
[0085] 另外，指导RNA在互补序列的3’侧上含有特异性地结合如在项目(3)中定义的蛋白的序列。据推测，依靠特定RNA序列和特定RNA三维结构来实现特异性结合。
[0086] 在指导RNA的3’侧上的特定RNA序列的一个例子可以是构成CRISPR的crRNA:tracrRNA或其类似序列中的上述互补序列的3’侧的RNA序列(参见SEQ ID NO: 8)。
[0087] 在本文中，crRNA:tracrRNA的类似序列表示具有特定碱基序列的RNA序列，所述碱基序列具有在SEQ ID NO: 8的碱基序列中的置换、缺失、插入和/或添加(向末端的添加)。具体地，所述类似序列表示含有特定碱基序列的RNA序列，所述碱基序列与SEQ ID NO: 8的碱基序列具有80%或更多、优选地85%或更多、更优选地90%或更多、还更优选地95%或更多、特别优选地98%或更多、甚至更优选地99%或更多的同一性，所述RNA序列具有与SEQ ID NO:
8的crRNA:tracrRNA的功能等同或更高的功能。
8的crRNA:tracrRNA的功能等同或更高的功能。
[0088] 构成CRISPR-Cas9系统的mRNA特别地表示(4)“编码蛋白的mRNA，所述蛋白当特异性地结合如在项目(3)中定义的指导RNA时表现出内切核酸酶活性”。
[0089] 由所述mRNA编码的蛋白是特异性地结合指导RNA以切割任意靶DNA序列的蛋白。所述蛋白的一个具体例子可以是Cas9核酸酶或其类似蛋白。
[0090] Cas9核酸酶是这样的蛋白：其识别被称作原隔离物邻近基序（proto-spacer adjacent motif）(PAM)的特定碱基序列且表现出切割在其上游的靶序列中的DNA的活性(内切核酸酶活性) (参见图8)。应当指出，PAM序列可以随Cas9核酸酶的来源细菌的种类而变化。例如，在从酿脓链球菌（Streptococcus pyogenes）衍生出的Cas9核酸酶(SpCas9)的情况下，识别PAM序列“NGG”。另外，在从嗜热链球菌（S. thermophiles）衍生出的Cas9核酸酶(StCas9)的情况下，识别PAM序列“NNAGAAW”。另外，还报道了识别PAM序列“NNNNGATT”的Cas9的种类。
[0091] 另外，Cas9核酸酶的类似蛋白表示具有特定氨基酸序列的蛋白，所述氨基酸序列具有在SpCas9(从酿脓链球菌衍生出的Cas9核酸酶)或StCas9 (从嗜热链球菌衍生出的Cas9核酸酶)的氨基酸序列中的置换、缺失、插入和/或添加(添加至末端)。具体地，Cas9核酸酶的类似蛋白表示含有特定氨基酸序列的蛋白，所述氨基酸序列与SpCas9或StCas9的氨基酸序列具有80%或更多、优选地85%或更多、更优选地90%或更多、更优选地95%或更多、特别优选地98%或更多、甚至更优选地99%或更多的同源性，所述蛋白具有与SpCas9或StCas9的功能等同或更高的功能。所述类似蛋白也包括人工生产的Cas9突变蛋白。
[0092] 转移进合子中的如在项目(4)中定义的mRNA被细胞的蛋白合成系统翻译以合成由所述mRNA编码的蛋白。如在项目(4)中定义的蛋白结合如在项目(3)中定义的结合充当靶标的基因组DNA序列的指导RNA，并且表现出在PAM序列的上游靶序列中切割DNA的活性(参见图8)。
[0093] 应当指出，在本发明的技术中，当使用DNA (具体地，质粒DNA)作为核酸分子时，不可得到期望的遗传修饰的个体。其一个可能的原因是，合子的转录系统难以充分起作用，并且难以充分地生产是翻译产物的人工蛋白。
[0094] 外切核酸酶1 (Exo1)在该技术中，期望的是，将“编码外切核酸酶1 (Exo1)的mRNA”与上述RNA分子分开地共转移。通过Exo1 mRNA的共转移，可以显著地改善靶基因的重组效率。
[0095] [电穿孔处理]本发明的技术是基本上包括以下内容的技术：将合子浸入含有核酸分子的溶液中；和对所述合子进行处理，所述处理包括在三个步骤中施加满足预定电脉冲条件的多个方波脉冲(电穿孔处理)。
[0096] 装置为了执行电穿孔处理，可以使用任何装置，只要所述装置可以在三个步骤中输出满足将在后面描述的预定电脉冲条件的多个方波脉冲。
[0097] 例如，可以适当地使用得自Nepa Gene Co., Ltd.的电脉冲输出装置“NEPA21 (商标)”。该装置具有测量每次处理的电阻抗值和电流值的功能，因此可以详细地设定电条件。所述装置还具有当施加多个电脉冲时转换每个电脉冲的电极性的功能。
[0098] 应当指出，尽管通过设计使用常规矩形脉冲系统电脉冲输出装置的方式可以执行电穿孔，但是这不是合适的，因为从对所述装置的功能的限制的观点看，不可以确定在电穿孔时的电能。
[0099] 电穿孔缓冲液通过制备在其中已经溶解了核酸分子的溶液和施加电脉冲以给所述溶液供能，执行电穿孔处理。
[0100] 在本文中，可以使用缓冲溶液诸如磷酸盐缓冲盐水(PBS)或合子的一般培养基作为溶液(电穿孔缓冲液)。也就是说，不需要购买或制备任何特殊的电穿孔缓冲液。
[0101] 合适的是，对于每种RNA，要掺入溶液中的核酸分子的浓度是0.5 ng/ μL或更高，优选地1 ng/ μL或更高，更优选地2 ng/ μL或更高，还更优选地5 ng/ μL或更高，特别优选地10 ng/ μL或更高，甚至更优选地20 ng/ μL或更高，还甚至更优选地30 ng/ μL或更高，还甚至更优选地40 ng/ μL或更高。其中核酸浓度非常低的情况不是优选的，因为基因转移效率降低。
[0102] 合适的是，对于每种mRNA，核酸浓度的上限是2,000 ng/ μL或更低，优选地1,500 ng/ μL或更低，更优选地1,000 ng/ μL或更低，还更优选地750 ng/ μL或更低，特别优选地500 ng/ μL或更低，甚至更优选地400 ng/ μL或更低。其中核酸浓度非常高的情况不是优选的，因为合子的存活率降低，从而导致将得到的后代的数目的减少。
[0103] 应当指出，当加入两类RNA时将RNA的浓度比适当地调节至，以摩尔比的形式，1:0.1至1:10，优选地1:0.2至1:8，更优选地1:0.4至1:6，还更优选地1:0.6至1:1.4，特别优选地1:0.8至1:1.2，甚至更优选约1:1。
[0104] 应当指出，所述溶液理想地不含抗生素。这是因为，当抗生素存在于溶液中时，所述抗生素通过电穿孔处理掺入细胞中以降低细胞的存活率。
[0105] 此外，所述溶液理想地也不含血清。这是因为，当血清存在于溶液中时，所述血清在电穿孔处理时抑制核酸分子向细胞中的掺入以降低转移效率。应当指出，允许血清的掺入，只要它的浓度较低(例如，1%或更低，优选地0.5%或更低)。
[0106] 电极使用与电脉冲输出装置连接的电极执行电穿孔处理。原则上可以使用任何种类的电极，且具体地，可以使用培养皿电极、腔室电极、针电极、镊子型电极、比色皿电极等。在那些电极中，具体地，适当地使用培养皿电极、腔室电极等。作为电极，可以使用根据一般标准的电极，和例如，可以使用具有2 mm至50 mm（优选地5 mm至25 mm）的电极间距离(gap)的电极。
