人和大型哺乳动物肺生物反应器
阅读：919发布：2020-05-13
专利汇可以提供人和大型哺乳动物肺生物反应器专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 提供用于大型 哺乳动物 肺 组织的 生物 反应器 。生物反应器能够进行液压驱动的 负压 和 正压 灌注和通气。灌注和通气以生理学速度递送并容易可控。在一个实施方式中，生物反应器包括 支撑 大型哺乳动物肺组织大小的支撑 支架 。在另一个实施方式中，生物反应器包括胸膜袋，其提供包围工程化肺的小隔离 流体 室，从而最小化需要的培养基的量。本发明还提供检查测试药剂功能的体外模型和减轻大型哺乳动物中肺 缺陷 的组合物和方法。，下面是人和大型哺乳动物肺生物反应器专利的具体信息内容。
1.用于大型哺乳动物肺组织的生物反应器，包括具有容纳至少一个大型哺乳动物肺的尺寸的室、将流体递送到肺脉管系统的血管环路和将流体递送到肺气道的气管环路。
2.权利要求1所述的生物反应器，其中所述室包括支撑支架以对所述肺提供支持。
3.权利要求1所述的生物反应器，其中所述室包括包围所述肺的胸膜袋和与所述肺的套管连接的套管入口，其中所述胸膜袋和套管入口提供包围所述肺的隔离无菌流体室。
4.权利要求1所述的生物反应器，其中所述室包括液压储存器，其通过隔离横板与所述室的其余部分分离。
5.权利要求4所述的生物反应器，其中所述生物反应器进一步包括液压驱动装置，其将流体泵进和泵出所述液压储存器，从而引起所述肺的膨胀和收缩。
6.权利要求1所述的生物反应器，其中所述生物反应器能够进行液压驱动的负压通气。
7.权利要求1所述的生物反应器，其中所述生物反应器能够进行正压通气。
8.权利要求1所述的生物反应器，其中所述生物反应器能够进行液压驱动的负压灌注。
9.权利要求1所述的生物反应器，其中所述生物反应器能够进行正压通气。
10.权利要求1所述的生物反应器，其中所述生物反应器能够进行搏动性灌注。
11.权利要求1所述的生物反应器，其中所述生物反应器能够将流体的前进、倒退、循环和振荡流动施用给所述肺的所述气道和脉管系统。
12.权利要求11所述的生物反应器，其中所述生物反应器能够通过液压驱动的负压通气和正压通气将流体递送给所述脉管系统，并进一步能够通过液压驱动的负压通气和正压通气将流体递送给所述气道。
13.权利要求1所述的生物反应器，其中所述生物反应器能够将流体同时递送到所述肺脉管系统的所述动脉侧和静脉侧，然后通过所述肺的负压收缩排出所述流体。
14.权利要求1所述的生物反应器，其中所述血管环路包括波纹管驱动装置。
15.权利要求1所述的生物反应器，其中所述血管环路将去细胞化溶液递送到所述肺以使所述肺去细胞化。
16.权利要求1所述的生物反应器，其中所述气管环路将去细胞化溶液递送到所述肺以使所述肺去细胞化。
17.权利要求1所述的生物反应器，其中所述血管环路将包括细胞的溶液递送到所述肺。
18.权利要求1所述的生物反应器，其中所述气管环路将包括细胞的溶液递送到所述肺。
19.权利要求1所述的生物反应器，其中所述生物反应器能够使大型哺乳动物肺去细胞化。
20.权利要求1所述的生物反应器，其中所述生物反应器能够使大型哺乳动物肺再细胞化。
21.权利要求1所述的生物反应器，其中所述生物反应器能够支持肺部细胞的生长和存活。
22.权利要求1所述的生物反应器，其中将所述肺用细胞群体接种。
23.权利要求17所述的生物反应器，其中所述细胞群体包括干细胞。
24.组合物，其包括权利要求1所述的生物反应器中培养的工程化大型哺乳动物肺。
25.体外模型，其包括权利要求1所述的生物反应器中培养的工程化大型哺乳动物肺。
26.针对调节肺组织健康的能力筛选测试药剂的方法，所述方法包括使所述测试药剂与权利要求1所述的生物反应器中培养的工程化大型哺乳动物肺接触和测量所述测试药剂对所述肺功能的影响，其中所述肺功能的任何改变是所述测试药剂能够调节所述肺组织健康的指示。
27.权利要求21所述的方法，其中所述测试药剂通过所述生物反应器的血管环路或气管环路施用给所述工程化肺。
28.减轻或治疗大型哺乳动物中肺缺陷的方法，所述方法包括给所述大型哺乳动物施用权利要求1所述的生物反应器中培养的工程化大型哺乳动物肺。
人和大型哺乳动物肺生物反应器
[0001] 相关申请的交叉引用
[0002] 该申请要求2013年1月8日提交的美国临时申请号61/750,088的权益，其全部内容通过引用被并入本文。
[0004] 该发明按照由国立卫生研究院(NIH)授予的授权号HL111016在政府支持下作出。政府在发明中具有一定的权利。
[0005] 发明背景
[0006] 组织工程化是一个正在成长的领域，其寻求组合细胞、分子、工艺和医学进展以产生适合移植和实验室研究的替换组织。有希望的工作已对许多种组织，包括血管、膀胱、心脏瓣膜和心脏组织进行(Nichols et al,.2008,Proc Am Thor Soc 5:723–30；Satchell等,2004,J Am Soc Nephrol 15:566–74；Atala等,2006,Lancet 367:1241–6；Orfanos等,2004,Intensive Care Med 30:1702–14)。然而，肺是在实验室中难以工程化的组织。肺需要复杂的基质，其可经得起呼吸的机械压迫，其可支撑内皮、上皮和间充质细胞的生长，并且其提供用于两个非常不同但亲密并置的区室之间的气体交换的手段。进一步，大型哺乳动物肺——包括人肺——的工程化受到器官的大尺寸的阻碍。人规模的肺的有效培养中的困难包括提供充分的无菌环境和提供大且笨重的器官的结构支撑。进一步，可以防止给这样的大组织提供培养基的成本。
[0007] 因此，本领域存在用于大型哺乳动物肺组织培养的生物反应器系统开发的需要。本发明满足本领域中的该需要。
[0009] 为了说明发明的目的，附图中描述发明的某些实施方式。然而，发明不限于附图中描述的实施方式的精确排列和机构。
[0010] 图1是发明的示例性生物反应器系统的示意图。
[0011] 图2是发明的生物反应器的一个实施方式的示例性室的示意图。
[0012] 图3是发明的生物反应器的一个实施方式的示例性液压驱动装置的示意图。
[0013] 图4是发明的生物反应器的一个实施方式的示例性血管驱动装置和血管环路的示意图。
[0014] 图5是发明的生物反应器的一个实施方式的示例性气管环路的示意图。
[0015] 图6是描述发明的生物反应器的一个实施方式的示例性室和工程化肺的示意图。
[0016] 图7是描述肺与示例性套管入口的连接的图。
[0017] 图8是描述发明的生物反应器的一个实施方式的示例性室和胸膜袋的图。
[0018] 图9是描述发明的一个实施方式的示例性室、液压驱动装置和血管驱动装置的图。
[0019] 图10是描述发明的一个实施方式的示例性血管驱动装置的图。
[0020] 发明详述
[0021] 本发明包括用于大型哺乳动物肺组织培养的生物反应器系统。在一个实施方式中，生物反应器系统为工程化人肺的去细胞化、再细胞化和培养提供无菌环境。在一个实施方式中，生物反应器系统提供工程化肺高度可控的灌注和通气。在一个实施方式中，生物反应器能通过液压驱动的负压，用多种流体和气体使肺通气和灌注肺，以及以生理速度和压力提供血管灌注和通气。生物反应器能够使流体通过脉管系统灌注、使流体或空气移动进和出气道，以及使肺通过负(和正)压通气等等。
[0022] 在一个实施方式中，本发明包括在本发明的生物反应器系统中培养的工程化大型哺乳动物肺。相应地，发明包括作为再生医学形式的血管化肺组织的产生的方法和组合物。在一个实施方式中，工程化肺组织来自去细胞化的天然肺组织。去细胞化的组织基本上没有细胞和DNA。优选，去细胞化的组织也没有免疫原性分子。更优选，去细胞化的组织保留对细胞附着和增殖重要的几种关键的细胞外基质分子。
[0023] 在一个实施方式中，工程化大型哺乳动物肺包括体外三维模型，其例如用于研究肺发育生物学。此外，该模型用于药物发现、毒性试验、疾病病理学等等。在一个实施方式中，体外模型概括了表明(reminiscent of)由与宿主循环紧密连接的导管上皮组成的肺泡形成单元的结构形成。
[0025] 定义
[0026] 除非另外限定，本文使用的所有的技术和科学术语通常具有与该发明所属领域技术人员通常理解的相同的意思。通常，本文使用的命名法和细胞培养中的实验室操作、分子遗传学、有机化学和核酸化学和杂交都是在本领域众所周知和通常使用的那些。
[0027] 本文使用冠词“一(a)”和“一(an)”来指一个或超过一个(即，至少一个)的冠词的语法对象。通过实例，“一要素”指一个要素或超过一个要素。
[0028] 如本文所用，“约”当提到可测量的值如量、短暂的持续时间等时，意为包括与指定值±20％或±10％、更优选±5％、甚至更优选±1％和更优选±0.1％的变化，因为这样的变化适合进行公开的方法。
[0029] 术语“前体细胞”、“祖细胞”和“干细胞”在本领域中可互换地使用，并且如本文所用指多能性或谱系未定型(lineage-committed)的祖细胞，其潜在地能够进行无限数目的有丝分裂以更新自身或产生将分化成期望的细胞类型的后代细胞。与多能性干细胞相比，谱系未定型的祖细胞通常被认为不能产生很多表现型上彼此不同的细胞类型。而是，祖细胞产生一种或可能地两种谱系未定型的细胞类型。