[0107] 如下执行电穿孔处理：使电极达到浸入'在其中溶解了核酸分子的溶液'的状态；将合子浸入所述溶液中从而建立静止状态；和施加电脉冲。具体地，期望的是，通过将合子浸入电极的正极和负极之间以建立静止状态和施加电脉冲，执行电穿孔处理。期望的是，将多个合子与连接电极的线平行地静止放置以避免合子的重叠。
[0108] 电脉冲处理将来自电脉冲输出装置的电脉冲输出引导至在电极之间静止放置的合子。
[0109] 应当指出，适当地在室温(例如，约10℃至约35℃)执行电穿孔处理。另外，推荐避免用冰冷却以便防止水微滴附着于电极的金属部件。
[0110] [电脉冲条件]本发明的方法包括通过下述三个步骤使用多个方波脉冲执行电穿孔：在预定条件下向含有核酸分子的溶液（合子静止放置在其中）施加具有高电压的方波电脉冲(第一电脉冲)短时间段；然后向所述溶液施加具有低电压的方波电脉冲(第二电脉冲)长时间段2次或更多次；和然后向所述溶液施加具有低电压的、具有与所述第二电脉冲相反的极性的方波电脉冲(第三电脉冲)长时间段2次或更多次(参见，例如，图1和图2)。
[0111] 要求本发明中的第一至第三电脉冲中的每一个的'电压'和'电能'落入将在后面描述的特定范围内。
[0112] 本文中使用的电压是这样的值：其代表每单位cm的电极间宽度将要施加的电压V。例如，为了使用5 mm间隙电极施加300 V/cm的电压，要施加的电压是150 V。另外，本文中使用的电能(W)是这样的值：其代表每100 μL溶液要施加的电能(能量的量)。例如，当将150 V的电压(V)施加于100 μL具有50Ω的阻抗值的溶液5毫秒的时间(T)（以脉冲长度的方式）时，产生3 A的电流(I)。在该情况下，每100 μL溶液要施加的电能(W=VIT)是2.25 J。
[0113] 另外，需要施加'方波' 电脉冲作为本发明的电脉冲。对于'衰减波' 电脉冲，不可实现要在本发明中达到的高基因转移效率。
[0114] 第一电脉冲：穿孔脉冲(Pp)本发明的电穿孔处理是基本上包括在预定条件下施加具有高电压的方波电脉冲(第一电脉冲: 穿孔脉冲)短时间段的技术。通过施加第一电脉冲，可以以小损伤程度在透明带中形成小孔。
[0115] 应当指出，在动物细胞的一般电穿孔方法(常规方法)中，尽管发现增加第一电脉冲的电压允许将核酸分子(例如，DNA)转移进细胞中，但是通过仅仅增加电压对于合子而言不可达到实用水平的基因转移。这可能是因为，当对透明带的损伤较严重时，进行电穿孔处理的合子的存活率显著下降，并且早期胚胎的正常生长显著受到抑制。
[0116] 在第一电脉冲中，必须施加至少375 V/cm或更高(在5 mm间隙电极的情况下，187.5 V或更高)的电压。期望的是，施加以下电压：优选地400 V/cm或更高，更优选地450 V/cm或更高，还更优选地500 V/cm或更高。其中电压非常低的情况不是优选的，因为不可在透明带中形成小孔。
[0117] 应当指出，可以施加第一电脉冲，而对它的电压值的上限没有任何特定限制，只要满足将在后面描述的总电能的条件即可。这是因为，对透明带的损伤程度主要依赖于'总电能(能量的量)'的值。应当指出，如果以任何方式给出的话，上限值可以是，例如，4,500 V/cm或更低，优选地3,750 V/cm或更低，更优选地2,500 V/cm或更低，还更优选地1,500 V/cm或更低。
[0118] 总电能的条件对应于当在透明带中形成适合于掺入核酸的小孔时抑制对透明带和细胞膜的损伤的条件。
[0119] 第一电脉冲的'总电能'落入预定范围内是重要的。在该背景下，所述总电能是这样的值：其表现出各自具有上述电压值或更高值的电脉冲的电能的总值。例如，当施加750 V/cm或更高的电脉冲2次时，2次电脉冲的电能的总值被定义为总电能的值。
[0120] 总电能必须是0.2 J/100 μL或更高。当总电能非常低时，不可达到足够的基因转移效率。总电能的下限可以是，例如，优选地0.286 J/100 μL或更高，更优选地0.3 J/100 μL或更高，还更优选地0.4 J/100 μL或更高，特别优选地0.5 J/100 μL或更高，甚至更优选地0.535 J/100 μL或更高，还甚至更优选地0.558 J/100 μL或更高。
[0121] 另外，总电能的上限是7.5 J/100 μL或更低是重要的。其中总电能非常高的情况不是优选的，因为对透明带或细胞膜的损伤增加，从而导致存活率的下降。总电能的上限可以是，例如，优选地7.317 J/100 μL或更低，更优选地7.3 J/100 μL或更低，更优选地7 J/100 μL或更低，特别优选地6.5 J/100 μL或更低，甚至更优选地6 J/100 μL或更低，还甚至更优选地5.5 J/100 μL或更低，还甚至更优选地5 J/100 μL或更低，更特别优选地4.5 J/
100 μL或更低，进一步更优选地4.3 J/100 μL或更低，还进一步更优选地4.255 J/100 μL或更低。
100 μL或更低，进一步更优选地4.3 J/100 μL或更低，还进一步更优选地4.255 J/100 μL或更低。
[0122] 总电能的条件对应于当在透明带中形成适合于掺入核酸的小孔时抑制对透明带和细胞膜的损伤的条件。
[0123] 应当指出，可以施加第一电脉冲，而对它的施加次数没有任何特定限制，只要总电能落在上述范围内即可。例如，可以在上述电能范围内施加电脉冲一次，或者可以通过分解电能来施加电脉冲2次或更多次。具体地，所述次数可以是例如2-20次。对于用分解电能施加电脉冲多次，预见到稍微减小对透明带的损伤程度的作用。所述次数可以是，例如，优选地3次或更多次，更优选地4次或更多次。所述次数的上限没有特别限制，但是可以是，例如，优选地15次或更少，更优选地10次或更少，还更优选地5次或更少。
[0124] 应当指出，在施加脉冲多次的情况下，脉冲之间的间隔可以是，例如，200毫秒或更短，优选地100毫秒或更短，更优选地75毫秒或更短，还更优选地50毫秒或更短。
[0125] 另外，在本发明中，第一电脉冲的脉冲长度和衰减率是用于确定电能的因素，但是没有显示出与基因转移效率和存活率的直接关联。
[0126] 第二电脉冲: 转移脉冲1 (Tp1)本发明的电穿孔处理是这样的技术：其基本上包括，在施加第一电脉冲以后(第一电脉冲的最后一次输出以后)，在预定条件下施加具有低电压的方波电脉冲(第二电脉冲: 转移脉冲1)长时间段。这是因为，借助于第二电脉冲，核酸分子穿过小孔(由第一电脉冲在透明带中形成的孔)有效地掺入细胞中。应当指出，所述第二电脉冲是具有低能量的量的低电能脉冲，且因此不具有造成合子损伤的风险。
[0127] 应当指出，第二电脉冲的电极性可以是与第一电脉冲的电极性相同的电极性(电极的方向相同)，或者可以是与第一电脉冲的电极性相反的极性(电极的方向相反)，但是期望的是，所述电脉冲优选地具有相同的极性。
[0128] 在第二电脉冲中，必须在250 V/cm或更低(在5 mm间隙电极的情况下，125 V或更低)的条件下施加电压。期望的是，施加以下电压：优选地240 V/cm或更低，更优选地225 V/cm或更低，更优选地200 V/cm或更低，特别优选地175 V/cm或更低，甚至更优选地150 V/cm或更低，还甚至更优选地125 V/cm或更低。其中电压非常高的情况不是合适的，因为对透明带的损伤增加，从而导致存活率的下降。
[0129] 应当指出，可以施加第二电脉冲，对其电压值的下限没有任何特定限制，只要满足将在后面描述的关于它的电能/脉冲的条件，但是如果以任何方式给出的话，下限值可以是，例如，15 V/cm或更高，优选地20 V/cm或更高，更优选地25 V/cm或更高，还更优选地30 V/cm或更高，特别优选地35 V/cm或更高。
[0130] 第二电脉冲的'电能/脉冲'必须落入预定范围内。电能必须是0.01 J/100 μL或更高。当电能非常低时，不可达到足够的基因转移效率。电能的下限可以是，例如，优选地0.012 J/100 μL或更高，更优选地0.02 J/100 μL或更高，还更优选地0.03 J/100 μL或更高，特别优选地0.034 J/100 μL或更高，甚至更优选地0.04 J/100 μL或更高，甚至更优选地0.05 J/100 μL或更高，甚至更优选地0.06 J/100 μL或更高，更特别优选地0.07 J/100 μL或更高，进一步更优选地0.08 J/100 μL或更高，还进一步更优选地0.1 J/100 μL或更高。
[0131] 另外，总电能的上限必须是3.6 J/100 μL或更低。其中电能非常高的情况不是优选的，因为对透明带的损伤增加，从而导致存活率的下降。电能的上限可以是，例如，优选地3.571 J/100 μL或更低，更优选地3 J/100 μL或更低，还更优选地2.5 J/100 μL或更低，特别优选地2.286 J/100 μL或更低，甚至更优选地2 J/100 μL或更低，还甚至更优选地1.75 J/100 μL或更低，甚至更优选地1.5 J/100 μL或更低，更特别优选地1.25 J/100 μL或更低，进一步更优选地1 J/100 μL或更低，还进一步更优选地0.8 J/100 μL或更低，还进一步更优选地0.7 J/100 μL或更低，还更特别优选地0.679 J/100 μL或更低，甚至还进一步更优选地0.6 J/100 μL或更低，还更特别优选地0.556 J/100 μL或更低。
[0132] 在本发明的技术中，要求将第二电脉冲施加2次或更多次。合适的是，所述次数优选地是3次或更多次，更优选地4次或更多次，还更优选地5次或更多次，特别优选地6次或更多次，甚至更优选地7次或更多次，还甚至更优选地8次或更多次，还甚至更优选地9次或更多次，更特别优选地10次或更多次。增加第二电脉冲的次数允许多次穿过小孔掺入核酸分子，且因此可以提高转移效率。
[0133] 所述次数的上限没有特别限制，可以是，例如，30次或更少，优选地25次或更少，更优选地20次或更少。即使当任意进一步增加次数时，可以预见到不会极大地改善效率。
[0134] 应当指出，在多次施加脉冲的情况下在脉冲之间的任何间隔可以是，例如，200毫秒或更短，优选地100毫秒或更短，更优选地75毫秒或更短，更优选地50毫秒或更短。
[0135] 另外，在本发明中，第二电脉冲的脉冲长度和衰减率是用于确定电能的因素，但是没有显示出与基因转移效率和存活率的直接关联。
[0136] 第三电脉冲: 转移脉冲2 (Tp2)本发明的电穿孔处理是这样的技术：其基本上包括，在施加第二电脉冲以后(第二电脉冲的最后一次输出以后)，在预定条件下施加具有低电压的、具有与第二电脉冲相反的电极性(电极的方向相反)的方波电脉冲(第三电脉冲: 转移脉冲2)长时间段。
[0137] 借助于第三电脉冲，即使在用第二电脉冲完成核酸分子向细胞中的掺入以后，可以进一步掺入核酸分子。也就是说，可以显著地改善转移效率。应当指出，与第二电脉冲一样，第三电脉冲也是具有低能量的量的低电能脉冲，且因此是不具有造成合子损伤风险的电脉冲。
[0138] 除了电极性相反以外，第三电脉冲是在与第二电脉冲相同条件下施加的电脉冲。也就是说，作为第三电脉冲的各种电条件，可以采用与上面关于第二电脉冲描述的条件相同的条件。
[0139] 具有不同性能的电脉冲之间的脉冲间隔Pp、Tp1和Tp2是具有不同于彼此的电脉冲性能的电脉冲，但是可以采用一般脉冲间隔作为脉冲之间的间隔。所述间隔没有特别限制，但是可以是，例如，200毫秒或更短，优选地
100毫秒或更短，更优选地75毫秒或更短，还更优选地50毫秒或更短。
100毫秒或更短，更优选地75毫秒或更短，还更优选地50毫秒或更短。
[0140] [合子的移植]将经过电穿孔处理的合子人工培养成早期胚胎，然后移植进雌性的子宫(输卵管或子宫)，由此能够在雌性的子宫中生长。在该情况下，优选的是，将早期胚胎培养成2-16细胞阶段胚胎，优选地2-8细胞阶段胚胎，更优选地2-4细胞阶段胚胎，还更优选地2细胞阶段胚胎。
其中培养物的发育过分进行的情况不是优选的，因为将生长成正常后代的个体的数目减小。
其中培养物的发育过分进行的情况不是优选的，因为将生长成正常后代的个体的数目减小。
[0141] 作为充当亲本（其为移植受体）的雌性，可以使用已经从其收集合子的个体(供体)本身，但是适当地使用与供体相同的物种的另一个雌性个体。应当指出，在啮齿动物的情况下，可以需要执行假孕处理(使用切除输精管的雄性的交配处理)。
[0142] 另外，即使对于没有为其建立基于胚胎移植的妊娠技术的物种，如果可以使近似物种的雌性受精，由此可以得到后代。
[0143] 应当指出，其中在移植之前除去合子的透明带的情况不是优选的，因为后代的出生率显著下降。
[0144] 妊娠以后，通过使雌性经历自发分娩(在单孔类动物的情况下，产卵)，可以得到正常生长的后代。如此得到的后代以高概率包括这样的个体：其中在上述基因组DNA上的目标基因已经被修饰。也就是说，可以有效地得到遗传修饰的哺乳动物个体。
[0145] [遗传修饰的个体]通过该技术得到的后代是这样的个体：其中仅基因组DNA中的任意区域已经被修饰。也就是说，可以得到其中任意靶基因(或任意间隔区)已经被修饰的个体。
[0146] 可以如下简单地确定后代是否是遗传修饰的个体(或其中间隔区已经被修饰的个体)：从血液提取基因组DNA；执行PCR，其包括使用在二者之间插入靶序列的引物；和(i)通过电泳检查扩增的片段的长度或(ii)通过测序读出序列。
[0147] 在本发明的技术中，通过RNA分子向合子中的转移，通过RNA分子的功能特异性地切割基因组DNA的靶区域中的序列，然后用内源性酶修复切割的位点。在此时，发生缺失突变或插入突变，并且如此得到的后代是其中已经敲除了靶基因的个体。
[0148] 在本发明中，基于这样的原理，可以破坏充当靶标的基因组DNA区域的功能，以提供删除了所述基因的功能的个体或抑制了所述基因的功能的个体。
[0149] 另外，在本发明中，通过利用该技术和同源重组，通过人工地诱导同源重组可以在功能上修饰靶基因。也就是说，可以得到敲入（knockin）个体。
[0150] 在该情况下，在电穿孔处理中，具有“为含有切割位点的靶区域的同源序列且包括期望的突变（诸如碱基置换）的DNA序列”的DNA片段需要与上述RNA分开地共转移。