[0030] 如本文所用，“人多能性干细胞”(hPS)指这样的细胞，其可来自任何来源，并且其能在适当的条件下产生是所有3个生发层(内胚层、中胚层和外胚层)的衍生物的不同细胞类型的人后代。hPS细胞可具有在8-12周龄的SCID小鼠中形成畸胎瘤的能力和/或在组织培养中形成所有三个胚层的可识别细胞的能力。人多能性干细胞的定义中包括多种类型的胚胎细胞，包括文献中人胚泡来源的干(hBS)细胞——常常称作人胚胎干(hES)细胞，(参见，例如，Thomson等(1998),Heins et.al.(2004)，以及诱导的多能性干细胞(参见，例如Yu等,(2007)Science 318:5858)；Takahashi等,(2007)Cell 131(5):861)。本文描述的各种方法和其它实施方式可需要或利用许多种来源的hPS细胞。例如，适合使用的hPS细胞可获自发育的胚胎。另外或可选地，合适的hPS细胞可获自建立的细胞系和/或人诱导的多能性干(hiPS)细胞。
[0031] 如本文所用“hiPS细胞”指人诱导的多能性干细胞。
[0032] 如本文所用，术语“支架”和“组织支架”指这样的结构，其包括提供适合细胞粘附和增殖的表面的生物相容性材料。支架可进一步提供机械稳定性和支撑。支架可以是特定形状或形式以影响或划界增殖细胞群体呈现的三维形状或形式。这样的形状或形式包括，但不限于，膜(例如具有基本上大于第三维的二维的形式)、带、索、片、平碟、圆柱、球、3-维无定形的形状等。
[0033] 如本文所用，“支撑支架”指较大的、肉眼可见的系统以机械地定位和锚定组织支架。
[0034] 如本文所用，“生物相容性”指当植入哺乳动物时不在哺乳动物中引起不利反应的任何材料。当引入个体时，生物相容性材料对该个体无毒或无害，也不在哺乳动物中引起材料的免疫排斥。
[0035] 如本文所用，“自体”指来自同一个体的生物材料，该材料随后将再导入到该个体中。
[0036] 如本文所用，“同种异体”指来自相同物种的遗传上不同的个体的生物材料，该材料随后将再导入到该个体中。
[0037] 如本文所用，“移植物”指植入个体或结构，通常替换、纠正或另外克服缺陷的细胞、组织或器官。移植物可进一步包括支架。组织或器官可由源于同一个体的细胞组成；该移植物在本文由以下可互换的术语引用：“自身移植物(autograft)”、“自体移植(autologous transplant)”、“自体植入物(autologous implant)”和“自体移植物(autologous graft)”。包括来自相同物种的遗传上不同个体的细胞的移植物在本文由以下可互换的术语引用：“同种异身移植物(allograft)”、“同种异体移植(allogeneic transplant)”、“同种异体植入物(allogeneic implant)”和“同种异体移植物(allogeneic graft)”。从个体至他的同卵双生的移植物在本文称作“同种移植物(isograft)”、“同基因移植(syngeneic transplant)”、“同基因植入物(syngeneic implant)”或“同基因移植物(syngeneic graft)”。“异种移植物(xenograft)”、“异基因移植(xenogeneic transplant)”或“异基因植入物(xenogeneic implant)”指从不同物种的一个个体至另一个的移植物。
[0038] 如本文所用，术语“组织移植”和“组织重建”均指将移植物植入个体以治疗或减轻组织缺陷，如肺缺陷或软组织缺陷。
[0039] 如本文所用，“减轻”疾病、缺陷、病症或状况指减小疾病、缺陷、病症或状况的一个或多个症状的严重性。
[0040] 如本文所用，“治疗”指减少患者经历的疾病、缺陷、病症或不利状况等的症状的频率
[0041] 如本文所用，“治疗有效量”是足以给组合物施用的个体提供有益作用的发明的组合物的量。
[0042] 如本文所用，术语“生长培养基”意欲指促进细胞生长的培养基。生长培养基将通常含有动物血清。在一些实例中，生长培养基可不含有动物血清。在一些实例中，生长培养基将促进细胞增殖。
[0043] “分化培养基”在本文用于指这样的细胞生长培养基，其包括添加物或缺少添加物以至于干细胞、胎儿肺细胞或没有完全分化的其它这样的祖细胞当在培养基中温育时发育成具有分化细胞特性中的一些或全部的细胞。
[0044] 如本文所用，术语“生长因子”指对细胞具有生长、增殖、分化或营养作用的蛋白质、肽、促分裂原或其它分子。生长因子包括，但不限于，成纤维细胞生长因子(FGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、酸性成纤维细胞生长因子(aFGF)、表皮生长因子(EGF)、胰岛素样生长因子-I(IGF-T)、胰岛素样生长因子-II(IGF-II)、血小板衍生的生长因子(PDGF)、血管内皮细胞生长因子(VEGF)、激活素-A、骨形态发生蛋白(BMPs)、胰岛素、生长激素、红细胞生成素、血小板生成素、白细胞介素3(IL-3)、白细胞介素6(IL-6)、白细胞介素7(IL-7)、巨噬细胞集落刺激因子、c-kit配体/干细胞因子、骨保护素配体、胰岛素、神经生长因子、睫状神经营养因子、细胞因子、趋化因子、形态发生素、中和抗体、其它蛋白和小分子。优选，FGF选自FGF2、FGF7、FGF10和其任何组合。
[0045] “分离的细胞”指已与组织或哺乳动物中天然伴随的其它组分和/或细胞分离的细胞。
[0046] 如本文所用，“胎儿肺细胞”(FPCs)指从胚胎的肺组织分离的细胞。混合的FPCs群体可包括，但不限于，上皮、间质和内皮细胞。
[0047] 如本文所用，“上皮细胞”指形成身体外表面和用作器官、腔和粘膜表面衬里的细胞。
[0048] 如本文所用，“内皮细胞”指用作血液和淋巴管和多种其它体腔衬里的细胞。
[0049] 如本文所用，“基本上纯化的”细胞是基本上没有其它细胞类型的细胞。因此，基本上纯化的细胞指已从以其天然存在的状态与其正常结合的其它细胞类型纯化的细胞。
[0050] “可扩张性”在本文用于指细胞增殖，例如，以在数目上扩张或，在细胞群体的情况下，经历群体倍增的能力。
[0051] “增殖”在本文用于指相似的形式，特别是细胞的生殖或繁殖。即，增殖包括更大数目的细胞的产生，并可通过简单地计数细胞数目、测量3H-胸苷掺入细胞等等来测量。
[0052] 如本文所用，“组织工程化”指离体产生组织用于组织置换或重建的过程。组织工程化是“再生医学”的一个实例，其包括通过细胞、基因或其它生物构建单元(building blocks)的并入连同生物工程化材料和技术修复或置换组织和器官的方法。
[0053] 如本文所用“内源”指来自生物体、细胞或系统或在生物体、细胞或系统内产生的任何材料。
[0054] “外源”指导入生物体、细胞或系统或在生物体、细胞或系统外产生的任何材料。
[0055] “编码”指多核苷酸，如基因、cDNA或mRNA中核苷酸的特定序列充当生物学过程中具有限定序列的核苷酸(即，rRNA、tRNA和mRNA)或限定序列的氨基酸和从其产生的生物学性质的其它聚合物和大分子合成的模板的固有性质。因此，如果对应于一基因的mRNA的转录和翻译在细胞或其它生物系统中产生蛋白质，那么该基因编码蛋白质。编码链，其核苷酸序列与mRNA序列相同并通常在序列表中提供，和非编码链，用作基因或cDNA转录的模板，均可被称作编码该基因或cDNA的蛋白质或其它产物。
[0056] 除非另外说明，“编码氨基酸序列的核苷酸序列”包括所有的核苷酸序列，其是彼此的简并版本并编码相同氨基酸序列。编码蛋白质和RNA的核苷酸序列可包括内含子。
[0057] “分离的核酸”指已与以天然存在的状态位于其两侧的序列分开的核酸节段或片段，即，已从正常邻近该片段的序列——即，在它天然存在的基因组中邻近该片段的序列——去除的DNA片段。该术语还应用于已基本上从天然伴随该核酸的其它组分——即，在细胞中天然伴随它的RNA或DNA或蛋白质——纯化的核酸。该术语因此包括，例如重组DNA，其并入载体、并入自主复制质粒或病毒、或并入原核生物或真核生物的基因组DNA，或其作为不依赖其它序列的单独的分子(即，作为PCR或限制性核酸内切酶消化产生的cDNA或基因组或cDNA片段)存在。它还包括重组DNA，其是编码另外的多肽序列的杂合基因的部分。
[0058] 术语“组织”，如本文所用，包括但不限于，骨、神经组织、纤维结缔组织——包括腱和韧带、软骨、硬脑膜、心包、肌肉、肺、心脏瓣膜、静脉和动脉和其它脉管系统、真皮、脂肪组织或腺组织。
[0059] “载体”是物质的组合物，其包括分离的核酸并且其可用于将分离的核酸递送到细胞内部。很多载体在本领域是已知的，包括但不限于，线性多核苷酸、与离子或两亲化合物结合的多核苷酸、质粒和病毒。因此，术语“载体”包括自主复制质粒或病毒。该术语应被解释为包括促进核酸转移至细胞中的非质粒和非病毒化合物，如例如，聚赖氨酸化合物、脂质体等。病毒载体的实例，包括但不限于，腺病毒载体、腺伴随病毒载体、逆转录病毒载体等。
[0061] 如本文所用，术语“脉管系统”包括对象的组织、器官或身体部分中循环系统的任何部分。
[0062] 如本文所用，术语“负压”针对负压灌注和/或负压通气而使用。在负压灌注/通气中，流体或空气被带进器官，因为器官周围的压力相对于器官内部较低。流体或空气被排出器官，因为器官周围的压力相对于器官内部升高。
[0063] 如本文所用，术语“正压”针对正压灌注和/或正压通气而使用。在正压灌注/通气中，流体或空气被推进器官，因为流体管路中的压力相对于器官的流体区室内的压力增加。流体或空气被从器官吸出，因为流体管路中的压力相对于器官的流体区室内的压力降低。
[0064] 如本文所用，术语“液压”涉及由在压力下在局限空间中移动的不可压缩流体引起或牵涉在压力下在局限空间中移动的不可压缩流体的目标或作用。在本发明的一个实施方式中，负压通气和灌注由液压作用而发生。
[0065] 范围：遍及该公开，发明的各个方面可以以范围形式呈现。应当理解，范围形式的描述仅为了方便和简洁，并不应被解释为对发明范围的不可改变的限制。相应地，范围的描述应被认为已具体公开了该范围内所有可能的子范围以及单个数值。例如，范围如1至6的描述应被认为已具体公开了子范围如1至3、1至4、1至5、2至4、2至6、3至6等，以及该范围内的单个数，例如1、2、2.7、3、4、5、5.3和6。不论范围的宽度，这都适用。
[0066] 描述
[0067] 本发明提供用于大型哺乳动物肺部(pulmonary)组织培养的生物反应器系统。优选，肺部组织是肺(lung)组织。在一个实施方式中，肺部组织是完整的肺。在一个实施方式中，生物反应器系统支持工程化肺的去细胞化、再细胞化和培养中的至少一个。在一个实施方式中，工程化肺是人肺。在一个实施方式中，生物反应器被设计以提供正压或负压灌注和通气。发明的生物反应器允许在宽范围生理参数下工程化肺的无菌通气和灌注。在一个实施方式中，生物反应器的功能是高度可控和可调节的，提供较先前的设计基本上更大的对流体流动的控制。在一个实施方式中，发明的生物反应器系统包括支撑支架，其对大重量的大型哺乳动物肺构建物提供支撑。在另一个实施方式中，生物反应器系统包括包围工程化肺的胸膜袋，从而提供包括工程化肺的小体积无菌储存器，这减少支持肺需要的培养基的量。
[0068] 本发明部分基于液压驱动系统的独特设计，其中充满生物反应器室的流体体积的液压介导的变化引起负压通气和/或灌注。使得发明的一个实施方式利用液压驱动负压通气/灌注成为可能，因为生物反应器的每个流体区室用非顺应性的或刚性的壁制造，并完全充满不可压缩的流体。以这种方式，每个流体区室的体积变化引起特定体积的流体通过多个路径进入和离开肺组织。本发明的液压驱动的生物反应器系统是高度控制和监测的设计。
[0069] 在一个实施方式中，本发明的生物反应器系统能够进行任何流体通过气道或脉管系统的前进、倒退、循环和振荡流动。进一步，在一个实施方式中，本发明的生物反应器系统能够进行负压和正压灌注以及负压和正压通气。因此，本发明的生物反应器在流体递送到工程化组织的方式和模式方面是高度灵活的。例如，在一个实施方式中，本发明的生物反应器允许流体立刻递送到脉管系统的两侧，并然后通过器官的负压收缩被推出。
[0070] 本发明还提供发明的生物反应器中培养的工程化大型哺乳动物肺部组织。在一个实施方式中，工程化肺部组织显示天然肺部组织例证的分支形态发生。因此，发明提供模拟天然肺部组织的体外模型。体外三维肺部组织模型用于药物发现、毒性试验、疾病病理学等等。
[0071] 在一些实例中，工程化三维肺部组织包括组织上培养的细胞。任何合适的细胞可用于在发明的去细胞化的组织上培养。合适的细胞包括，但不限于，人iPS细胞、人iPS衍生的内皮细胞、人iPS衍生的呼吸上皮细胞、人iPS衍生的内胚层等。在一些实例中，iPS细胞在用于肺组织再生的去细胞化的组织上培养。在一些实例中，iPS细胞在去细胞化的组织上培养。
[0072] 接种之后，使支架上的细胞任选地经受扩张培养基或分化培养基或在存在组织特异的生长因子的情况下培养。然后将组合物植入需要其的对象。对象可以是哺乳动物，但优选是人，并且用于生长和植入的细胞来源是任何哺乳动物，优选人。植入的组合物体内支持另外的细胞生长，因此提供组织重建。相应地，发明提供工程化三维肺组织部用于组织移植治疗的应用。
[0073] 发明还包括体内肺部组织的产生。优选，血管化肺部组织在体内产生。一方面，将胎儿肺部细胞在去细胞化的组织的情况下施用给哺乳动物以促进体内肺部组织形成。
[0074] 在本发明中，证明了发明的生物反应器系统能产生用于临床前体外药理学、生理学和科学试验的血管化三维肺部组织模型。此外，肺部组织可用合适的细胞，如新生肺部细胞或自体肺部细胞接种，并且产生的组合物可用于体内组织重建。
[0075] 本发明的组合物和方法具有无数的有用应用。组合物可用于减轻或治疗个体中组织缺陷的治疗方法。组合物还可体外或体内使用以识别治疗化合物，并因此可具有治疗潜力。
[0076] 生物反应器-概述
[0077] 发明提供培养肺组织的系统(例如，生物反应器)。生物反应器能够保持细胞生存力、细胞分化状态和肺形态学。在一个实施方式中，去细胞化的支架，当在具有合适细胞来源的生物反应器中培养时，可支持宽范围的细胞类型，包括肺部内皮、上皮和间质细胞的粘附和增殖。在一个实施方式中，生物反应器被构建以对大型哺乳动物工程化肺提供结构支持和完整性。在另一个实施方式中，生物反应器包括胸膜袋，其包围工程化肺，从而减少培养需要的培养基的量。在一个实施方式中，生物反应器包括两部分(two-part)液压室，其允许连接的肺组织的无菌操作。
[0078] 发明的生物反应器并入体内环境的主要特征。设计生物反应器以允许用于优化和定制去细胞化和/或再细胞化过程的改变。在一个实施方式中，生物反应器能够以用户指定的速度和优选在哺乳动物的生理流动和压力水平内通过工程化肺组织的脉管系统来灌注培养基。在一个实施方式中，生物反应器能够进行正压和负压灌注。在另一个实施方式中，生物反应器能够通过气管用空气或培养基使组织(例如，肺)通气。优选，使用负压通气以与正常的生理条件一致，虽然利用正压的通气也可以。在再一个实施方式中，生物反应器能够允许不同的培养基类型浸入组织的脉管和气道区室。在另一个实施方式中，生物反应器允许气体交换进培养基，同时满足期望的通气要求。在另一个实施方式中，生物反应器具有孔以允许压力测量，例如肺部动脉和气管压力的测量。优选，压力在正常的生理值内。在另一个实施方式中，生物反应器具有允许培养基定期交换的装置。
[0079] 发明的生物反应器通常包括至少一个用于将套管插入组织的套管插入装置、至少一个通过套管(或多个)供应流体的环路和保持器官或组织无菌环境的装置(例如，室)。套管插入装置通常包括导入到组织的脉管、导管和/或腔的大小适当的中空管。通常，一个或多个脉管、导管和/或腔在组织中被套管插入。流体环路可包括流体储存器(例如，细胞分裂培养基)和通过一个或多个套管使流体移动通过器官的机构(例如，液压作用、泵、气压、重力)。去细胞化、再细胞化和/或培养期间组织的无菌度可利用本文别处讨论的方法来保持。
[0080] 在一个实施方式中，生物反应器用于使组织去细胞化和再细胞化，如本文所描述的。可监测该过程的某些灌注特征(例如，压力、体积、流型、温度、气体、pH)、机械力(例如，心室壁运动和应力)和电刺激(例如，起搏)。灌注的有效性可在流出液中和组织切片中评价。灌注体积、流型、温度、O2和CO2分压和pH可利用标准方法来监测。
[0081] 传感器可用于监测生物反应器和/或组织。声纳微测量法(Sonomicromentry)、微量测压法(micromanometry)和/或电导测量可用于获得压力-体积。例如，传感器可用于监测移动通过插套管的器官或组织的液体压力；系统中的环境温度和/或器官或组织的温度；移动通过插套管的器官或组织的液体的pH和/或流速；和/或再细胞化组织的生物学活性。除了具有监测这样特征的传感器，用于去细胞化和/或再细胞化组织的系统还包括保持或调节这些特征的装置。保持或调节这些特征的装置可包括组件如温度计、恒温器、电极、压力传感器、溢流阀、用于改变液体流速的阀、用于打开和关闭与用于改变溶液pH的溶液的流体连接的阀、球囊、外部起搏器和/或顺应室。为了有助于保证稳定的条件(例如，温度)，可将室、储存器和管加水套。
[0082] 生物反应器能够为肺组织提供充分的营养供应和机械刺激以支持细胞生存和分化。生物反应器可用于体外肺组织培养和用于工程化肺组织培养。优选，生物反应器用于利用去细胞化的肺支架来培养工程化肺组织。
[0083] 能够进行肺组织真3-维区段的体外培养的生物反应器的开发是临床上有用的工程化肺组织开发中的重要步骤。例如，工程化肺组织的生长和成熟可在工程化肺植入受体之前在生物反应器中发生，从而增强体内最终植入的肺组织的功能性。此外，用于体外肺培养的生物反应器可用于辅助肺部生物学、生理学和发育的研究。即，形成肺泡-毛细血管屏障的肺内皮和上皮细胞的相互作用可利用发明的工程化肺组织和生物反应器来研究。熟练的技术人员将能够在较目前使用的多种动物模型更可控的环境中研究肺行为。工程化肺组织和生物反应器还在进行费时且昂贵的人或动物试验之前用于人或动物组织中的药理学试验和研究。
[0084] 生物反应器–详述
[0085] 本发明提供经设计以在机械和化学条件作用下培养工程化肺持续长时间跨度的生物反应器系统。在一些实例中，生物反应器系统被称作反应器。在一个实施方式中，工程化肺是大型哺乳动物，包括例如人的去细胞化的肺。在一个实施方式中，将工程化肺接种细胞。反应器能够使器官以宽范围的生理速度以无菌方式呼吸，和允许高程度的呼吸控制和校准。在一个实施方式中，使工程化肺通过正压通气来通气。在另一个实施方式中，使工程化肺通过负压通气来通气。反应器还能够以宽范围的生理速度，并且以高度可控的、自含式、无菌的方式进行器官的血管灌注。在一个实施方式中，经设计以与培养基接触的反应器的所有组分是可加压加热的并由生物相容性材料制成。例如，在一个实施方式中，反应器的组分由USP VI类材料制成。在一个实施方式中，反应器含有用于在密封室内定位和定向工程化肺的支架。在另一个实施方式中，反应器包括用于在该支架内插套管和安装工程化肺的系统。在一个实施方式中，反应器包括人工胸膜，其显著减少器官培养需要的流体体积，保持器官的形状、位置和定向，并充当允许在罩外部拆卸和维修反应器而没有无菌损害的无菌屏障。设计反应器以容易使用和高度灵活，允许许多参数的变化，以及标准传感设备和监测技术的容易整合。多种机构允许每个流体储存器的气体和营养水平、pH、压力和流速的实时测量。
[0086] 设计和构建本发明的生物反应器，目标是工程化人或大型哺乳动物肺构建物的去细胞化、再接种和生长。示例性生物反应器的设计标准如下：
[0087] i.在去细胞化和培养的所有阶段期间为构建物提供无菌环境。