[0151] 通过这样的处理得到的后代包括具有通过人工同源重组在功能上修饰的靶基因的个体。实施例
[0152] 在下文中通过实施例描述本发明。但是，本发明的范围不限于这些实施例。
[0153] 另外，在下表中，使用指示转移脉冲的极性的“+”符号作为表明具有与穿孔脉冲相同极性的电脉冲的符号。另外，使用“-”符号作为表明施加与穿孔脉冲相反极性的电脉冲的符号。
[0154] 另外，在下表中，以每1 cm的值(V/cm)的方式表达电脉冲的电压值(V)。另外，以每100 μL的值(J/100 μL)的方式表达能量值(J)。
[0155] [测试实施例1 (研究实施例)]“向具有完整透明带的原核阶段合子中的化合物转移的测试”通过执行基于方波三步方法的电穿孔，研究外源化合物是否能够转移进具有完整透明带的原核阶段合子中。
[0156] (1)“合子的收集”以150 IU/kg体重给F344/Stm品系(NBRP-Rat, Kyoto, 日本)的成熟雌性大鼠(8-16周龄)注射孕马血清促性腺激素(PMSG, ASKA Pharmaceutical Co., Ltd.)，并在此后48小时以75 IU/体重注射人绒毛膜促性腺激素(hCG, ASKA Pharmaceutical Co., Ltd.)以诱导超数排卵。
[0157] 允许所述雌性与相同品系的雄性(11-周龄)同居和交配。次日，收集原核阶段合子，并执行透明质酸酶处理以除去卵丘细胞。将收集的合子保存在改进的Krebs-Ringer溶液中。
[0159] (2)“电脉冲处理”在玻璃室上的培养皿铂板电极(CUY520P5, 5 mm间隙，L10×W5×H5 mmm，由Nepa Gene Co., Ltd.制造)之间，注射100 μL含有2 mg/mL的四甲基罗丹明标记的糊精的磷酸盐缓冲盐水(PBS)，并将收集的原核阶段合子在承载磷酸盐缓冲盐水的金属板电极之间静止放置成线(参见图3(A))。在该情况下，在保持收集时的状态的同时使用原核阶段合子，而不进行透明带除去和薄化处理。
[0160] 应当指出，使用的四甲基罗丹明标记的糊精是具有3 kDa的分子量并由Life Technologies Co.制造的荧光物质。
[0161] 向金属板连接能够产生方波电脉冲的电脉冲产生装置(NEPA21 (商标)，由Nepa Gene Co., Ltd.制造)(参见图3(B))，并且基于电穿孔方法执行电脉冲处理，所述电穿孔方法包括通过三个依次施加三类方波电脉冲（即，穿孔脉冲(Pp)、转移脉冲1 (Tp1)和转移脉冲(Tp2)）的步骤使用多个脉冲(参见图1)。将电脉冲的各种条件设定为表1所示的条件。应当指出，在室温条件下执行系列操作以便防止水微滴附着。
[0162] 另一方面，作为对照，在培养皿铂板电极之间，注射100 μL不含四甲基罗丹明标记的糊精的一般磷酸盐缓冲盐水(PBS)，并类似地执行电脉冲处理。
[0163] (3)“用荧光显微镜观察”通过施加在541 nm的激发光（用520 nm至550 nm滤光片）和检测在572 nm的荧光（用
580 nm透射滤光片），用荧光显微镜(Olympus Co., Tokyo, 日本)拍摄电处理以后合子的照片图像。结果显示在图4中。
580 nm透射滤光片），用荧光显微镜(Olympus Co., Tokyo, 日本)拍摄电处理以后合子的照片图像。结果显示在图4中。
[0164] (4)“结果”从结果看出，通过在表1所示的电条件下向具有完整透明带的合子施加具有高电压的电脉冲短时间段，然后在Tp1和Tp2之间改变极性的同时施加具有低电压的电脉冲长时间段，从合子的整个细胞质检测到四甲基罗丹明荧光(测试1-1-1-3)。
[0165] 从结果看出，通过执行基于三步多个方波脉冲方法的电穿孔，外源化合物能够有效地转移进具有完整透明带的原核阶段合子。
[0166] [表1]
[0167] [测试实施例2 (研究实施例)]“穿孔脉冲的条件的研究”在施加方波电脉冲下研究了穿孔脉冲的电条件。应当指出，使用培养的细胞作为样品来替代珍贵的合子，执行电条件的研究。
[0168] (1)“细胞溶液的制备”将Hela细胞(建立的人宫颈癌细胞的细胞系的粘附细胞)培养，并在除去液体培养基以后，用0.02%EDTA-PBS溶液洗涤2次或更多次，并执行胰蛋白酶处理以使处于粘附状态的细胞脱离。证实细胞脱离以后，加入ES液体培养基(不含血清和抗生素，由Nissui
Pharmaceutical Co., Ltd.制造)。执行离心，并抛弃上清液以除去胰蛋白酶。此后，将细胞再悬浮于ES液体培养基中。
Pharmaceutical Co., Ltd.制造)。执行离心，并抛弃上清液以除去胰蛋白酶。此后，将细胞再悬浮于ES液体培养基中。
[0169] 收集50 μL细胞混悬液，并用血球计数器计数细胞的数目。此后，再次执行离心(1,000 rpm, 5 min)，并抛弃剩余的上清液。通过加入ES液体培养基来再悬浮收集的细胞以制备细胞溶液。
[0171] (3)“电脉冲处理”在2 mL Eppendorf试管中，将细胞溶液和DNA溶液在正常温度在没有起泡下彻底混合以制备具有1×107个细胞/mL的最终细胞浓度和100 μg/mL的最终DNA浓度的混悬液。将100 μL溶液装入2 mm间隙比色皿(具有40 μL至400 μL的容量的EC-002S NEPA比色皿电极，Nepa Gene Co., Ltd.)中。
[0172] 将比色皿固定至能够产生方波电脉冲的电脉冲产生装置(NEPA21 (商标), Nepa Gene Co., Ltd.)的比色皿电极腔室(CU500, Nepa Gene Co., Ltd.)，并基于多个脉冲电穿孔方法执行电脉冲处理，所述电穿孔方法包括依次施加两类方波电脉冲，即，穿孔脉冲(Pp)和转移脉冲(Tp)。将电脉冲的各自条件设定至表2所示的条件。应当指出，在室温条件下执行系列操作以便防止水微滴附着。
[0173] (4)“转化效率的评价”在电脉冲处理以后1分钟内，将含有血清和抗生素的MEM培养基注射进比色皿中，并将整个量的细胞液体用注射器收集，加入用含有血清和抗生素的MEM培养基填充的培养板，并在37℃和5%的二氧化碳浓度的条件下培养。
[0174] 另外，作为对照，类似地培养没有进行电脉冲处理的细胞。
[0176] 另外，使用荧光显微镜(激发光：490 nm，检测的荧光：510 nm)计数表达GFP的细胞的数目，并与明视场中计数的数目进行对比以计算转移率。
[0177] 基于存活率和转移率的计算值，评价在每种电脉冲条件下的转化效率。
[0178] (5)“结果”如表2-A的结果所示，表明在调节穿孔脉冲的脉冲长度以调节总能量的量几乎恒定的条件下，当施加在250 V/cm至750 V/cm范围内的穿孔脉冲的电压时，在已经向其施加375 V/cm或更高的电压的样品中转移率表现出高值(测试2A-1-2A-5)。另外，表明存活率的值在这样的电条件范围内也较高。
[0179] 另外，如表2-B的结果所示，表明在调节穿孔脉冲的脉冲长度以调节总能量的量几乎恒定的条件下，当在从500 V/cm至4,500 V/cm的宽范围内施加穿孔脉冲的电压时，在任何样品中电处理以后的细胞的存活率值明显较高(测试2B-1-2B-9)。表明转移率值在这样的电条件范围内也明显较高。应当指出，具体地，表明即使在4,500 V/cm的非常高电压条件下，存活率是令人满意的。
[0180] 那些发现提示，为了通过用方波电脉冲进行基因转移得到存活率和转移效率的高结果，合适的是将穿孔脉冲的电压值的下限设定为375 V/cm或更高。还提示，只要穿孔脉冲的能量的量落入预定范围内，穿孔脉冲的电压值的上限不会特别地影响存活率和转移效率。
[0181] [表2-A]
[0182] [表2-B]
[0183] [测试实施例3 (研究实施例)]“穿孔脉冲的条件的研究”在施加方波电脉冲下研究了穿孔脉冲的电条件。应当指出，使用培养的细胞作为样品来替代珍贵的合子，执行电条件的研究。
[0184] (1)“细胞溶液和DNA溶液的制备”以与在测试实施例2(1)中描述的方法相同的方式制备Hela细胞的悬浮溶液，并用作细胞溶液。另外，以与在测试实施例2(2)中描述的方法相同的方式制备pCMV-EGFP质粒溶液，并用作DNA溶液。
[0185] (2)“电脉冲处理”7
制备细胞/DNA混悬液(Hela细胞: 1×10个细胞/mL, pCMV-EGFP: 100 μg/mL)，并将
100 μL该溶液以与在测试实施例2(3)中描述的方法相同的方式装入2 mm间隙比色皿。
制备细胞/DNA混悬液(Hela细胞: 1×10个细胞/mL, pCMV-EGFP: 100 μg/mL)，并将
100 μL该溶液以与在测试实施例2(3)中描述的方法相同的方式装入2 mm间隙比色皿。
[0186] 在表3所示的电条件下执行每个制备的样品的电脉冲处理。在该处理中使用的设备和基本操作与在测试实施例2(3)中描述的方法相同。
[0187] (3)“转化效率的评价”计算存活率和转移效率，并以与在测试实施例2(4)中描述的方法相同的方式评价转化效率。
[0188] (4)“结果”如表3-A的结果所示，表明在调节穿孔脉冲的电压为恒定的条件下，当施加电脉冲使得穿孔脉冲的总能量的量是0.080 J/100 μL至2.298 J/100 μL时，在已经向其施加电脉冲使得总能量的量为0.286 J/100 μL或更高的样品中转移率的值明显较高(测试3A-3-3A-11)。
表明存活率的值在这样的电条件范围内也较高。另外，具体地，表明在其总能量的量为
0.535 J/100 μL或更高的样品中转移率的值高达70%或更多(测试3A-4-3A-11)。
表明存活率的值在这样的电条件范围内也较高。另外，具体地，表明在其总能量的量为
0.535 J/100 μL或更高的样品中转移率的值高达70%或更多(测试3A-4-3A-11)。
[0189] 应当指出，穿孔脉冲的'每个脉冲'的能量的量和脉冲长度的值与转移率和存活率中的任一个没有关联。
[0190] 另外，如表3-B的结果所示，表明在调节穿孔脉冲的电压为恒定的条件下，当施加电脉冲使得穿孔脉冲的总能量的量是2.5 J/100 μL至7.317 J/100 μL时，存活率的值较高(测试3B-1-3B-3)。表明转移率的值在这样的电条件范围内也明显较高。应当指出，即使当施加具有7.317 J/100 μL的高总能量的量的脉冲时，存活率是令人满意的。
[0191] 那些发现提示，为了通过用方波电脉冲进行基因转移得到存活率和转移效率的高结果，合适的是将穿孔脉冲的'总'能量的量(总能量的量)的下限设定为0.286 J/100 μL或更高，优选地0.535 J/100 μL或更高。还提示，当将其上限设定为7.317 J/100 μL或更低时，存活率和转移率是令人满意的。
[0192] [表3-A]
[0193] [表3-B]
[0194] [测试实施例4 (研究实施例)]“转移脉冲的条件的研究”在施加方波电脉冲下研究了转移脉冲的电条件。应当指出，使用培养的细胞作为样品来替代珍贵的合子，执行电条件的研究。
[0195] (1)“细胞溶液和DNA溶液的制备”以与在测试实施例2(1)中描述的方法相同的方式制备Hela细胞的悬浮溶液，并用作细胞溶液。另外，以与在测试实施例2(2)中描述的方法相同的方式制备pCMV-EGFP质粒溶液，并用作DNA溶液。
[0196] (2)“电脉冲处理”7
制备细胞/DNA混悬液(Hela细胞: 1×10个细胞/mL, pCMV-EGFP: 100 μg/mL)，并将
100 μL该溶液以与在测试实施例2(3)中描述的方法相同的方式装入2 mm间隙比色皿。
制备细胞/DNA混悬液(Hela细胞: 1×10个细胞/mL, pCMV-EGFP: 100 μg/mL)，并将
100 μL该溶液以与在测试实施例2(3)中描述的方法相同的方式装入2 mm间隙比色皿。
[0197] 在表4所示的电条件下执行每个制备的样品的电脉冲处理。在该处理中使用的设备和基本操作与在测试实施例2(3)中描述的方法相同。
[0198] (3)“转化效率的评价”计算存活率和转移效率，并以与在测试实施例2(4)中描述的方法相同的方式评价转化效率。
[0199] (4)“结果”如表4-A的结果所示，在已经向其施加电脉冲使得每个脉冲的转移脉冲能量的量是从
0.012 J/100 μL至0.588 J/100 μL的样品中，存活率的值较高(测试4A-1-4A-4)。表明转移率的值在这样的电条件范围内也较高。另外，具体地，表明在每个脉冲的转移脉冲能量的量为0.07 J/100 μL或更高的样品中存活率的值高达80%或更多(测试4A-3和4A-4)。
0.012 J/100 μL至0.588 J/100 μL的样品中，存活率的值较高(测试4A-1-4A-4)。表明转移率的值在这样的电条件范围内也较高。另外，具体地，表明在每个脉冲的转移脉冲能量的量为0.07 J/100 μL或更高的样品中存活率的值高达80%或更多(测试4A-3和4A-4)。
[0200] 另外，如表4-B的结果所示，表明在已经向其施加电脉冲使得每个脉冲的转移脉冲能量的量是从0.135 J/100 μL至3.571 J/100 μL的样品中存活率的值也较高(测试4B-1-4B-7)。表明在这样的电条件范围内转移率的值也明显较高。另外，具体地，表明在每个脉冲的转移脉冲能量的量为0.679 J/100 μL或更低的样品中存活率的值高达80%或更多(测试
4B-1-4B-4)。
4B-1-4B-4)。
[0201] 应当指出，关于转移脉冲，提示转移脉冲的'总'能量的上限值与存活率没有关联，因为即使当以35.714 J/100 μL的非常高值的总能量的量施加转移脉冲时，存活率是令人满意的。
[0202] 那些发现提示，为了通过用方波电脉冲进行基因转移得到存活率和转移效率的高结果，合适的是将转移脉冲的'每个脉冲'的能量的量的下限设定为0.012 J/100 μL或更高。还提示，当将'每个脉冲'的能量的量的上限设定为3.571 J/100 μL或更低，特别是1.250 J/100 μL或更低、或甚至0.679 J/100 μL或更低时，存活率和转移率是令人满意的。