[0088] ii.允许反应器内工程化肺容易的套管插入和安装，以及当肺被安装在反应器中时外科套管插入术的容易观察。
[0089] iii.提供反应器内可靠地定位和定向肺的方式
[0090] iv.允许无菌环境外部反应器的拆卸和台式维修而没有损害肺自身的无菌度[0091] v.减少全部肺培养需要的培养基体积。这是重要的标准，因为大体积(10-30升)的细胞特定的培养基在应用如这个中一周花费数万美元。
[0092] vi.提供方法以与体内器官经历的高度相似的速度和体积使器官负压呼吸(同时如需要，仍然允许正压呼吸)，允许可变的呼吸体积、压力和速度。这必须以绝不损害无菌度的方式进行。
[0093] vii.提供方法以与体内器官经历的高度相似的搏动方式通过器官的脉管系统来灌注流体，允许可变的每搏输出量、压力和速度。这必须以绝不损害无菌度的方式进行。
[0094] viii.允许第三方监测/传感设备或技术的容易整合
[0095] ix.设计容易使用、紧凑、自含式和针对工作站之间输送容易移动的系统。
[0096] 在一些实例中，本发明的生物反应器满足这些标准中的一些、大部分或全部，从而提供用于大型哺乳动物工程化肺培养的有效生物反应器系统。
[0097] 如图1中所描绘的，发明的示例性生物反应器系统100通常包括器官室10、液压驱动装置30、血管环路40和气管环路60。在一些实施方式中，器官室10为工程化肺11提供无菌外壳。在一些实施方式中，器官室10完全充满流体。液压驱动装置30将流体泵进和泵出液压储存器12以改变器官室10的流体体积并从而将流体移进和移出肺11。血管环路40通过动脉管路41给肺11的动脉提供流体，同时还通过静脉管路42收集来自肺11静脉的流体。气管环路60通过吸入管路61为肺11的气管/支气管提供流体，同时还通过呼出管路62收集来自肺11的流体。在一个实施方式中，气管环路60进一步包括胸膜排放管路
63。
63。
[0098] 图2是器官室10的分离视图，其罩住工程化肺11。图6是描述包括肺11的示例性室10的图。如本文所考虑的，室10可以是容纳大型哺乳动物(例如人)肺的任何合适的尺寸和/或形状。在一个实施方式中，室10被设计大小和形状以容纳一对大型哺乳动物肺。在一个实施方式中，室10由任何刚性材料，包括例如塑料、玻璃等制造。在一些实施方式中，室10至少部分充满流体。在一个实施方式中，室10全部充满流体。充满流体的室10允许液压室12的体积变化在肺11的膨胀和收缩中通过固定的1:1比被直接反映。在一个实施方式中，室10部分或全部充满培养基。在另一个实施方式中，室10部分或全部充满任何合适的流体，而肺11浸在胸膜袋15中容纳的培养基中，如本文别处所描述的。例如，在一个实施方式中，室10充满水、盐水等。如本文别处所讨论的，在某些实施方式中，胸膜袋15的包含允许使用相对更小量的培养基，因此室10可充满便宜的流体(例如水)。在一个实施方式中，室10被构建以经得起多达10psi的压力。在另一个实施方式中，室10被构建以经得起多达100psi的压力。虽然不需要，但是在一些实施方式中，室10由任选光学透明的材料构建。在一个实施方式中，室10被密封以至于它的内容物保持无菌。在一个实施方式中，室10容易和可逆地装配和拆卸以允许进入内部组件以及进入肺11和胸膜袋15。
[0099] 室10包括顶板13，其可包括液压储存器12和/或隔离横板(isolation diaphragm)14。在一个实施方式中，顶板13包括几个流体孔，其允许流体流进和流出室10。流体孔可具有本领域已知的任何类型。例如，在一个实施方式中，流体孔是1/2英寸NPT凹孔，允许多种设备的连接和并入。在一个实施方式中，流体孔包括快速分离管配件，其允许管与顶板13的无菌分离。液压储存器12与液压驱动装置30流体连通，液压驱动装置30将流体泵进和泵出液压储存器12。流体泵进和泵出液压储存器12改变液压储存器12的体积。在一个实施方式中，隔离横板14是分离液压储存器12与室10其余部分的顺应性膜。
隔离横板14形成液压储存器12的至少一个壁并允许液压储存器12的体积改变直接改变室10的体积，从而允许肺11的负压通气和灌注。该液压驱动的方法允许进出肺11的流体的量精确地已知和控制。隔离横板14可由本领域已知的任何合适的顺应性材料构成。例如，在一个实施方式中，隔离横板14是硅酮膜。隔离横板14将室10中的流体与液压储存器12中的流体隔离，从而允许无菌负压通气和灌注。在全部的室10充满培养基的实施方式中，隔离横板14提供培养基和液压储存器12流体之间的无菌屏障。在一个实施方式中，顶板13进一步包括在隔离横板14下的密封圈，其允许无菌流体流动而不破坏室10的流体和液压室12的流体之间的膜屏障。
隔离横板14形成液压储存器12的至少一个壁并允许液压储存器12的体积改变直接改变室10的体积，从而允许肺11的负压通气和灌注。该液压驱动的方法允许进出肺11的流体的量精确地已知和控制。隔离横板14可由本领域已知的任何合适的顺应性材料构成。例如，在一个实施方式中，隔离横板14是硅酮膜。隔离横板14将室10中的流体与液压储存器12中的流体隔离，从而允许无菌负压通气和灌注。在全部的室10充满培养基的实施方式中，隔离横板14提供培养基和液压储存器12流体之间的无菌屏障。在一个实施方式中，顶板13进一步包括在隔离横板14下的密封圈，其允许无菌流体流动而不破坏室10的流体和液压室12的流体之间的膜屏障。
[0100] 如图2中所描绘的，器官室10还可包括无菌胸膜袋15、套管入口16、支撑支架17和锚定点18。胸膜袋15是成形的结构，其提供包围肺11的无菌屏障，从而提供肺11和胸膜袋15之间隔离的流体储存器。图8描绘发明的一个实施方式，其中室10包括胸膜袋15。因此，在一个实施方式中，胸膜袋15隔离胸膜袋15内的培养基与室10的流体。任何类型的合适的培养基可用于胸膜袋15内。合适的培养基的非限制的实例包括最低必需培养基伊格尔(Eagle)、ADC-1、LPM(无牛血清白蛋白)、F10(HAM)、F12(HAM)、DCCM1、DCCM2、RPMI
1640、BGJ培养基(具有和没有Fitton-Jackson改进)、基础培养基伊格尔(BME-加入Earle的盐碱(salt base))、杜尔贝科(Dulbecco)改进的伊格尔培养基(DMEM-无血清)、Yamane、IMEM-20、格拉斯哥(Glasgow)改进型伊格尔培养基(GMEM)、莱博维茨(Leibovitz)L-15培养基、McCoy的5A培养基、培养基M199(M199E-具有Earle的盐碱)、培养基M199(M199H-具有Hank的盐碱)、最低必需培养基伊格尔(MEM-E-具有Earle的盐碱)、最低必需培养基伊格尔(MEM-H-具有Hank的盐碱)和最低必需培养基伊格尔(具有非必需氨基酸的MEM-NAA)等。胸膜袋15的存在显著减少了肺11的高效培养需要的培养基的量。在一个实施方式中，以在去细胞化、通气和灌注期间生理学定向和配置来容纳肺11的方式设计胸膜袋15的形状。胸膜袋15可由任何合适的、生物相容性弹性材料构建。例如，在一个实施方式中，胸膜袋15由高度弹性的硅酮制造。因此，将胸膜袋15设计和构造以在肺11通气期间容易膨胀和收缩。套管入口16与肺11连接以至于肺11的套管与套管入口16的一侧连接，而套管入口16的另一侧与到达顶板13的管线连接(图7)。例如，在一个实施方式中，套管入口
16与动脉管路41、静脉管路42、吸入管路61、呼出管路62、胸膜排放管路63或其组合连接。
在一个实施方式中，套管入口16还充当胸膜袋15的密封圈，从而有助于形成肺11和胸膜袋15之间隔离的培养基室。套管入口16由本领域已知的任何合适的材料构建，包括例如，塑料、玻璃、硅酮等。总之，胸膜袋15和套管入口16允许在室10外部无菌分离、储存和运输肺11。
1640、BGJ培养基(具有和没有Fitton-Jackson改进)、基础培养基伊格尔(BME-加入Earle的盐碱(salt base))、杜尔贝科(Dulbecco)改进的伊格尔培养基(DMEM-无血清)、Yamane、IMEM-20、格拉斯哥(Glasgow)改进型伊格尔培养基(GMEM)、莱博维茨(Leibovitz)L-15培养基、McCoy的5A培养基、培养基M199(M199E-具有Earle的盐碱)、培养基M199(M199H-具有Hank的盐碱)、最低必需培养基伊格尔(MEM-E-具有Earle的盐碱)、最低必需培养基伊格尔(MEM-H-具有Hank的盐碱)和最低必需培养基伊格尔(具有非必需氨基酸的MEM-NAA)等。胸膜袋15的存在显著减少了肺11的高效培养需要的培养基的量。在一个实施方式中，以在去细胞化、通气和灌注期间生理学定向和配置来容纳肺11的方式设计胸膜袋15的形状。胸膜袋15可由任何合适的、生物相容性弹性材料构建。例如，在一个实施方式中，胸膜袋15由高度弹性的硅酮制造。因此，将胸膜袋15设计和构造以在肺11通气期间容易膨胀和收缩。套管入口16与肺11连接以至于肺11的套管与套管入口16的一侧连接，而套管入口16的另一侧与到达顶板13的管线连接(图7)。例如，在一个实施方式中，套管入口
16与动脉管路41、静脉管路42、吸入管路61、呼出管路62、胸膜排放管路63或其组合连接。
在一个实施方式中，套管入口16还充当胸膜袋15的密封圈，从而有助于形成肺11和胸膜袋15之间隔离的培养基室。套管入口16由本领域已知的任何合适的材料构建，包括例如，塑料、玻璃、硅酮等。总之，胸膜袋15和套管入口16允许在室10外部无菌分离、储存和运输肺11。