[0203] [表4-A]
[0204] [表4-B]
[0205] [测试实施例5 (实施例)]“通过ZFN mRNA转移建立重组体的测试”研究了通过执行基于方波三步方法的电穿孔通过将编码ZFN的mRNA转移进具有完整透明带的原核阶段合子中是否能够建立重组体。应当指出，采用在X染色体上存在的Il2rg基因作为靶基因。
[0206] (1)“mRNA的制备”合成了一对靶向大鼠白介素-2受体γ链基因(Il2rg: 免疫缺陷的致病基因)的ZFN质粒(ZFN左和ZFN右) (Sigma Aldrich, St. Louis, Mo, USA)。将这对ZFN设计成结合Il2rg基因的第二个外显子附近的特定序列(ZFN左: SEQ ID NO: 2, ZFN右: SEQ ID NO: 3) (参见图6)。应当指出，ZFN左的结合序列是Il2rg基因的序列的互补链序列。
[0207] 将每个具有这样的构建体的质粒DNA转移进大鼠成纤维细胞中，并执行Surveyor测定(Sigma Aldrich, St. Louis, Mo, USA)来证实通过ZFN的序列特异性的核酸酶活性将突变引入Il2rg基因中。
[0208] 接着，对质粒使用MessageMax (TM) T7 mRNA转录试剂盒(Cambio, Cambridge, UK)进行体外转录，然后使用A-Plus (TM) Poly(A) polymerase tailing kit(Epicentre Biotechnologies, Madison, WI, USA)进行3’末端的聚腺苷酸化处理。
[0209] 使用MEGAClear (TM)试剂盒(Life Technologies Co., Carlsbad, CA, USA)纯化每种得到的mRNA (约1 kb)。将mRNA以各自40 ng/ μL的浓度(总计80 ng/ μL)溶解在PBS中以制备靶向Il2rg基因的ZFN mRNA溶液。
[0210] (2)“合子的收集”以与在测试实施例1(1)中所述的方法相同的方式，将F344/Stm品系的大鼠的原核阶段合子收集并保存在改良的Krebs-Ringer溶液中。
[0211] (3)“电脉冲处理”在玻璃室上的培养皿铂板电极(CUY520P5, 5 mm间隙，L10×W5×H5 mmm，由Nepa Gene Co., Ltd.制造)之间，注射100 μL含有各40 ng/ μL的mRNA的磷酸盐缓冲盐水(PBS)，并将收集的原核阶段合子在承载磷酸盐缓冲盐水的金属板电极之间静止放置成线(参见图3(A))。在该情况下，在保持收集时的状态的同时使用原核阶段合子，而不进行透明带除去和薄化处理。
[0212] 向金属板连接能够产生方波电脉冲的电脉冲产生装置(NEPA21 (商标)，由Nepa Gene Co., Ltd.制造) (参见图3(B))，并且基于电穿孔方法执行电脉冲处理，所述电穿孔方法包括通过三个依次施加三类方波电脉冲（即，穿孔脉冲(Pp)、转移脉冲1 (Tp1)和转移脉冲(Tp2)）的步骤使用多个脉冲(参见图1和图2)。将电脉冲的各种条件设定为表5-A所示的条件。应当指出，在室温条件下执行系列操作以便防止水微滴附着。
[0213] 同时，作为对照，通过包括使用显微操作器的显微注射(显微注射方法)，将各个mRNA转移进合子中。应当指出，根据普通方法执行注射操作，并转移约2 pL含有各10 ng/ μL的mRNA的PBS。
[0214] (4)“合子的移植”将转移处理以后的合子在改良的Krebs-Ringer溶液中在37℃、5%CO2和95%空气的条件下培养成2-细胞阶段胚胎。计数2-细胞阶段胚胎的数目，并计算2-细胞阶段胚胎的数目与测试的卵的数目的比率(%)。
[0215] 将得到的2-细胞阶段胚胎移植进Jcl:Wistar品系(CLEA Japan Inc.)的假妊娠雌性大鼠(在前一天允许与切除输精管的雄性交配的个体)的输卵管中。通过移植后21天的自发分娩，得到后代。计算后代的数目与测试的卵的数目的比率(%)。
[0216] (5)“后代的基因突变分析”从培养的后代收集血液，并允许附着于FTA卡片和保存。从FTA卡片(由GE Healthcare Life Sciences制造)提取基因组DNA，并通过PCR反应扩增在二者之间插入在Il2rg基因上设计的突变位点的区域。对得到的PCR产物进行序列分析，以分析Il2rg基因突变在后代的基因组DNA中的存在或不存在。计算突变后代个体与所有后代个体的比率。
[0217] (6)“结果”如表5-B的结果所示，表明通过执行基于方波三步方法的电脉冲处理将编码ZFN的mRNA有效地转移进具有完整透明带的原核阶段合子中能够有效地生产遗传上修饰的小鼠(Il2rg基因-敲除的大鼠)，其利用ZFN的序列特异性的核酸酶活性，所述方波三步方法包括将穿孔脉冲的总能量的量调至从0.298 J/100 μL至1.062 J/100 μL (参见图5)。
[0218] 具体地，表明电脉冲处理以后合子的存活率(2-细胞阶段胚胎收率，后代收率)表现出与在显微注射方法中相当或更高的效率(测试5-1-5-3)。特别地，当将穿孔脉冲的总能量的量调至从0.298 J/100 μL至0.629 J/100 μL时，后代的收率的值(存活率)是在显微注射方法中的2.4倍至3.1倍(测试5-1和5-2)。
[0219] 推测高存活率的原因如下：除了没有执行透明带除去和薄化处理以外，落入合适范围内的穿孔脉冲的总能量的量会减小对合子的损伤。
[0220] 另外，得到的后代的基因突变率表现出与在显微注射方法中相当或更高的效率。特别地，当将穿孔脉冲的总能量的量调至从0.629 J/100 μL至1.062 J/100 μL时，突变率的值是在显微注射方法中的约2.2倍。
[0221] [表5-A]
[0222] [表5-B]
[0223] [测试实施例6 (实施例)]“通过TALEN mRNA转移建立重组体的测试”研究了通过执行基于方波三步方法的电穿孔将编码TALEN的mRNA转移进具有完整透明带的原核阶段合子中是否能够建立重组体。应当指出，采用存在于X染色体上的Il2rg基因作为靶基因。
[0224] (1)“mRNA的制备”合成了一对编码大鼠白介素-2受体γ链基因(Il2rg: 免疫缺陷的致病基因)的TALEN质粒(TALEN左和TALEN右)。将这对TALEN设计成结合Il2rg基因的第二个外显子中的特定序列(TALEN左: SEQ ID NO: 5, TALEN右: SEQ ID NO: 6) (参见图7)。应当指出，TALEN右的结合序列是Il2rg基因的序列的互补链序列。
[0225] 将每个具有这样的构建体的质粒DNA转移进大鼠成纤维细胞中，并执行Surveyor测定(Sigma Aldrich, St. Louis, Mo, USA)来证实通过TALEN的序列特异性的核酸酶活性将突变引入Il2rg基因中。
[0226] 接着，对质粒使用MessageMax (TM) T7 mRNA转录试剂盒(Cambio, Cambridge, UK)进行体外转录，然后使用A-Plus (TM) Poly(A) polymerase tailing kit(Epicentre Biotechnologies, Madison, WI, USA)进行3’末端的聚腺苷酸化处理。
[0227] 使用MEGAClear (TM)试剂盒(Life Technologies Co., Carlsbad, CA, USA)纯化每种得到的mRNA (约3 kb)。将mRNA以各自40 ng/ μL的浓度(总计80 ng/ μL)溶解在PBS中以制备靶向Il2rg基因的TALEN mRNA溶液。
[0228] (2)“合子的收集”以与在测试实施例1(1)中所述的方法相同的方式，将F344/Stm品系的大鼠的原核阶段合子收集并保存在改良的Krebs-Ringer溶液中。
[0229] (3)“电脉冲处理”以与在测试实施例5(3)中所述的方法相同的方式，在玻璃室上的培养皿铂板电极之间，注射100 μL含有各40 ng/ μL的mRNA的磷酸盐缓冲盐水(PBS)，并将收集的原核阶段合子在承载磷酸盐缓冲盐水的金属板电极之间静止放置成线。在该情况下，在保持收集时的状态的同时使用原核阶段合子，而不进行透明带除去和薄化处理。
[0230] 向金属板连接能够产生方波电脉冲的电脉冲产生装置，并且用表6中所示的穿孔脉冲的总能量的量执行电脉冲处理。另外，在该处理中使用的设备、基本操作和其它电条件与在测试实施例5(3)中所述的方法相同。
[0231] (4)“合子的移植”以与在测试实施例5(4)中所述的方法相同的方式，计算2-细胞阶段胚胎的数目与测试的卵的数目的比率(%)和后代的数目与测试的卵的数目的比率(%)。此后，将得到的2-细胞阶段胚胎移植进假妊娠的雌性的输卵管中，并通过自发分娩得到后代。计算后代的数目与测试的卵的数目的比率(%)。应当指出，以与在测试实施例5(4)中所述的方法相同的方式执行该处理的基本操作。
[0232] (5)“后代的基因突变分析”以与在测试实施例5(5)中所述的方法相同的方式计算Il2rg基因突变个体与所有后代个体的比率。应当指出，以与在测试实施例5(5)中所述的方法相同的方式执行该分析的基本操作。
[0233] (6)“结果”如表6的结果所示，表明通过执行基于方波三步方法的电脉冲处理将编码TALEN的mRNA有效地转移进具有完整透明带的原核阶段合子中能够有效地生产遗传修饰的大鼠，其利用TALEN的序列特异性的核酸酶活性，所述方波三步方法包括将穿孔脉冲的总能量的量调至从0.629 J/100 μL至1.062 J/100 μL。
[0234] 具体地，表明电脉冲处理以后合子的存活率的值(2-细胞阶段胚胎收率，后代收率)变高(测试6-1和6-2)。具体地，当将穿孔脉冲的总能量的量调至0.629 J/100 μL时，非常大数目（即，约一半(44%)）的合子生长成后代(测试6-1)。
[0235] 还表明，从得到的后代得到在靶序列中具有基因突变的个体(测试6-1和6-2)。具体地，表明，当将穿孔脉冲的总能量的量调至1.062 J/100 μL时，得到高突变率(测试6-2)。
[0236] 应当指出，通过转移TALEN mRNA得到的后代的基因突变率的值低于在实施例5中转移ZFN mRNA的实施例中的值。推测这是因为，用于TALEN转移的mRNA较长(ZFN mRNA的约3倍)，因此难以迁移进细胞质中。
[0237] [表6]
[0238] [测试实施例7 (实施例)]“利用CRISPR-Cas9系统建立重组体的测试”研究了通过执行基于方波三步方法的电穿孔将用于CRISPR系统的Cas9 mRNA和指导RNA转移进具有完整透明带的原核阶段合子中是否能够建立重组体。应当指出，采用酪氨酸酶基因作为靶基因。
[0239] (1)“RNA的制备”通过寡物合成制备靶向大鼠酪氨酸酶基因(Thy: 参与黑色素合成，它的缺失会造成白化病者)的指导RNA。将在指导RNA的5’侧上的20个碱基对设计成结合Thy基因上的靶序列(SEQ ID NO: 7)的互补链(参见图8)。另外，指导RNA的3’侧是序列(SEQ ID NO: 8: crRNA:
tracrRNA)，其形成三维结构以特异性地结合Cas9核酸酶。
tracrRNA)，其形成三维结构以特异性地结合Cas9核酸酶。
[0240] 使用MEGAshortscript (TM) T7试剂盒(Life Technologies Co., Carlsbad, CA, USA)转录在其中掺入了指导RNA的表达载体。另外，使用MessageMax (TM) T7 mRNA转录试剂盒(Cambio, Cambridge, UK)对在其中掺入了Cas9核酸酶(SpCas9)的表达载体进行体外转录，然后使用A-Plus (TM) Poly(A) polymerase tailing kit(Epicentre Biotechnologies, Madison, WI, USA)对得到的RNA的3’末端进行聚腺苷酸化处理。
[0241] 使用MEGAClear (TM)试剂盒(Life Technologies Co., Carlsbad, CA, USA)纯化得到的指导RNA和Cas9 mRNA。
[0242] 将得到的指导RNA和Cas9 mRNA溶解在PBS中从而分别具有192 ng/ μL和312 ng/ μL的浓度。从而制备靶向Thy基因的用于CRISPR-Cas9系统的RNA溶液。
[0243] (2)“合子的收集”将DA/Slc品系的大鼠的原核阶段合子收集并保存在改良的Krebs-Ringer溶液中。以与在测试实施例1(1)中所述的方法相同的方式执行该处理的基本操作。
[0244] (3)“电脉冲处理”以与在测试实施例5(3)中所述的方法相同的方式，在玻璃室上的培养皿铂板电极之间，注射100 μL含有RNA (192 ng/ μL的指导RNA和312 ng/ μL的Cas9 mRNA)的磷酸盐缓冲盐水(PBS)，并将收集的原核阶段合子在承载磷酸盐缓冲盐水的金属板电极之间静止放置成线。在该情况下，在保持收集时的状态的同时使用原核阶段合子，而不进行透明带除去和薄化处理。
[0245] 向金属板连接能够产生方波电脉冲的电脉冲产生装置，并且用表7中所示的穿孔脉冲的总能量的量执行电脉冲处理。另外，在该处理中使用的设备、基本操作和其它电条件与在测试实施例5(3)中所述的方法相同。
[0246] (4)“合子的移植”以与在测试实施例5(4)中所述的方法相同的方式，计算2-细胞阶段胚胎的数目与测试的卵的数目的比率(%)和后代的数目与测试的卵的数目的比率(%)。
[0247] (5)“胚胎的基因突变分析”计算Thy基因突变个体与所有2-细胞阶段胚胎个体的比率。应当指出，以与在测试实施例5(5)中所述的方法相同的方式执行该分析的基本操作。
[0248] (6)“结果”如表7的结果所示，表明通过执行基于方波三步方法的电脉冲处理将指导RNA和Cas9 mRNA转移进具有完整透明带的原核阶段合子中会得到在靶序列中具有基因突变的早期胚胎，所述方波三步方法包括将穿孔脉冲的总能量的量调至1.062 J/100 μL (测试7-1)。