[0101] 生物反应器系统100中包含胸膜袋15和套管入口16提供独特的机构以减少与组织工程化培养相关的感染和成本。总之，胸膜袋15和套管入口16提供肺11周围不依赖室10的无菌屏障。流体仍能流进和流出肺11，而不接触室10内周围的流体。这显著减小了感染的风险，同时允许在无菌罩外部容易处理、固定和操作肺11。进一步，胸膜袋15和套管入口16形成包围肺11的小隔离培养基室，这显著减少培养需要的培养基体积，同时仍然允许肺11在生理学功能上膨胀和收缩。胸膜袋15和套管入口16还为支撑支架17的连接提供锚定点。这允许室10内肺11的适当定位。如本文别处所描述的，支撑支架17连同胸膜袋15和套管入口16提供必要的支持以稳定肺11的重量，当室10没有充满流体时这可以是特别重要的。
[0102] 支撑支架17提供室10的刚性支架，允许室10内肺11的定位和定向。大型哺乳动物的肺可以是相当重的，因此支撑支架17辅助支撑室10内的肺11。将组织工程化按比例放大到人大小的器官的结果是构建物较小哺乳动物模型更加重和更难处理。因此，利用小哺乳动物器官的生物反应器系统不需要内部支架，因为这些组织足够强健以单独通过套管支撑它们自己的重量(或浮力)。然而，目前已发现当用大型哺乳动物(例如人)器官工作时，将支架并入生物反应器系统是必需的。在一个实施方式中，本发明的支撑支架17用于定位和定向肺11。在一个实施方式中，当没有悬浮在流体中时，支撑支架17支撑肺11。在一个实施方式中，当用空气通气时支撑支架17锚定肺11。在一个实施方式中，支撑支架
17由本领域已知的任何合适的刚性材料制造，包括但不限于塑料和玻璃。在一个实施方式中，支撑支架17由生物相容性材料构建。将支撑支架17通过锚定点18与胸膜袋15连接。
锚定点18的数目将取决于肺11的结构需要而变化。在一个实施方式中，还将支撑支架17与套管入口16连接。支撑支架17允许进出室10的肺11、胸膜袋15和套管入口16的设置和转移。进一步，在一个实施方式中，支撑支架17从室10可逆地去除，肺11和胸膜袋15仍然被安装，而不损害无菌度，从而充当对连接的肺11的独立式支撑。以这种方式，支撑支架17允许管路连接和肺11位置的容易和无菌调节。因此，在一个实施方式中，支撑支架17充当培养期间台式保持的支持。总之，支撑支架17与胸膜袋15的连接允许支撑肺11的重量，甚至当室10没有充满流体时，或当室10拆卸时。
17由本领域已知的任何合适的刚性材料制造，包括但不限于塑料和玻璃。在一个实施方式中，支撑支架17由生物相容性材料构建。将支撑支架17通过锚定点18与胸膜袋15连接。
锚定点18的数目将取决于肺11的结构需要而变化。在一个实施方式中，还将支撑支架17与套管入口16连接。支撑支架17允许进出室10的肺11、胸膜袋15和套管入口16的设置和转移。进一步，在一个实施方式中，支撑支架17从室10可逆地去除，肺11和胸膜袋15仍然被安装，而不损害无菌度，从而充当对连接的肺11的独立式支撑。以这种方式，支撑支架17允许管路连接和肺11位置的容易和无菌调节。因此，在一个实施方式中，支撑支架17充当培养期间台式保持的支持。总之，支撑支架17与胸膜袋15的连接允许支撑肺11的重量，甚至当室10没有充满流体时，或当室10拆卸时。
[0103] 在一个实施方式中，室10进一步包括卸压系统19。在一个实施方式中，卸压系统19包括至少一个卸压阀。例如，在一个实施方式中，卸压系统19包括两个卸压阀。在另一个实施方式中，卸压系统19包括压力监测器和/或压力传感器。如本领域技术人员所将理解的，允许连续或定期测量室10的压力的本领域已知的任何压力监测器都适合用于本发明。可与卸压系统19一起使用的一个示例性压力监测器是PendoTECH压力MAT监测器/传送器(PendoTech,Princeton,NJ)。至少一个卸压阀保证室10内的压力没有达到程序设计的最大压力之上或达到程序设计的最小压力之下。卸压系统19因此防止如果流体管路变得堵塞或另外发生故障时对室10和生物反应器系统100的损害。
[0104] 在一个实施方式中，室10进一步包括至少一个填充/排放管路20。在一个实施方式中，室10包括两个填充/排放管路20。例如，在一个实施方式中，室10包括在室10的顶部终止的一个填充/排放管路20和在室10的底部终止的另一个填充/排放管路20。填充/排放管路20允许室10快速充满和排放，同时保持无菌密封。
[0105] 在一个实施方式中，室10进一步包括热调节系统21，其保持室10中流体的温度。在一个实施方式中，热调节系统21排除了将室10放置在培养箱内的需要，从而允许生物反应器系统100的台式操作。这是关键性的，因为在一些实施方式中，室10太大以至于不能适合常规的培养箱。在一个实施方式中，热调节系统21包括热源，例如，浸入式加热线圈。
在另一个实施方式中，热调节系统21包括温度传感器，其连续或定期地提供室10内温度的测量。在一个实施方式中，热调节系统21保证室10内的温度不达到程序设计的最大温度之上或程序设计的最小温度之下。
在另一个实施方式中，热调节系统21包括温度传感器，其连续或定期地提供室10内温度的测量。在一个实施方式中，热调节系统21保证室10内的温度不达到程序设计的最大温度之上或程序设计的最小温度之下。
[0106] 图3是与室10连接的液压驱动装置30的分离视图。液压驱动装置30可通常包括体积控制器31、循环速度控制器32、驱动电动机33、液压呼吸体积泵34和液压管路35。在一个实施方式中，驱动电动机33包括齿轮电动机。在一个实施方式中，循环速度控制器
32包括可变速度驱动装置。在一个实施方式中，体积控制器31包括可变偏移驱动臂。在一个实施方式中，液压呼吸体积泵包括液压活塞。通过液压管路35将流体泵进和泵出液压储存器12引起如隔离横板14的顺从性所允许的液压储存器12的膨胀和收缩。液压储存器12的膨胀和收缩改变室10的体积，这随后驱动胸膜袋15和肺11的膨胀和收缩。以这种方式，液压驱动装置30提供负压灌注和/或通气，如本文别处所进一步描述的。液压管路35提供液压呼吸体积泵34至液压储存器12之间的流体连通。在一个实施方式中，液压管路35由标准的管组成，如本领域技术人员所将理解的。如本领域技术人员所将理解的，液压驱动装置30可包括允许将流体泵进和泵出液压储存器12的任何另外的组件。在一个实施方式中，液压驱动装置30能够进行每分钟0-15个循环之间的通气。在优选实施方式中，液压驱动装置30能够进行每分钟0-30个循环之间的通气。在一个实施方式中，液压驱动装置30产生约10-1000mL的每搏输出量。在优选实施方式中，液压驱动装置30产生约
20-750mL的每搏输出量。示例性液压驱动装置30在图9中描绘。
32包括可变速度驱动装置。在一个实施方式中，体积控制器31包括可变偏移驱动臂。在一个实施方式中，液压呼吸体积泵包括液压活塞。通过液压管路35将流体泵进和泵出液压储存器12引起如隔离横板14的顺从性所允许的液压储存器12的膨胀和收缩。液压储存器12的膨胀和收缩改变室10的体积，这随后驱动胸膜袋15和肺11的膨胀和收缩。以这种方式，液压驱动装置30提供负压灌注和/或通气，如本文别处所进一步描述的。液压管路35提供液压呼吸体积泵34至液压储存器12之间的流体连通。在一个实施方式中，液压管路35由标准的管组成，如本领域技术人员所将理解的。如本领域技术人员所将理解的，液压驱动装置30可包括允许将流体泵进和泵出液压储存器12的任何另外的组件。在一个实施方式中，液压驱动装置30能够进行每分钟0-15个循环之间的通气。在优选实施方式中，液压驱动装置30能够进行每分钟0-30个循环之间的通气。在一个实施方式中，液压驱动装置30产生约10-1000mL的每搏输出量。在优选实施方式中，液压驱动装置30产生约
20-750mL的每搏输出量。示例性液压驱动装置30在图9中描绘。
[0107] 图4是血管环路40的分离视图，血管环路40包括动脉管路41、静脉管路42、血管流体储存器43、可调节收缩压卸压阀44、血管驱动装置45和血管储存器气体交换机构46。在一个实施方式中，血管驱动装置45是波纹管驱动装置。在一些实施方式中，血管驱动装置45包括循环速度控制器47、体积控制器48、驱动电动机49和液压血管体积泵50。在一个实施方式中，驱动电动机49包括齿轮电动机。在一个实施方式中，循环速度控制器47包括可变速度驱动装置。在一个实施方式中，体积控制器48包括可变偏移驱动臂。在一个实施方式中，液压血管体积泵50包括循环顺应性室。在一个实施方式中，液压血管体积泵50包括波纹管泵，具有生理学的“鸭嘴”阀。血管驱动装置45通过动脉管路41将血管流体泵到肺11的动脉。如本领域技术人员所将理解的，血管驱动装置45可包括允许将血管流体泵到肺11的动脉的任何另外的组件。在一个实施方式中，血管驱动装置45能够产生每分钟0-50个循环之间的脉率。在优选实施方式中，血管驱动装置45能够产生每分钟0-94个循环之间的脉率。在一个实施方式中，血管驱动装置45产生约0-100mL的每搏输出量。在优选实施方式中，血管驱动装置45产生约0-55mL的每搏输出量。示例性血管驱动装置45在图10中描绘。
[0108] 在某些实施方式中，血管储存器43包括用于递送至肺11的脉管系统的血管流体。在一个实施方式中，血管流体是液体。在一个实施方式中，血管流体是去细胞化溶液。在另一个实施方式中，血管流体是再细胞化溶液，其中所述溶液包括细胞并在肺支架再细胞化期间递送至肺11。在另一个实施方式中，血管流体包括培养基。在另一个实施方式中，血管流体包括血浆、血清和/或血液。在另一个实施方式中，血管流体包括水、盐水等。血管环路40提供血管流体给肺11的脉管系统。动脉管路41将血管流体从血管储存器43运送到肺11的动脉，而静脉管路42将血管流体从肺11的静脉运送到血管储存器43。在某些实施方式中，动脉管路41和静脉管路42包括能够进行流体递送的任何类型的标准管。