[0249] 结果提示，通过利用电穿孔方法和CRISPR-Cas9系统能够生产遗传上修饰的大鼠。
[0250] [表7]
[0251] [测试实施例8 (实施例)]“遗传性状的传递测试”证实了遗传性状向在前面建立的Il2rg基因突变体中的转移是否传递给下一代。
[0252] (1)“种系传递分析”筛选了在表8中显示的基因型的Il2rg基因突变体大鼠(在测试实施例5(4)中通过ZFN mRNA的转移建立的Il2rg基因突变个体)。现在，在表中，'G0Δ'或'F1Δ' 代表Il2rg基因中的突变在X染色体上的存在。另外，在Δ的右边的值代表缺失的碱基的数目。另外，'+' 代表正常X染色体，且'Y' 代表Y染色体。
[0253] 允许突变个体各自与F344/Stm品系的野生型自然地交配以提供后代，并计算基因突变个体的比率。以与在测试实施例5(5)中描述的方法相同的方式，证实基因突变的存在或不存在。
[0254] (2)“结果”如表8的结果所示，在通过允许雄性Il2rg基因突变个体（即，突变体8-1 (G0Δ13/Y)或突变体8-2 (G0Δ7/Y)）与雌性野生型(+/+)交配而得到的后代中，所有雌性是Il2rg基因突变体。另外，在后代中的所有雄性是野生型。
[0255] 另外，在通过允许雌性Il2rg基因突变个体（即，突变体8-3 (F1Δ13/+)）与雄性野生型(Y/+)交配而得到的后代中，雄性和雌性的约半数是Il2rg基因突变体。
[0256] 结果表明，通过ZFN mRNA的转移建立的Il2rg基因突变个体的遗传性状(基因组上的突变)被传递给后代。
[0257] [表8]
[0258] [测试实施例9 (对比实施例)]“将DNA转移进合子中的测试”研究了通过执行基于方波三步方法的电穿孔通过将质粒DNA转移进具有完整透明带的原核阶段合子中是否能够建立重组体。
[0259] (1)“质粒DNA的制备”制备EmGFP (Pc DNA6.2)质粒(Invitrogen)的质粒溶液，并用作DNA溶液。以与在测试实施例2(2)中描述的方法相同的方式，执行质粒制备的基本操作。
[0260] (2)“电脉冲处理”以与在测试实施例5(3)中描述的方法相同的方式，在玻璃室上的培养皿铂板电极之间，注射100 μL含有表9所示浓度的质粒DNA的磷酸盐缓冲盐水(PBS)，并将收集的原核阶段合子在承载磷酸盐缓冲盐水的金属板电极之间静止放置成线。在该情况下，在保持收集时的状态的同时使用原核阶段合子，而不进行透明带除去和薄化处理。
[0261] 向金属板连接能够产生方波电脉冲的电脉冲产生装置，并且用表9中所示的穿孔脉冲的总能量的量执行电脉冲处理。另外，在该处理中使用的设备、基本操作和其它电条件与在测试实施例5(3)中所述的方法相同。
[0262] (3)“合子的移植”以与在测试实施例5(4)中所述的方法相同的方式，计算2-细胞阶段胚胎的数目与测试的卵的数目的比率(%)和后代的数目与测试的卵的数目的比率(%)。应当指出，以与在测试实施例5(4)中所述的方法相同的方式执行该处理的基本操作。
[0263] (4)“后代的基因突变分析”将后代剃毛，并用490 nm的激发光照射以检查它们的表皮细胞是否发射荧光，由此计算GFP荧光-阳性的个体与所有后代个体的比率。
[0264] (5)“结果”如表9的结果所示，在使用质粒DNA作为转移的核酸的分子物质的情况下，即使当在上述测试实施例确定的最适电条件下执行电脉冲处理时，不能生产遗传修饰的个体。
[0265] 从那些结果和测试实施例5-7的结果，考虑到合适的是，使用'RNA'作为核酸分子物质以便通过基于方波三步方法的电穿孔遗传修饰具有完整透明带的'合子'。
[0266] [表9]
[0267] 工业实用性利用用于修饰在基因组上具有靶序列的基因的技术(基于ZFN等的基因组编辑技术)，本发明的基因修饰技术能够以高效率和良好再现性建立遗传修饰的哺乳动物个体，不限于特定哺乳动物物种。
[0268] 因而，预见到根据本发明的技术是显著地促进基因功能的分析或疾病机制的阐明的技术。
[0269] 应当指出，本申请的发明人已经将本发明的技术命名为“TAKE方法”(通过电穿孔方法得到动物敲除系统的技术)。
[0270] 参考符号列表1: 电极
2: 原核阶段合子
3: 卵衍生的核
4: 精子衍生的核
5: 透明带
6: 用穿孔脉冲形成的微孔
7: mRNA
11: 具有培养皿铂板电极的玻璃室
12: 培养皿铂板电极
13: 立体显微镜
14: 电脉冲产生装置
21: Il2rg基因敲除的大鼠
22: 野生型大鼠(F344/Stm品系)
31: 在Il2rg基因中设计的ZFN左的结合序列(互补链序列)
32: 锌指蛋白(序列特异性的DNA-结合结构域)
33: FokI (限制性酶活性结构域)
34: 在Il2rg基因中设计的ZFN右的结合序列(基因序列)
35: 锌指蛋白(序列特异性的DNA-结合结构域)
36: FokI (限制性酶活性结构域)
41: 在Il2rg基因中设计的TALEN左的结合序列(基因序列)
42: 转录活化物-样效应物(序列特异性的DNA-结合结构域)
43: FokI (限制性酶活性结构域)
44: 在Il2rg基因中设计的TALEN右的结合序列(互补链序列)
45: 转录活化物-样效应物(序列特异性的DNA-结合结构域)
46: FokI (限制性酶活性结构域)
51: Thy基因的基因组DNA
52: 在Thy基因中设计的CRISPR-Cas9系统的指导RNA的识别序列
53: 原间隔区衔接子基序(PAM)
54: 指导RNA (crRNA:tracrRNA)
55: Cas9核酸酶
2: 原核阶段合子
3: 卵衍生的核
4: 精子衍生的核
5: 透明带
6: 用穿孔脉冲形成的微孔
7: mRNA
11: 具有培养皿铂板电极的玻璃室
12: 培养皿铂板电极
13: 立体显微镜
14: 电脉冲产生装置
21: Il2rg基因敲除的大鼠
22: 野生型大鼠(F344/Stm品系)
31: 在Il2rg基因中设计的ZFN左的结合序列(互补链序列)
32: 锌指蛋白(序列特异性的DNA-结合结构域)
33: FokI (限制性酶活性结构域)
34: 在Il2rg基因中设计的ZFN右的结合序列(基因序列)
35: 锌指蛋白(序列特异性的DNA-结合结构域)
36: FokI (限制性酶活性结构域)
41: 在Il2rg基因中设计的TALEN左的结合序列(基因序列)
42: 转录活化物-样效应物(序列特异性的DNA-结合结构域)
43: FokI (限制性酶活性结构域)
44: 在Il2rg基因中设计的TALEN右的结合序列(互补链序列)
45: 转录活化物-样效应物(序列特异性的DNA-结合结构域)
46: FokI (限制性酶活性结构域)
51: Thy基因的基因组DNA
52: 在Thy基因中设计的CRISPR-Cas9系统的指导RNA的识别序列
53: 原间隔区衔接子基序(PAM)
54: 指导RNA (crRNA:tracrRNA)
55: Cas9核酸酶
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