[0109] 在一个实施方式中，血管环路40给肺11提供体积测量的搏动灌注。以该灌注方式，血管驱动装置45遍及环路泵送血管流体。本发明中血管环路40实施的体积测量的搏动灌注较先前的系统提供关于灌注每搏输出量、速度和特征显著更大程度的控制、精确度和准确度。
[0110] 在另一个实施方式中，血管环路40给肺11提供压力测量的搏动灌注。以该方式，可调节收缩压卸压阀44允许利用相同的环路组件时血管流动是压力测量的。在一个实施方式中，设置可调节收缩压卸压阀44以限制收缩压。在该实施方式中，当动脉管路41的压力高于该设定值时，使血管流体的流动转移回血管储存器43，从而绕过递送至肺11。以压力测量的搏动灌注方式，血管储存器43内血管流体的高度决定舒张压。在一个实施方式中，血管储存器43本身总是在大气压下。例如，在一个实施方式中，将血管储存器43与外部环境通气。在另一个实施方式中，血管储存器43由顺应性材料构建。以压力测量的搏动灌注方式，脉率仍然通过血管驱动装置45的设置来决定，但是每搏输出量取决于压力。该压力测量的搏动灌注方式是先前的生物反应器系统中不存在的能力。
[0111] 在另一个实施方式中，血管环路40和液压驱动装置30一起工作以提供生物反应器系统100中液压驱动的负压灌注。以该液压驱动的负压灌注方式，液压驱动装置30将流体泵进和泵出液压储存器12，从而产生液压储存器12和室10内的压力变化。在室10完全充满流体，室10的壁是刚性的并且覆盖其它套管的实施方式中，血管流体因此从血管储存器43流进和流出肺。在一个实施方式中，引起的负压促进搏动的循环流动，其中血管流体进入肺脉管系统的动脉侧并通过静脉侧离开。在另一个实施方式中，引起的负压产生振荡的、非循环流动，其中进入血管树一侧的血管流体通过同一套管离开，而不被强迫通过毛细血管床。液压驱动的负压灌注具有较正压灌注更精细调节和校准的能力。该能力特别用于肺去细胞化、细胞接种和培养的某些部分中。
[0112] 如图5中所描绘的，气管环路60包括吸入管路61、呼出管路62、胸膜排放管路63、气管储存器64和气管储存器气体交换机构65。气管环路60提供气管流体给肺11的气道。吸入管路61运送来自气管储存器64和肺11的气道的气管流体，而呼出管路62将气管流体从肺11的气道运送到气管64。胸膜排放管路63连接气管储存器64与胸膜袋15内的隔离的储存器，允许可能已渗入肺11和胸膜袋15之间的空间的流体排放。如本文所期望的，吸入管路61、呼出管路62和胸膜排放管路63可以由能够进行流体递送的任何类型的标准管构建。
[0113] 在某些实施方式中，气管储存器64包括用于递送到肺11的气道的气管流体。在一个实施方式中，气管流体是液体。在另一个实施方式中，气管流体是气体。例如，在一个实施方式中，气管流体是空气。在一个实施方式中，气管流体是去细胞化溶液。在另一个实施方式中，气管流体是再细胞化溶液，其中所述溶液包括细胞并在肺支架再细胞化期间递送到肺11。在另一个实施方式中，气管流体包括培养基。在另一个实施方式中，气管流体包括血浆、血清和/或血液。在另一个实施方式中，气管流体包括水、盐水等。在一个实施方式中，气管储存器64本身总是在大气压下。例如，在一个实施方式中，将气管储存器64与外部环境通气。在另一个实施方式中，气管储存器64由顺应性材料构建。
[0114] 在一个实施方式中，气管环路60和液压驱动装置30一起工作以提供生物反应器系统100中液压驱动的负压通气。以该液压驱动的负压通气方式，液压驱动装置30将流体泵进和泵出液压储存器12，从而产生液压储存器12和室10内的体积变化。在室10完全充满流体并且室10的壁是刚性的实施方式中，气管流体因此从气管储存器64流进和流出肺。在一个实施方式中，引起的负压促进搏动的循环流动，其中气管流体通过吸入管路61进入气道并通过呼出管路62离开。在另一个实施方式中，引起的负压产生振荡的、非循环流动，其中气管流体通过同一套管进入和离开肺11的气道。液压驱动的负压通气提供较其它生物反应器系统关于呼吸体积、速度和机械学大得多的程度的控制、精确度和准确度。
[0115] 在某些实施方式中，生物反应器系统100能够同时进行负压通气和负压灌注。在一些实施方式中，将气管环路60的吸入管路61和呼出管路62密封，从而只允许从血管环路40的负压灌注。在另一个实施方式中，将血管环路40的动脉管路41和静脉管路42密封，从而只允许从气管环路60的负压通气。在其它实施方式中，负压通气与压力驱动的或体积测量的灌注组合。
[0116] 在一个实施方式中，在生物反应器系统100内培养期间血管储存器43和/或气管储存器65被气体调节。在一个实施方式中，血管环路40包括血管储存器气体交换机构46。在一个实施方式中，气管环路60包括气管储存器气体交换机构65。如本领域技术人员所将理解的，血管储存器气体交换机构46和/或气管储存器气体交换机构65可包括调节血管储存器43和/或气管储存器64中气体交换的任何已知的机构。在某些实施方式中，血管储存器气体交换机构46和/或气管储存器气体交换机构65包括商业上可获得的生物过程气体调节系统。在一个实施方式中，血管储存器43和/或气管储存器64的壁由高度透气性材料构建。在另一个实施方式中，将血管储存器43和/或气管储存器64置于培养箱中。
在一个实施方式中，血管储存器气体交换机构46和气管储存器气体交换机构65包括无菌过滤器，其允许储存器中充分的气体交换。
在一个实施方式中，血管储存器气体交换机构46和气管储存器气体交换机构65包括无菌过滤器，其允许储存器中充分的气体交换。
[0117] 在某些实施方式中，生物反应器系统100的储存器在培养期间必须进行热控制。如上面所描述的，在一个实施方式中，室10包括温度调节系统21，其测量和控制室10内的温度。在另一个实施方式中，室10由水套包围，从而隔离室10。在某些实施方式中，室10的水套允许台式操作。在另一个实施方式中，将室10、血管储存器43和/或气管储存器64置于温度控制的培养箱中。在另一个实施方式中，将室10、血管储存器43和/或气管储存器64置于温度控制的水浴中。
[0118] 在某些实施方式中，生物反应器系统100重量超过100磅。因此，在一个实施方式中，将生物反应器系统100的组件与可支撑全部系统的重量的带轮手推车连接。在一个实施方式中，将一个或多个组件整合进手推车。在另一个实施方式中，一个或多个组件是单独可携带的，但是位于手推车内。
[0119] 去细胞化
[0120] 在一些实施方式中，发明的生物反应器系统支持大型哺乳动物肺的去细胞化。在一个实施方式中，本发明提供利用去细胞化组织作为起始来源，优选来自大型哺乳动物(例如人)的去细胞化天然组织，制备工程化组织支架的方法。
[0121] 如本领域技术人员所将理解的，去细胞化的任何过程可以与发明的生物反应器一起使用。例如，美国专利申请公开号US2012/0064050描述了用于肺组织去细胞化的示例性去细胞化方法，其全部公开内容通过引用被并入本文。
[0122] 在一个实施方式中，去细胞化过程依赖化学方法学。一方面，用于去细胞化的化学溶液或另外称作去细胞化溶液通常至少包括高渗溶液、洗涤剂和螯合剂。优选，高渗溶液是高渗氯化钠溶液。优选，洗涤剂是两性离子洗涤剂，如CHAPS。优选，螯合剂是EDTA。
[0123] 在一个实施方式中，去细胞化溶液可包括针对与细胞的渗透相容性的缓冲剂(例如，PBS)。在一些实例中，去细胞化溶液还可包括酶如，没有限制地，一种或多种胶原酶、一种或多种分散酶、一种或多种DNA酶或蛋白酶如胰蛋白酶。在一些实例中，去细胞化溶液还或可选地可包括一种或多种酶的抑制剂(例如，蛋白酶抑制剂、核酸酶抑制剂和/或胶原酶(collegenase)抑制剂)。
[0124] 在一个实施方式中，发明的使组织去细胞化的方法包括用去细胞化溶液灌注组织。可将去细胞化溶液通过组织灌注的压力调节到期望的压力。优选，将去细胞化溶液以低于约30mmHg的灌注压力通过组织灌注。更优选，将去细胞化溶液以小于约20mmHg的压力通过组织灌注。在一个实施方式中，将去细胞化溶液以9和18mmHg之间的压力通过组织灌注。
[0125] 在一个实施方式中，可将去细胞化溶液导入肺组织的气道以引起细胞去除。发明的生物反应器促进本文别处讨论的许多不同方式和模式的流体流动，其可用于去细胞化溶液的递送。
[0126] 在一个实施方式中，发明的去细胞化组织基本上由组织的全部或大部分区域的细胞外基质(ECM)组分——包括血管树的ECM组分——组成。ECM组分可包括下列的任一种或全部：纤连蛋白、微纤维蛋白、层粘连蛋白、弹性蛋白、胶原蛋白家族成员(例如，胶原蛋白I、III和IV)、糖胺聚糖、基质、网状纤维和凝血酶敏感蛋白，其可保持有机构造为限定的结构如基底层。成功的去细胞化被定义为组织学切片中利用标准的组织学染色程序缺乏可检测的肌丝、内皮细胞、平滑肌细胞、上皮细胞和细胞核。优选，但不是必需的，残留的细胞碎片也已从去细胞化的组织去除。
[0127] 在一个实施方式中，天然组织的去细胞化过程保持组织固有的3-维结构。即，在去细胞化过程期间和之后保持组织的形态学和体系结构，包括ECM组分。ECM的形态学和体系结构可在视觉上和/或组织学上检查。例如，实体器官的外表面上或器官或组织的脉管系统内的基底层不应由于去细胞化而被去除或显著损伤。此外，ECM的原纤维应与未被去细胞化的器官或组织相似或明显未改变。
[0128] 在一个实施方式中，一种或多种化合物可应用于去细胞化组织中或上，以例如保持去细胞化的组织，或制备去细胞化的组织用于再细胞化，和/或在再细胞化过程期间辅助或刺激细胞。这样的化合物包括，但不限于，一种或多种生长因子(例如，VEGF、DKK-1、FGF、BMP-1、BMP-4、SDF-1、IGF和HGF)、免疫调节剂(例如，细胞因子、糖皮质激素、IL2R拮抗剂、白三烯拮抗剂)和/或改变凝血级联的因子(例如，阿司匹林、肝素结合蛋白和肝素)。此外，去细胞化器官或组织可用例如辐照(例如，UV、γ)进一步处理以减少或消除去细胞化组织上或中残留的任何类型的微生物的存在。
[0129] 发明的去细胞化溶液产生去细胞化组织的应用提供破坏组织细胞的可控的、精确的方式，同时使在下面的ECM，包括血管化和原组织的其它总形态学特征未受损。去细胞化支架然后适合用适当的细胞接种。在该过程在体外进行的情况下，接种的组织适合作为置换组织植入受体。除了去细胞化组织本身，发明包括由这样的支架建造的工程化组织的制造方法。
[0130] 本发明提供适合产生用于组织工程化的组织支架的方法。虽然组织的来源不受限于示例性实施方式，但是组织来自相对大的动物或公认为具有与人相似解剖学(关于感兴趣的组织)的动物，如猪、母牛、马、猴子或类人猿。在一些实施方式中，组织的来源是人，其的应用可减少基于支架的工程化组织的排斥可能性。在优选实施方式中，该方法留下组织未受损的血管结构，以及保持肺泡间隔的肺泡体系结构。如本文所用，术语“未受损的”指元件能在基本的程度上进行其原来的功能的状态。
[0131] 在一个实施方式中，去细胞化肺保留正常肺基质的几个关键特征。例如，去细胞化肺包括胶原蛋白、弹性蛋白、纤连蛋白和蛋白聚糖中至少一种或多种。
[0132] 去细胞化组织不保留主要组织相容性复合物(MHC)I或II类抗原，因此当施用给受体时，组织不引起不利的免疫应答。
[0133] 去细胞化组织保留正常的天然肺的机械学性质。去细胞化组织还保留正常的天然肺的屏障功能中的一些。
[0134] 组合物
[0135] 发明的组合物包括工程化大型哺乳动物肺组织。优选，工程化肺组织显示以下性质中的任何一个或多个：1)脉管系统和气道，其中存在可被通气的专利的、灌注的脉管系统和专利的气道树；2)气体交换，其中工程化肺能够在气道和血管区室之间交换足够的气体以支持受体的生理需要；最优选，肺部静脉中的氧分压是至少50mmHg；3)机械学，其中工程化组织足够强健以经得起所有需要的移动，特别是呼吸运动和血管灌注，以及手术植入期间的操纵；4)免疫原性，其中当植入受体时，工程化肺组织不引起免疫应答。
[0136] 本发明的组合物和方法可利用任何合适的细胞实施。优选，合适的细胞是再生的并可用于再细胞化发明的去细胞化组织。再生细胞的实例包括但不限于，干细胞、胚胎干细胞、成体干细胞、脐带血细胞、可诱导多能干细胞(iPSC)、组织衍生的干细胞或祖细胞、骨髓衍生的干细胞或祖细胞、血液衍生的干细胞或祖细胞、间质干细胞(MSC)、骨骼肌衍生的细胞、多潜能成体祖细胞(MAPC)、胎儿肺部细胞、分化的肺部上皮细胞、肺部祖细胞、血管祖细胞、分化的血管细胞等。可使用的另外的再生细胞包括骨髓衍生的干细胞如骨髓单核细胞(BM-MNC)、内皮或血管干细胞或祖细胞以及外周血衍生的干细胞如内皮祖细胞(EPC)。
[0137] 优选，合适的细胞分离自哺乳动物，更优选灵长类，仍然更优选，人。用于本发明的方法的细胞利用本领域已知的方法来分离。分离之后，将合适的细胞在培养基中培养。
[0138] 作为非限制性实例，可诱导多能性干细胞(iPSCs)关于培养细胞被更详细地描述。然而，熟练的技术人员将认识到培养条件可针对合适的细胞修改。支持iPSCs生长的培养基配方包括，但不限于，最低必需培养基伊格尔、ADC-1、LPM(无牛血清白蛋白)、F10(HAM)、F12(HAM)、DCCM1、DCCM2、RPMI 1640、BGJ培养基(具有和没有Fitton-Jackson改进)、基础培养基伊格尔(BME-加入Earle的盐碱)、杜尔贝科改进的伊格尔培养基(DMEM-无血清)、Yamane、IMEM-20、格拉斯哥改进型伊格尔培养基(GMEM)、莱博维茨L-15培养基、McCoy的5A培养基、培养基M199(M199E-具有Earle的盐碱)、培养基M199(M199H-具有Hank的盐碱)、最低必需培养基伊格尔(MEM-E-具有Earle的盐碱)、最低必需培养基伊格尔(MEM-H-具有Hank的盐碱)和最低必需培养基伊格尔(具有非必需氨基酸的MEM-NAA)等。
[0139] 发明还提供“接种”支架的细胞。在该情况下，将去细胞化器官或组织与细胞群体，分化的(成熟或初级的)细胞、干细胞(例如，iPS细胞)、或部分分化的细胞接触。因此，细胞可以是全能细胞、多能细胞或多潜能细胞，并可以是未定型的或定型的，并可以是单谱系细胞。细胞可以是未分化的细胞、部分分化的细胞或完全分化的细胞——包括胎儿衍生的细胞。
[0140] 导入到去细胞化器官中和上以产生器官或组织的细胞数目取决于器官(例如，器官的大小和重量)或组织及再生细胞的类型和发育阶段。关于那些细胞将达到的群体密度，不同类型的细胞可具有不同的趋向。相似地，不同的器官或组织可以以不同密度被细胞化。作为实例，去细胞化器官或组织可用至少约1,000(例如，至少10,000、100,000、1,000,000、10,000,000或100,000,000)个再生细胞接种；或可具有附着到其的约1,000个细胞/mg组织(湿重，即，在去细胞化之前)至约10,000,000个细胞/mg组织(湿重)。
[0141] 细胞可通过注射进一个或多个位置而导入去细胞化器官或组织。此外，超过一种类型的细胞(即，细胞的混合物)可导入去细胞化的器官或组织中。例如，细胞的混合物可在去细胞化器官或组织中的多个位置注射或不同细胞类型可被注射进去细胞化器官或组织的不同部分。可选地，或除了注射，再生细胞或细胞混合物可通过灌注进插套管的去细胞化器官或组织而被导入。例如，细胞可利用灌注培养基被灌注进去细胞化器官，灌注培养基然后可换成扩张和/或分化培养基以诱导再生细胞的生长和/或分化。在肺组织的情况中，细胞可通过气管被导入气道区室或通过肺部动脉或静脉被导入血管区室，或通过气管被导入气道区室和通过肺动脉或静脉被导入血管区室。在本发明的生物反应器的一个实施方式中，细胞通过将细胞悬液加入到血管储存器和/或气管储存器而被导入工程化肺。
[0142] 再细胞化期间，将器官或组织保持在这样的条件下，其中再生细胞中的至少一些可在去细胞化器官或组织内和上繁殖和/或分化。那些条件没有限制地包括，适当的温度和/或压力、电和/或机械活动、力、适当量的O2和/或CO2、适当的量的湿度以及无菌或接近无菌的条件。再细胞化期间，将去细胞化器官或组织和附着到其的细胞保持在合适的环境中。例如，细胞可需要营养补剂(例如，营养素和/或碳源如葡萄糖)、外源激素或生长因子和/或特定的pH。
[0143] 细胞可以与去细胞化器官或组织是同种异体的(例如，用人细胞接种的人去细胞化器官或组织)，或再生细胞可以与去细胞化器官或组织是异种的(例如，用人细胞接种的猪去细胞化器官或组织)。
[0144] 在一些实例中，可将用本文描述的方法产生的器官或组织移植进患者。在那些情况中，用于对去细胞化器官或组织再细胞化的细胞可获自患者以至于再生细胞与该患者是自体的。来自患者的细胞可利用本领域已知的方法获自例如在不同生命阶段(例如，出生前、新生或围产期、青春期期间或作为成人)的血液、骨髓、组织或器官。可选地，用于对去细胞化器官或组织再细胞化的细胞可以是与患者同基因的(即，来自同卵双生)，细胞可以是来自例如患者亲属(relative)或与患者无关系的HLA匹配的个体的人淋巴细胞抗原(HLA)匹配的细胞，或细胞可以是与患者同种异体的，来自例如非HLA匹配的供体。
[0145] 不论细胞的来源(例如，自体的或不是)，去细胞化实体器官可以是与患者自体的、同种异体的或异基因的。
[0146] 在某些实例中，去细胞化组织可在体内(例如，组织已移植进个体之后)用细胞再细胞化。体内再细胞化可如上面所描述的(例如，注射和/或灌注)用例如本文描述的细胞中的任何一种进行。可选地或另外地，去细胞化器官或组织用内源细胞的体内接种可天然地发生或由递送到再细胞化组织的因子介导。
[0147] 施用
[0148] 发明考虑体外和体内情况中工程化大型哺乳动物组织的应用。因此，发明提供工程化组织用于研究目的和用于治疗或医学/兽医目的应用。在研究情况中，对于该技术存在巨大数目的实际应用。这样的应用的一个实例是离体癌症模型中工程化组织的应用，如实验室中检测多种消除技术(包括，例如辐照治疗、化学疗法治疗或组合)的有效性，因此避免生病的患者优化治疗方法的应用。例如，可将最近去除的肺与生物反应器连接并处理肺以消除组织。体内应用的另一个实例是用于组织工程化。
[0149] 本发明的工程化组织具有体内应用。在多种应用中，可提到对象(与“患者”在本文可互换地使用，应意为包括人和动物)体内治疗的方法。对某些实施方式一般而言，治疗对象的方法包括将根据发明的工程化组织植入到对象中或对象表面上，其中组织的植入导致对象中可检测的变化。可检测的变化可以是可利用天然感官或利用人造的装置来检测的任何变化。虽然本发明预想任何类型的治疗(例如，疾病或病症的治疗性治疗、皮肤斑点的化妆性治疗等)，但是在许多实施方式中，治疗是对象的疾病、病症或其它痛苦的治疗性治疗。因此，可检测的变化可以是影响对象的疾病或病症的至少一个临床症状的变化，优选改进的检测。示例性体内治疗方法包括肿瘤治疗之后器官的再生、医疗装置植入的手术位点的准备、皮肤移植以及组织或器官，如疾病或病症损害或破坏的组织或器官的部分或全部的置换。示例性器官或组织包括：心、肺、肝、肾、膀胱、脑、耳、眼或皮肤。考虑到对象可以是人或动物的事实，本发明具有医学和兽医应用。
[0150] 在一个实施方式中，方法包括将组织暴露于发明的去细胞化方法以杀死被治疗组织的细胞并产生组织支架。所述方法可进一步包括用细胞接种组织支架和允许接种的细胞在组织支架中和上增殖。增殖产生含有健康且有功能的细胞的再生组织。
[0151] 发明还提供通过将程化肺组织植入需要其的哺乳动物而治疗患者的方法。在一些实例中，工程化肺组织包括合适的细胞，例如iPS细胞。然而，发明应不限于任何特定类型的细胞。植入之后，移植的细胞可对将引起它显现内源组织特征的环境条件(environmental cues)有反应。优选，细胞形成组织型肺泡样结构，由形成导管结构的分化远端上皮细胞(proSpC表达)组成。因此，植入的细胞将显现使它和周围组织相似的特性。利用这些方法，生物支架可增大组织；发明的生物支架可用于组织工程化和用于任何常规的组织工程化情况。
[0152] 相应地，发明包括组织再生应用。组织再生治疗方法的目的是以优化最初创伤机械学和最后新生组织产生的形式将高密度的修复胜任细胞(或当受局部环境影响时可变得能胜任的细胞)递送到缺陷部位。本发明的组合物特别用于减轻或治疗个体中肺组织缺陷的方法。有利地，发明的组合物提供改进的肺组织再生。具体地，由于发明的组合物，更迅速地实现组织再生。
[0153] 有利地，发明的组合物和方法代表对现有技术方法的改进。在一个实施方式中，用于治疗肺组织缺陷的组合物包括干细胞，优选iPS细胞，其接种在支架上并体外培养以产生3维培养物，如本文别处所描述的。
[0154] 用于药物发现的模型
[0155] 本发明提供适合允许测试化合物关于肺部疾病或病症治疗活性评价的体外方法。优选，所述方法包括工程化三维肺组织的应用。
[0156] 发明基于用于大型哺乳动物肺组织培养的生物反应器的开发。在一些实例中，肺组织自去细胞化的肺支架产生，其可用合适的细胞接种。在一些实例中，含有上皮、间质和内皮细胞的混合iPS细胞群体用于产生三维工程化肺组织。例如，将iPS细胞置于三维去细胞化肺组织内。因此，模型并入了iPS细胞对生长和与邻近细胞的细胞间通信的影响。三维肺组织模拟天然的肺组织，例如工程化肺组织显示天然肺组织例证的分枝形态发生。因此，在某些实施方式中，发明的生物反应器中生长的工程化肺组织充当用于评价各种组合物性质的模型。
[0157] 该模型用于关于肺组织病理学测试药物。此外，该模型可用于检查治疗剂的特定递送载体对肺组织病理学的影响，例如以比较通过不同递送系统施用的相同药剂的影响，或只是评价是否递送载体自身(例如病毒载体)能影响肺病理学。
[0158] 在一个实施方式中，发明提供针对测试药剂调节肺组织健康的能力筛选测试药剂的体外方法。该方法包括使测试药剂与工程化三维肺组织模型接触和测量测试药剂具有的对肺组织模型的影响。在存在测试药剂的情况下对模型的任何改变是测试药剂能调节肺组织健康的指示。
[0159] 在另一个实施方式中，本发明提供观察测试药剂具有的对肺组织的影响的体外方法，包括以下步骤：
[0160] a)提供至少一个三维肺组织模型，其中模型意欲模仿正常肺组织；
[0161] b)使测试药剂与肺组织模型接触；和
[0162] c)观察测试药剂具有的对肺组织模型的影响。
[0163] 组织模型是这样的构建物，其包括支架例如胶原基质上三维排列的细胞和至少一种测试细胞。该方法包括观察测试药剂对肺组织病理学的影响。然而该方法可进一步包括观察测试药剂对肺组织的个别细胞类型的影响的步骤。
[0164] 测试药剂可以是任何药剂，包括化学药剂(如毒素)、药物、肽、蛋白质(如抗体、细胞因子、酶等)和核酸——包括基因药物和导入的基因，其可编码治疗剂如蛋白质、反义药剂(即包括与靶细胞类型中表达的靶RNA互补的序列的核酸，如RNAi或siRNA)、核酶等。另外或可选地，测试药剂可以是物理剂如辐照(例如电离辐照、紫外线或热)；这些可单独或与化学和其它药剂组合测试。
[0165] 该模型还可用于测试递送载体。这些可以具有任何形式，从常规的药物制剂到基因递送载体。例如，该模型可用于比较对通过两种或多种不同递送系统(例如贮存库制剂(depot formulation)和控制释放制剂)施用的相同药剂的治疗效果的影响。它还可用于研究是否特定的载体可具有它自己对组织的影响。随着基于基因的治疗法增加，与多种可能的递送系统相关的安全性问题变得日益重要。因此本发明的模型可用于研究用于核酸治疗法的递送系统的性质，如裸露DNA或RNA病毒载体(例如逆转录病毒或腺病毒载体)、脂质体等。因此测试药剂可以是具有或没有任何相关治疗剂的任何适当类型的递送载体。
[0166] 测试药剂可利用任何合适的手段加入将被测试的模型。例如，测试药剂可滴加到模型表面上和允许扩散进或另外进入模型，或它可加入营养培养基和允许通过器官灌注。该模型还适合测试物理剂如电离辐照、紫外线或热单独或与化学药剂组合(例如，在光动力学疗法中)的效果。
[0167] 观察测试药剂具有的对模型的影响可利用许多种方法来实现。例如，特定的药剂可诱导细胞进入凋亡。细胞中可检测的变化可包括细胞面积、体积、形状、形态学、标志表达(例如细胞表面标志表达)或其它合适的特征，如染色体片段化的变化。细胞数目也可被监测以便观察测试药剂对细胞增殖的影响；这可直接例如通过计数存在的特定细胞类型的数目，或间接例如通过测量特定细胞群的大小进行分析。这些可利用例如合适的荧光细胞染色在未受损的模型上直接或间接进行观察。这可通过用活体染料或遗传上导入的荧光标记(例如绿色荧光蛋白)预先标记细胞，用于活体模型的连续分析，或通过固定和用荧光物质如碘化丙啶或荧光标记的抗体后标记。可选地，模型可通过正常的组织学方法，如利用针对合适的细胞靶标的抗体的免疫组织化学，或原位杂交处理以检测特定mRNA种类的表达。而且，这可以以自动/机器人或半自动方式利用计算机系统和软件实施以在各个时间点使细胞成像和检测例如细胞密度、位置和/或形态学的任何变化。共聚焦激光扫描显微镜检查特别地允许未损伤模型的三维分析。因此它可能直接应用于未损伤的三维肺组织模型、细胞行为的定量分析——其正常仅对常规的二维培养中的细胞是可能的。通过该手段，细胞增殖、凋亡、坏死、迁移和基质侵入等的定量的连续分析在三维肺组织模型中获得，该三维肺组织模型架起常规的二维细胞培养和活体动物模型之间间隔的桥梁。
[0168] 实验实施例
[0169] 发明通过参考以下实验实施例而被进一步详细地描述。提供这些实施例仅用于说明的目的，而不是意欲被限制，除非另外说明。因此，发明应决不被解释为受限于以下实施例，而应被解释为包括由于本文提供的教导而变得明显的任何和全部变化。
[0170] 无需进一步的描述，据认为本领域技术人员可利用先前的描述和以下说明性的实施例，制备和利用本发明的化合物和实施要求保护的方法。因此以下操作实施例具体地指出本发明的优选实施方式，而不被解释为以任何方式限制公开的剩余部分。
[0171] 实施例1：生物反应器
[0172] 设计和构建本发明的生物反应器，目标是工程化人或大型哺乳动物肺构建物的去细胞化、再接种和生长。示例性生物反应器的设计标准如下：
[0173] ·在去细胞化和培养的所有阶段期间为构建物提供无菌环境。
[0174] ·允许反应器内工程化肺容易的套管插入和安装，以及当肺被安装在反应器中时外科套管插入术的容易观察。
[0175] ·提供反应器内可靠地定位和定向肺的方式
[0176] ·允许无菌环境外部反应器的拆卸和台式维修而没有损害肺自身的无菌度[0177] ·减少全部肺培养需要的培养基体积。这是重要的标准，因为大体积(10-30升)的细胞特定的培养基在应用如这个中一周花费数万美元。
[0178] ·提供方法以与体内器官经历的高度相似的速度和体积使器官负压呼吸(同时如需要，仍然允许正压呼吸)，允许可变的呼吸体积、压力和速度。这必须以绝不损害无菌度的方式进行。
[0179] ·提供方法以与体内器官经历的高度相似的搏动方式通过器官的脉管系统来灌注流体，允许可变的每搏输出量、压力和速度。这必须以绝不损害无菌度的方式进行。
[0180] ·允许第三方监测/传感设备或技术的容易整合
[0181] ·设计容易使用、紧凑、自含式和针对工作站之间输送容易移动的系统。
[0182] 本发明的生物反应器的非限制的实例在图1-10中描绘。
[0183] 本文引用的每个和每一个专利、专利申请和出版物的公开内容在此以它们的全部通过引用被并入本文。
| 标题 | 发布/更新时间 | 阅读量 |
|---|---|---|
| 用于检测错误折叠蛋白的装置及其使用方法 | 2020-07-24 | 1 |
| 一种以宽内径持卵管去除哺乳动物卵母细胞核的方法 | 2020-06-22 | 5 |
| 用于选择素抑制的喹啉衍生物和包含喹啉衍生物的医药组合物 | 2021-02-01 | 2 |
| 降钙素受体结合肽 | 2021-08-01 | 2 |
| 作为兴奋性氨基酸神经传递素拮抗药的合成杂芳基多胺 | 2020-10-25 | 1 |
| 具有延长的体内半衰期的因子VIIa-聚唾液酸结合物 | 2020-10-01 | 3 |
| 包含白藜芦醇的营养药物组合物的新颖用途 | 2021-11-07 | 1 |
| 包含脱氢乙酸和护肤活性物质的护肤组合物 | 2021-06-28 | 1 |
| 用于哺乳动物基因表达的人杂合宿主细胞 | 2020-06-02 | 0 |
| 初免靶向 | 2022-08-10 | 2 |
高效检索全球专利专利汇是专利免费检索,专利查询,专利分析-国家发明专利查询检索分析平台，是提供专利分析，专利查询，专利检索等数据服务功能的知识产权数据服务商。
我们的产品包含105个国家的1.26亿组数据，免费查、免费专利分析。
分析报告
专利汇分析报告产品可以对行业情报数据进行梳理分析，涉及维度包括行业专利基本状况分析、地域分析、技术分析、发明人分析、申请人分析、专利权人分析、失效分析、核心专利分析、法律分析、研发重点分析、企业专利处境分析、技术处境分析、专利寿命分析、企业定位分析、引证分析等超过60个分析角度，系统通过AI智能系统对图表进行解读，只需1分钟，一键生成行业专利分析报告。
QQ群二维码
意见反馈
意见反馈